Luận án Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận axit poly γ-Glutamic và hướng ứng dụng trong thực phẩm

g γ-PGA trong sản phẩm nƣớc cam đục 30% dịch ép đã chứng tỏ khả năng thay thế của γ-PGA đối với các loại phụ gia khác nhƣ Xanthan gum, CMC, Agar... Không chỉ có chất lƣợng tốt nhƣ Xanthan gum, γ-PGA đƣợc đánh giá cao bởi tính chất của sản phẩm này khi dùng trong nƣớc cam, bởi γ-PGA có thể kết hợp chung với các ion Ca2+ đƣợc đƣa trong nƣớc cam nhằm mục đích bổ sung canxi cho ngƣời sử dụng. Khi ion Ca2+ đƣợc bổ sung vào nƣớc cam γ-PGA sẽ tạo phức và có khả năng dễ hấp thu hơn trong cơ thể khi sử dụng với các loại chất ổn định khác. Đây là một trong những tính chất ƣu việt của γ-PGA mà các loại chất ổn định khác không có đƣợc [46] 3.11. Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong cải thiện chất lƣợng giò Do đặc tính của giò là một sản phẩm đƣợc làm từ nguyên liệu chính là thịt heo ngay sau khi giết mổ, nên cấu trúc protein chƣa bị biến đổi. Giò ngon chỉ sử dụng thịt tƣơi và không sử dụng thêm chất phụ gia nào khác. Tuy nhiên trong thực tế sản xuất công nghiệp giò đƣợc sản xuất từ các loại thịt đã giết mổ tàng trữ trong kho lạnh và trong quá trình chế biến đƣợc bổ sung thêm các loại phụ gia khác nhƣ tinh bột, chất phụ gia thực phẩm... Để đánh giá mức độ ảnh hƣởng của các dạng phụ gia đến chất lƣợng giò, tiến hành nghiên cứu so sánh các mức độ ảnh hƣởng của các loại chất ổn định đến chất lƣợng giò. 103 3.11.1. Ảnh hƣởng của các loại phụ gia đến độ dẻo của khối thịt xay. Nghiên cứu này đƣợc dùng để đánh giá mức độ nhuyễn, độ dẻo của khối thịt khi sử dụng mỗi loại phụ gia. Các phụ gia đƣợc sử dụng trong nghiên cứu gồm γ-PGA, sodium tripolyphosphate (STPP), borac (hàn the), tinh bột biến tính (TBBT) và chitosan là những phụ gia đã đƣợc sử dụng và không đƣợc sử dụng trong ngành chế biến thực phẩm hiện nay. Các phụ gia đƣợc sử dụng mức giới hạn của Bộ Y tế cho phép và phụ gia bị cấm trong danh mục (hàn the) đƣợc sử dụng theo kinh nghiệm thực tế (0,1 – 0,5%) , mục đích của việc sử dụng phụ gia bị cấm này chỉ làm mẫu đối chứng, để so sánh đặc tính và để gợi mở ra những thay đổi trong việc sử dụng phụ gia an toàn trong thực phẩm. Sau khi thử nghiệm trên các khối thịt xay tiến hành đo độ nhớt của các mẫu nghiên cứu thu đƣợc kết quả trong đồ thị hình 3.36: Hình 3.36. Biểu đồ ảnh hƣởng của phụ gia tạo cấu trúc đến chất lƣợng khối thịt xay. Sự thay đổi của khối thịt xay trong quá trình làm giò khi bổ sung các phụ gia ổn định và tạo cấu trúc của giò thể hiện qua đồ thị cho thấy sự thay đổi rõ rệt nhất về độ nhớt, độ quánh là ở các mẫu sử dụng hàn the và stpp. Tiếp theo là sự thay đổi không đáng kể về độ dẻo quánh và độ nhớt ở các mẫu sử dụng γ-PGA, tinh bột biến tính và chitosan. Sự thay đổi này phần nào cũng đã cho ta thấy bƣớc đầu sự ảnh hƣởng của mỗi loại phụ gia, làm cơ sở để chỉ ra cho những ngƣời nghiên cứu phải sử dụng những công cụ, thiết bị gì khi thay đổi thành phần công thức. Tuy nhiên nghiên cứu này chƣa thể đánh giá đƣợc chất tạo cấu trúc nào là tốt, chỉ có thể đánh giá đƣợc khi sản phẩm đƣợc hoàn thiện đến công đoạn cuối cùng. Đánh giá về độ nhớt trong quá trình xay để thấy đƣợc sự ảnh hƣởng của độ nhớt đến quá trình chế biến giò, nếu độ nhớt khi xay lớn, đồng nghĩa với việc chế biến phức tạp, đòi hỏi, máy móc công suất cao, lãng phí nhiên liệu. 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 Đối chứng γ-PGA STPP TBBT Hàn the Chitosan Độ nhớt (cp) 104 3.11.2. Ảnh hƣởng của các loại phụ gia đến chất lƣợng của giò. 3.11.2.1. Đánh giá chất lượng giò qua thông số lực nén và lực cắt. Sự thay đổi về tính chất, cấu trúc của khối thịt xay trong quá trình làm giò đã phần nào đánh giá đƣợc mức độ ảnh hƣởng của các loại phụ gia đến quá trình chế biến thực phẩm. Tuy nhiên để phân tích đánh giá cấu trúc của sản phẩm cần đánh giá trên các mẫu sản phẩm cuối cùng. Các mẫu phụ gia đƣợc bổ sung vào các mẫu giò nghiên cứu sau đó đƣợc chế biến trong cùng một điều kiện (bao gói tiêu chuẩn, nhiệt độ, thời gian chế biến, thành phần phụ nhƣ nhau) các mẫu đƣợc bảo ôn và đem đi phân tích trên máy đo cấu trúc cho kết quả trong hình 3.37: Hình 3.37. Biểu đồ lực nén và lực cắt của giò thành phẩm Khi kết hợp giữa hai yếu tố lực nén và lực cắt lên sản phẩm giò có thể đánh giá đƣợc mức độ giòn, cứng của sản phẩm. Qua đồ thị hình 3.32 về lực nén (LN) và lực cắt (LC) của máy đo cấu trúc phân tích giò thành phẩm cho thấy lực nén của các mẫu có sử dụng Chitosan và γ-PGA là lớn nhất, đồng nghĩa với độ đàn hồi và độ cứng của giò thành phẩm là tốt nhất các mẫu có lực nén gần nhau là mẫu đối chứng, mẫu bổ sung hàn the và mẫu sử dụng stpp. Các mẫu này có lực nén trung bình từ 1200-1300g. Mẫu có lực nén thấp nhất là mẫu sử dụng tinh bột biến tính, lực nén đo đƣợc từ mẫu này phản ánh đúng bản chất của tinh bột khi bổ sung vào các sản phẩm giò. Mẫu bổ sung tinh bột tạo cho giò bở và cấu trúc bề mặt mịn kém xốp. Đồ thị lực cắt thể hiện độ dai, dẻo của sản phầm, lực cắt của các mẫu chứa chitosan (2318,2) và γ-PGA (2294,6) gần nhƣ nhau, mẫu sử dụng tinh bột biến tính vẫn là mẫu có lực cắt kém nhất (1364,2) sự liên kết rời rạc trong cấu trúc giò của mẫu tinh bột biến tính 0 200 400 600 800 1000 1200 0 500 1000 1500 2000 2500 Đối chứng Hàn the TBBT STPP γ-PGA Chitosan LN (g ) LC ( g) LN LC 105 ảnh hƣởng lớn đến việc tạo cấu trúc trong giò thành phẩm. Các mẫu sử dụng hàn the và stpp có lực cắt thấp hơn so với mẫu đối chứng, bởi hàn the và stpp đƣợc sử dụng trong thực phẩm chủ yếu để tăng độ giòn của sản phẩm, còn đối với mẫu giò trong nghiên cứu làm từ thịt lạnh đông nên việc cải thiện cấu trúc của giò bởi stpp và hàn the có ảnh hƣởng không đáng kể. Chỉ số lực cắt và lực nén là hai thông số thể hiện tính chất, đặc tính của sản phẩm giò, để đánh giá mức độ đồng nhất, độ đàn hồi về cấu trúc của giò tiến hành khảo sát lực cắt và lực nén khi các đầu đâm xuyên cách mẫu 15mm đối với đầu P/5S để đánh giá cƣờng lực gel đối với các mẫu khi sử dụng các loại phụ gia khác nhau, kết quả thể hiện trong hình 3.38 Hình 3.38. Biểu đồ đánh giá cƣờng lực gel của các mẫu sản phẩm giò Đánh giá mức độ đồng nhất, độ đàn hồi của khối giò khi lực nén ở một khoảng cách nhất định đi qua khối giò trong biểu đồ hình 3.38 cho thấy cƣờng lực gel lớn nhất ở mẫu có sử dụng chitosan thấp hơn nữa lần lƣợt là các mẫu chứa γ-PGA; STPP; Tinh bột biến tính và thấp nhất là hàn the và mẫu đối chứng. Qua phân tích về cƣờng lực gel một lần nữa khẳng định việc sử dụng chitosan và γ-PGA làm phụ gia ổn định cải thiện cấu trúc trong sản phẩm giò lụa là ƣu việt và an toàn. 3.11.2.2. Đánh giá chất lượng giò sử dụng các loại phụ gia tạo cấu trúc bằng phương pháp cảm quan Các mẫu giò sau khi đƣợc đánh giá qua phân tích lực nén, lực cắt đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp cảm quan để đánh giá chất lƣợng. 