Luận án Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theobroma cacao l.) chuyển gen

n cứu đã tiến hành khảo sát, đánh giá khả năng hình thành mô sẹo, phôi soma sơ cấp, thứ cấp, khả năng nảy mầm, ra rễ và phát triển thành cây của phôi soma từ nguồn vật liệu là nhị lép, cánh hoa của 9 dòng ca cao thương mại ở Việt Nam. Kết quả cho thấy, mô sẹo của các dòng ca cao TD1, TD3, TD5, TD7, TD8 và TD9 có khả năng hình thành phôi soma sơ cấp với tỷ lệ dao động từ 2,6 - 44,0%. Trong đó, dòng TD8 có tỷ lệ tạo phôi soma cao nhất (44,0%). Phôi soma thứ cấp thu được từ trục mầm và lá mầm của 5 dòng TD1, TD3, TD5, TD7, TD8 với tỷ lệ dao động từ 5,0 - 48,5%. Các phôi soma của các dòng TD1, TD3, TD5, TD7, TD8, TD9 đểu có khả năng nảy mầm thành cây hoàn chỉnh và phát triển bình thường ở nhà lưới. 2. Gen mã hóa chitinase (TcChi1) đã được phân lập thành công từ hệ gen của cây ca cao dòng TD3 và được đăng ký trên Ngân hàng gen Quốc tế với mã số KF268030. Vector biểu hiện trong thực vật pCB301 mang gen TcChi1 đã được đánh giá hoạt động trên cây thuốc lá mô hình. 3. Quy trình chuyển gen sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA105 vào phôi soma của dòng ca cao TD8 đã được chuẩn hóa thông qua gen chỉ thị gus/gusplus và tạo được 3 dòng ca cao mang gen chỉ thị gusplus. Hiệu quả chuyển gen dao động từ 0 - 1,4% dựa vào kết quả PCR dương tính của các cây tái sinh vượt qua giai đoạn chọn lọc. 4. Gen mã hóa chitinase TcChi1 đã được chuyển thành công vào dòng ca cao TD8 thông qua A. tumefaciens và thu được 2 dòng ca cao TD8 mang gen TcChi1 ở thế hệ T0 là TD8/pCB/TcChi1/2 và TD8/pCB/TcChi1/3 với hiệu quả chuyển gen cao nhất là 0,57%. Khả năng gắn kết ổn định của gen TcChi1 trong các cây ca cao chuyển gen đã được khẳng định bằng kết quả lai Southern. ĐỀ NGHỊ 1. Tiếp tục triển khai thí nghiệm biến nạp gen TcChi1 để thu thêm các dòng ca cao mang gen TcChi1. 103 2. Tiếp tục theo dõi và đánh giá các dòng ca cao tái sinh in vitro và chuyển gen ngoài nhà lưới qua các thế hệ. 3. Thử nghiệm sinh học khả năng kháng nấm của các dòng ca cao chuyển gen mã hóa chitinase. 104 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Lê Thị Thu Hiền, Hà Hồng Hạnh, Trần Thị Ngọc Diệp (2010). Nghiên cứu khả năng tái sinh invitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen: Hiện trạng và triển vọng. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(4): 1761-1773. 2. Hà Hồng Hạnh, Lê Thanh Hương, Lê Thị Thu Hiền (2013). Phân lập gen mã hóa chitinase và thiết kế các vector biểu hiện thực vật. Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2013, 82-86. 3. Hà Hồng Hạnh, Đỗ Tiến Phát, Chu Hoàng Hà, Lê Thị Thu Hiền (2013). Nghiên cứu khả năng tái sinh invitro thông qua phôi soma của một số dòng ca cao thương mại và có triển vọng thương mại ở Việt Nam. Tạp chí Công nghệ Sinh học 11(1): 107-114. 4. Hà Hồng Hạnh, Nông Văn Hải, Lê Thị Thu Hiền (2013). Nghiên cứu khả năng hình thành và tái sinh cây in vitro từ phôi soma thứ cấp của một số dòng ca cao ở Việt Nam. Tạp chí Công nghệ Sinh học 11(4): 697-703. 5. Hà Hồng Hạnh, Nông Văn Hải, Lê Thị Thu Hiền (2014). Nghiên cứu chuyển gen vào dòng ca cao thương mại TD8 ở Việt Nam thông qua Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Công nghệ Sinh học 12(2): 255-260. 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Aguilar ME, Villalobos VM, Vasquez N (1992) Production of cocoa plant (Theobroma cacao L.) via micrografting of somatic embryos. In Vitro Cell Dev Biol 28: 15-19. 2. Aime MC, Phillips-Mora W (2005) The causal agents of witches’ broom and frosty pod rot of cacao (chocolate, Theobroma cacao) form a new lineage of Marasmiaceae. Mycologia 97: 1012-1022. 3. Alemanno L, Berthouly M, Michaux-Ferrière N (1996) Histology of somatic embryogenesis from floral tissues cocoa. Plant Cell Tiss Organ Cult 46: 187-194. 4. Allen G, Hall G, Michalowski S, Newman W, Spiker S, Weissinger A, Thompson W (1996) High-level transgene expression in plant cells: Effects of a strong scaffold attachment region from tobacco. Plant Cell Rep 8: 899-913. 