Luận án Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei pq6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm

latory element-binding protein-1c (SREBP-1c) và fatty acid synthase (FAS) vào trong nhân tế bào cần phải Ďược tiếp tục nghiên cứu trong thời gian tới theo các công bố của tác giả Peet và cộng sự, (1998) và Dang et al., (2009) [178, 179]. Hình 3.39. Sơ Ďồ tóm tắt bước Ďầu nghiên cứu cơ chế phân tử tác dụng giảm cholesterol và tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Ghi chú: LDL-R: The low - Density Lipoprotein Reccetor; CYP7A1: cholesterol 7a-hydroxylase; LXR: liver X receptor; ABC: ATP-binding cassette transporter member 1; ApoE : apoliprotein; Insig-2a: insulin induced gene 2-a; SREBP-1c: sterol regulatory element-binding protein 1c; FAS: Fatty acid synthase; FATP4: fatty acid transport protein 4; SCD-1: stearoyl-Coenzyme A desaturase 1; CPT-1: Carnitine palmitoyltransferase ; ACOX: acyl-CoA oxidase; LPL: lipoprotein lipase; MCAD: medium-chain acyl CoA dehydrogenase; HMGCS2- hydroxymethylglutaryl CoA synthase 2. 127 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ các kết quả nghiên cứu Ďã Ďược trình bày ở phần nêu trên, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1. Lựa chọn Ďược chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong số 32 chủng Schizochytrium spp. và 8 chủng Thraustochytrium spp. từ Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học có khả năng tổng hợp squalene cao nhất (Ďạt 102,01 mg/g sinh khối khô). 2. Điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 khi nuôi ở bình tam giác là 28ᵒC, nồng Ďộ glucose 3%, cao nấm men 1% và bổ sung tebinafine với nồng Ďộ 100 g/mL. 3. Điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 khi nuôi ở bình lên men 30 lít tự tạo là lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất; môi trường nuôi cấy Ďược bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin (vitamin B1-45 g/L, vitamin B6-45 g/L và vitamin B12-0,25 g/L) với nguồn nitơ là 1,2% cao nấm men và 6,42% monosodium glutamate; thời gian tối ưu Ďể bổ sung glucose là tại thời Ďiểm 36 giờ và tiến hành thu sinh khối tảo sau 48 giờ bổ sung glucose, mật Ďộ tế bào tảo Ďạt (369,35 ±7,94) x 106 tế bào/mL; sinh khối khô Ďạt (75,41± 1,35) g/L, hàm lượng squalene Ďạt (93,53 ± 2,45) mg/g sinh khối khô và sản lượng squalene Ďạt (6928,6± 14,6) mg/L. 4. Đã xây dựng Ďược quy trình tách chiết và tinh sạch squalene ở quy mô nhỏ và quy mô pilot từ sinh khối chủng S. mangrovei PQ6. Từ 46 L dịch lên men (tương Ďương 3,9 ± 0,1 kg sinh khối khô), squalene tinh khiết có hàm lượng (305,23±2,34)g với Ďộ tinh sạch Ďạt 90-95%, Ďảm bảo yêu cầu chất lượng theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm. 5. Những thử nghiệm Ďộc tính cấp và bán trường diễn trên mô hình Ďộng vật thực nghiệm cho thấy squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 là không Ďộc. Sau 60 ngày sử dụng liên tục, chuột Ďuợc uống squalene với liều 400 và 1.200 mg/kg khối lượng cơ thể chuột/ngày Ďảm bảo an toàn, không làm thay 128 Ďổi các chỉ tiêu huyết học, sinh hoá, không gây tổn thương tế bào và chức năng gan, thận và lách của chuột thực nghiệm so với công thức Ďối chứng. 6. Trên mô hình in vivo và in vitro Ďã cho thấy squalene có tác dụng tăng lipoprotein có tỷ trọng cao gắn với cholesterol và tỷ lệ HDL- cholesterol/cholesterol toàn phần trong máu; có tác dụng giảm cholesterol và tryglyceride nội bào, làm giảm cholesterol gắn với lipoprotein tỷ trọng thấp và rất thấp trong máu mà không gây ảnh hưởng Ďến sự phát triển cân nặng cơ thể và gan, cholesterol toàn phần và tryglyceride máu. Trên mô hình tế bào, bước Ďầu Ďã xác Ďịnh Ďược cơ chế tác dụng giảm cholesterol của squalene là Ďiều hòa biểu hiện của các gen mã hóa cho protein, enzyme tham gia vào quá trình vận chuyển (như thụ thể LDL- low density lipoprotein - receptor, LDL-R; thụ thể trong gan - Liver - X receptor, LXRs) và thoái hóa cholesterol (CYP7A1- enzyme cholesterol 7 alpha- hydroxylase). Ngoài ra, squalene có tác dụng giảm tryglyceride trong máu. KIẾN NGHỊ 1. Cần tiếp tục nghiên cứu về cơ chế tác dụng giảm cholesterol và tryglyceride của squalene là do tăng cường mức Ďộ biểu hiện của gen mã hóa cho protein Insig-2a dẫn Ďến ức chế quá trình vận chuyển SREBP-1c vào trong nhân tế bào. 2. Nghiên cứu mức Ďộ biểu hiện của các gen tham gia vào quá trình hấp thu acid béo trong tế bào gan, giảm Ďiều hòa biểu hiện các gen tham gia vào quá trình tổng hợp tryglyceride, tăng Ďiều hòa biểu hiện các gen tham gia vào quá trình beta-ôxy hóa và hấp thu acid béo, quá trình ketosis và vận chuyển ngược cholesterol thông qua việc kích hoạt thụ thể PPARα. 129 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ (09) 1. Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Minh Hiền, Nguyễn Hoàng Ngân, Đặng Diễm Hồng. Đánh giá mức độ an toàn và tác dụng của squalene tách chiết từ Schizochytrium mangrovei PQ6 đến sự tăng cholesterol của lipoprotein tỷ trọng cao (HDL-C) ở động vật thực nghiệm. Tạp chí Sinh học, 2019, 41(2), 39-48. 2. Hoang Thi Lan Anh, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Pham Van Nhat, Hoang Thi Minh Hien, Ngo Thi Hoai Thu, Dang Diem Hong, Different fermentation strategies by Schizochytrium mangrovei strain PQ6 to produce feedstock for exploitation of squalene and omega-3 fatty acids. Journal of Phycology, 2018, 54 (4), 550-556 (SCI, Q1; IF-3,0). 3. Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Minh Hiền, Đặng Diễm Hồng, Cơ chế giảm cholesterol của squalene tách chiết từ Schizochytrium mangrovei PQ6. Báo cáo toàn văn tại Hội thảo Khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2018 tại Trung tâm Hội nghị quốc gia Hà Nội 26.10.2018, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ; 2018, 589-594. 4. Nguyen Cam Ha, Hoang Thi Minh Hien, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Dang Diem Hong, Optimization of fermentation conditions for squalene production by heterotrophic marine microalgae Schizochytrium mangrovei. Academia Journal of Biology, 2017, 39(3), 449-458. 