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 Đối chứng Hàn the TBBT STPP γ-PGA Chitosan LN(g.mm) 106 Hình 3.39. Biểu đồ điểm đánh giá cảm quan các mẫu giò sử dụng phụ gia. Từ hình 3.39 và những kết quả thu đƣợc từ quá trình đánh giá cảm quan cho thấy nhƣ sau: Màu sắc của sản phẩm không có sự khác biệt nhiều giữa các mẫu trong quá trình phân tích. Màu sắc chia làm hai nhóm chính nhóm sản phẩm có màu hồng nhạt là các sản phẩm sử dụng hàn the, γ-PGA, nhóm có màu trắng nhạt gồm có mẫu đối chứng, mẫu có chứa chitosan, tinh bột biến tính và mẫu chứa stpp. Về mùi vị, mẫu có sử dụng γ-PGA đạt giá trị nghiệm thức cao nhất và khác biệt không có ý nghĩa so với mẫu đối chứng và mẫu sử dụng stpp, so với mẫu sử dụng hàn the, tinh bột biến tính và chitosan thì khác biệt là có ý nghĩa về mặt thống kê. Về hình dáng, các mẫu khác nhau không đáng kể, về độ giòn dai, mẫu sử dụng chitosan có giá trị nghiệm thức cao nhất và khác biệt so với các mẫu còn lại, trên góc độ phân tích cảm quan độ giòn và dai kém nhất khi sử dụng tinh bột biến tính. Khả năng sử dụng các loại phụ gia thực phẩm trong việc ổn định và cải thiện chất lƣợng của giò đƣợc thử nghiệm so sánh giữa γ-PGA và 4 loại phụ gia khác hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi trên thị thƣờng sản xuất, cho thấy γ-PGA có khả năng ổn định trạng thái, cho màu sắc đặc trƣng của giò tƣơi, có thể thay thế các phụ gia độc hại nhƣ hàn the, tạo cấu trúc trong sản phẩm giò tốt hơn khi sử dụng các hợp chất photphat và các loại tinh bột biến tính. Về mặt ứng dụng thực tiễn và hiệu quả kinh tế chƣa đáp ứng đƣợc nhƣ chitosan, nhƣng ở một góc độ nhất định γ-PGA có khả năng tạo màu cho sản phẩm nên đây cũng là một lợi thế của γ-PGA trong quá trình ứng dụng. 0 1 2 3 4 5 Đối chứng Hàn the Tinh bột biến tính γ-PGA STPP Chitosan Màu sắc Mùi, vị Hình dáng Độ giòn dai 107 3.11.3. Khảo sát nồng độ γ-PGA đến chất lƣợng của giò. Nghiên cứu về ảnh hƣởng của γ-PGA đến khả năng ổn định, cải thiện cấu trúc của giò cho thấy ở nồng độ 0,1% γ-PGA cải thiện đƣợc chất lƣợng giò tốt hơn các phụ gia hiện đang sử dụng trên thị trƣờng. Tuy nhiên để tối ƣu nồng độ sử dụng cho sản phẩm cần có những nghiên cứu sơ bộ về γ-PGA khi sử dụng trong sản phẩm giò. Để khảo sát nồng độ thích hợp của γ-PGA cho cải thiện và ổn định chất lƣợng giò, tiến hành thử nghiệm tại các nồng độ γ-PGA từ 0 đến 0,25% với bƣớc nhảy nồng độ là 0,05% sau khi thử nghiệm tiến hành đánh giá cảm quan và đo cƣờng lực gel của từng mẫu nghiên cứu kết quả thể hiện trong hình 3.40 Hình 3.40. Cƣờng lực gel của các mẫu giò sử dụng γ-PGA So sánh các mẫu có sử dụng γ-PGA với các nồng độ khác nhau và có thêm một mẫu đƣợc thu thập ngoài thị trƣờng để so sánh đánh giá chất lƣợng của các mẫu giò qua thông số cƣờng lực gel cho thấy mẫu giò đối chứng và mẫu giò hiện đang bán trên thị trƣờng của Công ty Vissan cho thấy cƣờng lực gel của hai mẫu này tƣơng đƣơng nhau. Khi đem so sánh với các mẫu có bổ sung γ-PGA thấy sự khác nhau rõ rệt giữa các mẫu có và không có γ-PGA. Ở các nồng độ từ 0,05% đến 0,15% cƣờng lực gel của các mẫu này có giá trị dao động từ 8582 g.mm đến 9356 g.mm. Cƣờng lực gel của mẫu giò đạt giá trị cao nhất trong mẫu có sử dụng γ-PGA với nồng độ 0,20% và có xu hƣớng giảm ở nồng độ γ-PGA là 0,25%. Nhìn vào đồ thị có thể thấy cƣờng lực gel của các mẫu giò đạt cực đại ở nồng độ γ- PGA là 0,20%. Trên phƣơng diện đánh giá cảm quan cho thấy: 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 Mẫu thị trường Mẫu đối chứng 0,05% γ- PGA 0,10% γ- PGA 0,15% γ- PGA 0,20% γ- PGA 0,25% γ- PGA LN(g.mm) 108 Mẫu đối chứng và mẫu sử dụng γ-PGA nồng độ 0,05% có màu sắc trắng sáng, lỗ hút vừa, bề mặt cắt khá mịn, có mùi thơm và vị ngọt của thịt. Có vết rạn khi gập đôi miếng giò. Mẫu sử dụng γ-PGA từ nồng độ 0,10% đến nồng độ 0,20% đều có màu sắc hồng nhạt, đều màu, lỗ hút nhỏ, bề mặt khá mịn, giò có độ giòn và dai, gấp đôi và gấp3 lát cắt giò đều không bị rạn, có hƣơng vị thơm ngon đặc trƣng. Mẫu sử dụng γ-PGA nồng độ 0,25% có màu hồng sáng, không đều màu, lỗ hút nhỏ, bề mặt cắt khá mịn. Giò hơi dai, gấp làm 3 lần lát cắt giò hơi rạn. Từ nghiên cứu thực tế cho thấy có thể sử dụng γ-PGA nồng độ 0,20% làm phụ gia trong chế biến giò, nhằm cải thiện chất lƣợng giò, thay thế cho hàn the đang sử dụng tràn lan trên thị trƣờng chế biến. 109 KẾT LUẬN Sau một quá trình nghiên cứu, luận án đã thu đƣợc kết quả cơ bản sau:  Từ các mẫu thực phẩm truyền thống đã phân lập đƣợc 27 chủng vi khuẩn và đã tuyển chọn đƣợc chủng B5 có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA cao từ sản phẩm tƣơng Bần. Bằng phƣơng pháp xác định đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử đã định tên đƣợc chủng B5 là B. subtilis B5.  Bằng phƣơng pháp khảo sát đơn yếu tố và phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm bậc 2 Box- Bernken đã xác định đƣợc điều kiện tối ƣu chủng B. subtilis B5 sinh tổng hợp γ- PGA cao: tiền chất natri glutamat là 25 g/l, axit citric 15 g/l, NH4NO3 15 g/l, tỷ lệ cấp giống 5%, nuôi tĩnh ở nhiệt độ 39,7oC, pH = 8 sau thời gian 97 giờ thu nhận γ-PGA có nồng độ 25,02 g/l.  Đã đƣa ra quy trình thu nhận, tinh sạch chế phẩm γ-PGA dạng bột: Chủng giống  Lên men  Dịch lên men  Bổ sung H2O gia nhiệt (100 o C)  Tảy màu, tảy mùi  Lọc thô  Lọc tinh  Kết tủa bằng cồn 98% (2 lần, tỷ lệ 3:1)  Thẩm tích  γ-PGA Sấy phun (maltodextrin 5%, nhiệt độ 160oC ở 11.000 v/p, lƣu lƣợng cấp dịch 5 l/h)  Chế phẩm γ-PGA dạng bột. Hiệu suất thu hồi γ-PGA trên thực tế triển khai quy mô pilot so với tính toán lý thuyết đạt 95%.  