5. Antúnez de Mayolo G, Maximova SN, Pishak S, Guiltinan MJ (2003) Moxalactam as a counter-selection antibiotic for Agrobacterium-mediated transformation and its positive effects on Theobroma cacao somatic embryogenesis. Plant Sci 164(4): 607-615. 6. Appiah AA, Flood J, Archer SA, Bridge PD (2004) Molecular analysis of the major Phytophthora species on cocoa. Plant Pathol 53: 209-219. 7. Arakane Y, Muthukrishnan S (2010) Insect chitinase and chitinase-like proteins. Cell Mol Life Sci :67201-67216. 8. Arout X, Salse J, Aury JM, Guiltinan MJ, Droc G, Gouzy J (2011) The genome of Theobroma cacao L. Nat Genet 43: 101-110. 9. Bae H, Kim SH, Kim MS, Sicher RC, Lary D, Strem MD, Natarajan S, Bailey BA (2008) The drought response of Theobroma cacao (cacao) and the regulation of genes involved in polyamine biosynthesis by drought and other stresses. Plant Physiol Biochem 46(2): 174-188. 10. Bennett A (2003) Out of the Amazon: Theobroma cacao enters the genomic era. Trends Plant Sci 8(12) : 561-563. 11. Beranova´ M, Rakousky´ S, Va´vrova´ Z, Skalicky´ T (2008) Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linux usitatissimum L.). Plant Cell Tiss Organ Cult 94: 253-259. 12. Boller T (1987) Hydrolytic enzymes in plant disease resistance. In: Koshuge T and Nester EW (eds). Plant-Microbe Interactions Molecular and Genetic Perspectives New York: Macmillan: 3385-3411. 106 13. Bowers JH, Bailey BA, Hebbar PK, Sanogo S, Lumsden RD (2001) The impact of plant diseases on worldwide chocolate production (APSNet; Plant Health Progress 14. Broglie K, Chet I, Holliday M, Cressman R, Biddle P, Knowlton S, Mauvais CJ, Broglie R (1991) Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia solani. Science: 2541194-2541197. 15. Broothaerts W, Mitchell HJ, Weir B, Kaines S, Smith LMA, Yang W, Mayer JE, Roa-Rodriguez C, Jefferson RA (2005) Gene transfer to plants by diverse species of bacteria. Nature 433: 629-633. 16. Bùi Thị Thu Hương (2015) Ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng hoa Lilium có khả năng chịu nóng. Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội. 17. Bùi văn Thắng, Lê văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013) Nghiên cứu tạo cây Xoan ta (Melia azedarach L.) chuyển gen P5CSm tăng cường khả năng chịu hạn. Tạp chí Nông Nghiệp & PTNT 1: 203-208. 18. Carstens M, Vivier MA, Pretorius IS (2003) The Saccharomyces cerevisiae chitinase, encoded by the CTS1-2 gene, confers antifungal activity against Botrytis cinerea to transgenic tobacco. Transgen Res: 12497-12508. 19. Chen XL, Song RT, Yu MY, Sui JM, Wang JS, Qiao LX (2015) Cloning and functional analysis of the chitinase gene promoter in peanut. Genet Mol Res 14(4): 12710-12722. 20. Chu Hoàng Lan, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2010) Nghiên cứu quy trình tái sinh và chuyển gen cho giống khoai tây Diamant thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3A): 425-431. 21. Chu Văn Mẫn (2003) Ứng dụng tin học trong sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 22. Collinge DB, Kragh KM, Mikkelsen JD, Nielsen KK, Rasmussen U, Vad K (1993) Plant chitinases. Planta 3(1): 31-40. 23. Couch JA, Zintel HA, Fritz PJ (1993) The genome of the tropical tree Theobroma cacao L. Mol Genet 237: 123-128. 24. Coutinho PMHB (1999) Carbohydrate-active enzymes: An integrated database approach. In: Gilbert HH, Davies GJ, Henrissat H, Svensson B (eds). Recent advances in carbohydrate bioengineering Royal Soc. Chemistry, Cambridge, UK3-12. 107 25. Desai PNSN, Padh H (2010) Production of heterologous proteins in plants: Strategies for optimal expression. Biotechnol Adv 28:427-435. 26. Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2011) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa gibberellins 20-oxidase vào cây Xoan ta (Melia azedarach L.) bằng Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(2): 217-222. 27. Draper J, Scott R, Armittage P (1988) Plant genetic transformation and gene expression. Lab Manual: 3-26. 