Luận án Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài tai chua (garcinia cowa roxb. ex choisy) và đằng hoàng (garcinia hanburyi hook f.) ở Việt Nam

-13,17-bis(3-methyl-2-butenyl)-13α,11α-methano-8H,2H-furo[3,4- g]pyrano[3,2-b]xanthene-8,12-dione (desoxymorellin) công bố trong tài liệu tham khảo [197]. Do đó chúng tôi kết luận GH6 chính là desoxymorellin. Bảng 4.23. Dữ liệu phổ NMR của GH6 và desoxymorellin Vị trí GH6 Desoxymorellin, [197] Hab (mult; J) Cac COSY HMBC (HC) Hab Cac 2 78,4 78,4 3 5,54 (d; 10,0) 126,1 H-4 2, 5 5,54 126,2 4 6,66 (d; 10,0) 115,6 H-3 2, 6 6,66 115,5 5 103,0 102,9 6 12,90 (s) 157,8 12,97 157,8 OH-6 5, 7, 16, 18 7 100,6 100,7 8 179,6 179,6 9 133,8 H-11 133,7 10 7,46 (d;7,0) 134,9 H-10; H-21 8, 11, 12, 14 7,45 134,9 11 3,51 (dd; 6,5; 5,0) 47,0 10, 21 3,51 46,9 12 203,5 203,5 13 84,7 84,6 14 90,5 90,5 16 157,5 157,5 123 17 108,3 106,4 18 160,6 160,6 19 1,46 (s) 28,29 2, 3, 20 1,46 28,8 20 1,46 (s) 28,26 H-22, H-11 2, 3, 19 1,46 28,8 21 2,35 (dd; 13,5; 4,5); 1,34 (dd; overlap) 25,5 H-21, H-23 10, 11, 14, 22, 23 25,4 22 2,51 (d; 9,5) 49,2 H-22 11, 24, 25 2,51 49,2 23 83,2 83,1 24 1,73 (s) 30,1 23, 24, 25 1,74 30,1 25 1,31 (s) 29,1 H-27 23, 24, 25 1,30 29,1 26 2,59 (d; 7,5) 28,8 H-26 12, 13, 14, 27, 28 2,58 29,0 27 4,46 (t; 7,0) 117,9 29, 30 117,8 28 134,9 134,9 29 1,09 (s) 16,7 16,7 30 1,39 (s) 25,6 H-32 27, 28, 29 25,5 31 3,35 (m) 21,7 H-31 16, 18 3,35 21,6 32 5,24 (dd; 6,5; 7,5) 122,2 17, 34, 35 5,23 122,2 33 131,6 131,6 34 1,79 (s) 18,2 32, 33, 35 1,62 18,1 35 1,69 (s) 25,7 32 , 33, 34 1,69 25,8 a Đo trong CDCl3, b 500 MHz, c 125 MHz. 4.2.7. Hợp chất GH7: Isomoreollin B Hợp chất GH7 được phân lập dưới dạng bột màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 58-59 oC. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1416 17 18 19 20 21 22 25 26 28 29 24 23 27 O O OH O O O 34 35 33 32 31 30 CHO OCH3 O O O O O O CHO H H H H O HMBC COSY Hình 4.81. Cấu trúc hóa học và các tương tác COSY, HMBC chính của GH7 Phổ 1H NMR của hợp chất GH7 cho thấy các tín hiệu của 40 proton trong đó có 7 nhóm methyl, 4 CH olefin, 1 nhóm OH liên hợp với nhóm cacbonyl (H 12,9; OH-6) và một nhóm methoxy tại H 3,22 (OCH3-10). Phổ 13C NMR của GH7 cho tín hiệu cộng hưởng của 34 cacbon trong đó có 3 nhóm C=O (C 208,1; 193,3 và 195,1); 14 C sp2 trong đó có 3 cacbon gắn với oxygen; 4 nhóm -CH olefin, 7 nhóm -CH3 và 1 nhóm methoxy. Ngoài ra còn có 5 cacbon sp3 liên kết với oxygen tại C 78,6 (C-2); 86,0 (C-13); 88,3 (C-14); 82,1 (C-23) và 74,1 (C-10). 124 Trên phổ 1H và 13C NMR của GH7 xuất hiện tín hiệu của một proton aldehyde tại H 9,43/ C 195,1 (CH-29) tương tự như tín hiệu của nhóm -CHO trong GH5. Điều này chứng tỏ GH7 có chứa một nhóm aldehyde. Ngoài ra, phổ 1H NMR còn cho thấy sự biến mất của một proton ở H 7,46-7,55 là tín hiệu đặc trưng cho proton của nối đôi liên hợp với nhóm cacbonyl (H-10) trong khung xanthone lồng, thay vào đó là sự xuất hiện của 1 proton ở H 4,37 (dd; 4,5; 1,5; H-10) là tín hiệu proton của cacbon no liên kết với oxygen và 1 proton tại H 3,07 (d; 1,0; H-9) cùng với tín hiệu của nhóm methoxy tại H 3,33/C 55,9. Điều này chứng tỏ liên kết đôi ở C9-C10 đã bị oxygen hóa. Hình 4.82. Phổ 1H NMR của hợp chất GH7 Hình 4.83. Phổ 13C NMR của hợp chất GH7 Phổ COSY, HSQC và HMBC cho thấy GH7 có hai nhóm prenyl, 1 nối đôi CH=CH và 2 nhóm methyl cùng gắn với C-2, 1 hệ spin CH (9)-CH (10)-O và 1 hệ spin CH (11)-CH2 (21)-CH (22) (hình 4.81). Ngoài ra số lượng nhóm methyl (7 nhóm) và C=O (3 nhóm) gợi ý đến cấu trúc của isomoreollin B. Bằng việc kết hợp các phổ COSY, HSQC và HMBC có thể gán được các tín hiệu cacbon và proton còn lại. Ngoài ra, kết quả so sánh phổ của GH7 với hợp chất isomoreollin B trong tài liệu tham khảo [36] cho thấy dữ liệu phổ hoàn toàn trùng khớp. Do vậy chúng tôi kết luận GH7 chính là isomoreollin B. 125 Bảng 4.24. Dữ liệu phổ NMR của GH7 và isomoreollin B Vị trí GH7 Isomoreollin B, [36] Hab (mult; J) Cac HMBC (H→C) Had (mult; J) Cae 2 78,6 78,6 3 5,52 (d; 10,5) 126,5 2, 5 5,53 (d; 9,9) 126,5 4 6,62 (d; 10,0) 115,3 2, 18 6,62 (d; 9,9) 115,2 5 103,3 103,3 6 156,4 156,4 6- OH 11,87 (s) 5,6, 7 11,75 (s) 7 101,8 101,8 8 193,3 193,3 9 3,07 (d; 1,0) 48,5 11, 10, 14, 8 3,08 (d; 1,1) 43,5 10 4,37 (dd; 4,5; 1,5 ) 74,1 14, 8, 12 4,37 (dd; 4,6; 1,1) 74,1 11 2,89 (t; 5,5; 5,0) 43,7 14, 12 2,91 (dd; 6,0; 4,6) 43,7 12 208,1 208,2 13 86,0 82,1 14 88,3 88,3 16 155,5 155,5 17 109,1 109,2 18 160,9 160,9 19 1,46 (s) 28,6 20, 2 1,47 (s) 27,6 20 1,40 (s) 28,2 19, 2 1,40 (s) 28,2 21 1,41 (1H; overlap); 2,00 (1H; dd; 15,0; 6,5) 20,0 22, 10, 23, 14 1,41 (1H; dd; 14,7; 8,5); 2,00 (dd; 14,7; 6,0) 20,0 22 2,54 (d; 8,5) 43,6 11, 13, 14, 24 2,55 (d; 8,5) 48,5 23 82,1 85,9 24 1,37 (s) 29,8 24, 22, 23 1,37 (s) 29,8 25 1,16 (s) 27,6 25, 22, 23 1,16 (s) 28,6 26 3,03 (1H; dd; 8,0) 2,96 (1H; dd; 5,5) 27,3 13, 28, 27, 12 3,06 (dd; 16,4; 7,5); 2,92 (dd; 16,4; 6,2) 27,3 27 6,96 (t) 148,8 30, 29 6,97 (m) 148,9 28 139,9 139,9 29 9,43 (s) 195,1 30, 28 9,54 (s) 195,2 30 1,75 (s) 9,3 28, 27, 29 1,76 (s) 9,3 31 3,30 (1H; dd; 8,0) 3,21 (1H; dd; 6,0) 21,6 17, 32, 33, 18 3,31 (1H; dd; 14,1; 7,6); 3,19 (1H; dd; 14,1; 5,7) 21,6 32 4,97 (dt; 6,0; 1,5) 122,4 34, 35 4,97 (m) 122,3 33 131,5 131,5 34 1,75 (s) 18,1 32, 33, 35 1,76 (s) 18,1 35 1,64 (s) 25,7 34, 33, 32 1,64 (s) 25,7 a Đo trong CDCl3, b 500 MHz, c 125 MHz, d 270 MHz, e 68 MHz. 126 4.2.8. Hợp chất GH8: acid 10α-butoxygambogic Hợp chất GH8 được phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng nhạt. Phổ 1H, 13C NMR và HSQC của GH8 cho phép xác định các tín hiệu của 54 proton và 42 cacbon, trong đó có 1 nhóm -OH tại H 11,92; 9 nhóm methyl; 8 nhóm methylen, trong đó có một nhóm methylen đính với oxygen tại H 3,51 (1H; m); 3,38 (1H; m)/C 68,1 (CH2- 1’); 6 nhóm -CH sp2; 4 nhóm methine, trong đó có một nhóm gắn với oxygen tại H 4,42 (1H; dd; 4,5; 1,5)/ C 72,3 (CH-10); 3 cacbon cacbonyl; 10 Csp2 bậc 4 trong đó có 3 cacbon gắn với oxygen và 4 Csp3 bậc 4 gắn với oxygen. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1416 17 18 19 20 21 22 25 26 28 29 24 23 27 O O OH O O O 3435 33 32 31 30 40 39 38 37 36 HOOC O 1' 3' O O O O O O HOOC H H H H O HMBC COSY Hình 4.84. Cấu trúc hóa học và các tương tác COSY, HMBC của GH8 Hình 4.85. Phổ 1H NMR của hợp chất GH8 Hình 4.86. Phổ 13C NMR của GH8 Các tương tác trên phổ COSY, HSQC và HMBC cho thấy GH8 có các mảnh cấu trúc gồm: ba nhóm prenyl, trong đó có một nhóm prenyl có chứa một nhóm 127 COOH; một nối đôi CH=CH; một hệ spin CHsp3-CHsp3-CHsp3-CH2-CHsp3; một hệ spin CH2-CH2-CH2-CH3 (hình 4.84). Các dữ liệu này cho phép dự đoán GH8 có cấu trúc của một xanthone lồng với liên kết đôi C9=C10 thường gặp trong các khung xanthone đã bị oxygen hóa. Các tín hiệu phổ NMR của nhóm CH-9 tại H 3,18 (1H; m)/ C 48,6 hoàn toàn tương tự tín hiệu của hai nhóm này trong hợp chất GH7 giúp khẳng định dự đoán trên hoàn toàn chính xác, tuy nhiên theo dữ liệu phổ ở trên thì nhóm thế gắn với C-10 là nhóm α-butoxy. Kết hợp phân tích các phổ COSY, HSQC và HMBC chúng tôi gán được các tín hiệu cacbon và proton còn lại (bảng 4.25). Ngoài ra kết quả so sánh dữ liệu phổ của GH8 và của acid 10α-butoxygambogic trong tài liệu tham khảo [166, 198] cho thấy dữ kiện phổ của hai chất hoàn toàn trùng khớp. Do đó chúng tôi kết luận GH8 chính là acid 10α-butoxygambogic. Bảng 4.25. Dữ liệu phổ NMR của GH8 và acid 10α-butoxygambogic Vị trí GH8 Acid 10α- butoxygambogic, [166] Hab (mult; J) Cac COSY HMBC (HC) Had (mult; J) Cae 2 81,0 81,3 3 5,44 (d; 10,0) 125,1 H-4 5, 2 5,44 (d; 10,0) 124,9 4 6,66 (dd; 10,0; 1,5) 115,9 H-3 3, 6, 18, 2, 5 6,66 (d; 10,0) 116,0 5 102,8 102,8 6 156,4 156,5 6- OH 11,92 (s) 6, 5, 7, 18 11,95 (s) 7 101,8 101,9 8 193,8 193,9 9 3,18 (m) 48,6 11, 10, 13, 14, 8 3,18 (m) 48,7 10 4,42 (dd; 4,5; 1,5) 72,3 H-11 9, 14, 1’, 8, 12 4,42 (d; 3,6) 72,3 11 2,81 (m) 44,2 H-10, H-21 12, 13, 10, 9, 22 2,81 (m) 44,3 12 208,4 208,7 13 86,4 86,5 14 88,4 88,5 16 155,7 155,8 17 108,9 108,8 18 161,2 161,4 19 1,36 (s) 27,2 H-19 2, 3, 20 1,44 (s) 27,9 20 1,77 (m); 1,63 (m) 41,9 H-21 2, 3 1,58; 1,76 (m) 42,2 21 1,94 (m); 1,38 (m) 20,0 H-11, H-22 22, 10, 23, 14, 12 1,37 (m) 20,1 128 Vị trí GH8 Acid 10α- butoxygambogic, [166] Hab (mult; J) Cac COSY HMBC (HC) Had (mult; J) Cae 22 2,50 (d; 8,5) 43,6 H-21 11, 13, 14, 24, 21 2,51 (d; 8,4) 43,6 23 82,4 82,6 24 1,35 (s) 29,7 25, 22, 23 1,36 (s) 29,9 25 1,15 (s) 27,2 22,23, 24 1,15 (s) 27,4 26 3,20 (m); 3,10 (m) 28,0 H-27 27, 28, 13 3,11; 3,19 (m) 28,1 27 6,61 (dt; 7,0; 1,0) 139,0 H-26 29, 13,26 6,65 (m) 139,1 28 127,6 127,6 29 171,6 171,9 30 1,96 (s) 20,6 29, 27, 28 1,96 (s) 20,8 31 3,28 (m); 3,19 (m) 21,5 H-32 32, 33, 16, 18, 17 3,17; 3,27 m 21,6 32 5,03 (dt; 6,0; 1,5) 122,6 H-31 33, 34, 35 5,01 (m) 122,7 33 131,3 131,5 34 1,73 (s) 18,1 32, 33, 35 1,73 (s) 18,2 35 1,62 (s) 25,6 32, 33, 34 1,62 (s) 25,8 36 2,08 (m) 22,9 H-37, H-20 20, 37, 38 2,02 (m) 22,9 37 5,09 (dt; 7,0; 1,5) 123,8 H-36 5,05 (m) 123,9 38 131,9 132,1 39 1,56 (s) 17,6 37, 38, 40 1,55 (s) 17,8 40 1,66 (s) 25,6 37, 38, 39 1,65 (s) 25,8 1’ 3,51 (m); 3,38 (m) 68,1 3,50 (m); 3,38 (m) 68,2 2’ 1,47 (m) 31,6 1,44 (m) 31,7 3’ 1,27 (m) 19,2 1,26 (m) 19,4 4’ 0,85 (t; 7,0; 7,5) 13,8 0,84 (m) 14,0 a Đo trong CDCl3, b 500 MHz, c 125 MHz, d 400 MHz, e 100 MHz. 4.3. Kết quả tổng hợp dẫn xuất của GA (GH1) 4.3.1. Kết quả khảo sát sự hồi phục phân tử ở trạng thái gương và trạng thái dung dịch siêu lạnh của acid gambogic vô định hình Trong số các dạng hình thái của hoạt chất, dạng vô định hình được quan tâm hơn dạng tinh thể vì khả năng tan tốt hơn trong nước và hoạt tính sinh học cao hơn. Dạng vô định hình của vật liệu được tạo ra bằng cách làm lạnh nhanh thuốc để tránh sự kết tinh sau khi làm nóng chảy nó ở nhiệt độ nóng chảy. Sự chuyển động phân tử trong các vật liệu vô định hình được đặc trưng bởi thời gian hồi phục cấu trúc α trong các trạng thái dung dịch siêu lạnh và trạng thái gương. Những vật liệu này có cấu trúc sắp xếp không theo trật tự và phụ thuộc vào nhiệt độ, ở nhiệt độ cao vật liệu vô định 129 hình có tính chất giống như chất lỏng nhưng ở nhiệt độ thấp quá trình hồi phục phân tử diễn ra chậm hơn rất nhiều và các vật liệu này có tính chất giống chất rắn. Việc khảo sát sự hồi phục phân tử ở trạng thái gương và trạng thái dung dịch siêu lạnh của GA nhằm đánh giá tiềm năng ứng dụng làm thuốc của GA. Tính chất nhiệt của GA đã được khảo sát trên cơ sở phương pháp phân tích nhiệt quét vi sai (DSC) trong khoảng nhiệt độ từ 273-373 K với tốc độ tăng nhiệt là 10 K/phút. Kết quả đã xác định được nhiệt độ chuyển thủy tinh của GA là Tg = 338K (hình 4.87). Hình 4.87. Phổ DSC của a) GA mẫu ban đầu; b) GA sau khi được nung ở 373 K trong 3 phút Để khảo sát động học phân tử của GA vô định hình, tiến hành đo phổ điện môi băng thông rộng (BDS) trong khoảng tần số rộng từ 10-1 đến 106. Trong quá trình đo, nhiệt độ tăng từ 153 đến 333 K với tốc độ gia nhiệt 10 K/phút và từ 333 đến 411 K với tốc độ gia nhiệt 2 K/phút. Quang phổ điện môi băng thông rộng BDS của GA từ dạng dung dịch siêu lạnh và dạng thủy tinh được trình bày trong hình 4.88 dưới đây. Hình 4.88. Quang phổ điện môi băng thông rộng của GA ở nhiệt độ a) cao hơn nhiệt độ chuyển gương và b) thấp hơn nhiệt độ chuyển gương. Trên quang phổ điện môi băng thông rộng của GA ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ chuyển pha thủy tinh có thể quan sát thấy hai quá trình hồi phục phân tử thứ cấp β và γ kết hợp với chuyển động nội phân tử của GA. Trong khi đó trên phổ BDS ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển thủy tinh xuất hiện đỉnh tương ứng với quá trình 130 hồi phục cấu trúc α và độ dẫn điện dc. Các quá trình hồi phục phân tử của GA dịch về phía tần số cao hơn khi tăng nhiệt độ, cho thấy sự tăng mức độ chuyển động phân tử khi tăng nhiệt độ. Bằng việc kết hợp các dữ kiện thực nghiệm đo được trong phổ BDS, kết hợp với phương trình Vogel–Fulcher–Tammann (VFT) thu được nhiệt độ chuyển thủy tinh Tg = 333 K (xác định ở nhiệt độ mà thời gian hồi phục bằng 100 s). Kết quả này có sai lệch so với phương pháp DSC nhưng sai số này là bình thường và chấp nhận được. Kết quả tính toán lý thuyết trên cơ sở sự phụ thuộc của thời gian hồi phục cấu trúc dạng α vào nhiệt độ τα (T = 300 K) cũng cho biết GA có thể tồn tại ở trạng thái ổn định động học trong khoảng 2,31.109 ngày. Điều