Đã xác định đƣợc cấu trúc và một số đặc tính của sản phẩm γ-PGA thu đƣợc: Mw>158 kDa, trong γ-PGA có chứa α NH+ và γ COO-; tỷ lệ đồng phần D:L glutamic – 47,97:52,03; có tính chất nhớt trong vùng axít từ pH 2,5 đến 7,0; bền nhiệt trong khoảng 25–125oC và đáp ứng tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm, về vi sinh vật và hàm lƣợng kim loại nặng.  Bƣớc đầu thử nghiệm ứng dụng γ-PGA 0,05% trong ổn định nƣớc cam tự nhiên và 0,1- 0,2% trong sản phẩm giò lụa cho kết quả tốt. Chế phẩm γ-PGA có thể dùng để thay thế hàn the trong chế biến bảo quản giò cũng nhƣ các sản phẩm chế biến từ thịt khác. Các hướng nghiên cứu tiếp tục dự kiến. - Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong lĩnh vực nông nghiệp và mỹ phẩm - Nghiên cứu tạo γ-PGA từ các phụ phẩm của nhà máy chế biến thực phẩm - Nghiên cứu sản xuất các túi đựng sinh học tự phân hủy từ γ-PGA 110 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 1. Nguyễn Chí Dũng, Nguyễn Văn Cách, Trần Liên Hà (2013), Phân lập, tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic, Tạp chí Nông nghiệp và phát triên Nông thôn số 219 năm 2013 trang 39-44. 2. Nguyễn Chí Dũng, Trần Liên Hà, Nguyễn Văn Cách, Đặng Thị Thu, Đào Văn Minh (2013), Khảo sát các điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic của chủng vi khuẩn bacillus subtilis b5 Báo cáo khoa học – Tuyển tập Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2013 quyển 2, trang 133-137. 3. Nguyễn Chí Dũng, Đặng Thị Thu,Nguyễn Văn Cách, Trần Liên Hà (2014), Tối ƣu hóa các điều kiện sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic từ chủng vi khuẩn bacillus subtilis B5. Tuyển tập Hội thảo nghiên cứu phát triển các sản phẩm tự nhiên toàn quốc lần thứ IV trang 239-245 4. Nguyễn Chí Dũng, Trần Văn Anh, Đặng Thị Thu, Trần Liên Hà (2015), Ứng dụng chế phẩm axit poly γ-glutamic để cải thiện chất lƣợng cảm quan nƣớc cam, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Trƣờng Đại học Công nghiệp, số 26.2015, trang 50-53. 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Phạm, Hữu Lý; Đỗ, Thị Bích Thanh và Lê, Đức Giang (2009), "Tổng hợp poly L glutamic axit làm chất mang thuốc chống ung thƣ nhả chậm paclitaxel", Tạp chí Hóa học. 5, pp. 188-191. 2. Phạm, Hữu Lý; Đỗ, Thị Bích Thanh và Lê, Đức Giang (2007), "Nghiên cứu một số polyme bị phân hủy sinh học trên cơ sở L-axit Glutamic", Tạp chí khoa học và công nghệ. 45(1), pp. 47-54. 3. Trần, Liên Hà (2010), Nghiên cứu sản xuất các thực phẩm chức năng từ đậu tƣơng, Thành phố Hà Nội Sở Khoa học và Công nghệ. Tài liệu tiếng Anh 4. Adetoro, O; Aditya, B; Irorere, V; Hill, D.; Williams, V and Iza, R (2015), "Poly- gamma-glutamic acid production, properties and applications", Microbiology. 161. 5. Akagi, T; Kaneko, T; Kida, T and Akashi, M (2005), "Preparation and characterization of biodegradable nanoparticles based on polyγ-glutamic acid with l-phenylalanine as a protein carrier", Journal of Controlled Release. 108(2–3), pp. 226-236. 6. Akagi, T.; Matsusaki, M. and Akashi, M. (2010), "Pharmaceutical and Medical Applications of Poly Gamma Glutamic Acid", Amino Acid Homopolymers Occurring in Nature. 15, pp. 119-153. 7. Akishige, K and Haruki, T (1995), "Determination of γ-Polyglutamic Using Cetyltrimethylammonium Bromide", Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi. 42(11), pp. 878-886. 8. Arunsri, L (2003), "Thua nao: Alkali Fermented Soybean from Bacillus subtilis", Silpakorn University Journal of Social Sciences, Humanities and Arts. 3, pp. 277- 292. 9. Ashiuchi, M (2010), "Occurrence and Biosynthetic Mechanism of Poly-Gamma- Glutamic Acid", Amino-Acid Homopolymers Occurring in Nature. 15, pp. 77-93. 10. Ashiuchi, M and Misono, H (2002), "Biochemistry and molecular genetics of poly- γ-glutamate synthesis", Applied Microbiology and Biotechnology. 59(1), pp. 9-14. 11. Ashiuchi, M; Shimanouchi, K; Nakamura, H; Kamei, T; Soda, K; Park, C; Sung, M.H and Misono, H (2004), "Enzymatic Synthesis of High-Molecular-Mass Poly-γ- Glutamate and Regulation of Its Stereochemistry", Applied and Environmental Microbiology. 70(7), pp. 4249-4255. 12. Ashiuchi, m; Soda, K and Misono, H (1999), "A Poly-γ-glutamate Synthetic System of Bacillus subtilis IFO 3336: Gene Cloning and Biochemical Analysis of Poly-γ- glutamate Produced by Escherichia coli Clone Cells", Biochemical and Biophysical Research Communications. 263(1), pp. 6-12. 112 13. Ashiuchi, M.; Kamei, T.; Baek, D. H.; Shin, S. Y.; Sung, M. H.; Soda, K.; Yagi, T. and Misono, H. (2001), "Isolation of Bacillus subtilis (chungkookjang), a poly-γ- glutamate producer with high genetic competence", Applied Microbiology and Biotechnology. 57(5-6), pp. 764-769. 14. Ashiuchi, M.; Nakamura, H.; Yamamoto, T.; Kamei, T.; Soda, K.; Park, C.; Sung, M. H.; Yagi, T. and Misono, H. (2003), "Poly-γ-glutamate depolymerase of Bacillus subtilis production, simple purification and substrate selectivity", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 23(2–6), pp. 249-255. 15. Ashiuchi, M.; Nawa, C.; Kamei, T.; Song, J. J.; Hong, S. P.; Sung, M. H.; Soda, K.; Yagi, T. and Misono, H. (2001), "Physiological and biochemical characteristics of poly γ-glutamate synthetase complex of Bacillus subtilis", European Journal of Biochemistry. 268(20), pp. 5321-5328. 16. Ashiuchi, M.; Shimanouchi, K.; Horiuchi, T.; Kamei, T. and Misono, H. (2006), "Genetically Engineered Poly-gamma- glutamate Producer from Bacillus subtilis ISW1214", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70(7), pp. 1794-1797. 17. Bajaj, I. B and Singhal, R. S (2010), "Effect of aeration and agitation on synthesis of poly γ-glutamic acid in batch cultures of Bacillus licheniformis NCIM 2324", Biotechnology and Bioprocess Engineering. 15(4), pp. 635-640. 18. Bajaj, I. B. and Singhal, R. S. (2009), "Sequential Optimization Approach for Enhanced Production of Poly gamma Glutamic Acid from Newly Isolated Bacillus subtilis", Food Technology and Biotechnology. 47(3), pp. 313–322. 19. Bajaj, I. B. and Singhal, R. S. (2011), "Poly gamma glutamic acid – An emerging biopolymer of commercial interest", Bioresource Technology. 