28. Driver JA, Kuniyuki AH (1984) In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. Hort Sci 19: 507-509. 29. Eilenberg H, Pnini-Cohen S, Schuster S, Movtchan A, Zilberstein A (2006) Isolation and characterization of chitinase genes from pitchers of the carnivorous plant Nepenthes khasiana. J Exp Bot 57: 2775-2784. 30. Esan E (1992) Micropropagation of cocoa (Theobroma cacao L.). In: Bajaj YPS (eds) Biotechonology in agriculture and forestry. 18: 96-122. 31. Fiedler J, Philips J, Artsaenko O, Conrad U (1997) Optimization of scFv antibody production in transgenic plants. Immunotechnology 3: 205-216. 32. Figueira A, Janick J (1993) Development of nucellar somatic embryos of Theobroma cacao. Acta Hortic 336: 231-236. 33. Florez SL, Erwin RL, Maximova SN, Guiltinan MJ, Curtis WR (2015) Enhanced somatic embryogenesis in Theobroma cacao using the homologous BABY BOOM transcription factor. BMC Plant Biology 15:121. 34. Flynn WP, Glicenstein LJ, Fritz PJ (1990) Theobroma cacao L.: An axillary bud in vitro propagation procedure. Plant Tiss Organ Cult 20: 111-117. 35. Furtek D (1994) Genetic transformation of cocoa tree, Theobroma cacao L. Final report of Project Number: 10.139. Grant Number: COM-5600-G-00-0024-00. US Agency for International Development. 36. Galloway G, Malmberg R, Price R (1998) Phylogenetic utility of the nuclear gene arginine decarboxylase: an example from Brassicaceae. Mol Biol Evol 15(10): 1312-1320. 37. Garcia-casado G, Collada C, Allona I, Casado R, Pacios LF, Aragoncillo C, Gomez L (1998) Site directed mutagenesis of active site residues in a class I endochitinase from chestnut seeds. Glucobiology 8: 1021-1028. 108 38. Gooday GW (1996) Aggresive and Defensive Roles for Chitinases In: Muzzarelli RAA (eds) Chitin Enzymology Atec Edizioni, Italia 2:125- 133. 39. Guiltinan M, Verica J, Zhang D, Figueira A (2008) Genomics of tropical crop plants. In: P H Moore, R Ming (eds) The food of the Gods. Springer. 40. Guyton B, Lumsden R, Matlick B (2003) Strategic plan for sustainable cocoa production. Manuf Conf 83: 55-60. 41. Hedrick S, Bell JN, Boller T, Lamb CJ (1988) Chitinase cDNA cloning and mRNA induction by fungal elicitor, wounding and infection. Plant Physiol 86: 182-186. 42. Helliwell EE, Vega-Arreguín J, Shi Z, Bailey B, Xiao S, Maximova SN, Tyler BM, Guiltinan MJ (2015) Enhanced resistance in Theobroma cacao against oomycete and fungal pathogens by secretion of phosphatidylinositol-3-phosphate- binding proteins. J Plant Biol: 1-12. 43. Holster M, De Waele D, Depicker A, Messens E, Van Montagu M, Schell J (1987) Transfection and transformation of A. tumefaciens. Mol Gen 163: 181- 187. 44. Iqbal MM, Nazir F, Ali S, Asif MA, Zafar Y, Iqbal J, Ali GM (2012) Over expression of rice chitinase gene in transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) improves resistance against leaf spot. Mol Biotech 50(2): 129-136. 45. Jabeen N, Chaudhary Z, Gulfraz M, Rashid H, Mirza B (2015) Expression of Rice Chitinase Gene in Genetically Engineered Tomato Confers Enhanced Resistance to Fusarium Wilt and Early Blight. Plant Pathol J 31(3): 252 - 258. 46. Jach G, Gornhardt B, Mundy J, Logemann J, Pinsdorf E, Leah R, Schell JCM (1995) Enhanced quantitative resistance against fungal disease by combinatorial expression of different barley antifungal proteins in transgenic tobacco. Planta: 897-109. 47. Jefferson R (1987) GUS fusion: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6(13): 3901-3907. 48. Jollès P, Muzzarelli RAA (1999) Chitin and chitinases (Eds.). Birkhauser Verlag, Basel. ISBN 3-7643-5815-7. 49. Kale SD, Gu B, Capelluto DG, Dou D, Feldman E, Rumore A, Arredondo FD, Hanlon R, Fudal I, Rouxel T, Lawrence CB, Shan W, Tyler BM (2010) External lipid PI3P mediates entry of eukaryotic pathogen effectors into plant and animal host cells. Cell Mol Life Sci 142: 284 - 295. 