đó chứng tỏ GA khá bền và có thể lưu trữ ở nhiệt độ phòng. Ngoài ra, dựa vào phương trình VFT cũng tính được độ giòn vật liệu của GA là mp = 103 (các chất thông thường mp = 16-200 [199]). Khi độ giòn trong khoảng 16 đến 30, ví dụ như thủy tinh (SiO2) thì vật liệu được coi là rất cứng. Với độ giòn vật liệu lớn hơn 100, vật liệu được coi là rất giòn. Trong khoảng từ 30 đến 100, độ giòn vật liệu ở mức trung bình. Do đó, GA ở trạng thái dung dịch siêu lạnh có thể được xếp vào vật liệu giòn. Kết quả tính toán trên phần mềm ECNLE thu được nhiệt độ chuyển thủy tinh Tg = 338 K với tốc độ gia nhiệt 10 K/phút hoàn toàn phù hợp với thực nghiệm. Ngoài ra kết quả tính toán cũng cho thấy quá trình β có mối liên hệ chặt chẽ với sự hồi phục phân tử và hình thành từ động học của các phân tử riêng lẻ, quá trình này còn gọi là quá trình hồi phục Johari–Goldstein. Như vậy các tính chất về thời gian ổn định động học lớn và độ giòn vật liệu tương đối của GA cho thấy GA có thể đáp ứng được các yêu cầu về mặt vật lý của một hoạt chất có tiềm năng làm thuốc. Đây là cơ sở quan trọng để tiến hành các phản ứng tổng hợp dẫn xuất của GA nhằm thu được các dẫn xuất có hoạt tính cao có tiềm năng ứng dụng vào thực tế. 4.3.2. Định hướng tổng hợp dẫn xuất O O OH O O O HOOC Hình 4.89. Cấu trúc hóa học và tinh thể của GA Cấu trúc tinh thể của GA cho thấy cấu trúc hệ vòng xanthone nằm trên một mặt phẳng và có hai mặt trên và dưới khác nhau. Hai nhóm prenyl và vòng polycyclic nằm 131 ở phía trên, tạo nên phía kỵ nước (hydrophobic face), còn nhóm acid cacboxylic và nhóm carbonyl của hệ vòng polycyclic nằm phía dưới tạo nên phía ưa nước (hydrophilic face) (hình 4.89). Các kết quả về việc chuyển hóa nhóm cacboxylic đã gợi ý rằng phía mặt phẳng hydrophilic không đóng vai trò quan trọng trong sự gắn kết với đích sinh học của nó. Nhóm cacboxyl -COOH có thể chuyển hóa về các dạng nhóm chức khác như ester, amide hay nhóm mang tính base khác mà không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính apoptosis [184]. Các nghiên cứu về hoạt tính-cấu trúc (SAR) của GA đã chỉ ra tầm quan trọng của nối đôi trên vòng D (liên hợp với nhóm C=O của vòng C) đối với hoạt tính [171]. Các dẫn xuất tạo ra từ sự chuyển hóa nhóm 6-OH (vòng B) như methyl hay acyl hóa có hoạt tính tương tự như chất đầu. Vì thế nhóm 6-OH này cũng không đóng vai trò quyết định đối với hoạt tính. Từ các kết quả phân tích SAR của GA nói trên, chúng tôi lựa chọn tổng hợp một số dẫn xuất của GA bằng cách chuyển hóa nhóm acid cacboxylic về dạng ester và amide với mục đích giữ nguyên các phần cấu trúc có hoạt tính của GA. Các phản ứng chuyển hóa sử dụng hệ xúc tác DCC/DMAP để hoạt hóa nhóm acid. Các dẫn xuất sau khi tổng hợp được đem thử hoạt tính gây độc tế bào nhằm tìm ra các dẫn xuất có hoạt tính cao đồng thời làm sáng tỏ mối quan hệ của các phần cấu trúc còn lại của GA với hoạt tính. 4.3.3. Kết quả tổng hợp các dẫn xuất Việc chuyển hoá nhóm COOH của GA được thực hiện theo sơ đồ hình 3.4. Cấu trúc của các sản phẩm và hiệu suất phản ứng được trình bày trong bảng 4.26. Bảng 4.26. Cấu trúc các sản phẩm và hiệu suất phản ứng Ký hiệu Tên hợp chất R Hiệu suất (%) Trạng thái vật lý Khối lượng (mg) Ghi chú GA1 Methyl gambogate -OCH3 91 Dầu, màu vàng 220 GA2 Ethyl gambogate -OC2H5 75 Dầu, màu vàng 175 GA3 N,N-diallyl gambogamide N 70 Dầu, màu vàng 250 Hợp chất mới GA4 N-piperidinyl gambogamide N 84 Dầu, màu vàng 233 GA5 N-morpholinyl gambogamide NO 79 Dầu, màu vàng 189 Hợp chất mới GA6 1-(4- trifluoromethylbenzene- piperazinyl)-gambogamide NN CF3 51 Dầu, màu vàng 140 Hợp chất mới 132 GA7 1-(2,5- difluorobenzyl)piperazinyl- gambogamide N N F F 68 Dầu, màu vàng 126 Hợp chất mới GA8 N-(2-thiophen-2- yl)ethylgambogamide S NH 15 Dầu, màu vàng 52 Hợp chất mới Bằng việc tham khảo tài liệu [200], cơ chế tổng quát của phản ứng ester/amide hóa với hệ xúc tác DCC/DMAP được trình bày trong hình 4.90, trong đó GA được viết đơn giản là R’COOH: R' C O O H N N R' C O O N NH N C N R' C O O C N N N NH R' C O O C N N H A H R' C O AR'' H O C N N H R' C O R'' A O C HN N H (A= O, N) (DMAP) - DMAP + R'' (DCC) Hình 4.90. Cơ chế của phản ứng ester hóa và amide hóa Cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp được xác định bằng phổ NMR một chiều và hai chiều. Các hợp chất sạch GA1-GA5 đã được đo phổ khối phân giải cao. 4.3.3.1. Hợp chất GA1: Methyl gambogate 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1416 17 18 19 20 21 22 25 26 28 29 24 23 27 O O OH O O O 34 35 33 32 31 30 40 39 38 37 36 H3CO O Hình 4.91. Cấu trúc hóa học của hợp chất GA1 Trên phổ khối phân giải cao HRESIMS của GA1 xuất hiện pic ion phân tử natri hóa [M+Na]+ tại m/z 665,3076 (tính toán lý thuyết cho CTPT C39H46O8 Na là 665,3090). Do đó công thức phân tử của GA1 được xác định là C39H46O8, nhiều hơn một nhóm -CH2 so với GA (CTPT C38H44O8). 133 Phổ 1H NMR của hợp chất GA1 có các tín hiệu đặc trưng của khung xanthone lồng với độ dịch chuyển của các proton gần như không thay đổi so với GA (GH1). Trên phổ 1H NMR vẫn xuất hiện tín hiệu singlet của proton nhóm hydroxy 6-OH tại δH 12,84, chứng tỏ nhóm 6-OH không bị ete hóa. Tuy nhiên, sự xuất hiện thêm tín hiệu của một nhóm methoxy dạng singlet tại δH 3,43 (3H; s; OCH3) chứng tỏ nhóm cacboxyl của GA đã bị ester hóa. Hình 4.92. Phổ 1H NMR của hợp chất GA1 Dựa vào kết quả phân tích phổ 1H NMR và HRESIMS của hợp chất GA1, kết quả so sánh dữ liệu phổ của GA1 với acid gambogic (GH1) và tham khảo tài liệu [29], chúng tôi kết luận GA1 chính là ester methyl gambogate. 4.3.3.2. Hợp chất GA2: Ethyl gambogate Trên phổ HRESIMS của hợp chất GA2 cho pic ion phân tử natri hóa [M+Na]+ tại m/z 679,3232 (tính toán lý thuyết cho CTPT C40H48O8Na là 679,3247). Do đó, CTPT của GA2 được xác định là C40H48O8, nhiều hơn GA hai nhóm -CH2. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1416 17 18 19 21 22 26 28 24 23 27 O O OH O O O 34 35 33 32 31 O O Hình 4.93. Cấu trúc hóa học của hợp chất GA2 Phổ NMR của hợp chất GA2 cũng xuất hiện các tín hiệu proton và cacbon với độ chuyển dịch hầu như không thay đổi so với GA. Tuy nhiên, phổ NMR của GA2 xuất hiện thêm hai tín hiệu của một nhóm methylen liên kết với oxygen tại δH 3,89 (2H; m)/ δC 60,1 và một nhóm methyl tại δH 1,09 (3H; t; 7,0)/ δC 14,0. Ngoài ra còn có sự tách tín hiệu của proton H-26 thành 2 pic tại δH 3,02 (1H; dd; 14,5; 5,0); 2,92 (1H; dd; 16,5; 7,0)/ δC 29,1 so với tín hiệu tại δH 2,95 (2H; d; 7,0)/ δC 29,3 và 2,98 (2H; d; 7,0) lần lượt trên 134 phổ của GH1 và GA1. Sự tách tín hiệu này có thể do ảnh hưởng hiệu ứng không gian của nhóm -OC2H5 cồng kềnh hơn nhóm -OH và -OCH3. Trên phổ 13C NMR của GA2 cũng quan sát thấy sự chuyển dịch về phía trường cao hơn của C-27 (GH1: δC 137,8; GA2: δC 122,3) và sự dịch về phía trường thấp hơn của C-28 (GH1: δC 127,8; GA2: δC 135,1). Điều này có thể giải thích là do nhóm -OC2H5 có thể có hiệu ứng +C mạnh hơn so với nhóm -OH, làm giảm sự liên hợp của liên kết đôi C27=C28 với nhóm cacbonyl C=O, kết quả là độ chuyển dịch hóa học của hai cacbon này bị thay đổi. Đây cũng có thể coi là một dấu hiệu cho thấy nhóm cacboxyl của GA đã bị chuyển hóa. Các dữ liệu phổ NMR của GA2 chứng tỏ GA đã bị ethyl ester hóa ở nhóm cacboxyl. Hình 4.94. Phổ 1H NMR của hợp chất GA2 Hình 4.95. Phổ 13C NMR của hợp chất GA2 Dựa vào kết quả phân tích phổ NMR và HRESIMS của GA2, kết hợp so sánh với hợp chất GH1, chúng tôi kết luận hợp chất GA2 chính là ester ethyl gambogate. 4.3.3.3. Hợp chất GA3: N,N-diallyl gambogamide 135 Trên phổ HRESIMS của hợp chất GA3 xuất hiện pic phân tử proton hóa [M+H]+ tại m/z 708,3883 (tính toán cho CTPT C44H54NO7 là 708,3900). Do đó, CTPT của hợp chất GA3 là C44H53NO7. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1416 17 18 19 20 21 22 25 26 28 29 24 23 27 O O OH O O O 34 35 33 32 31 30 40 39 38 37 36 O N Hình 4.96. Cấu trúc hóa học của hợp chất GA3 Phổ 1H, 13C NMR và HSQC của GA3 cho thấy các tín hiệu proton và cacbon tương ứng với nhóm allyl tại δH 5,61 (2H; m)/ δC 133,6; 132,8 (2CH= allyl); δH 5,09- 5,02 (4H; m)/ δC 117,6 (2CH2= allyl); δH 3,88 (2H; m)/ δC 45,5 (CH2 allyl); δH 3,71; 3,61 (2H; dd; 16,0; 5,5)/ δC 49,5 (CH2 allyl). Kết quả phân tích trên phổ COSY không cho thấy tương tác nào của các proton allyl với các proton của GA. Hình 4.97. Phổ 1H NMR của hợp chất GA3 Hình 4.98. Phổ 13C NMR của hợp chất GA3 Độ chuyển dịch hóa học proton và cacbon của các vị trí khác trong khung chất của GA gần như không thay đổi. Tuy nhiên có một số thay đổi liên quan đến proton và cacbon ở vị trí 26, 27, 28. Cụ thể: tín hiệu proton H-26 bị tách thành hai pic tại δH 136 2,22 (1H; dd; 15,0; 6,0); 2,42 (1H; dd; 15,0; 7,0); tín hiệu proton H-26, -27 bị dịch về trường cao hơn so với GA (GH1: δH 2,95 (H-26), δH 6,09 (H-27); GA3: δH 2,42; 2,22 (H-26), δH 5,43 (H-27)); tín hiệu cacbon C-27 (δC 122,3) dịch chuyển về phía trường cao hơn, trong khi C-28 (δC 133,9) bị dịch chuyển về trường thấp hơn (GH1: δC 137,8 (C-27), δC 127,8 (C-28); GA3: δC 122,3 (C-27), δC 133,8 (C-28)). Kết quả sự tách tín hiệu của H-26 và sự dịch chuyển tín hiệu proton H-26 và H- 27 về phía trường cao hơn có thể được giải thích do sự chắn từ xa của nguyên tử N có mật độ electron lớn khi hai liên kết đôi liên hợp C=C và C=O tồn tại ở cấu dạng S-trans và do cấu trúc cồng kềnh của diallyl amine. Điều này có thể là do liên kết đôi C27=C28 có cấu hình cis như tài liệu [198]. Khi đó hai proton H-26 có thể nằm ở vị trí khác nhau trong không gian so với nguyên tử N nên chúng không còn là proton tương đương, kết quả cho hai tín hiệu trên phổ 1H NMR. Sự tách tín hiệu cũng xảy ra đối với ester ethyl gambogate nhưng không xảy ra với methyl gambogate. Kết quả sự dịch chuyển của C-27 và C-28 có thể giải thích do nguyên tử N có mật độ electron lớn, có thể gây hiệu ứng liên hợp với liên kết C=O làm cho sự liên hợp của hai liên kết đôi C27=C28 và C=O giảm. Sự biến đổi của các tín hiệu chỉ ra ở trên có thể coi là những tín hiệu đặc trưng chứng tỏ GA đã bị ester hóa hoặc amide hóa. Dựa vào kết quả phân tích phổ NMR và HRESIMS, chúng tôi xác định GA đã bị amide hóa, sản phẩm GA3 thu được là N,N-diallylgambogamide. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được tổng hợp. 4.3.3.4. Hợp chất GA4: N-piperidinylgambogamide 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1416 17 18 19 20 21 22 25 26 28 29 24 23 27 O O OH O O O 34 35 33 32 31 30 40 39 38 37 36 O N Hình 4.99. Cấu trúc hóa học của hợp chất GA4 Trên phổ HRESIMS của hợp chất GA4 xuất hiện tín hiệu của phân tử proton hóa [M+H]+ tại m/z 696,3888 (tính toán lý thuyết cho CTPT C43H54NO7 là 696,3900). Do đó, CTPT của GA4 được xác định là C43H53NO7. Trên phổ 1H, 13C NMR và HSQC của GA4 ngoài các tín hiệu proton và cacbon của khung acid gambogic còn thấy xuất hiện thêm các tín hiệu proton và cacbon của vòng piperidine tại δH 3,53 (1H; m); 3,36 (1H; m)/ δC 41,8 (CH2-N); δH 3,11 (2H; t; 5,0)/ δC 46,9 (CH2-N); δH 1,53 (2H; m)/ δC 24,6 (CH2-CH2-N); δH 1,33-1,38 (4H; m)/ 137 δC 25,5; 26,8 (CH2-CH2-N; CH2-CH2-CH2-N). Ngoài ra, cũng tương tự như phổ của GA3, trên phổ của GA4 cũng xuất hiện một số tín hiệu khác với acid gambogic GH1 đặc trưng cho sự amide hóa, đó là: sự tách thành hai tín hiệu của hai proton H-26 (δH 2,42; 2,22); sự chuyển dịch về phía trường cao hơn của H-26 và H-27 (δH 5,39); sự chuyển dịch về phía trường cao của C-27 và sự chuyển dịch về phía trường thấp của C-28 tại δC lần lượt là 121,5 và 133,1. Hình 4.100. Phổ 1H NMR của hợp chất GA4 Hình 4.101. Phổ 13C NMR của hợp chất GA4 Các kết quả phân tích phổ NMR của GA4 chứng tỏ GA đã bị amide hóa, cấu hình của liên kết C27-C28 trong GA và GA4 là cấu hình cis và cấu dạng của liên kết C=C và C=O là S-trans. Dựa vào kết quả phân tích phổ NMR và HRESIMS, chúng tôi kết luận GA4 chính là N-piperidinylgambogamide. 