102(10), pp. 5551- 5561. 20. Bajaj, I.N and Singhal, R.S (2011), "Flocculation Properties of Poly γ-Glutamic Acid Produced from Bacillus subtilis Isolate", Food and Bioprocess Technology. 4(5), pp. 745-752. 21. Baruch, E.; Belostotskii, A. M. and Mastai, Y. (2008), "Relationship between the antifreeze activities and the chemical structures of polyols", Journal of Molecular Structure. 874(1–3), pp. 170-177. 22. Bhattacharyya, D.; Hestekin, J. A.; Brushaber, P.; Cullen, L.; Bachas, L. G. and Sikdar, S. K. (1998), "Novel poly-glutamic acid functionalized microfiltration membranes for sorption of heavy metals at high capacity", Journal of Membrane Science. 141(1), pp. 121-135. 23. Bhavik, M and Argyrios, M (2010), "A novel method for the selective recovery and purification of γ polyglutamic acid from Bacillus licheniformis fermetation broth", Biotechnol. 26(3). 24. Bhunia, B.; Mukhopadhy, D. G.; Mandal, T. and Dey, A. (2012), "Improved production, characterizationand flocculation properties of poly (γ)-glutamic acid produced from Bacillus subtilis", Journal of Biochemical Technology. 3(4). 25. Boris, R.B (2002), "Biosynthesis of amino acids of the glutamate and aspartate families, alanine, and polyamines. In Bacillus subtilis and its Closest Relatives", American Society for Microbiology., pp. 203–231. 113 26. Bourne, M.C. (1978), "Texture profile analysis", Food Technology and Biotechnology. 7, pp. 62-65. 27. Bovarnick, M (1942), "The formation of extracellular D-Glutamic acid polypeptide by Bacillus subtilis", J. Biol.Chem. 145, pp. 415-421. 28. Bradford, M.M. (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. ", Analytical Biochemistry. 72(2), pp. 48-54. 29. Bratzler, L.J (1949), "Determining the tenderness of meat by use of the Warner- Bratzler method", Proccesing Recipice. Meat Conference. 2, pp. 117-121. 30. Buescher, J. M. and Margaritis, A. (2007), "Microbial Biosynthesis of Polyglutamic Acid Biopolymer and Applications in the Biopharmaceutical, Biomedical and Food Industries", Critical Reviews in Biotechnology. 27(1), pp. 1-19. 31. Caine, W.R.; Aalhus, J.L.; Best, D.R.; Dugan, M.E.R. and Jeremiah, L.E. (2003), "Relationship of texture profile analysis and Warner-Bratzler shear force with sensory characteristics of beef rib steaks", Meat Science. 64(4), pp. 333-339. 32. Candela, T and Fouet, A (2005), "Bacillus anthracis CapD, belonging to the γ- glutamyltranspeptidase family, is required for the covalent anchoring of capsule to peptidoglycan", Molecular Microbiology. 57(3), pp. 717-726. 33. Candela, T. and Fouet, A. (2006), "Poly-gamma-glutamate in bacteria", Molecular Microbiology. 60(5), pp. 1091-1098. 34. Chen, J; Shi, F; Zhang, B; Zhu, F; Cao, W; Xu, Z; Xu, G and Cen, P (2010), "Effects of Cultivation Conditions on the Production of γ-PGA with Bacillus subtilis ZJU-7", Applied Biochemistry and Biotechnology. 160(2), pp. 370-377. 35. Cheng, C.; Asada, Y. and Aida, T. (1989), "Production of gamma;-Polyglutamic Acid by Bacillus licheniformis A35 under Denitrifying Conditions", Agricultural and Biological Chemistry. 53(9), pp. 2369-2375. 36. Chunhachart, O; Itoh, T; Sukchotiratana, M; Tanimoto, H and Tahara, Y (2006), "Characterization of gamma-Glutamyl Hydrolase Produced by Bacillus sp. Isolated from Thai Thua-nao", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70(11), pp. 2779-2782. 37. Chunhachart, O.; Hanayama, T.; Hidesaki, M.; Tanimoto, H. and Tahara, Y. (2006), "Structure of the Hydrolyzed Product (F-2) Released from Poly gamma glutamic Acid by -Glutamyl Hydrolase YwtD of Bacillus subtilis", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70(9), pp. 2289-2291. 38. Cromwick, A.M; Birrer, G.A and Gross, R.A (1996), "Effects of pH and aeration on γ-poly(glutamic acid) formation by Bacillus licheniformis in controlled batch fermentor cultures", Biotechnology and Bioengineering. 50(2), pp. 222-227. 39. Do, J. H; Chang, H. N and Lee, S. Y (2001), "Efficient recovery of γ-poly glutamic acid from highly viscous culture broth", Biotechnology and Bioengineering. 76(3), pp. 219-223. 40. Do, T. H.; Suzuki, Y.; Abe, N.; Kaneko, J.; Itoh, Y. and Kimura, K. (2011), "Mutations Suppressing the Loss of DegQ Function in Bacillus subtilis (natto) 114 Poly-γ-Glutamate Synthesis", Applied and Environmental Microbiology. 77(23), pp. 8249-8258. 41. Dubois, M; Gilles, K.A; Hamilton, J.K and Rebers, P.A (1956), "Calorimetric method for determination of sugars and related substances. ", Analytical Chemistry. 28, pp. 350-356 42. Fukushima, T.; Kitajima, T.; Yamaguchi, H.; Ouyang, Q.; Furuhata, K.; Yamamoto, H.; Shida, T. and Sekiguchi, J. (2008), "Identification and Characterization of Novel Cell Wall Hydrolase Cwlt: A Two-Domain Autolysin Exhibiting N-Acetylmuramidase and Dl-Endopeptidase Activities", Journal of Biological Chemistry. 283(17), pp. 11117-11125. 43. Fumio, Y; Yoshihiro, O; Mamoru, K; Katsumi, Y and Hiroshi, M (1996), "Detection ofγ-Polyglutamic Acid (γ-PGA) by SDS-PAGE", Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 60(2), pp. 255-258. 44. Gaborieau, M and Castignolles, P (2011), "Size exclusion chromatography (SEC) of branched polymers and polysaccharides", AnalBio AnalChem. 399. 45. Goto, A and Kunioka, M (1992), "Biosynthesis and Hydrolysis of Poly(γ-glutamic acid) from Bacillus subtilis IF03335", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 56(7), pp. 1031-1035. 46. Gross, R. A and Ko, Y. H (1998), "Effects of glucose and glycerol on γ-poly glutamic acid formation by Bacillus licheniformis ATCC 9945a", Biotechnology and Bioengineering. 57(4), pp. 430-437. 47. Guocheng, D; Ge, Y; Yinbo, Q; Jian, C and Shiy, L (2005), "Effects of glycerol on the production of poly(γ-glutamic acid) by Bacillus licheniformis", Process Biochemistry. 40(6), pp. 2143–2147. 48. Hara, T.; Fujio, Y. and Ueda (1982), "Polyglutamate production by bacillus subtilis (natto)", J. Appl. Biochem. 3, pp. 112-120. 49. Hiroyuki, T (2010), "Food Applications of Poly-Gamma-Glutamic Acid", Amino- Acid Homopolymers Occurring in Nature. 15, pp. 155-168. 