109 50. Karmakar S, Molla KA, Chanda PK, Sarkar SN, Datta SK, Datta K (2015) Green tissue-specific co-expression of chitinase and oxalate oxidase 4 genes in rice for enhanced resistance against sheath blight. Planta DOI: 10.1007/s11274-013- 1546-3. 51. Kasprzewska A (2003) Plant chitinases--regulation and function. Cell Mol Biol Lett 8(3): 809-824. 52. Kawase T, Saito A, Sato T, Kanai R, Fujii T, Nikaidou N, Miyashita YKWT (2004) Distribution and phylogenetic analysis of family 19 chitinases in Actinobacteria. Appl Environ Microbiol :701135-701144. 53. Keen C, Holt R, Oteiza P, Fraga C, Schmitz H (2005) Cocoa antioxidants and cardiovascular health. Am J Clin Nutr 81(1): 298-303. 54. Koga D, Hoshika H, Matsushita M, Tanaka A, Ide AMK (1996) Purification and characterization of β-N-acetylhexosaminidase from the liver of a prawn, Penaeus japonicus. Biosci Biotech Biochem 60(2): 194-199. 55. Kramer KJ, Corpuz L, Choi HKSM (1993) Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta. Insect Biochem Mol Biol: 23691-23701. 56. Kramer KJ, Muthukrishnan S (1997) Insect chitinases: Molecular biology and potential use as biopesticides. Insect Biochem Mol Biol : 27887-27900. 57. Langner T, Göhre V (2015) Fungal chitinases: Function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Curr Genet DOI: 10.1007/s00294-015-0530. 58. Leila P, Ali AH, Maryam JK, Ahmad K, Zahra T (2012) Agrobacterium- mediated transformation of chitinase gene in Rosa damascena cv. Ghamsar. Annal Biol Res 3(6): 2843-2850. 59. Li F, Hao C, Yan L, Wu B, Qin X, Lai J, Song Y (2015) Gene structure, phylogeny and expression profile of the sucrose synthase gene family in cacao (Theobroma cacao L.). J Genet 94: 461 - 472. 60. Li F, Wu B, Qin X, Yan L, Hao C, Tan L, Lai J (2014) Molecular cloning and expression analysis of the sucrose transporter gene family from Theobroma cacao L. J Gene 546: 336 - 341. 61. Li Z, Traore A, Maximova S, Guiltinan M (1998) Somatic embryogenesis and plant regeneration from floral explants of cacao (Theobroma cacao L.) using thidiazuron. In vitro Cell Dev Biol Plant 34: 293-299. 110 62. Litz R (1986) Tissue culture studies with Theobroma cacao. In: Dimick PS (eds) Proe Cacao Biotechnol Symp. Pensylvania State Univ, University Park : 111- 120. 63. Liu M, Sun ZX, Zhu J, Xu T, Harman GE, Lorito M (2004) Enhancing rice resistance to fungal pathogens by transformation with cell wall degrading enzyme genes from Trichoderma atroviride. J Zhejiang Univ Sci: 5133-5136. 64. Lu CY (1993) The use of thidiazuron in tissue culture. In Vitro Cell Dev Biol 29: 92-96.65. Matsumoto K (2006) Fungal chitinases. In: Gerardo, R., Guevara- Gonzales and I. Torres-Racheco (eds) Advances In Agricultural and Food Biotechnology. Research Signpost Kerala, India, ISBN-13: 97881773692695: 289-304. 66. Maximova NS, Laurence A, Ann Y, Nicole F, Abdoulaye T, Mark JG (2002) Efficiency, genotypic variability, and cellular origin of primary and secondary somatic embryogenesis of Theobroma cacao L. In Vitro Cell Dev Biol Plant 38: 252-259. 67. Maximova S, Young A, Pishak S, Miller C, Traore A, Guiltinan M J (2005) Integrated system for propagation of Theobroma cacao L. In: Jain SM; Gupta PK (eds) Protocols for somatic embryogenesis in woody plants. Dordrecht, The Netherlands: 209-229. 68. Maximova SN, Marelli JP, Young A, Pishak S, Verica JA, Guiltinan MJ (2006) Over-expression of a cacao class I chitinase gene in Theobroma cacao L. enhances resistance against the pathogen Colletotrichum gloeosporioides. Planta 224(4):740-749. 69. Maximova SN, Miller C, Mayolo GA, Pishak S, Young A, Guiltinan MJ (2003) Stable transformation of Theobroma cacao L. and influence of matrix attachment regions on GFP expression. Plant Cell Rep 21: 872-883. 70. Maximova SN, Young A, Pishak S, Guiltinan MJ (2008) Field performance of Theobroma cacao L. plants propagated via somatic embryogenesis. In vitro Cell Dev Biol Plant 44: 487-493. 71. Mayola GA, Maximova SN, Pishak S, Guiltinan MJ (2003) Moxalactam as a counter - selection antibiotic for Agrobacterium - mediated transformation and its positive effects on Theobroma cacao somatic embryogenesis. Plant Sci 164 : 607-615. 