5. Hoang Thi Minh Hien, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Dang Diem Hong, Squalene promotes cholesterol homeostasis in macrophage and hepatocyte cells via activation of liver X receptor (LXR) α and β. Biotechnology Letters, 2017, 39 (8), 1101-1107 (SCI, Q2; IF-1,7). 6. Đặng Diễm Hồng, Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Lưu Thị Tâm, Hoàng Thị Lan Anh, Ngô Thị Hoài Thu, Nhiên liệu sinh học từ vi tảo biển dị dưỡng của Việt Nam: Biodiesel và tận thu các sản phẩm phụ (acid béo không bão hòa đa nối đôi - PUFAs, glycerol và squalene) trong quá trình sản xuất biodiesel. Tạp chí Sinh học, 2017, 39 (1), 51-60. 7. Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Pham Van Nhat, Hoang Thi Lan Anh and Dang Diem Hong. Extraction of squalene from 130 Vietnam heterotrophic marine microalga. Proceeding of The 4 the Academic conference on natural Science for Yong Scientists, Master & PhD. Student from Asian Countries. 15-18 December, 2015 - Bangkok, Thailand, 2016, 46-56. 8. Hoang Thi Lan Anh, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Dang Diem Hong Optimization of culture conditions and squalene enrichment from heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei PQ6 for squalene production. Research Journal of Biotechnology, 2016, 14 (2), 337- 346 (SCI-E). 9. Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Đặng Diễm Hồng, Hoàng Minh Hiền, Nghiên cứu tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium sp. trên tế bào Hep G2. Tạp chí Dược liệu, 2016, 21 (4), 270 -274. 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. K. Wołosik, M. Kna´s, A. Zalewska, M. Niczyporuk, The importance and perspective of plant-based squalene in cosmetology, Journal of Cosmetic Science, 2013, 64 (1), 19-65. 2. S. Lopez, B. Bermudez, S. Montserrat-de la Paz, S. Jaramillo, L. M. Varela, A. Ortega-Gomez, R. Abia, F. J. Muriana, Membrane composition and dynamics: a target of bioactive virgin olive oil constituents, Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, 2014, 1838 (6), 1638-1656. 3. I. Popa, N. E. Babeanu, S. NiTa, O. Popa, Squalene - Natural resources and applications. Farmacia, 2014, 62 (5). 4. O. Popa, N. E. B˘abeanu, I. Popa, S. Nit˘a, E. C. DinuPaˆrvu, Methods for obtaining and determination of squalene from natural sources, BioMed Research International, Article ID 367202, 2015, 16 pages. 5. D. M. Pham, B. Boussouira, D. Moyal, Q. L. Nguyen, Oxidization of squalene, a human skin lipid: a new and reliable marker of environmental pollution studies. International Journal of Cosmetic Science, 2015, 37 (4), 357-365. 6. A. L. Ronco, E. De Stéfani, Squalene: a multi-task link in the crossroads of cancer and aging. Functional foods in health and disease, 2013, 3 (12), 462- 476. 7. Y. Kohno, Y. Egawa, S. Itoh, S. Nagaoka, M. Takahashi, K. Mukai, Kinetic study of quenching reaction of singlet oxygen and scavenging reaction of free radical by squalene in n-butanol, Biochim Biophys Acta, 1995, 1256 (1), 52-56. 8. M. Spanova, G. Daum, Squalene - biochemistry, molecular biology, process biotechnology, and applications. Eur. J. Lipid Sci. Technol, 2011, 113, 1299- 1320. 9. T. Hauss, S. Dante, N.A. Dencher, T. H. Haines, Squalane is in the midplane of the lipid bilayer: Implications for its function as a proton permeability barrier. Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1556, 149–154. 132 10. K. Lohner, G. Degovics, P. Laggner, E. Gnamusch, F. Paltauf, Squalene promotes the formation of non-bilayer structures in phospholipid model membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1993, 1152, 69-77. 11. W. Xu, X. Ma, Y. Wang, Production of squalene by microbes: an update. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2016, 32 (12), 195. 12. N. Dellas, S. T. Thomas, G. Manning, J. P. Noel, Discovery of a metabolic alternative to the classical mevalonate pathway, 2013, Elife 2: e00672. 13. J. Acimovic, D. Rozman, Steroidal triterpenes of cholesterol synthesis. Molecules, 2013, 18(4), 4002-4017. 14. G. P. Ghimire, H. T. Nguyen, N. Koirala, J. K. Sohng, Advances in biochemistry and microbial production of squalene and its derivatives. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2016, 26 (3), 441-451. 15. T. Moses, K. K. Papadopoulou, A. Osbourn, Metabolic and functional diversity of saponins, biosynthetic intermediates and semi-synthetic derivatives. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2014, 49 (6), 439-462. 16. M. A. Lozano-Grande, S. Gorinstein, E. Espitia-Rangel, G. Davila´-Ortiz, Mart´ınez- A. L. Ayala, Review article: Plant sources, extraction methods, and uses of squalene. International Journal of Agronomy, 2018, 13 pages. 17. Y. Xie, B Sen, G Wang, Mining terpenoids production and biosynthetic pathway in thraustochytrids, Bioresour Technol, 2017, 244 (2), 1269 – 1280. 18. E. Naziri, R. Consonni, M. Z. Tsimidou, Squalene oxidation products: monitoring the formation, characterisation and pro-oxidant activity. European Journal of Lipid Science and Technology, 2014, 116 (10), 1400 - 1411. 19. L. Xu, N.A. Porter, Free radical oxidation of cholesterol and its precursors: implications in cholesterol biosynthesis disorders. Free Radical Research, 2015, 49 (7), 835 - 849. 20. H. Yin, E. Niki, K. Uchida, Special issue on “recent progress in lipid peroxidation based on novel approaches. Free Radical Research, 2015, 49 (7), 813-815. 21. G.S. Kelly (1999). Squalene and its potential clinical uses. Altern. Med. Rev, 1999, 4(1), 29-36. 133 22. M. Micera, A. Botto, F. Geddo, S. Antoniotti, C. M, Bertea, R. Levi, M. P. Gallo, G. Querio, Squalene: More than a step toward sterols, Antioxidants, 2020, 9 (8), E688. 23. R. Ciriminna, V. Pandarus, F. Béland, M. Pagliaro, Catalytic hydrogenation of squalene to squalane. Org. Process Res. Dev, 2014, 18, 1110-1115. 24. D. Smith, A. Espino-Montoro, F. PerezJimenez, J. Pedro-Botet, J. Jimenez Pereperez, J. M. Ordovas. Effect of a high saturated fat and cholesterol diet supplemented with squalene or β-sitosterol on lipoprotein in fib hamsters. Nutr. Res., 2000, 20, 1309-1318. 25. S. Sánchez-Fidalgo, A. Cárdeno, M. Sánchez-Hidalgo, M. Aparicio-Soto, C. Alarcón de la Lastra, Dietary extra virgin olive oil polyphenols supplementation modulates DSS-induced chronic colitis in mice. J Nutr Biochem, 2013, 24(7), 1401-1413. 