50. Ho, G. H.; Ho, T. I.; Hsieh, K. H.; Su, Y. C. ; Lin, P. Y. ; Yang, J. ; Yang, K. H. and Yang, S. C. (2006), "γ-Polyglutamic Acid Produced by Bacillus Subtilis (Natto): Structural Characteristics, Chemical Properties and Biological Functionalities", Journal of the Chinese Chemical Society. 53(6), pp. 1363-1384. 51. House, W and Riley, D (1962), The biosynthesis of homopolymeric peptides, Biosynthesis, Vol. 3, academic press, New York and London, 389-412. 52. Hsieh, C.W; Lin, W.C; Hin, W.C; Huang, Y.P; Lai, C. H and Ko, W. C (2009), "Improvement of the stability of nattokinase using γ-polyglutamic acid as a coating material for microencapsulation", LWT - Food Science and Technology. 42(1), pp. 144-149. 53. Huang, Ji.; Du, Y.; Xu, G.; Zhang, H.; Zhu, F.; Huang, L. and Xu, Z. (2011), "High yield and cost-effective production of poly(γ-glutamic acid) with Bacillus subtilis", Engineering in Life Sciences. 11(3), pp. 291-297. 54. Ivanovíc, G and Erdos. (1937), "Ein Beitrag zum Wesen der Kapselsubtanz des Milzbrandbazillus", Immunitatsforsch. 90, pp. 5-19. 115 55. Jiang, H.; Shang, L.; Yoon, S. H.; Lee, S. Y. and Yu, Z. (2006), "Optimal Production of Poly-γ-glutamic Acid by Metabolically Engineered Escherichia coli", Biotechnology Letters. 28(16), pp. 1241-1246. 56. John, F. H.; Peter, H.A.S.; Staley, J.T. and Williams, S.T. (1994), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Ninth ed, ed. 9th, LWW, 754. 57. Joseph, M. and Kumar, A. (2012), Production of poly-γ-glutamic acid under L- glutamate independent solid state fermentation by a newly isolated Bacillus subtilis AR1 and optimization of nutritional parameters, International Journal of Biotechnology, Vol. 5, 035-041. 58. Judit, E.; Fleischer, R.; Levente, N. and Janos, B. (2006), "Poly gamma glutamic acid based crosslinked nanoparticles ", Polymer Preprints. 47(1). 59. Jun, Y.; Hong, X.; Jun, W.; Min, J. and Pingkai, O. (2007), "Removal of Cr(III), Ni(II) and Cu(II) by poly(γ-glutamic acid) from Bacillus subtilis NX-2", Journal of Biomaterials Science Polymer Edition. 18(2), pp. 193– 204. 60. Jung, D. Y.; Jung, S.; Yun, J. S.; Kim, J. N.; Wee, Y. J.; Jang, H. G. and Ryu, H. W. (2005), "Influences of cultural medium component on the production of poly(γ- glutamic acid) by Bacillus sp. RKY3", Biotechnology and Bioprocess Engineering. 10(4), pp. 289-295. 61. Kambourova, M.; Tangney, M. and Priest, F. G. (2001), "Regulation of Polyglutamic Acid Synthesis by Glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis", Applied and Environmental Microbiology. 67(2), pp. 1004-1007. 62. Kedia, G.; Hill, H; Hill, R. and Radecka, I. (2010), "Production of poly-γ-glutamic acid by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis with different growth media. ", J Nanosci Nanotechnol. 10, pp. 1-9. 63. Kilcast, D (2004), "Force/deformation techniques for measuring texture.", Texture in food. 2, pp. 109-145. 64. Kimura, K and Fujimoto, Z (2010), "Enzymatic Degradation of Poly-Gamma- Glutamic Acid", Springer Berlin Heidelberg. 15, pp. 95-117. 65. Kimura, K and Itoh, Y (2003), "Characterization of Poly-γ-Glutamate Hydrolase Encoded by a Bacteriophage Genome: Possible Role in Phage Infection of Bacillus subtilis Encapsulated with Poly-γ-Glutamate", Applied and Environmental Microbiology. 69(5), pp. 2491-2497. 66. Kimura, K; Tran, L. S. P; Do, T. H and Itoh, Y (2009), "Expression of the pgsB Encoding the Poly-gamma-DL-glutamate Synthetase of Bacillus subtilis (natto)", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73(5), pp. 1149-1155. 67. Kimura, K; Tran, L. S. P; Uchida, I and Itoh, Y (2004), "Characterization of Bacillus subtilis γ-glutamyltransferase and its involvement in the degradation of capsule poly-γ-glutamate", Microbiology. 150(12), pp. 4115-4123. 68. Kimura, K.; Tran, L. S. P. and Itoh, Y. (2004), "Roles and regulation of the glutamate racemase isogenes, racE and yrpC, in Bacillus subtilis", Microbiology. 150(9), pp. 2911-2920. 116 69. King, E.C; Blacker, A.J and Bugg, T.D.H (2000), "Enzymatic Breakdown of Poly- γ-d-glutamic Acid in Bacillus licheniformis:  Identification of a Polyglutamyl γ- Hydrolase Enzyme", Biomacromolecules. 1(1), pp. 75-83. 70. Krop, J.J (1974), The mechanism of cloud loss phenomena in orange juice, Agricultural University, The Netherlands, Agricultural. 71. Kubota, H.; Matsunobu, T.; Uotani, K.; Takebe, H.; Satoh, A.; Tanaka, T. and Taniguchi, M. (1993), "Production of Poly(gamma-glutamic acid) by Bacillus subtilis F-2-01", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 57(7), pp. 1212- 1213. 72. Leonard, C. G. ; Mattheis, D. K. ; Mattheis, M. J. and Housewright, R. D. (1964), "Transformation to Prototrophy and Polyglutamic Acid Synthesis in Bacillus licheniformis", Journal of Bacteriology. 88(1), pp. 220-225. 73. Leonard, C. G.; Housewright, R.D. and Thorne, C.B. (1958), "Effects of some metallic ions on glutamyl polypeptide synthesis by bacillus subtilis", J Bacteriol. 76(5), pp. 499-503. 74. Liang, H. F.; Chen, S. C.; Chen, M. C. ; Lee, P. W.; Chen, C. T. and Sung, H. W. (2006), "Paclitaxel-Loaded Poly γ-glutamic acid -poly lactide Nanoparticles as a Targeted Drug Delivery System against Cultured HepG2 Cells", Bioconjugate Chemistry. 17(2), pp. 291-299. 75. Liang, H. F.; Yang, T. F.; Huang, C. T.; Chen, M. C. and Sung, H. W. (2005), "Preparation of nanoparticles composed of poly γ-glutamic acid -poly lactide block copolymers and evaluation of their uptake by HepG2 cells", Journal of Controlled Release. 105(3), pp. 213-225. 76. Luana, P; Moraes, N and Ranulfo, M (2013), "The Existing Studies on Biosynthesis of Poly(ɣ-glutamic acid) by Fermentation", Food and Public Health. 3(1), pp. 28- 36. 77. Mahmoud, B.; Aliaa, M.E.B.; Samia, M.E.S.; Yasser, R.A.F. and Samy., E.A. (2006), "Optimization of Culture Conditions for Production of Polyamide Biopolymer (Polyglutamate) by Bacillus sp. Strain-R", Journal of Biological Sciences. 6(4), pp. 687-694. 78. Mahmoud, M. B and Mohamed, S. A. O (2013 ), "Enhanced production of poly glutamic acid by Bacillus sp. SW1-2 using statistical experimental design", African Journal of Biotechnology. 