111 72. Mediavilla J, Jain S, Kriakov J, Ford ME, Duda RL, Jacobs WRJ, Hendrix RW (2000) Genome organization and characterization of mycobacteriophage Bxb1. Mol Microbiol: 38955-38970. 73. Michels A, Van Den Ende W, Tucker M, Van Riet L, Van Laere A (2003) Extraction of high-quality genomic DNA from latex-containing plants. Analytic Biochem 315(1): 85-89. 74. Minyaka E, Koffi K. E., Issali E. A., Sangare A., D. ON (2008) Effect of MgSO4 and K2SO4 on somatic embryo differentiation in Theobroma cacao L. Plant Cell Tiss Organ Culture 94:149-160. 75. Motamayor JC, Lachenaud P, da Silva, e Mota JW, Loor R, Kuhn DN, Steven Brown J, Schnell RJ (2008) Geographic and genetic population differentiation of the Amazonian Chocolate Tree (Theobroma cacao L.). PLoS ONE 3:3311. 76. Motamayor JC, Mockaitis K, Schmutz L, Haiminen N, et al. (2013) The genome sequence of the most widely cultivated cacao type and its use to identify candidate genes regulating pod color. Genome Biol 14: 53. 77. Murashige T, Skoog F (1962) Arevised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 473-497. 78. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Thanh Phương, Hồ Thị Thu Thanh, Lê Hải Hà, Hoàng Thị Giang, Nguyễn Thị Hòa Vân, Trịnh Thị Huê (2009) Nhân nhanh in vitro và xác định sự biểu hiện của gen chuyển ở các dòng đồng tiền được chuyển gen. Hội nghị Quốc gia về Sinh vật biến đổi gen và Quản lý an toàn sinh học: 81-87. 79. Nguyễn Thị Hải Yến (2012) Nghiên cứu tạo cây cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá do virus bằng kỹ thuật chuyển gen. Luận án Tiến sĩ sinh học. 80. Nguyễn Thị Thanh, Võ Phan Mi Sa, Lê Tấn Đức (2009) Nghiên cứu chuyển gen gna kháng rầy rệp vào giống hồ tiêu Karimunda. Hội nghị Quốc gia về Sinh vật biến đổi gen và Quản lý an toàn sinh học: 165-170. 81. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2012) Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của virus H5N1 phục vụ sản xuất vaccine thực vật. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên 89(1): 123-127. 82. Nguyễn Văn Đồng (2011) Hoạt động của Promoter OsNAC6 tăng cường khả năng chống chịu trên dòng lúa Việt Nam chuyển gen CH1. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam 4(25): 112-117. 112 83. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Hữu Kiên, Trần Thị Cúc (2012) Kết quả bước đầu trong nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cry1b ở đậu tương. Tạp chí Khoa học và Công nghệ nông nghiệp Việt Nam 9(39): 125-131. 84. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Phạm Thị Hương, Lê Thị Lan, Nguyễn Thị Hòa, Nguyễn Anh Vũ, Phạm Thị Thu Hà, Lê Huy Hàm (2013) Nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen kháng sâu. Hội thảo quốc gia về khoa học cây trồng lần thứ nhất: 409-415. 85. Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013) Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật (Methods in plant physiology). Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 86. Niemenak N, Katja S-S, Christina R, Denis ON, Reinhard L (2008) Regeneration of somatic embryos in Theobroma cacao L. in temporary immersion bioreactor and analyses of free amino acids in different tissues. Plant Cell Rep 27: 667-676. 87. Nirala NK, Das DK, Srivastava PS, Sopory SK, Upadhyaya KC (2010) Expression of a rice chitinase gene enhances antifungal potential in transgenic grapevine (Vitis vinifera L.). Vitis 49(4): : 181-187. 88. Noval FJ, Donini B, Owusu G (1986) Somatic embryogenesis and in vitro plant development of cocoa (Theobroma cacao). In: Proe In Symp Nuclear techniques and in vitro culture for plant improvement IAEA Vienna. : 443-449. 89. Núñez de Cáceres González FF, Davey MR, Cancho Sanchez E, Wilson ZA (2015) Conferred resistance to Botrytis cinerea in Lilium by overexpression of the RCH10 chitinase gene. Plant Cell Rep 34(7): 1201 - 1209. 