26. H. N. Bhilawade, Tatewaki N, Nishida H, Konishi T. Squalene as novel food factor. Curr Pharm Biotechnol, 2010, 11(8): 875 - 880. 27. H. N. Bhilawade, N. Tatewaki, T. Konishi, M. Nishida, T. Eitsuka, H. Yasui. The adjuvant effect of squalene, an active ingredient of functional foods, on doxorubicin-treated allograft mice. Journal nutrition and cancer, 2019, 71 (7): 1153-1164. 28. R. Moroti, R. Petre, I. Niculescu, I. Pigulea, V. Molagic, A. Hristea, A. Porojnicu, Vitamin D an antimicrobial weapon against acute respiratory tract infections. A systematic review. Farmacia, 2012, 60(2), 159-167. 29. J. D. Kedl, R. M. Kedl, How squalene GLAdly helps generate antigen specific T cellsvia antigen-carrying neutrophils and IL-18. Eur. J. Immunol, 2015, 45, 376-379. 30. S. K. Kim, F. Karadeniz. Biological importance and applications of squalene and squalane, Advances in Food and Nutrition Research, 2012, 65, 223-33. 31. K. P. Patra, F. Li, D. Carter, J. A. Gregory, S. Baga, S. G. Reed, S. P. Mayfield, J. M. Vinetz. Algae-produced malaria transmission-blocking vaccine candidate Pfs25 formulated with ahuman use-compatiblepotent adjuvant induces highaffinity antibodies that block Plasmodium falciparum infection of mosquitoes. Infect. Immun, 2015, 83, 1799-1808. 134 32. G. Del Giudice, E. Fragapane, R. Bugarini, M. Hora, T. Henriksson, E. Palla, D. O’Hogan, J. Donnelly, R. Rappuoli, A. Podda, Vaccines with MF59 adjuvant do not stimulate antibody responses against squalene, Clin. Vaccine Immunology, 2006, 13, 1010-1013. 33. M. T. Hensel, J. D. Marshall, M. R. Dorwart, D. S. Heeke, E. Rao, P. Tummala, L. Yu, G. H. Cohen, R. J. Eisenberg, D. D. Sloan, Prophylactic herpes simplex virus 2 (HSV-2) vaccines adjuvanted wit stable emulsion and toll-like receptor 9 agonist induce a robust HSV-2-specific cell-mediated immune response, protect against symptomatic disease, and reduce the latent viral reservoir. J. Virol, 2017, 91(9), e02257-16. 34. G. Lippi, G. Targher, M. Franchini. Vaccination, squalene and anti-squalene antibodies: facts or fiction? Eur. J. Inter. Med, 2010, 21, 70-73. 35. C. Sánchez-Quesada, A. López-Biedma, E. Toledo, J. J. Gaforio. Squalene stimulates a key innate immune cell to foster wound healing and tissue repair. Evid. Based Complement Alternat. Med, 2018, 9473094. 36. J. J. Stelzner, M. Behrens, S. E. Behrens, K. Mäder, Squalene containing solid lipid nanoparticles, a promising adjuvant system for yeast vaccines, Vaccine, 2018, 36, 2314-2320. 37. D. Panatto, D. Amicizia, L. Arata, P. L. Lai, R. Gasparini, A comprehensive analysis of Italian web pages mentioning squalene-based influenza vaccine adjuvants reveals a high prevalence of misinformation. Human vaccines & immunotherapeutics, 2018, 14 (4), 969 - 977. 38. A. Sethi, T. Kaur, S. K. Malhotra, M. L. Gambhir, Moisturizers: the slipperyroad. Indian J. Dermatol, 2016, 61, 279-287. 39. A. O. Oyewole, A. A. Birch-Machin, Sebum, inflammasomes and the skin: current concepts and future perspective. Exp Dermatol, 2015, 24, 651 – 654. 40. P. Chan, B. Tomlinson, C. B. Lee, Y. S. Lee, Effectiveness and safety of low- dose pravastatin and squalene, alone and in combination, in elderly patients with hypercholesterolemia. J Clin Pharmacol., 1996, 36, 422- 427. 41. Y. Liu, X. Xu, D. Bi, X. Wang, X. Zhang, H. Dai, S. Chen, W. Zhang, Influence of squalene feeding on plasma leptin, testosterone and blood pressure in rats. Indian J. Med. Res, 2009, 129, 150-153. 135 42. Geyeregger, M. Zeyda, T. M. Stulnig, Liver X receptors in cardiovascular and metabolic disease. Cell Mol Life Sci, 2006, 63 (5), 524-539. 43. J. J. Repa, K. E. Berge, C. Pomajzl, J. A. Richardson, H. Hobbs, D. J. Mangelsdorf, Regulation of ATP-binding cassette sterol transporters ABCG5 and ABCG8 by the liver X, J Biol Chem., 2002, 277(21), 18793-800. 44. Tangirala, I. G. Schulman, Macrophage liver X receptor is required for antiatherogenic activity of LXR agonists. Arterioscl Thromb Vasc, 2005, 25, 135-142. 45. J. R. Schultz, H. Tu, A. Luk, J. J. Repa, J. C. Medina, L. Li, S. Schwendner, S. Wang, M. Thoolen, D. J. Mangelsdorf, K. D. Lustig, B. Shan, Role of LXRs in control of lipogenesis. Genes Dev, 2000, 14, 2831–2838. 46. C. Gabas-Rivera, C. Barranquero, R. Martınez-Beamonte, M. A. Navarro, J. C. Surra, J. Osada, Dietary squalene increases high density lipoprotein cholesterol and paraoxonase and decreases oxidative stress in mice. Plos one, 2014, 9 (8): e104224. 47. X. Q. Wang, K. W. Kim, S. H. Chu, R. Phitakatansakul, S. W. Park, I. M. Chung, Y. S. Lee, Y. J. Park, Genome-wide association study for squalene contents and functional haplotype analysis in rice, ACS Omega, 2019, 4 (21), 19358 – 19365. 48. A. Katabami, L. Li, M. Iwasaki, M. Furubayashi, K. Saito, D. Umeno, Production of squalene by squalene synthases and their truncated mutants in Escherichia coli. J Biosci Bioeng, 2015, 119, 165–71. 49. W. Xu, I. Yao, L. Liu, X. Ma, W. Li, X. Sun, Y. Wang, Improving squalene production by enhancing the NADPH/NADP+ ratio, modifying the isoprenoid-feeding module and blocking the menaquinone pathway in Escherichia coli, Biotechnology for Biofuels, 2019, 12, 68. 50. INCI: Squalene CAS No: 111-02-4 EINECS No: 203-826-1 51. Sage, Final report on the safety assessment of squalane and squalene, International Journal of Toxicology, 1982, 1 (2), 37–56. 52. M. Vadala, C. Laurino, L. Palmieri, B. Palmieri, Shark derivatives (Alkylglycerols, Squalene, Cartilage) as putative nutraceuticals in oncology. European journal of on cology, 2017, 22 (1), 5-20. 136 53. T. Rosales-García, C. Jimenez-Martinez, G. Dávila-Ortiz, Squalene extraction: biological sources and extraction methods. International Journal of Environment, Agriculture and Biotechnology (IJEAB), 2017, 2 (4), 1662- 1670. 54. G. Cirmena, P. Franceschelli, E. Isnaldi, L. Ferrando, M. De Mariano, A. Ballestrero, G. Zoppoli. Squalene epoxidase as a promising metabolic target in cancer treatment, Cancer Lett, 2018, 425, 13-20. 