12(5), pp. 481-490. 79. Masaaki, M (2006), "Beneficial Biofilm Formation by Industrial Bacteria Bacillus subtilis and Related Species", Journal of Bioscience and Bioengineering. 101(1), pp. 1-8. 80. Mitsui, N; Murasawa, H and Sekiguchi, J (2011), "Disruption of the cell wall lytic enzyme CwlO affects the amount and molecular size of poly-gamma-glutamic acid produced by Bacillus subtilis (natto)", The Journal of General and Applied Microbiology. 57(1), pp. 35-43. 81. Moraes, L.P. ; Alegre, R. M. and Brito, P. N. (2012 ), "Optimisation of Poly(γ- Glutamic Acid) Production by Bacillus velezensis NRRL B – 23189 in Liquid Fermentation with Molasses as the Carbon Source without Addition of Glutamic Acid ", International Review of Chemical Engineering. 4(6), pp. 618-623. 117 82. Morikawa, M; Kagihiro, S; Haruki, M; Takano, K; Branda, S; Kolter, R and Kanaya, S (2006), "Biofilm formation by a Bacillus subtilis strain that produces γ- polyglutamate", Microbiology. 152(9), pp. 2801-2807. 83. Nagai, T.; Tran, P. L. S.; Inatsu, Y. and Itoh, Y. (2000), "A New IS4 Family Insertion Sequence, IS4Bsu1, Responsible for Genetic Instability of Poly-γ- Glutamic Acid Production in Bacillus subtilis", Journal of Bacteriology. 182(9), pp. 2387-2392. 84. Nuttawut, K.; Chaniga, C.; Chiravoot, P. and Sarote, S. (2012), "Production of Poly-γ-glutamic acid by Bacillus licheniformis Synthesis and Characterization", Journal of Metals, Materials and Minerals. 22(2), pp. 7-11. 85. Ogawa, Y.F; Yamaguchi, K and Yuasa, T (1997), "Efficient production of γ- polyglutamic acid by Bacillus subtilis (natto) in jar fermenters.", Biosci. Biotechnol. Biochem. 61, pp. 1684-1687. 86. Park, C; Choi, J. C. and Choi, Y.H. (2005), "Synthesis of super-high-molecular- weight poly-γ-glutamic acid by Bacillus subtilis subsp. chungkookjang", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35(4-6), pp. 128-133. 87. Peng, S. F; Yang, M. J; Su, C. J; Chen, H. L; Lee, P. W; Wei, M. C and Sung, H. W (2009), "Effects of incorporation of poly(γ-glutamic acid) in chitosan/DNA complex nanoparticles on cellular uptake and transfection efficiency", Biomaterials. 30(9), pp. 1797-1808. 88. Poo, H.; Park, C.; Kwak, M. S.; Choi, D. Y.; Hong, S. P.; Lee, I. H.; Lim, Y. T.; Choi, Y. K.; Bae, S. R.; Uyama, H.; Kim, C. J. and Sung, M. H. (2010), "New Biological Functions and Applications of High-Molecular-Mass Poly-γ-glutamic Acid", Chemistry & Biodiversity. 7(6), pp. 1555-1562. 89. Radu, J. E. F.; Novak, L.; Hartmann, J.; Beheshti, N.; Kjøniksen, A. L.; Nyström, B. and Borbély, J. (2008), "Structural and dynamical characterization of poly- gamma-glutamic acid-based cross-linked nanoparticles", Colloid and Polymer Science. 286(4), pp. 365-376. 90. Richard, A. and Margaritis, A. (2003), "Optimization of cell growth and poly(glutamic acid) production in batch fermentation by Bacillus subtilis", Biotechnology Letters. 25(6), pp. 465-468. 91. Sawamura, S (1913), "On Bacillus Natto", J. Coll. Agric. Tokyo. 5(189-191). 92. Seong, H. C.; Jong, S. P.; Kyung, S. W.; Min, H. Y. and Wang, Y. C. (2004), "Production of Microbial Biopolymer, Poly(γ-glutamic acid) by Bacillus subtilis BS 62", Agricultural Chemistry & Biotechnology. 47(2), pp. 60-64. 93. Shi, F; Xu, Z and Cen, P (2006), "Efficient production of poly-γ-glutamic acid by bacillus subtilis ZJU-7", Applied Biochemistry and Biotechnology. 133(3), pp. 271-281. 94. Shih, I. L.; Chen, L. D. and Wu, J. Y. (2010), "Levan production using Bacillus subtilis natto cells immobilized on alginate", Carbohydrate Polymers. 82(1), pp. 111-117. 95. Shih, I. L. and Van, Y. T. (2001), "The production of poly-(gamma-glutamic acid) from microorganisms and its various applications", Bioresource Technology. 79(3), pp. 207-25. 118 96. Shih, I. L.; Van, Y. T. and Chang, Y. N. (2002), "Application of statistical experimental methods to optimize production of poly(γ-glutamic acid) by Bacillus licheniformis CCRC 12826", Enzyme and Microbial Technology. 31(3), pp. 213- 220. 97. Shih, I. L.; Van, Y. T. and Sau, Y. Y. (2003), "Antifreeze activities of poly(γ- glutamic acid) produced by Bacillus licheniformis", Biotechnology Letters. 25(20), pp. 1709-1712. 98. Shih, I. L.; Van, Y. T.; Yeh, L. C.; Lin, H. G. and Chang, Y. N. (2001), "Production of a biopolymer flocculant from Bacillus licheniformis and its flocculation properties", Bioresource Technology. 78(3), pp. 267-272. 99. Shih, I. L. and Yu, Y. T. (2005), "Simultaneous and selective production of levan and poly(γ-glutamic acid) by Bacillus subtilis", Biotechnology Letters. 27(2), pp. 103-106. 100. Shih, I. L.; Yu, Y. T.; Shieh, C. J. and Hsieh, C. Y. (2005), "Selective Production and Characterization of Levan by Bacillus subtilis (Natto) Takahashi", Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53(21), pp. 8211-8215. 101. Stanley, N. R and Lazazzera, B. A (2005), "Defining the genetic differences between wild and domestic strains of Bacillus subtilis that affect poly-γ-dl-glutamic acid production and biofilm formation", Molecular Microbiology. 57(4), pp. 1143- 1158. 102. Stellato, D. A. and Camesano, T. A. (2005), "Quantitative Analysis of Biopolymer Conformation Using Atomic Force Microscopy: Copper-Induced Conformational Changes in Poly-γ-glutamic Acid", Formatex, pp. 25-32. 103. Sumihiko, S.; Takeo, M.; Sawao, M. and Seijiro, O. (1973), "Isolation and Purification of Polyglutamic Acid Produced by Bacillus subtilis No. 5 E, and Studies on its Chemical Properties", Japan society for bioscience, biotechnology, and agrochemistry. 47 (3), pp. 159-165. 104. Sung, M. H.; Park, C.; Kim, C. J.; Poo, H.; Soda, K. and Ashiuchi, M. (2005), "Natural and edible biopolymer poly-γ-glutamic acid: synthesis, production, and applications", The Chemical Record. 5(6), pp. 352-366. 105. Suzuki, T and Tahara, Y (2003), "Characterization of the Bacillus subtilis ywtD Gene, Whose Product Is Involved in γ-Polyglutamic Acid Degradation", Journal of Bacteriology. 185(7), pp. 2379-2382. 