4.3.3.5. Hợp chất GA5: N-morpholinyl gambogamide 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1416 17 18 19 20 21 22 25 26 28 29 24 23 27 O O OH O O O 34 35 33 32 31 30 40 39 38 37 36 O N O 138 Hình 4.102. Cấu trúc hóa học của hợp chất GA5 Trên phổ HRESIMS của hợp chất GA5 xuất hiện pic phân tử proton hóa [M+H]+ tại m/z 698,6393 (tính toán lý thuyết cho CTPT C42H52NO8 là 698,3693). Do đó, CTPT của hợp chất GA5 là C42H51NO8. Trên phổ 1H NMR của GA5 ta thấy có xuất hiện thêm tín hiệu proton gắn với cacbon liên kết với oxygen hoặc nitrogen tại δH 3,62-3,21 (8H; m; 4CH2 morpholine). Trên phổ 13C NMR của GA5 cũng xuất hiện thêm tín hiệu của hai cacbon sp3 liên kết với oxygen tại δC 67,2; 66,8 (2CH2-O morpholine) và hai cacbon sp3 liên kết với nitrogen tại δC 46,3 (CH2-N); 41,3 (CH2-N). Tương tự hai dẫn xuất amide GA3 và GA4, trên phổ của hợp chất GA5 cũng xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho sự amide hóa, đó là sự tách thành hai tín hiệu của proton H-26 tại δH 2,39 (1H; dd; 15,0; 6,0); 2,25 (1H; dd; 15,0; 7,0); đó là sự dịch chuyển về phía trường cao của cacbon C-27 và sự dịch về phía trường thấp của C-28 so với GA (δC 122,2 (C-27), δC 133,2 (C-28)). Hình 4.103. Phổ 1H NMR của hợp chất GA5 139 Hình 4.104. Phổ 13C NMR của hợp chất GA5 Căn cứ vào kết quả phân tích phổ NMR và HRESIMS của GA5, chúng tôi kết luận GA5 chính là N-morpholine gambogamide. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên tổng hợp được. 4.3.3.6. Hợp chất GA6: 1-(4-trifluoromethylbenzene-piperazinyl)-gambogamide 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1416 17 18 19 20 21 22 25 26 28 29 24 23 27 O O OH O O O 34 35 33 32 31 30 40 39 38 37 36 O N N CF3 Hình 4.105. Cấu trúc hóa học của hợp chất GA6 Kết quả đo phổ HRESIMS của GA6 thu được pic phân tử proton hóa [M+H]+ là 841,4016 (tính toán lý thuyết cho CTPT C49H56F3N2O7 là 841,9733). Do đó, CTPT của GA6 là C49H55F3N2O7. Trên phổ 1H và 13C NMR của hợp chất GA6 xuất hiện các tín hiệu proton và cacbon đặc trưng của acid gambogic. Tuy nhiên, phổ NMR và HSQC của GA6 xuất hiện tín hiệu của 4 nhóm CH thơm thuộc nhóm 1-(4-trifluoromethyl-phenyl)- piperazinyl tại δH 7,49 (2H; d; 9,0)/ δC 126,52; 126,49; δH 6,89 (2H; d; 9,0)/ δC 115,2. Tín hiệu cacbon thơm bậc 4 liên kết với nitrogen xuất hiện tại δC 152,9. Tín hiệu của cacbon nhóm CF3 và cacbon thơm liên kết với nhóm này không quan sát thấy trên phổ 13C NMR. Các tín hiệu proton và cacbon của 4 nhóm CH2 trong vòng piperazine quan sát được trên phổ NMR và HSQC tại các độ dịch chuyển δH 3,74 (1H; m); 3,59 (1H; m)/ δC 40,6 (CH2 piperazine); 3,35-3,05 (6H; m)/ δC 49,0; 49,0; 48,0 (3CH2 piperazine). 140 Hình 4.106. Phổ 1H NMR của hợp chất GA6 Hình 4.107. Phổ 13C NMR của hợp chất GA6 Trên phổ COSY của GA6, ngoài các hệ spin đặc trưng của GA, dễ dàng nhận ra sự xuất hiện của hai hệ spin mới do các tương tác giữa proton tại δH 7,49 với proton tại δH 6,89 và tương tác của các proton tại δH 3,74-3,05 với nhau. Các dữ liệu trên chứng tỏ đã xuất hiện nhóm 1-(4-trifluoromethyl-phenyl)- piperazinyl trong cấu trúc của hợp chất GA6, khẳng định sản phẩm amide đã được tạo thành. Ngoài ra trên phổ NMR của GA6 cũng xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho sự amide hóa của nhóm cacboxyl trong GA, đó là sự tách thành hai tín hiệu của H- 26; sự dịch chuyển về phía trường cao hơn của H-26 và H-27; sự dịch về phía trường cao của C-27 và sự dịch về trường thấp hơn của C-28. Căn cứ vào dữ liệu phổ NMR và HRESIMS chúng tôi kết luận hợp chất GA6 chính là 1(4-trifluoromethylbenzenepiperazinyl)gambogamide. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên tổng hợp được. 4.3.3.7. Hợp chất GA7: 1-(2,5-difluorobenzyl)piperazinyl-gambogamide 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1416 17 18 19 20 21 22 25 26 28 29 24 23 27 O O OH O O O 34 35 33 32 31 30 40 39 38 37 36 O N N F F Hình 4.108. Cấu trúc hóa học của hợp chất GA7 Phổ 1H và 13C NMR của hợp chất GA7 có các tín hiệu đặc trưng của acid gambogic. Ngoài ra, tại vùng trường thấp trên phổ NMR cũng thấy xuất hiện thêm tín hiệu của các proton thơm của vòng benzen trong nhóm 1-(2,5- 141 difluorobenzyl)piperazinyl tại δH 7,14 (m; 1H; CH aromatic); 6,99 (m; 1H; CH thơm) và 6,95 (m; 1H; CH thơm). Tín hiệu của 4 nhóm methylen thuộc nhóm 1-(2,5- difluorobenzyl)piperazinyl cũng xuất hiện trên phổ NMR tại δH 3,80; 3,67 (2x1H; m; CH2 piperazine); 3,35-3,17 (6H; m; CH2 piperazine). Tín hiệu của một nhóm CH2 liên kết với N và vòng thơm có dạng singlet xuất hiện ở δH 3,51 (2H; s; CH2-N). Hình 4.109. Phổ 1H NMR của hợp chất GA7 Hình 4.110. Phổ 13C NMR của hợp chất GA7 Trên phổ 13C NMR của GA7, ngoài các tín hiệu cacbon của khung acid gambogic cũng xuất hiện các tín hiệu của sáu cacbon thơm tại δC 159,7; 156,3; 126,4; 117,1; 116,2; 115,0 và tín hiệu của bốn cacbon sp3 liên kết với nitrogen tại δC 46,1; 45,8; 40,9; 40,8. Ngoài ra trên phổ NMR của GA7 cũng xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho sự amide hóa của nhóm cacboxyl trong GA, đó là sự tách thành hai tín hiệu của H-26; sự dịch chuyển về phía trường cao hơn của H-26 và H-27; sự dịch về phía trường cao của C-27 và sự dịch về trường thấp hơn của C-28. Các dữ kiện trên chứng tỏ đã xuất hiện nhóm 1-(2,5-difluorobenzyl) piperazinyl trong cấu trúc của hợp chất GA7, khẳng định sản phẩm amide đã được 142 tạo thành. Kết quả phân tích phổ NMR của hợp chất GA7 và so sánh với dữ kiện phổ của GH1 và GA6 cho thấy hợp chất GA7 chính là 1-(2,5-difluorobenzyl)- piperazinylgambogamide. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên tổng hợp được. 4.3.3.8. Hợp chất GA8: N-(2-thiophen-2-yl)ethylgambogamide 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1416 17 18 19 20 21 22 25 26 28 29 24 23 27 O O OH O O O 34 35 33 32 31 30 40 39 38 37 36 O HN S Hình 4.111. Cấu trúc hóa học của hợp chất GA8 Hình 4.112. Phổ 1H NMR của hợp chất GA8 Tại vùng trường thấp trên phổ 1H NMR của hợp chất GA8 ngoài các tín hiệu proton đặc trưng của acid gambogic, còn xuất hiện các tín hiệu proton thơm của vòng thiophen tại δH 7,06 (m; 1H; CH thiophene); 6,85 (m; 1H; CH thiophene); 6,75 (m; 1H; CH thiophene). Trên phổ 1H NMR cũng xuất hiện tín hiệu của một nhóm methylen liên kết với nitrogen tại δH 3,40 (2H; m; CH2-N) và tín hiệu của một nhóm methylen tại δH 2,94 (2H; m; CH2-CH2-N). Ngoài ra, tín hiệu của proton methylen H- 26 bị tách thành hai tín hiệu xuất hiện tại δH 2,55 (1H; dd; 15,5; 8,0) và 2,40 (1H; dd; 15,5; 8,5). Các dữ liệu trên chứng tỏ đã xuất hiện nhóm (2-thiophen-2-yl)ethyl trong cấu trúc của hợp chất GA8, khẳng định sản phẩm amide đã được tạo thành. Dữ liệu phổ 1H NMR đã chỉ ra GA8 chính là N-(2-thiophen-2-yl)ethylgambogamide. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên tổng hợp được. 4.4. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học của các chất phân lập và các dẫn xuất tổng hợp được 143 4.4.1. Hoạt tính chống oxygen hóa ABTS và DPPH Các hợp chất GC7-GC17, GH1-GH8 đã được thử nghiệm hoạt tính chống oxygen hóa theo hai phương pháp là ABTS và DPPH với chứng dương được sử dụng là acid ascorbic và trolox. Kết quả giá trị IC50 (nồng độ làm giảm 50% gốc tự do ABTS.+ hoặc nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của DPPH) được trình bày trong bảng 4.27. Bảng 4.27. Giá trị IC50 của các hợp chất GC1-GC18 Hợp chất IC50 (µM) Hợp chất IC50 (µM) ABTS DPPH ABTS DPPH GC7 - - GH1 - - GC8 - - GH2 - - GC9 - - GH3 - - GC10 - - GH4 - - GC11 - 621,32±56,61 GH5 - - GC12 - 20,39±1,92 GH6 - - GC13 74,45±8,89 70,98±3,55 GH7 - - GC14 167,11±14,83 692,08±38,34 GH8 - - GC15 64,56±4,51 269,21±13,04 Acid ascorbic 82,38 ± 8,97 55,35 ± 5,22 GC16 105,72±12,91 384,80±23,12 Trolox 22,05±1,64 24,25±0,72 GC17 - 639,74±38,46 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxygen hóa cho thấy các hợp chất GC13- GC16 thể hiện hoạt tính theo cả hai phương pháp ABTS và DPPH; các hợp chất GC11, GC12 và GC17 chỉ thể hiện hoạt tính theo phương pháp DPPH, các chất còn lại không thể hiện hoạt tính chống oxygen hóa tại nồng độ nghiên cứu. Trong số các chất thể hiện hoạt tính, hợp chất GC12 thể hiện hoạt tính mạnh theo phương pháp DPPH với giá trị IC50 là 20,39 µM nhỏ hơn giá trị IC50 của chất chứng dương trolox (IC50 24,25 µM) và chưa bằng ½ giá trị IC50 của acid ascorbic. Theo phương pháp ABTS, hai hợp chất GC13 và GC15 thể hiện hoạt tính chống oxygen hóa mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 74,45 và 64,56 µM, nhỏ hơn so với giá trị IC50 của acid ascorbic. 4.4.2. Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase Các hợp chất chứa hai nhóm thế prenyl hoặc geranyl GC12-GC17 đã được thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase với chất chứng dương acarbose. Bảng 4.28. Giá trị IC50 ức chế enzym α-glucosidase của các hợp chất GC12-GC17 Hợp chất % ức chế tại các nồng độ (µg/mL) IC50 (µM) 128 32 8 2 GC12 24 14 4 0 - GC13 86 72 50 48 17,23±0,32 144 GC14 85 77 35 26 33,53±0,93 GC15 13 11 8 4 - GC16 80 35 15 0 149,47±2,8 GC17 12 10 6 4 - Acarbose 257,32±4,80 Kết quả cho thấy hợp chất GC13-GC14 và GC17 thể hiện hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase rất mạnh với giá trị IC50 nhỏ hơn nhiều so với chứng dương acarbose. Hợp chất GC13 và GC14 thể hiện hoạt tính rất mạnh, IC50 lần lượt chỉ bằng 6,7% và 13,0% giá trị IC50 của acarbose (IC50 257,32), hứa hẹn đây là những chất chống tiểu đường tiềm năng. Hợp chất GC16 cũng thể hiện hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase mạnh với giá trị IC50 bằng khoảng 60% giá trị IC50 của acarbose. Điểm chung của các hợp chất có hoạt tính là có chứa 1-2 nhóm thế prenyl hoặc geranyl không bị oxygen hóa. Các hợp chất chứa cả hai nhóm thế prenyl hoặc geranyl bị hydroxy hóa không thể hiện hoạt tính. Hợp chất GC13, chứa một nhóm prenyl và một nhóm geranyl không bị oxygen hóa và là hợp chất duy nhất không chứa nhóm methoxy ở C-7, thể hiện hoạt tính mạnh nhất. Trong khi đó, hợp chất GC12 có cấu trúc hoàn toàn giống với hợp chất GC13, chỉ khác một nhóm methoxy ở vị trí C-7 lại không thể hiện hoạt tính. Điều này chứng tỏ nhóm hydroxy gắn với khung xanthone đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase. 4.4.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro 4.4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chất phân lập được Các hợp chất GC1-GC18 phân lập từ cây G. cowa và GH1-GH8 phân lập từ cây G. hanburyi đã được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên hai dòng tế bào ung thư là dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 và dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa theo phương pháp MTT. Kết quả tính toán giá trị IC50 của các hợp chất được trình bày trong bảng 4.28. Bảng 4.29. Giá trị IC50 của các hợp chất GC1-GC18, GH1-GH8 Hợp chất IC50 (µM) Hợp chất IC50 (µM) HT-29 HeLa HT-29 HeLa Các hợp chất từ cây G. cowa GC1 49,49 104,42 GC10 45,20 39,30 GC2 83,98 46,55 GC11 6,66 7,85 GC3 - - GC12 2,80 16,58 GC4 - - GC13 3,49 13,46 GC5 127,36 147,33 GC14 2,41 42,06 GC6 64,23 117,48 GC15 1,60 81,84 GC7 - - GC16 3,90 11,96 GC8 56,29 - GC17 9,62 45,86 145 GC9 - - GC18 - - Các hợp chất từ cây G. hanburyi GH1 0,79 0,99 GH5 4,48 3,58 GH2 5,76 10,99 GH6 4,01 47,38 GH3 15,54 17,52 GH7 4,32 6,88 GH4 4,57 2,89 GH8 0,95 10,43 Doxorubicin 0,21 1,46 Kết quả cho thấy các hợp chất phân lập được từ nhựa cây G. cowa thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào HT-29 cao hơn so với dòng tế bào HeLa. Các hợp chất GC11, GC13 và GC16 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh trên dòng tế bào HeLa với giá trị IC50 trong khoảng 7,85-13,46 µM. Năm hợp chất GC12-GC16 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 với giá trị IC50 1,60-3,90 µM, trong đó hợp chất GC15 thể hiện hoạt tính mạnh nhất với IC50 1,60 µM. Điểm chung của các hợp chất này là chúng đều chứa 1-2 nhóm prenyl/geranyl không no, có thể bị hydroxy hóa hoặc không bị hydroxy hóa. Điều này chứng tỏ nhóm prenyl/geranyl không no có thể đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính. Một điểm thú vị nữa là các xanthone không chứa nhóm methoxy ở C-7 (GC2-GC5) hầu như không thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên cả hai dòng tế bào ung thư nghiên cứu, so với hoạt tính mạnh của các xanthone chứa nhóm methoxy có cấu trúc tương tự (GC14-GC17). Điều này chứng tỏ nhóm 7-OCH3 này cũng đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính trên hai dòng tế bào trên. Các hợp chất GH1-GH8 đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh trên cả hai dòng tế bào HT-29 và HeLa với giá trị IC50 rất nhỏ, chỉ từ 0,79-17,52 µM (trừ hợp chất GH6 có IC50 trên dòng tế bào HeLa là 47,38 µM). Trong đó, hợp chất GH8 thể hiện hoạt tính rất mạnh trên dòng tế bào ung thư HT-29 với giá trị IC50 0,95 µM; các hợp chất GH4-GH5 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên dòng tế bào HeLa với IC50 lần lượt là 2,89 và 3,58 µM. Đặc biệt acid gambogic (GH1) thể hiện hoạt tính mạnh nhất trên cả hai dòng tế bào HT-29 và HeLa với giá trị IC50 lần lượt là 0,795 và 0,99 µM. Hoạt tính của GH1 trên dòng tế bào HeLa thậm chí còn mạnh hơn so với chất chứng dương doxorubicin (IC50 1,46 µM). 