55. K. H. Tsoi, S. Y. Chan, Y. C. Lee, B. H. Y. Ip, C. C. Cheang, Shark conservation: an educational approach based on children’s knowledge and perceptions toward sharks. PLoS ONE, 2016, 17 pages. 56. N. Seltenrich, New link in the food chain? Marine plastic pollution and seafood safety. Environ. Health Perspect, 2015, 123, 34 - 41. 57. R. Ramírez-García, N. Gohil, V. Singh. Recent advances, challenges, and opportunities in bioremediation of hazardous materials. Phytomanagement of Polluted Sites, 2019, 517-568. 58. C. Samaniego-Sanchez, J. J. Quesada-Granados, S. H. Lopez-Garcıa de la, M. C. LopezMartinez, β - carotene, squalene and waxes determined by chromatographic method in picual extra virgin olive oil obtained by a new cold extraction system. Journal of Food Composition and Analysis, 2010, 23, 671 - 676. 59. G. S. Mlakar, M. Turinek, M. Jakop, M. Bavec, F. Bavec, Grain Amaranth as an Alternative and Perspective Crop in Temperate Climate. J. for Geography, 2010, 5(1), 135-145. 60. E. Drozdíková, M. Garaiová, Z. Csáky, M. Obernauerov, I. Hapala, Production of squalene by lactose-fermenting yeast Kluyveromyces lactis with reduced squalene epoxidase activity. Lett. Appl. Microbiol, 2015, 61, 77-84. 61. X. Song, X. Wang, Y. Tan, Y. Feng, W. Li, Q. Cui, High production of squalene using a newly isolated yeast-like strain Pseudozyma sp. SD301, J Agric Food Chem, 2015, 63 (38), 8445-8451. 62. A, Rasool, M. S. Ahmed, C. Li, Overproduction of squalene synergistically downregulates ethanol production in Saccharomyces cerevisiae. Chem. Eng. Sci, 2016, 152, 370 - 380. 137 63. B. E. Ebert, E. Czarnotta, L. M. Blank. Physiologic and metabolic characterization of Sccharomyces cerevisia reveals limitation in the synthesis of the triterpene squalene. FEMS Yeast Res, 2018, 18 (8). 64. I. M. Aasen, H. Ertesvåg, T. M. B. Heggeset, B. Liu, T. Brautaset, O. Vadstein, T. E. Ellingsen, Thraustochytrids as production organisms for docosahexaenoic acid (DHA), squalene, and carotenoids. Appl. Microbiol. Biotechnol, 2016, 100, 4309-4321. 65. Y. Jiang, K. W. Fan, R. T. Wong, F. Chen, Fatty acid composition and squalene content of the marine microalga Schizochytrium mangrovei, J Agric Food Chem, 2004, 52(5), 1196-1200. 66. B. Pora, Y. Qian, B. Caulier, S. Comini, P. Looten, L. Segueilha, Method for the preparation and extraction of squalene from microalgae, Patent Number US20140088201, 2014. 67. Q. Li, G. Q. Chen, K. W. Fan, F. P. Lu, T. Aki, Screening and characterization of squalene-producing Thraustochytrids from Hong Kong mangroves. Agric.Food Chem, 2009, 57, 4267-4272. 68. T. R. García, C. J. Martinez, G. D. Ortiz, Squalene Extraction: Biological Sources and Extraction Methods. International Journal of Environment, Agriculture and Biotechnology (IJEAB), 2017, 2(4). 69. L. Vázquez, C. F. Torres, T. Fornari, F. J. Señoráns, G. Reglero, Recovery of squalene from vegetable oil sources using countercurrent supercritical carbon dioxide extraction. J Supercrit Fluids, 2007, 40 (1), 59 - 66. 70. P. Mercer, R. E. Armenta, Developments in oil extraction from microalgae. Eur. J. Lipid Sci. Technol, 2011, 113 (5), 539-547. 71. A. Thompson, S. Kwak, Y. Su Jin, Squalene production using Saccharomyces cerevisae. An Undergraduate Research Journal, 2014, 1(1), 8 pages. 72. H. Xiao, Z. Yao, Q. Peng, F. Ni, Y. Sun, C. X. Zhang, Z. X. Zhong, Extraction of squalene from camellia oil by silver ion complexation. Sep Purif Technol, 2016, 169, 196-201. 73. K. Paramasivan, K. Rajagopal, S. Mutturi, Studies on squalene biosynthesis and the standardization of its extraction methodology from Saccharomyces cerevisiae. Appl Biochem Biotechnol, 2019, 187 (3), 691-707. 138 74. I. Wandira, E. H. Legowo, D. I. Widiputri, Optimization of squalene produced from crude palm oil waste. AIP Conference Proceedings, 2017, 1803 (1), 8 pages. 75. J. Krulji, T. Brlek, L. Pezo, J. Brkljača, S. Popović, Z. Zeković Z, S. M. Bodroža, Extraction methods of Amaranthus sp. grain oil isolation. J. Sci Food Agric, 2016, 96 (10), 3552 - 3558. 76. K. Y. Khaw, M. O. Parat, P. N. Shaw, J. R. Falconer, Solvent supercritical fluid technologies to extract bioactive compounds from natural sources: A review. Molecules, 2017, 22 (1186), 1-24. 77. S. T. H. Sherazi, S. A. Mahesar, Sirajuddin, Vegetable oil deodorizer distillate: a rich source of the natural bioactive components. J. Oleo Sci, 2016, 65 (12), 957-966. 78. N. Xynos, M. Zervos, A. Angelis, N. Aligiannis, A single-step isolation of squalene from olive oil deodorizer distillates by using centrifugal partition chromatography. Separation science and technology, 2016, 51 (5), 830 - 835. 79. S. Gunawan, N. S. Kasim, Y. H. Ju, Separation and purification of squalene from soybean oil deodorizer distillate. Separation and Purification Technology, 2008, 60 (2), 128- 135. 80. H. T. Lu, Y. Jiang, F. Chen. Preparative separation and purification of squalene from the microalga Thraustochytrium ATCC 26185 by high - speed counter - current chromatography. Journal of Chromatography, 2003, 994 (1-2), 37-43. 81. O. Perez-Garcia, Y. Bashan, Microalgal heterotrophic and mixotrophic culturing for bio-refining: from metabolic routes to techno-economics. Algal Biorefineries, 2015, 2, 61 - 131. 82. F. Di Caprio, A. Visca, P. Altimari, L. Toro, B. Masciocchi, G. Iaquaniello, F. Pagnanelli, Two-stage process of microalgae cultivation for starch and carotenoid production, Chemical Engineering Transactions, 2016, 49, 415 - 420. 83. F. Chen, High cell density culture of microalgae in heterotrophic growth. Trends Biotechnol, 1996, 14, 412-426. 84. G. Q. Chen, F. Chen, Growing phototrophic cells without light. Biotechnol. Lett, 2006, 28, 607-616. 139 85. P. Altimari, F. Di Caprio, L. Toro, A. L. Capriotti, F. Pagnanelli, Hydrogen photo-production by mixotrophic cultivation of Chlamydomonas reinhardtii: Interaction between organic carbon and nitrogen. Chemical Engineering Transactions, 2014, 38, 199-204. 86. F. Pagnanelli, P. Altimari, F. Trabucco, L. Toro, Mixotrophic growth of Chlorella vulgaris and Nannochloropsis oculata: influence of glucose and nitrate concentration. J. Chem. Technol. Biotechnol, 2014, 89, 652-661. 