90. Ohnuma T, Taira T, Yamagami T, Aso Y, Ishiguro M (2004) Molecular cloning, functional expression, and mutagenesis of cDNA encoding class I chitinase from rye (Scale cereal) seeds. Biosci Biotechnol Biochem 68: 324-332. 91. Oliveira MLP, Febres VJ, Costa MGC, Moore GA, Otoni WC (2009) High efficiency Agrobacterium-mediated transformation of citrus via sonication and vacuum infiltration. Plant Cell Rep 28: 387-395. 92. Pence VC (1989) Cacao (Theobroma cacao L.). In: Bajaj YPS (eds) Biotechnology in agriculture and forestry. Springer Berlin Heidelberg New York 5: 203-221. 93. Pence VC, Hasegawa PM, Janick J (1980) Initiation and development of asexual embryos of Theobroma cacao L. in vitro. Z Pflanzenphysiol 98: 1-14. 113 94. Perry M, Power J, Lowe K (2000) Biolistic transformation of cacao (Theobroma cacao L.). Trop Agric 77: 64-66. 95. Phạm Hồng Đức Phước (2009) Kỹ thuật trồng ca cao ở Việt Nam. NXB Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh 96. Phạm Thị Lý Thu, Nguyễn Văn Đồng, Lê Huy Hàm (2011) Kết quả bước đầu trong nghiên cứu chuyển gen kháng nguyên Hemagglutinin của virus H5N1 vào bèo tấm Spirodela polyrrhiza bằng súng bắn gen. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam 9(30): 100-104. 97. Phan Thị Thu Hiền, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà (2015) Quy trình chuyển gen hiệu quả vào phôi soma của giống mía ROC22 (Saccharum officinarum L.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Khoa học, chuyên san Khoa học tự nhiên và Công nghệ 31(4): 108 - 114. 98. Phan Tường Lộc, Hoàng Văn Dương, Mai Trường, Lê Tấn Đức, Trần Thị Ngọc Hà, Văn Đắc Thành, Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh, Hổ NH (2014) Chuyển gen kháng sâu cry1Ab, cry1B-cry1Ab vào cây mía (Saccharum officinarum L.). Tạp chí Khoa học và Phát triển 12(7): 1058 - 1067. 99. Plett JM, Kemppainen M, Kale SD, Kohler A, Legue V, Brun A, Tyler BM, Pardo AG, Martin F (2011) A secreted effector protein Laccaria bicolor is required for symbiosis development. Curr Biol 21: 1197- 1203. 100. Punja ZK, Zhang Y (1993) Plant chitinases and their roles in resistance to fungal diseases. J Nematol 25(4) : 526-540. 101. Purdy LH, Dickstein ER (1989) Theobroma cacao, a host for Agrobacterium tumefaciens. Plant Dis 73: 638-639. 102. Quainoo AK, Wetten AC, Allainguillaume J (2008) The effectiveness of somatic embryogenesis in eliminating the cocoa swollen shoot virus from infected cocoa trees. J Virol Methods 149: 91-96. 103. Renner T, Specht CD (2012) Molecular and functional evolution of class I chitinase for plant carnivory in the caryophyllales. Mol Biol Evol 29(10):2971-85. 104. Rice R, Greenberg R (2003) The Chocolate Tree: Growing cacao in the forest. Nat His 112: 36-43. 105. Rifat H, Minhaj AK, Mahboob A, Malik MA, Javed M, Saleem J (2013) Chitinases: An update. J Pharm Bioallied Sci 5(1): 21-29. 106. Rober WK, Selitremennikoff CP (1988) Plant and bacterial chitinase difer in antifugal activity. J Gen Microbiol 134: 169-176. 114 107. Sain SL, Oduro KK, Furtek DB (1994) Genetic transformation of cocoa leaf cells using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Tiss Organ Cult 37 : 342-351. 108. Sambrook J, Russell D (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Chapter 8, In vitro amplification of DNA by the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Lab Press, NY. 109. Santos M, Albuquerque de Barros E, Tinoco M, Brasileiro A, Aragão F (2002) Repetitive somatic embryogenesis in cacao and optimisation of gene expression by particle bombardment. J Plant Biotech Lett 4 : 71-76. 110. Seidl V, Huemer B, Seiboth B, Kubicek CP (2005) A complete survey of Trichoderma chitinase reveal three distinct subgroups of family 18 chitinase. J FBBS 272: 5923-5939. 111. Silva TER, Cidade LC, Alvim FC, Cascardo JCM, Costa MGC (2009) Studies on genetic transformation of Theobroma cacao L.: Evaluation of different polyamines and antibiotics on somatic embryogenesis and the efficiency of uidA gene transfer by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Tiss Organ Cult 99:287- 298. 