4.4.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các dẫn xuất của GA Acid gambogic (GH1) và các dẫn xuất GA1-GA9 được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên ba dòng tế bào ung thư ở người là gan (Hep-G2), phổi (LU-1) và 146 mô liên kết (RD) theo phương pháp SRB với chứng dương được sử dụng là ellipticine. Giá trị IC50 của các dẫn xuất được trình bày trong bảng 4.30. Kết quả cho thấy các dẫn xuất GA1-GA5, GA8 có hoạt tính mạnh tương đương hoặc mạnh hơn so với acid gambogic (GH1) và chứng dương ellipticine trên cả ba dòng tế bào ung thư Hep-G2, LU-1 và RD. Trong đó, trên dòng tế bào RD, các dẫn xuất GA1, GA4-GA5 có giá trị IC50 là 0,27-0,33 μM nhỏ hơn từ 39-50% so với giá trị IC50 của GH1; trên dòng tế bào Hep-G2, dẫn xuất GA5 có giá trị IC50 nhỏ hơn so với IC50 của GH1 là 38%; các dẫn xuất còn lại có IC50 nhỏ hơn so với giá trị của GH1 từ 15-22%. Riêng hai dẫn xuất GA6, GA7 có chứa với vòng piperazine gắn với nhân benzen flo hóa lại có hoạt tính yếu hơn GH1 trên cả ba dòng tế bào với giá trị IC50 lớn hơn từ 4-7 lần. Các dẫn xuất có hoạt tính tốt có thể được nghiên cứu tiếp tục để tìm ra những chất chống ung thư tiềm năng. Bảng 4.30. Giá trị IC50 của các hợp chất GA1-GA9 TT Ký hiệu mẫu Giá trị IC50 (M) Hep-G2 LU-1 RD 1 GA1 0,52 1,13 0,27 2 GA2 0,59 1,24 0,50 3 GA3 0,55 1,10 0,42 4 GA4 0,54 1,10 0,33 5 GA5 0,43 1,03 0,30 6 GA6 4,08 4,83 2,17 7 GA7 4,71 - 3,40 8 GA8 0,52 1,29 0,45 10 GH1 0,69 1,34 0,54 11 Ellipticine 0,97 1,26 0,77 Nhận xét: Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập và tổng hợp được cho thấy acid gambogic (GH1) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên cả 5 dòng tế bào ung thư nghiên cứu là HT-29, HeLa, Hep-G2, RD và LU-1 với giá trị IC50 lần lượt là 0,79; 0,99; 0,69; 0,54 và 1,34 μM (bảng 4.25- 4.27). Kết quả khảo sát thành phần hóa học của nhựa và thân cành cây G. hanburyi cũng cho thấy acid gambogic là thành phần chính, chiếm hàm lượng lớn nhất với khoảng 5% khối lượng của nhựa cây [126]. Những yếu tố này giúp acid gambogic (GH1) có thể được ứng dụng là một chất chống ung thư tiềm năng. 147 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận 1. Đã nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nhựa cây tai chua (G. cowa). Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học đã xác định cấu trúc 18 hợp chất, gồm 17 xanthone polyoxygen thế: cowaxanthone I-K (GC1-GC3), norcowanol A-B (GC4-GC5), garcinone F (GC6), fuscaxanthone A (GC7), 7-O- methylgarcinone E (GC8), cowagarcinone A (GC9), cowaxanthone (GC10), rubraxanthone (GC11), cowanin (GC12), norcowanin (GC13), cowanol (GC14), kaennacowanol A (GC15), garcinone D (GC16), fuscaxanthone I (GC17) và 01 hợp chất tocotrienol: parvifoliol F (GC18). Trong đó, 06 hợp chất: cowaxanthone I-K, norcowanol A-B, garcinone F (GC1-GC6) được xác định là các hợp chất mới, 03 hợp chất: garcinone D, fuscaxanthone I, parvifoliol F (GC16-GC18) được xác định lần đầu tiên phân lập từ cây G. cowa. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy các hợp chất GC12, GC13 và GC15 thể hiện hoạt tính chống oxygen hóa mạnh, trong đó giá trị IC50 của hợp chất GC12 theo phương pháp DPPH là 20,39 µM nhỏ hơn giá trị IC50 của trolox (IC50 24,25 µM) và chưa bằng 1/2 lần giá trị IC50 của acid ascorbic (IC50 55,35 µM). Các hợp chất GC12-GC16 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 với giá trị IC50 1,6-3,90 µM. Các hợp chất GC13-GC14 thể hiện hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase rất mạnh với giá trị IC50 17,23-33,53 µM chỉ bằng khoảng 1/10 giá trị IC50 của chất chứng dương acarbose. 2. Đã nghiên cứu thành phần hóa học của nhựa và thân cành cây đằng hoàng (G. hanburyi). Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học đã xác định cấu trúc 08 xanthone lồng, gồm acid gambogic (GH1), acid isogambogic (GH2), acid morellic (GH3), acid isomorellic (GH4), isomorellin (GH5), desoxymorellin (GH6), isomoreollin B (GH7) và acid 10α-butoxygambogic (GH8). Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy hợp chất GH8 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất trên dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 với giá trị IC50 0,95 µM. Đặc biệt acid gambogic (GH1) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên 5 dòng tế bào nghiên cứu gồm ung thư đại trực tràng (HT-29), cổ tử cung (HeLa), gan (Hep-G2), mô liên kết (RD) và phổi (LU-1) với giá trị IC50 rất nhỏ, chỉ từ 0,35-1,34 μM. 148 3. Đã khảo sát một số tính chất động học phân tử của GA phân lập từ nhựa cây đằng hoàng (G. hanburyi) bằng các phương pháp thực nghiệm DSC và BDS kết hợp với các phương trình và phần mềm lý thuyết VFT, ECNLE. Kết quả thu được nhiệt độ chuyển gương của GA là Tg = 338 K với tốc độ gia nhiệt 10 K/phút, thời gian ổn định động học là 2,31.109 ngày và độ giòn vật liệu mp = 103. Điều này cho thấy GA đáp ứng được các tiêu chuẩn của các hoạt chất có tiềm năng ứng dụng trong thực tế, làm cơ sở để nghiên cứu chuyển hóa acid gambogic. Kết quả chuyển hóa acid gambogic đã thu được 08 dẫn xuất, trong đó có 02 dẫn xuất ester là methyl gambogate (GA1), ethyl gambogate (GA2) và 06 dẫn xuất amide là N,N-diallylgambogamide (GA3), N-piperidinylgambogamide (GA4), N-morpholinegambogamide (GA5), 1(4-trifluoromethylbenzene-piperazinyl)gambogamide (GA6), 1-(2,5- difluorobenzyl)piperazinylgambogamide (GA7) và N-(2-thiophen-2- yl)ethylgambogamide (GA8). Trong đó 05 dẫn xuất N,N-diallylgambogamide (GA3), N-morpholinegambogamide (GA5), 1(4-trifluoromethylbenzene- piperazinyl)gambogamide (GA6), 1-(2,5-difluorobenzyl)piperazinylgambogamide (GA7) và N-(2-thiophen-2-yl)ethylgambogamide (GA8) là các hợp chất mới. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy các dẫn xuất GA1-GA8 đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh trên ba dòng tế bào ung thư gan (Hep- G2), phổi (LU-1) và mô liên kết (RD). Trong đó các dẫn xuất GA1-GA5, GA8 có hoạt tính mạnh hơn so với acid gambogic trên cả ba dòng tế bào ung thư nghiên cứu với giá trị IC50 nhỏ hơn từ 15-50% so với IC50 của acid gambogic. 