87. S. K. Saha, P. Murray, Exploitation of Microalgae Species for Nutraceutical Purposes: Cultivation Aspects, Fermentation, 2018, 4 (46): 17 pages. 88. P. Bhattacharjee, R. S. Singhal, Extraction of squalene from yeast by supercritical carbon dioxide. Journal of Microbiology & Biotechnology, 2003, 19, 605–608. 89. R. S. Coelho, A. D. S. Vidotti, E. M. Reis, T. T. Franco, High cell density cultures of microalgae under fed-batch and continuous growth. Chemical engineering transactions, 2014, 38: 313-318. 90. F. Chen, M. R. Johns, A strategy for high cell density culture of heterotrophic microalgae with inhibitory substrates. J Appl Phycol, 1995, 7: 43–46. 91. Hoàng Thị Minh Hiền, Lưu Thị Tâm, Lê Thị Thơm, Nguyễn Cẩm Hà, Lương Hồng Hạnh, Hoàng Thị Lan Anh, Ngô Thị Hoài Thu, Đặng Diễm Hồng, Nghiên cứu quá trình tách chiết lipid tổng số và acid béo tự do cho sản xuất dầu Omega-3 và Omega-6 từ sinh khối vi tảo biển dị Schizochytrium mangrovei PQ6. Tạp chí sinh học, 2013, 35(4): 484-493. 92. Lê Thị Thơm, Lưu Thị Tâm, Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Hương Quỳnh, Phạm Văn Nhất, Hoàng Thị Lan Anh, Ngô Thị Hoài Thu, Hoàng Thị Minh Hiền, Đặng Diễm Hồng, Tách chiết và tinh sạch acid béo không bão hòa đã nối đôi omega-3 và omega-6 làm thực phẩm chức năng từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6. Tuyển tập Hội nghị Khoa học toàn quốc sinh học biển và phát triển bền vững lần thứ 2. Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và Công nghệ, DOI 10.1562/MBSD2.2014-0086, 2014a, 735- 743. 93. Lê Thị Thơm, Lưu Thị Tâm, Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Lan Anh, Ngô Thị Hoài Thu, Hoàng Thị Minh Hiền, Đặng Diễm Hồng, Tách chiết và làm giàu 140 hỗn hợp acid béo ω-3 và ω-6 từ dầu tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 bằng phương pháp tạo phức với urê. Tạp chí Sinh học, 2014b, 36 (1), 73-80. 94. Đinh Thị Ngọc Mai, Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Đặng Diễm Hồng, Bước đầu nghiên cứu squalene trong một số chủng vi tảo biển phân lập ở Việt Nam. Tạp chí sinh học, 2013, 35 (3), 333 - 341. 95. L. F. Marchan, K. J. L, Chang, P. D. Nichols, W. J. Mitchell, J. L. Polglase, T. Gutierrez, Taxonomy, ecology and biotechnological applications of thraustochytrids: A review, Biotechnology Advances, 2018, 36 (1), 26 - 46. 96. D. Honda, T. Yokochi, T. Nakahara, S. Raghukumar, A. Nakagiri, K. Schaumann, T. Higashihara, Molecular phylogeny of labyrinthulids and thraustochytrids based on the sequencing of 18S ribosomal RNA gene. J. Eukaryot. Microbiol, 1999, 46, 637-647. 97. O. R. Anderson, T. Cavalier-Smith, Ultrastructure of Diplophrys parva, a new small freshwater species, and a revised analysis of Labyrinthulea (Heterokonta). Acta Protozool, 2012, 51, 291-304. 98. F. Gomaa, E. Mitchell, E. Lara, Amphitremida (Poche, 1913) is a new major, ubiquitous Labyrinthulomycete clade. PLoS One 8, 2013. 99. S. M. Adl, A. G. B Simpson, M. A. Farmer, R. A. Andersen, O. R. Anderson, J. R. Barta, S. S. Bowser, G. Brugerolle, R. A. Fensome, S. Frederiq, T. Y. James, S. Karpov, P. Kugrens, J. Krug, C. E. Lane, L. A. Lewis, J. Lodge, D. H. Lynn, D. G. Mann, R. M. McCourt, L. Mendoza, Ø. Moestrup, S. E. Mozley-Standridge, D. A. Nerad, C. A. Shearer, A. V. Smirnov, F. W. Spiegel, M. F. J. R. Taylor, The new higher level classification of eukaryotes with emphasis on the taxonomy of protists. J Eukaryot Microbiol, 2005, 52, 399-451. 100. S. M. Adl, A. G. B. Simpson, C. E. Lane, J. Lukes, D. Bass, S. S. Bowser, M. W. Brown, F. Burki, M. Dunthorn, V. Hampl, A. Heiss, M. Hoppenrath, E. Lara, L. Le Gall, D. H. Lynn, H. McManus, E. A. D. Mitchell, S. E. Mozley-Stanridge, L. W. Parfrey, J. Pawlowski, S. Rueckert, L. Shadwick, C. L. Schoch, A. Smirnov, F. W. Spiegel, The revised classification of Eukaryotes. Journal of Eukaryotic Microbiology, 2012, 59 (5), 429-493. 101. S. M. Adl, D. Bass, C. E. Lane, J. Lukeš, C. L. Schoch, A. Smirnov, S. Agatha, C. Berney, M. W. Brown, F. Burki, P. Cárdenas, I. Čepička, L. 141 Chistyakova, J. del Campo, M. Dunthorn, B. Edvardsen, Y. Eglit, L. Guillou, V. Hampl, A. A. Heiss, M. Hoppenrath, T. Y. James, A. Karnkowska, S. Karpov, E. Kim, M. Kolisko, A. Kudryavtsev, D. J. G. Lahr, E. Lara, L. Le Gall, D. H. Lynn, D. G. Mann, R. Massana, E. A. D. Mitchell, C. Morrow, J. S. Park, J. W. Pawlowski, M. J. Powell, D. J. Richter, S. Rueckert, L. Shadwick, S. Shimano, F. W. Spiegel, G. Torruella, N. Youssef, V. Zlatogursky, Q. Zhang, Revisions to the classification, nomenclature, and diversity of eukaryotes. J Eukaryot Microbiol, 2019, 66 (1), 4-119. 102. J. W. Brown, U. Sorhannus, A molecular genetic timescale for the diversification of autotrophic Stramenopiles (Ochrophyta): substantive underestimation of putative fossil ages. PLoS One 5, 2010, 1e11. 103. M. A. Ruggiero, D. P. Gordon, T. M. Orrell, Bailly N, Bourgoin T, Brusca RC, Cavalier-Smith T, Guiry MD, Kirk PM, A higher level classification of all living organisms. PLoS One, 2015, 10 (4). 104. G. W. Beakes, D. Honda, M. Thines, Systematics of the stramenopila: Labyrinthulomycota, Hyphochytriomycota and Oomycota. In: McLaughlin, D.J., Spatafora, J.W. (Eds.), The Mycota: A Comprehensive Treatise on Fungi as Experimental Systems for Basic and Applied Research. VIISystematics and Evolution. Part A. Springer, 2014, 39-97. 105. H. S. Yoon, J. D. Hackett, G. Pinto, D. Bhattacharya, The single, ancient origin of chromist plastids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, 99 (24), 15507-15512. 106. T. Cavalier-Smith, E. E. Y. Chao, Phylogeny and megasystematics of phagotrophic heterokonts (kingdom Chromista). Journal of Molecular Evolution, 2006, 62, 388 - 420. 107. S. Raghukumar, Ecology of the marine protists, the labyrinthulomycetes (Thraustochytrids and Labyrinthulids). Eur J Protistol, 2002, 38, 127-145. 108. Đặng Diễm Hồng, Hoàng Thị Lan Anh. Vi tảo biển dị dưỡng Labyrinthula, Schizochytrium, Thraustochytrium mới ở Việt Nam: Tiềm năng và thách thức. Bộ sách chuyên khảo Tài nguyên thiên nhiên và môi trường Việt Nam. Nhà Xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ, 2016, 626 trang. 