106. Tanaka, T.; Hiruta, O.; Futamura, T.; Uotani, K.; Satoh, A.; Taniguchi, M. and Susumu, O. (1993), "Purification and Characterization of Poly(γ-glutamic acid) Hydrolase from a Filamentous Fungus, Myrothecium sp. TM-4222", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 57(12), pp. 2148-2153. 107. Tanimoto, H.; Mori, M.; Motoki, M.; Torii, K.; Kadowaki, M. and Noguchi, T. (2001), "Natto Mucilage Containing Poly- gamma- glutamic Acid Increases Soluble Calcium in the Rat Small Intestine", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 65(3), pp. 516-521. 108. Tarui, Y; Iida, H.; Ono, E.; Miki, W.; Hirasawa, E; Fujita, K.; Tanaka, T. and Taniguchi, M. (2005), "Biosynthesis of poly-gamma-glutamic acid in plants: 119 transient expression of poly-gamma-glutamate synthetase complex in tobacco leaves", J Biosci Bioeng. 100(4), pp. 443-448. 109. Thitikorn, M and Piyawan, G (2011), "Effect of freeze - drying and maltodextrin matrix on poly γ glutamic acid productivity from Bacillus subtilis starter powder", Proceeding of IFC 2011. 1, pp. 80-84. 110. Thorne, C.B. and Leonard, C.G. (1958), "Isolation of D- and L-glutamyl polypeptides from culture filtrates of Bacillus subtilis", J. Biol. Chem. 233(5), pp. 1109-1112. 111. Tianlei, Q.; Xiang, Y.; Meilin, H.; Xuming, W. and Qunhui, W. (2012), "Optimization of fermentative production of poly-(γ-glutamic acid) by a newly isolated Bacillus subtilis BABRC-11", African Journal of Microbiology Research. 6(42), pp. 7035-7039. 112. Toshio, H. and Seinosuke, U. (1982), "Regulation of Polyglutamate Production in Bacillus subtilis (natto): Transformation of High PGA Productivity", Agricultural and Biological Chemistry. 46(9), pp. 2275-2281. 113. Troy, F.A. (1973), "Chemistry and biosynthesis of poly γ D glutamyl capsule in Bacillus licheniformis", J. Biol. Chem. 248, pp. 305 - 316. 114. Vedan, I (2006), Gamma-poly-glutamic acid, Vedan Taiwan. 115. Wang, L. L.; Wu, Y. X.; Xu, R. W.; Wu, G. Y. and Yang, W. T. (2008), "Synthesis and Characterization of Poly L-Glutamic Acid-Co-L-Aspartic Acid", Chinese Journal of Polymer Science. 26(04), pp. 381-391. 116. Wang, N.; Yang, G.; Che, C. and Liu, Y. (2011), "Heterogenous expression of poly-γ-glutamic acid synthetase complex gene of Bacillus licheniformis WBL-3", Applied Biochemistry and Microbiology. 47(4), pp. 381-385. 117. Weber, J. (1990), "Poly gamma-glutamic acids are the major constituents of nematocysts in Hydra (Hydrozoa, Cnidaria)", Journal of Biological Chemistry. 265(17), pp. 9664-9669. 118. Weizhong, S (2011), "Method of low cost preparing gamma- polyglutamic acid utilizing farm and side line products solid fermentation", Euro Patent office(CN2005191813 20050806). 119. Weng, T. M and Chen, M. T (2010), "Changes of Protein in Natto (a fermented soybean food) Affected by Fermenting Time", Food Science and Technology Research. 16(6), pp. 537-542. 120. Wu, Q; Xu, H; Liang, J and Yao, J (2010), "Contribution of Glycerol on Production of Poly(γ-Glutamic Acid) in Bacillus subtilis NX-2", Applied Biochemistry and Biotechnology. 160(2), pp. 386-392. 121. Wu, Q; Xu, H; Xu, L and Ouyang, P (2006), "Biosynthesis of poly(γ-glutamic acid) in Bacillus subtilis NX-2: Regulation of stereochemical composition of poly(γ- glutamic acid)", Process Biochemistry. 41(7), pp. 1650-1655. 122. Wu, Q.; Xu, H.; Shi, N.; Yao, J.; Li, S. and Ouyang, P. (2008), "Improvement of poly(γ-glutamic acid) biosynthesis and redistribution of metabolic flux with the presence of different additives in Bacillus subtilis CGMCC 0833.", Appl Microbiol Biot. 79(4), pp. 527-535. 120 123. Xu, H; Jiang, M; Li, H; Lu, D and Ouyang, P (2005), "Efficient production of poly(γ-glutamic acid) by newly isolated Bacillus subtilis NX-2", Process Biochemistry. 40(2), pp. 519-523. 124. Yang, L. C; Wu, J. B; Ho, G. H; Yang, S. C; Huang, Y. P and Lin, W. C (2008), "Effects of Poly-γ-glutamic Acid on Calcium Absorption in Rats", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72(12), pp. 3084-3090. 125. Yasuhiro, I; Keitarou, K and Yoshifumi, I (2002), "Characterization of Bacillus subtilis Strains Isolated from Fermented Soybean Foods in Southeast Asia: Comparison with B. subtilis (natto) Starter Strains", Japan Agricultural Research Quarterly. 36(3), pp. 169-175. 126. Yokoi, H; Arima, T; Hirose, J; Hayashi, S and Takasaki, Y (1996), "Flocculation properties of poly(γ-glutamic acid) produced by Bacillus subtilis", Journal of Fermentation and Bioengineering. 82(1), pp. 84-87. 127. Yoon, S. H.; Jin, H. D.; Sang, Y. L. and Ho, N. C. (2000), "Production of poly-γ- glutamic acid by fed-batch culture of Bacillus licheniformis", Biotechnology Letters. 22(7), pp. 585-588. 128. Yoshihito, I.; Takeshi, T.; Tetsuo, O. and Yoshihiro, A. (1996), "Glutamic Acid Independent Production of Poly(γ-glutamic acid) by Bacillus subtilis TAM-4", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 60(8), pp. 1239-1242. 129. Yung, S. S. and Wen, C. S. (2010), "Improving The Emulsion Stability of Sponge Cake by The Addition of γ-Polyglutamic Acid", Journal of Marine Science and Technology. 18(6), pp. 895-900. 130. Zeng, W.; Chen, G.; Zhang, Y.; Wu, K. and Liang, Z. (2012), "Studies on the UV spectrum of poly(γ-glutamic acid) based on development of a simple quantitative method", International Journal of Biological Macromolecules. 51(1–2), pp. 83-90. 121 PHỤ LỤC Hình PL1. Ảnh khuẩn lạc trên môi trƣờng LB, môi trƣờng E và ảnh chụp qua kính hiển vi nhuộm bào tử, nhuộm gram của vi khuẩn Bacillus subtilis B5 122 Bảng PL1. Bảng thành phần các môi trƣờng lên men sinh tổng hợp γ-PGA Thành phần Môi trƣờng E (g/l) Môi trƣờng E1 (g/l) Môi trƣờng E2 (g/l) Môi trƣờng E3 (g/l) Môi trƣờng E4 (g/l) L-glutamic 20,00 20,00 Axit citric 12,00 12,00 12,00 12,00 Glycerol 80,00 80,00 80,00 80,00 Natri glutamat 20,00 10,00 Đậu tƣơng bột 10,00 20,00 112,00 NH4Cl 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 MgSO4.7H2O 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 FeCl3.6H2O 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 K2HPO4 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 CaCl22H2O 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 MnSO4.H2O 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 Bảng PL2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh γ-PGA 30°C 35°C 40°C 45°C 50°C 24h 0,100 ± 0,008 0,741 ± 0,004 0,952 ± 0,006 0,053 ± 0,005 0,042 ± 0,001 48h 1,430 ± 0,008 1,941 ± 0,014 5,768 ± 0,005 3,959 ± 0,004 0,027 ± 0,001 72h 1,851± 0,007 2,179 ± 0,004 8,076 ± 0,013 1,554 ± 0,005 0,029 ± 0,003 96h 3,932 ± 0,009 4,131 ± 0,007 9,076 ± 0,010 0,602 ± 0,003 0,039 ± 0,001 120h 5,084 ± 0,002 5,444 ± 0,010 6,995 ± 0,011 0,138 ± 0,003 0,038 ± 0,005 123 Bảng PL3. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh γ-PGA pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 24h 0,046 ± 0,003 0,005 ± 0,002 0,316± 0,007 0,342± 0,004 0,005 ± 0,001 48h 0,104 ± 0,006 0,736 ± 0,007 4,470 ± 0,012 4,488 ± 0,007 0,240± 0,007 72h 0,094 ± 0,002 3,985 ± 0,007 5,481 ± 0,009 5,050 ± 0,02 0,279 ± 0,009 96h 0,012 ± 0,001 6,569 ± 0,009 9,780 ± 0,012 13,020 ± 0,008 0,038 ± 0,002 120h 0,008 ± 0,001 5,363 ± 0,011 4,535 ± 0,010 8,947 ± 0,010 0,001 ± 0,000 Hình PL2. Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng γ-PGA y = 0.005x + 0.012 R² = 0.991 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 20 40 60 80 100 120 OD 216 nm γ PGA (µg/ml) 124 Hình PL3. Ảnh các peak khi giải trình tự 2 chiều 125 126 Hình PL4. Đƣờng chuẩn đánh giá hàm lƣợng carbonhydrat Hình PL5. Bảng phối màu từ ba màu cơ bản Tiêu chí đánh giá cảm quan đối với sản phẩm nước cam. Phƣơng pháp này để đánh giá tổng quan mức chất lƣợng của một sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan: màu sắc, mùi vị, hình thái... Các chỉ tiêu đƣợc xây dựng trên một thang thống nhất gồm 6 mức độ 5 điểm( 0 đến 5 điểm). Đối với sản phẩm nƣớc cam cần đánh giá 3 tính chất cảm quan sau: màu sắc, mùi vị và hình thái. y = 0.0583x + 0.1795 R² = 0.992 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 4 5 6 7 8 9 10 11 Cacbonhydrat (µg/ml) OD 490 nm 127 Tổng hệ số trọng lƣợng của tất cả các chỉ tiêu đƣợc đánh giá cho một sản phẩm bằng 4. Chất lƣợng sản phẩm đƣợc tính là điểm trung bình của từng chỉ tiêu nhân với hệ số trọng lƣợng của nó.Hệ số trọng lƣợng của sản phẩm nƣớc cam đƣợc tính nhƣ sau: Bảng PL4. Hệ số trọng lƣợng đánh giá cảm quan Màu sắc 1,2 Mùi, vị 2,0 Hình thái 0,8 Tổng 4 Để tiến hành đánh giá chất lƣợng cảm quan của sản phẩm chúng tôi thành lập hội đồng đánh giá cảm quan gồm 9 thành viên. Thành viên đánh giá cảm quan đƣợc yêu cầu quan sát màu sắc, ngửi mùi, nếm vị, thử trạng thái của từng mẫu nƣớc cam, sau đó đƣa ra ý kiến của mình bằng cách điền vào phiếu đã đƣợc phát. Lƣợng nƣớc quả sử dụng 50ml/thành viên/lần đánh giá. Tất cả các thành viên đều đƣợc tập huấn về phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng theo bảng hƣớng dẫn sau: Bảng PL5. Thang điểm đánh giá cảm quan sản phẩm nƣớc cam Chỉ tiêu Hệ số quan trọng Mức điểm Yêu cầu Màu sắc 1,2 5 4 3 2 1 0 Sản phẩm có màu vàng cam. Sản phẩm có màu vàng. Sản phẩm có màu vàng nhạt. Không đặc trƣng. Biến màu. Biến màu của sản phẩm hƣ hỏng. Mùi vị 2,0 5 4 Mùi thơm đặc trƣng của cam, vị ngọt dịu, chua dịu, thanh mát. Mùi thơm đặc trƣng của cam và hơi có mùi đƣờng, vị ngọt vừa. Có mùi nồng, vị ngọt đậm hoặc chua gắt. 128 3 2 1 0 Sản phẩm không có mùi thơm đặc trƣng, vị nhạt, Sản phẩm có mùi và vị khác lạ. Sản phẩm có mùi và vị hƣ hỏng. Hình thái 0,8 5 4 3 2 1 0 Có lẫn bột quả, khi lắc phân tán đều. Vón nhẹ, khi lắc thì tan. Vón nhẹ, lắc ít tan. Vón, lắc không tan. Vón cục có tạp chất. Vón cục lớn, có tạp chất. Cộng 4 15 Bảng PL6. Thang điểm đánh giá chất lƣợng sản phẩm nƣớc cam Chất lƣợng tốt 18,6 – 20,0 Chất lƣợng khá: 15,2 – 18,5 Chất lƣợng trung bình: 11,2 – 15,1 Chất lƣợng kém: 7,2 – 11,1 Chất lƣợng rất kém: 4 – 7,1 Chất lƣợng hỏng: 0 – 3,9 Sau khi thử, các phiếu sẽ đƣợc tập hợp lại đễ xử lý thông kê cho từng chỉ tiêu ghi trên mẫu. mẫu nào đạt điểm cao nhất thì coi nhƣ tốt nhất. Phép thử cho điểm thị hiếu: Để đánh giá các chỉ tiêu cảm quan, sử dụng phƣơng pháp đánh giá cảm quan cho điểm ƣa thích (Dùng phép thử mô tả trên thang cƣờng độ có cấu trúc gồm 9 bậc), đánh giá mức độ ƣa thích nhƣ sau: 129 Bảng PL7. Thang điểm đánh giá thị hiếu sản phẩm Cực kì thích 9 điểm Rất thích 8 điểm Thích 7 điểm Hơi thích 6 điểm Không thích cũng không chê 5 điểm Hơi chán 4 điểm Chán 3 điểm Rất chán 2 điểm Cực kì chán 1 điểm Về hình thức các mẫu đƣợc giới thiệu hoàn toàn giống nhau và đƣợc mã hóa 1 cách ngẫu nhiên để đảm bảo tính khách quan. Số liệu thu đƣợc đƣợc phân tích và so sánh dựa trên phƣơng sai sử dụng phần mềm SPSS Tiêu chí đánh giá cảm quan đối với sản phẩm giò Bảng PL8. Hệ số trọng lƣợng đánh giá cảm quan sản phẩm giò lụa Màu sắc 0,8 Hình dạng 1 Mùi, vị 0,8 Độ giòn, dai 1,4 Điểm chất lƣợng của các sản phẩm có giá trị từ 0 đến 20 theo 6 mức chất lƣợng sau: Để tiến hành đánh giá chất lƣợng cảm quan của sản phẩm chúng tôi lập hội đồng đánh giá cảm quan gồm 10 thành viên. Các thành viên là ngƣời đã từng làm giò lụa và là ngƣời có kiến thức về phân tích cảm quan tất cả các thành viên đều đƣợc tập huấn về phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng theo bảng hƣớng dẫn sau: Bảng PL9. Thang điểm đánh giá cảm quan sản phẩm giò Thang điểm 5 4 3 2 1 0 Màu sắc Có màu hồng nhạt, sáng đồng Có màu hồng nhạt, Có màu hồng đậm, đều màu Có màu hồng đậm, tối đều Có màu hồng đậm, tối, không Có màu nâu, tối sẫm, 130 đều không đều màu màu đều màu không đều màu Mùi, vị Mùi thơm đặc trƣng của thịt Vị ngọt hài hòa, vị tự nhiên của thịt. Có mùi thơmcủa thịt Vị ngọt tự nhiên của thịt, có vị của gia vị. Có mùi của thịt. Vị ngọt vừa của thịt giảm, có vị mặn của gia vị Không còn mùi thơm của thịt, mùi gia vị ít đi, xuất hiện mùi lạ. - Không còn mùi thơm của thịt, xuất hiện mùi lạ. - Không có mùi của thịt và gia vị, có mùi lạ. Hình dạng Phẳng đều, bề mặt lát cắt rất mịn, phẳng,có lỗ hút nhỏ Phẳng đều, bề mặt lát mịn, có nhiều lỗ hút nhỏ Hơi phồng, méo, bề mặt lát cắt mịn, có lỗ hút vừa Phồng, méo, bề mặt lát cắt xơ, có lỗ hút to Phồng méo, bề mặt lát cắt xơ, gồ ghề, có lỗ hút to Phồng méo, bề mặt lát cắt rất xơ, gồ ghề, có lỗ hút to Độ giòn, dai Độ giòn rất tốt, độ dai tốt Giò có độ giòn, hơi dai Giò hơi giòn, dẻo, không đƣợc dai Giò có độ giòn, độ dai kém Giò không giòn, không dai, nát Giò nát, bở, cấu trúc nhão.