2. Kiến nghị Từ các kết quả nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài thực vật là cây tai chua (G. cowa) và cây đằng hoàng (G. hanburyi) có thể thấy hai loài thực vật này có nhiều tiềm năng trong việc phát hiện các hợp chất mới hoặc các hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng, đặc biệt là hoạt tính gây độc tế bào ung thư. Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu hai loài thực vật này nhằm phát hiện các hợp chất có cấu trúc mới độc đáo hoặc các hoạt tính sinh học tiềm năng. Acid gambogic phân lập từ cây đằng hoàng thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quan trọng, đặc biệt là hoạt tính gây độc tế bào trên nhiều dòng tế bào ung thư. Vì vậy cần tiếp tục nghiên cứu chuyển hóa acid gambogic nhằm thu được các dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao hơn, độc tính thấp hơn chất đầu; đồng thời tiến hành các thử nghiệm hoạt tính sinh học sâu hơn để có thể hiểu cơ chế tác dụng của GA và các dẫn xuất nhằm ứng dụng trong các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh. 149 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN  Đã nghiên cứu thành phần hóa học của nhựa cây tai chua (G. cowa) thu ở Quỳ Châu, Nghệ An, Việt Nam. Kết quả đã phân lập và xác định cấu trúc 18 hợp chất, trong đó, 06 hợp chất cowaxanthone I-K (GC1-GC3), norcowanol A-B (GC4- GC5), garcinone F (GC6) được xác định là các hợp chất mới, 03 hợp chất garcinone D (GC16), fuscaxanthone I (GC17) và 01 hợp chất tocotrienol: parvifoliol F (GC18) được xác định lần đầu tiên phân lập từ cây G. cowa.  Đã nghiên cứu thành phần hóa học của nhựa và thân cành cây đằng hoàng (G. hanburyi) thu ở Phú Quốc, Kiên Giang. Kết quả đã phân lập và xác định cấu trúc 08 xanthone lồng.  Đã nghiên cứu tính chất động học và nhiệt động học của acid gambogic bằng các phương pháp thực nghiệm DSC và BDS kết hợp với các phương trình và phần mềm lý thuyết VFT, ECNLE. Kết quả thu được nhiệt độ chuyển gương của GA là Tg = 338 K với tốc độ gia nhiệt 10 K/phút, thời gian ổn định động học là 2,31.109 ngày và độ giòn vật liệu mp = 103.  Đã nghiên cứu chuyển hóa acid gambogic phân lập từ nhựa cây đằng hoàng (G. hanburyi). Kết quả đã tổng hợp được 08 dẫn xuất, trong đó N,N-diallylgambogamide (GA3), N-morpholinegambogamide (GA5), 1(4-trifluoromethylbenzene- piperazinyl)gambogamide (GA6), 1-(2,5-difluorobenzyl)piperazinylgambogamide (GA7) và N-(2-thiophen-2-yl)ethylgambogamide (GA8) là các dẫn xuất mới.  Đã khảo sát hoạt tính chống oxygen hóa của các hợp chất GC7-GC17 và GH1- GH8 theo hai phương pháp là ABTS và DPPH. Kết quả cho thấy các hợp chất GC12, GC13 và GC15 thể hiện hoạt tính chống oxygen hóa mạnh.  Đã khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các hợp chất GC12-GC17. Kết quả cho thấy các hợp chất GC13-GC14 thể hiện hoạt tính rất mạnh với giá trị IC50 17,23-33,53 µM chỉ bằng khoảng 1/10 giá trị IC50 của chất chứng dương acarbose.  Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập và chuyển hóa được trên một số dòng tế bào ung thư người, kết quả cho thấy: - Acid gambogic (GH1) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên 5 dòng tế bào nghiên cứu gồm ung thư đại trực tràng HT-29, cổ tử cung HeLa, gan Hep- G2, mô liên kết RD và phổi LU-1 với giá trị IC50 rất nhỏ, chỉ từ 0,35-1,34 μM. - Các hợp chất GC12-GC16 và GH8 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 với giá trị IC50 0,95-3,90 µM. - Các dẫn xuất GA1-GA8 đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh trên ba dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (LU-1) và mô liên kết (RD). 150 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 1. Anh D Phan, Tran Thi Thu Thuy, Nguyen Thi Kim An, Justyna Knapik- Kowalczuk, Marian Paluch, Katsunori Wakabayashi - Molecular relaxations in supercooled liquid and glassy states of amorphous gambogic acid: dielectric spectroscopy, calorimetry and theoretical approach. AIP Advances 2020, 10, 025128. DOI: 10.1063/1.5139101 (SCIE, Q2). 2. Thi Kim An Nguyen, Gyu Won Huh, Dai Quang Ngo, Quoc Long Pham, Jae Wook Lee and Thi Thu Thuy Tran - Antiproliferative xanthones from the latex of Garcinia cowa Roxb. Phytochemistry, 2020, submitted (SCIE, Q1). 3. Nguyen Thi Kim An, Ngo Dai Quang, Pham Quoc Long, Tran Thi Thu Thuy - Cytotoxic xanthoneoids from the sterm bark of G. hanburyi collected in Vietnam, Vietnam Journal of Science and Technology, 2020, 58(2), 133-142. DOI: 10.15625/2525-2518/58/2/14367. (ACI) 4. Nguyen Thi Kim An, Ngo Dai Quang, Pham Quoc Long, Tran Thi Thu Thuy - Polyprenylated caged xanthones from the resin of G. hanburyi growing in Vietnam, Journal of Chemistry, 2019, 57(4e3,4), 306-274. (ESCI) 5. Nguyễn Thị Kim An, Đinh Thị Hà, Trần Thị Thu Thủy - Phân lập hai xanthone tetraoxygen thế từ dịch chiết điclometan của nhựa cây Garcinia cowa và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của chúng. Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội, 2019, 52, 97-100. 6. Nguyen Thi Kim An, Dinh Thi Ha, Pham Quoc Long, Tran Thi Thu Thuy - Tetraoxygenated xanthones from the latex of Garcinia cowa growing in Viet Nam, Vietnam Journal of Science and Technology, 2018, 56(5): p, 560-566. DOI: 10.15625/2525-2518/56/5/11826. (ACI) 7. Nguyen Thi Kim An, Ngo Dai Quang, Pham Quoc Long, Tran Thi Thu Thuy – Cytotoxic compounds from the latex of Garcinia cowa, Vietnam Journal of Science and Technology, 2020, bản thảo gửi tạp chí. (ACI) 8. Đinh Thị Hà, Nguyễn Thị Kim An, Trần Thị Hồng Hà, Phạm Quốc Long, Trần Thị Thu Thủy - Bán tổng hợp và thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất acid gambogic. Tạp chí Hóa học, 2017, 55(5E34), 137-142. (ESCI). 9. Bằng độc quyền sáng chế: Phân lập acid gambogic từ nhựa cây Garcinia hanburyi và quy trình tổng hợp các dẫn xuất amide có hoạt tính gây độc tế bào của acid gambogic - Trần Thị Thu Thủy, Phạm Quốc Long, Đinh Thị Hà, Nguyễn Thị Kim An, Lê Tất Thành, Phạm Minh Quân. Chấp nhận đơn. 151 PHỤ LỤC 1 1