142 109. Đặng Diễm Hồng, Hoàng Lan Anh, Ngô Hoài Thu, Phân lập được vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium giàu DHA ở vùng biển huyện Đảo Phú Quốc. Tạp chí Sinh học, 2008, 30 (2), 50-55. 110. Đinh Thị Ngọc Mai, Hoàng Lan Anh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Diễm Hồng. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và định tên khoa học dựa trên trình tự gen 18S rRNA của chủng Schizochytrium sp. TH 16 phân lập từ vùng rừng ngập mặn Tĩnh Gia- Thanh Hoá. Báo cáo khoa học về sinh thái và tài nguyên sinh vật. Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ ba Hà Nội, 22/10/2009. Nhà XB NN-2009, 2009, 1009-1016. 111. Hoàng Lan Anh, Đinh Thị Ngọc Mai, Đinh Thu Hằng, Đặng Diễm Hồng, Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học chủng vi tảo biển dị dưỡng giàu DHA Schizochytrium sp. TB 17 phân lập từ vùng rừng ngập mặn Điêm Điền, Thái Bình. Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2009. Công nghệ sinh học phục vụ Nông - Lâm nghiệp, Thuỷ sản, công nghiệp, Y - dược và bảo vệ môi trường, Nhà XB Đại học Thái Nguyên, 2009, 492-496. 112. G. Chen, K. W. Fan, F. P. Lu, Q. Li, T. Aki, F. Chen, Y. Jiang, Optimization of nitrogen source for enhanced production of squalene from thraustochytrid Aurantiochytrium sp, 2010, 27(4), 382-389. 113. P. Bhattacharjee, V. B. Shukla, R. S. Singhal, P. R. Kulkarni, Studies on fermentative production of squalene. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2001, 17(8), 811-816. 114. A. Nakazawa, H. Matsuura, R. Kose, S. Kato, D. Honda, I. Inouye, K. Kaya, M. M. Watanabe, Optimization of culture of the thraustochytrid Aurantiochytrium sp. strain 18W-13a for squalene production. Bioresource Technology, 2012, 109, 287-291. 115. M. M. Watanabe, Hydrocarbon – producing algae: their potential as a fossil-oil. Abstract of the 6 th Asian Pacific Phycological Forum (APPF 2011), 2011. 116. A. Nakazawa, Y. Kokubun, H. Mattsuura, N. Yonezawa, R. Kose, M. Yoshida, Y. Tanabe, E. Kusuda, D. V. Thang, M. Ueda, D. Honda, A. Mahakhant, K. Kaya, M. M. Watanabe, TLC screening of thraustochytrid strains for squalene production. Journal of Applied Phycology, 2014, 26 (1), 29 - 41. 143 117. M. Otagiri, A. Khalid, S. Moriya, H. Osada, S. Takahashi, Novel squalene- producing thraustochytrids found in mangrove water, Biosci Biotechnol Biochem, 2017, 81(10), 2034-2037. 118. G. Martins, M. C. Paulo, M. Padilha, J. Countinho, C. Cardoso, N. M. Bandarra, I. Batista, Simultaneous evaluation of the production of squalene and fatty acids by Aurantiochytrium. Journal of Marine Biology and Aquaculture, 2018, 4(1), 14-20. 119. J. J. Zhong, C. J. Yue, Plant cells: secondary metabolite heterogeneity and its manipulation. Adv Biochem Eng/Biotech, 2005, 100, 53–88. 120. C. J. Yue, Y. Jiang, Impact of methyl jasmonate on squalene biosynthesis in microalga Schizochytrium mangrovei. Process biochemistry, 2009, 44(8), 923-927. 121. N. Gohil, G. Bhattacharjee, K. Khambhati, D. Braddick, V. Singh, Engineering strategies in microorganisms for the enhanced production of squalene: Advances, challenges and opportunities. Front. Bioeng. Biotechnol, 2019, 24 pages. 122. Hoàng Thị Lan Anh, Đinh Thị Ngọc Mai, Ngô Thị Hoài Thu, Đặng Diễm Hồng, Phân lập chủng vi tảo biển dị dưỡng mới thuộc chi Thraustochytrium giàu DHA và carotenoid từ đầm ngập mặn Thị Nại – Bình Định. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2010, 8 (3A), 459-465. 123. Le Thi Thom, Nguyen Cam Ha, Hoang Minh Hien, Hoang Thi Lan Anh, Ngo Thi Hoai Thu, Dang Diem Hong, Extraction and purification of squalene from heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei PQ6. Proceedings of the 3 rd Academic Conference on Natural Science for master and PhD students from Asean countries, 11-15 November, PhomPenh, Campodia, Publishing House for Scienec and Tehcnology – 2014, 2014, 177-183. 124. Hoang Minh Hien, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Luu Thi Tam, Hoang Thi Lan Anh, Ngo Thi Hoai Thu, Dang Diem Hong, Extraction of squalene as value-added product from the residual biomass of Schizochytrium mangrovei PQ6 during biodiesel producing process. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2014, 118 (6), 632-639. 144 125. Dang Diem Hong, Hoang Thi Lan Anh, Ngo Thi Hoai Thu, Study on biological characteristics of heterotrophic marine microalga – Schizochytrium mangrovei PQ6 isolated from Phu Quoc Island, Kien Giang province, Vietnam. J. Phycol., 2011, 47 (4), 944-954. 126. E. G. Bligh, W. J. Dyer, A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol, 1959, 37, 911-917 127. A. D. L. Jara, H. Mendoza, A. Martel, C. Molina, Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii, J Appl Phycol, 2003, 15, 433-438. 128. G. L. Miller, Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 1959, 31, 426-428. 129. G. H. Rothblat, D. S. Martak, D. Kritchevsky, A quantitative colorimetric assay for squalene, Analytical Biochemistry,1962, 4, 52-56. 130. T. E. Lewis, P. D. Nichols, T. A. McMeekin, Sterol and squalene content of a docosahexaenoic acid producing thraustochytrid: influence of culture age, temperature and dissolved oxygen. Mar Biotechnol, 2001, 3, 439-447. 131. Y.M. Choo, L.N. Harrison Lau, A.N. Ma, Extraction of vitamin E, phytosterols and squalene from palm oil, US Pat 0250953, 2005. 132. C.J Pouchert, J. Behnke, The Aldrich Library of 13C and 1H FTNMR Spectra, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, 1993, WI, 46. 133. TCVN 2627 - 1993. Dầu thực vật -Phương pháp xác Ďịnh màu sắc, mùi và Ďộ trong. 134. TCVN 6120 - 2007. Dầu mỡ Ďộng thực vật -Xác Ďịnh Ďộ ẩm và hàm lượng chất bay hơi. 135. TCVN 6127 - 2010. Dầu mỡ Ďộng và thực vật -Xác Ďịnh trị số acid và Ďộ acid 136. TCVN 6126 – 2007. Dầu mỡ Ďộng và thực vật -Xác Ďịnh chỉ số xà phòng. 137. TCVN 6121 - 2010. Dầu mỡ Ďộng và thực vật -Xác Ďịnh trị số peroxit - phương pháp xác Ďịnh Ďiểm kết thúc chuẩn Ďộ Iốt (quan sát bằng mắt thường). 138. TCVN 6122 - 2010. Dầu mỡ Ďộng và thực vật -Xác Ďịnh trị số Iốt. 145 139. TCVN 4884:2005. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp Ďịnh lượng vi sinh vật trên Ďĩa thạch - Kỹ thuật Ďếm khuẩn lạc ở 30ᵒC. 140. TCVN 8275-2:2010, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - phương pháp Ďịnh lượng nấm men và nấm mốc - phần 2: kỹ thuật Ďếm khuẩn lạc trong các sản phẩm có hoạt Ďộ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0,95, 2010. 141. TCVN 7924-2:2008, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - phương pháp Ďịnh lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidara - phần 2: kỹ thuật Ďếm khuẩn lạc ở 44 C sử dụng 5-bromo-4-clo-3-indolyl β-D- glucuronid. 142. TCVN 6848:2007, Tiêu chuẩn Quốc gia, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - phương pháp Ďịnh lượng Coliform - kỹ thuật Ďếm khuẩn lạc. 143. TCVN 4829:2005, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – phương pháp phát hiện Salmonella trên Ďĩa thạch. 144. TCVN 4830-1:1999, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – phương pháp Ďịnh lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với Coagulase (Staphylococcus aureus và các loài khác) trên Ďĩa thạch – phần 1: kỹ thuật sử dụng môi trường thạch Baird - parker, 145. Tiêu chuẩn Việt Nam (2007) Thực phẩm - xác Ďịnh hàm lượng chì bằng phương pháp quan phổ hấp thụ nguyên tử, TCVN 7602:2007. 146. AOAC 999.10-2005, Lead, Cadmium, Zinc, Copper, and iron in foods. Atomic absorption spectrophotometry after microwave digestion. 147. Đỗ Trung Đàm, Phương pháp Litchfield Wilcoxon. Phương pháp xác Ďinh Ďộc tính của thuốc, Nhà xuất bản y học, 2014, 101 - 112. 148. Bộ Y tế, Quy định về thử thuốc trên lâm sàng, Thông tư số 29/2018/TT- BYT, ngày 29 tháng 10 năm 2018. 149. OECD. Drug Safety Evaluation I: Acute and subchronic toxicity assessement; USA Academy Press, 2002. 150. WHO, General Guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of Traditional Medicine, EDM/TRM, Geneva, Switzerland, 2000. 146 151. F. Denizot, R. Lang. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods, 1986, 89(2), 271- 277. 152. Hoang Minh Hien, Y. Jia, H. J. Jun, J. H. Lee, B. Y. Lee, S. J. Lee, Fucosterol Is a Selective Liver X Receptor Modulator That Regulates the Expression of Key Genes in Cholesterol Homeostasis in Macrophages, Hepatocytes, and Intestinal Cells. Agriculture food, chemistry, 2012, 11567- 11575. 153. J. Y. Lee, S. H. Mitmesser, T. P. Carr, Regulation of cellular cholesterol, In Molecular Nutrition. CABI Publishing. London, UK, 2002, 309-320. 154. Dang Diem Hong, Dinh Thi Ngọc Mai, Le Thi Thom, Nguyen Cam Ha, Bui Dinh Lam, Luu Thi Tam, Hoang Thi Lan Anh, Ngo Thi Hoai Thu, Biodiesel production from Vietnam heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei PQ6. J. Biosci. Bioeng., 2013, 116 (2), 180-185. 155. T. Yokochi, D. Honda, T. Higashihara, T. Nakahara, Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinum SR21. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1998, 49, 72 - 79. 156. S. T. Wu, S. T. Yu, L. P. Lin, Effect of culture condition on docosahexaenoic acid production by Schizochytrium sp. S31. Process Biochem., 2005, 40, 3103-3108. 157. K.W. Fan, T. Aki, F. Chen, Enhanced production of squalene in the thraustochytrid Aurantiochytrium mangrovei by medium optimization and treatment with terbinafine, World J. Microbiol. Biotechnol., 2010, 26, 1303- 1309. 158. T. Ono, The first step of oxygenation in cholesterol biosynthesis, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 292, 1283 - 1288. 159. N.S. Ryder, Terbinafine- mode of action and properties of the squalene epoxidase inhibition. Br. J. Dermato, 1992, 126 (Suppl), 2-7. 160. C. Ruckenstuhl, S. Lang, A. Poschenel, A. Eidenberger, P. K. Baral, P. Kohut, I. Hapala, K. Gruber, F. Turnowsky, Characterization of squalene epoxidase of Saccharomyces cerevisiae by applying terbinafine-sensitive variants. Antimicrob. Agents Chemother., 2007, 51, 275-284. 147 161. L. Qu, L. J. Ren, G. N. Sun, X. J. Ji, Z. K. Nie, H. Huang, Batch, fed-batch and repeated fed-batch fermentation processes of the marine thraustochytrid Schizochytrium sp. for producing docosahexaenoic acid, Bioprocess. Biosyst. Eng., 2013, 36, 1905-1912. 162. Nguyễn Hoàng Lộc, Giáo trình nhập môn Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Đại học Huế, 2007, 355. 163. N. G. Cheng, M. Hasan, A. C. Kumoro, C. F. Ling, M. Tham, Production of ethanol by fed-batch fermentation, Pertanika J. Sci. & Technol., 2009, 17, 399-408. 164. K. E. Cooksey, J. B. Guckert, S. A. William, P. R. Callis, Fluorometric determination of the neutral lipid-content of microalgal cells using nile red. J. Microbiol. Meth., 1987, 6, 333-345. 165. R. Halim, M. K. Danquah, P. A. Webley, Extraction of oil from microalgae for biodiesel production: A review. Biotechnol. Adv., 2012, 30, 709-732. 166. .E. M. Grima, E. H. Belarbi, F. G. A. Fernandez, F. G. A. Medina, Y. Chisti, Recovery of microalgal biomass and metabolites: process options and economics. Biotechnol Advances, 2003, 20 (7-8), 491-515. 167. V. K. Bajpai, R. Majumder, J. G. Park, Isolation and purification of plant secondary metabolites using column-chromatographic technique, Bangladesh J Pharmacol, 2016, 11, 844-848. 168. M. Watanabe, K. Kaya, M. Shiho, A. Nakazawa, I. Inoue, D. Honda, Novel microorganism having high squalene-producing ability, and method for producing squalene by means of same,European patent EP2650356A, 2013. 169. F. E. Gunes, Medical use of squalene as a natural antioxidant, Musbed, 2013, 3(4), 220-228. 170. CTFA, Submission of data by CTFA, Leberco Labs. Acute oral LD50*, June 11, 1971. 171. E. A. Fisher, J. E. Feig, B. Hewing, S. L. Hazen, J. D. Smith, HDL Function, Dysfunction, and Reverse Cholesterol Transport, Arterioscler Thromb. Vasc. Biol, 2012, 32(12), 2813-2820. 172. G. Silbernagel, P. Pagel, V. Pfahlert, B. Genser, H. Scharnagl, M. E. Kleber, G. Delgado, H. Ohrui, A. Ritsch, T. B. Grammer, W. Koenig, W. März. 148 High-Density Lipoprotein Subclasses, Coronary Artery Disease, and Cardiovascular Mortality. Clin. Chem., 2017, 63(12), 1886-1896. 173. S. Pallavi, B. Ganesan, R. Anandan, Beneficial Effect of Dietary Squalene supplementation on Experimentally Induced Cardiomyopathy in Rats. International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, 2013, 3, 525-533. 