112. Singh HR, Deka M, Das S (2015) Enhanced resistance to blister blight in transgenic tea (Camellia sinensis [L.] O. Kuntze) by overexpression of class I chitinase gene from potato (Solanum tuberosum). Funct Integr Genomics 15(4): 461 - 480. 113. Snyder T (1994) Isolation and characterization of a genomic chitinase clone form Theobroma cacao L. Intercollege Program in Plant Physiology The Pennsylvania State University. 114. Sondahl MR, Liu S, Bellato C (1993) Cacao somatic embryogenesis. Acta ttortic 336: 245-248. 115. Souki HB (2009) Development of protocol for Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of cocoa (Theobroma cacao). MSc. Thesis. School of Science and Technology, University Malaysia Sabah. 116. Spiker S, Thompson W (1996) Nuclear matrix attachment regions and transgene expression in plants. Plant Physiol 110:15-21. 117. Tôn Thất Thân, Nguyễn Thị Thanh (2010) Chuyển gen ipt vào giống hoa phong lan Dendrobium Sonia Earsakul nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí công nghệ Sinh học 8(3A): : 567-572. 115 118. Traore A, Maximova SN, Guiltinan MJ (2003) Micropropagation of Theobroma cacao L. using somatic embryo-derived plants. In Vitro Cell Dev Biol Plant 39: 332-337. 119. Utro F, Cornejo OE, Livingstone D, Motamayyor JC, Parida L (2012) ARG- based-genome-wide analysis of cacao cultivas. BMC Bioinforma 13 (Suppl.19), S17. 120. Wang YC, Janick J (1984) Inducing precocious germination in asexual embryo of cacao. Hort Sci 19: 839-841. 121. Xiao YH, Li XB, Yang XY, Luo M, Hou L, Guo SH, Luo XY, Pei Y (2007) Cloning and characterization of a balsam pear class I chitinase gene (Mcchit1) and its ectopic expression enhances fungal resistance in transgenic plants. Biosci Biotechnol Biochem 71(5): 1211-1219. 122. You M, Xuan X, Tsuji N, Kamio T, Taylor D, Suzuki N, Fujisaki KWT (2003) Identification and molecular characterization of a chitinase from the hard tick Haemaphysalis longicornis. J Biol Chem: 2788556-2788563. 123. Zhang Y, Clemens A, Maximova SN, Guiltinan MJ (2014) The Theobroma cacao B3 domain transcription factor TcLEC2 plays a duel role in control of embryo development and maturation. BMC Plant Biology 14: 106. 124. Các trang web tham khảo SUMMARY “Study on in vitro tissue culture and genetic transformation of Theobroma cacao L. plants” Cacao (Theobroma cacao L.) is an important tree-crop, providing sustainable economic benefits with a significant outcome as an efficient exporting commodity to a number countries in the world. Cocoa beans, main products from cacao are commonly used as materials for confectionery, food, cosmetic, and pharmaceutical industries in many countries. Althought originated from Amazon (South America) region, today cacao is expandedly grown throughout the world in the humid tropics, often in agroforestry ecosystems with other fruit and commodity crops. It was introduced into Vietnam in the 19 th century, however, there was little cacao production in Vietnam before the 21st century. In 2000, the Ministry of Agriculture and Development announced a master plan to stimulate cocoa production in Vietnam so that 50,000 hectares of cocoa cultivation and $65 - 75 million worth of cocoa exports will be achieved by 2020. Similar with many other tropical tree species, cacao production is facing many problems, including fungi causing diseases. For a number of reasons, long-term efforts toward breeding for disease resistance in cacao has yielded only limited success. First, the long generation time makes it difficult for the traditional breeding. Additionally, because many of the cacao pathogens are opportunistic, sources of resistance have not co-evolved. Biotechnological approaches including genetic transformation would provide powerful means for improving quality and quantity traits such as insect and disease resistance, stress tolerance, high productivity and good quality of cacao tree. Despite advantages