174. N. Guillén, S. Acín, M. A. Navarro, J. S. Perona, J. M. Arbonés-Mainar, C. Arnal, A. J. Sarría, J. C. Surra, R. Carnicer, I. Orman, J. C. Segovia, V. Ruiz- Gutiérrez, J. Osada, Squalene in a sex-dependent manner modulates atherosclerotic lesion which correlates with hepatic fat content in apoE- knockout male mice, Atherosclerosis, 2008, 197(1), 72-83. 175. K. Nakamura, M. A. Kennedy, A. Baldan, D. D. Bojanic, K. Lyons, P.A. Edwards. Expression and regulation of multiple murine ATP-binding cassette transporter G1 mRNAs/isoforms that stimulate cellular cholesterol efflux to high density lipoprotein. J. Biol. Chem, 2004, 279, 25989–45980. 176. N. Wang, D. Lan, W. Chen, F. Matsuura, ATP-binding cassette transporters G1 and G4 mediate cellular cholesterol efflux to high-density lipoproteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101, 9774-9779. 177. K. Wouters, R. Shiri-Sverdlov, P. J. van Gorp, M. van Bilsen, M. H. Hofker, Understanding hyperlipidemia and atherosclerosis: lessons from genetically modified apoe and ldlr mice. Clin Chem Lab Med, 2005, 43, 470-479. 178. D. J. Peet, S. D. Turley , W. Ma , B. A. Janowski , J. M. Lobaccaro , R. E. Hammer , D. J. Mangelsdorf , Cholesterol and bile acid metabolism are impaired in mice lacking the nuclear oxysterol receptor LXRa. Cell, 1998, 93, 693-704. 179. H. X. Dang, Y. Liu, W. Pang, C. H. Li, N. P. Wang, J. Y. J. Shyy, Y. Zhu, Suppression of 2,3-oxidosqualene cyclase by high fat diet contributes to liver X receptor-α-mediated improvement of hepatic lipid profile. J Chem Biol, 2009, 284, 621. PHỤ LỤC 1/ PHỤ LỤC 1 Phƣơng pháp xác định sơ bộ hàm lƣợng squalene bằng phƣơng pháp so màu (Chƣơng 2, phần 2.2.1.6) Hình P1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng squalene chuẩn và OD400 Trong Ďó: y- Hàm lượng squalene (mg/g); x - giá trị OD400 y = 6.5893x + 0.1504 R2 = 0.9966 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Hàm lượng squalene (mg) O D 4 0 0 2/PHỤ LỤC 2 Phƣơng pháp tách chiết RNA, tổng hợp cDNA, trong nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipit của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro (Chƣơng 2, phần 2.2.4.2) 2.1. Tách chiết RNA tổng số theo kit RNAiso Plus Chuyển dịch trên sang ống mới, bổ sung 1V = 500 µL isopropanol Voltex mạnh, giữ 5 phút ở nhiệt Ďộ phòng Chuyển dịch trên sang ống mới, bổ sung 0,2V = 100 µL chloroform Tế bào nuôi cấy Bổ sung V=500 µL RNAISO Plus Giữ 5 phút ở nhiệt Ďộ phòng Ly tâm 12000 g/5 phút/4 ᵒC Ly tâm 12000 g/15 phút/4 ᵒC Giữ 10 phút ở nhiệt Ďộ phòng Ly tâm 12000 g/10 phút/4 ᵒC, thu tủa (RNA) Rửa RNA bằng 75% ethanol Ly tâm 7500 g/5 phút/4 ᵒC Thu tủa và hong khô tủa Hòa tan tủa bằng nước khử ion Ďã Ďược xử lý DEPC (50µL) Hình P2. Quy trình tách chiết RNA tổng số theo kit RNAISO Plus 2.2. Tổng hợp cDNA theo kit RevertAid First Strand cDNA cDNA Ďược tổng hợp từ 1 mg RNA tổng số theo hướng dẫn của kít Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Syntheisis Kit (Thermo Scientific, Singapore). - Bước 1: Tạo khuôn cDNA. Bổ sung hóa chất theo thứ tự và hàm lượng vào ống eppendorf không có nuclease như sau: STT Hóa chất Hàm lƣợng 1 RNA tổng số 1 mg 2 Oligo (dT)18 primer, 100 M 1 L 3 Nước không có nuclease Ďến 12 L Tổng thể tích 12 L - Bước 2: Tổng hợp cDNA Tiếp tự bố sung các thành phần vào ống eppdendorf có chứ khuôn cDNA theo thứ tự như sau: STT Hóa chất Hàm lƣợng 1 5X Reaction buffer 4 L 2 RiboLock RNAase Inhibitor(20U/L) 1 L 3 100 mM dNTP 2 L 4 RevertAid M-MuLV RT (200U/L) 1 L Tổng thể tích 20 L + Trộn Ďều và ly tâm nhanh. + Ủ ở 42 C trong thời gian 60 phút. + Dừng phản ứng bằng cách ủ mẫu ở 70 C trong thời gian 5 phút. + Mẫu cDNA sau Ďó Ďược giữ ở -20 C cho các thí nghiệm phân tích theo 3/ PHỤ LỤC 3 (Chƣơng 3, phần 3.3.4) Hình P3. Phiếu kết quả thử nghiệm sản phẩm squalene của Trung tâm chứng nhận phù hợp (Quacert), Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng, Bộ Khoa học và Công nghệ. 4/PHỤ LỤC 4 5/PHỤ LỤC 5 Hình P5. Ảnh minh họa quá trình tách chiết squalene thô từ sinh khối tảo khô chủng S. mangrovei PQ6 Hình P4. Hình ảnh minh họa cho lên men theo mẻ có bổ sung Ďường của chủng S. mangrovei PQ6 ở hệ thống bình lên men 30 Lít. 6/PHỤ LỤC 6 7. PHỤ LỤC 7  Tốc Ďộ sinh trưởng Ďặc trưng (ký hiệu là có Ďơn vị là /ngày) Ďược tính theo công thức: µ = (ln Nt – ln N0) / (tt – t0) Trong Ďó: Nt, N0 là MĐTB ở thời Ďiểm t và thời Ďiểm ban Ďầu t0 (TB/mL); t là thời gian (ngày)  Thời gian nhân Ďôi thế hệ (ký hiệu là Dt): Dt = ln 2/ . Trong Ďó: là tốc Ďộ sinh trưởng Ďặc trưng của tảo.  Năng suất tảo (TB/mL/ngày) Ďược tính bằng công thức: Năng suất tảo = (Nt – N0) / (tt – t0). Trong Ďó: Nt và N0 là MĐTB ở thời Ďiểm t và thời Ďiểm ban Ďầu t0 (TB/mL); t là thời gian (ngày). Hình P6. Ảnh minh họa quá trình tách chiết squalene thô từ dịch tế bào chủng S. mangrovei PQ6 Bảng 3.2.Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên hàm lượng và sản lượng squalene trong quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất của tế bào S. mangroveei PQ6 Thời gian (h) Mật độ tế bào (106 tb/mL) Sinh khối khô (g/L) Tốc độ sinh trƣởng đặc trƣng (µ; /ngày) Có VTM Không VTM Có VTM Không VTM Có VTM Không VTM 0 0,90 ± 0,07 0,90 ± 0,21 - - 24 222,35 ± 13,71 45,44 ± 2,63 24,43 ± 0,41 12,25 ± 1,36 5,51 3,92 36 271,00 ± 12,53 203,52 ± 9,66 39,33 ± 1,59 27,95 ± 0,77 3,80 3,61 Bổ sung glucose 12 262,03 ± 17,70 226, 52 ± 6,12 44,10 ± 2,09 42,69 ± 3,19 24 309,17 ± 7,42 278,18 ± 8,03 60,56 ± 1,95 42,63 ± 1,72 0,33 0,41 48 369,35 ± 7,94 300,9 ± 5,14 75,41 ± 1,35 59,36 ± 2,42 0,23 0,05 72 381,97 ± 5,63 345,4 ± 3,18 99,28 ± 1,48 79,85 ± 0,82 0,15 0,06 96 374,93 ± 9,45 359,6 ± 5,56 105,25 ± 0,75 92,93 ±1,59 0,102 0,01 120 298,81 ± 8,23 202,53 ± 9,58 100,10 ± 0,18 90,37 ±1,06 0,03 -0,13 Như vậy tốc Ďộ sinh trưởng Ďặc trưng cao nhất tại thời Ďiểm 24h có vitamin trước khi bổ sung glucose với giá trị µ là 5,51/ngày và mật Ďộ tế bào tảo Ďạt cao nhất là ở thời Ďiểm sau 72 h bổ sung glucose ở môi trường có vitamin 8/PHỤ LỤC 8 Hình P7. Ảnh minh họa các lô thí nghiệm trên mô hình Ďộng vật thực nghiệm Ďược thực hiện tại Bộ môn Dược lý, Học viện Quân y, Bộ Quốc Phòng. 9/ PHỤ LỤC