and achievements in plant biotechnology for several crop and tree genetic improvements, no study regards this field for cacao has been done. Therefore, in this research we conducted the work “Study on in vitro regeneration and genetic transformation of Theobroma cacao L. plants” with purpose to (1) establish for in vitro plant regeneration procedure for 1-2 cultivated cacao clones in Vietnam; (2) develop a genetic transformation protocol for selected cacao clones and produce transgenic cacao plants carrying either gus/gusplus or antifungal genes. This project was carried out with the following activities: (1) Investigate in vitro plant regeneration ability of nine elite cacao genotypes cultivated in Vietnam; (2) Characterize the antifungal gene TcChi1 isolated from cacao leaves and construct a plant expression vector containing TcChi1 gene; (3) Establish a genetic transformation protocol for selected elite cacao genotypes of Vietnam based on the reportable gus/gusplus gene; (4) Produce transgenic cacao plants carrying TcChi1 gene and analyze transgenic plants at molecular level. Based on the tissue culture method of Li et al. (1998), Maximova et al. (2002, 2003), an in vitro plant regeneration protocol for Vietnamese cacao clones was optimized. Un-opened immature buds of nine elite cacao clones TD1, TD2, TD3, TD4, TD5, TD6, TD7, TD8, and TD9 were colected from Cacao Nursery Garden of University of Agriculture and Forestry, Ho Chi Minh City, cold-stored and transfered to our laboratiory in Hanoi within a day. After surface-sterilization, staminodes and petals were removed from the flowers and used as initial explants for somatic embryogenesis. Various culture conditions such as nutrition and plant growth regulator concentrations were evaluated for their ability to stimulate somatic embryogenesis and somatic embryo production of selected cacao clones. The results revealed that somatic embryogenesis have occurred in staminodes and petals of all selected cacao clones with ratios ranging from 80 - 91.5% for staminodes, and 55.2 - 82.5% for petals. The primary somatic embryos were also observed directly from staminodes/petals of TD1, TD3, TD5, TD7, TD8 and TD9 clones in 2.6% to 44.0%. Among them, TD8 clone is the best by getting responses from 44% of cultured staminodes. The number of somatic embryos per explant ranged from 4 to 8. Callus formation could be seen in only three clones (TD3, TD5, and TD8). An average number of 7 - 15 secondary somatic embryos can be obtained from hypocotyl and cotyledon of primary somatic embryos of five clones (TD1, TD3, TD5, TD7, and TD8). Both primary and secondary somatic embryos were efficiently germinated into plantlets with survival ratio of 85%. In short, an in vitro plant generation procedure of cacao clones cultivated in Vietnam was established and can be used for genetic transformation of cacao in Vietnam. An Agrobacterium-mediated genetic transformation protocol has been set up for TD8 cacao clone using reportable genes (gus or gusplus) under the control of promoter CaMV35S or FMV34S, cotyledon fragments of mature primary somatic embryos, and A. tumefaciens strain EHA105. Cotyledons of TD8 primary somatic embryos were cut into small pieces, shaken in thermomixer for 30s, and incubated for 48 h with A. tumefaciens at optical density (OD600nm) of 1.0. Treated explants were co-cultivated for 2 days on SCG medium (secondary callus growth) containing 2 mg/l 2.4-D and 0.05 mg/l BAP, 0.1 mM acetosyringone at 25°C in the dark. After, explants were moved to SCG medium supplemented with 50 mg/l kanamycin for nptII selection, and 200 mg/l moxalactam for eliminating A. tumefaciens. Secondary somatic embryos were induced by transferring of primary somatic embryo derived embryogenic callus onto embryo development medium (ED) containing 30 g/l sucrose, 1 g/l glucose, 50 mg/l kanamycin, 200 mg/l moxalactam. Secondary somatic embryos were matured on the embryo development in light medium (EDL) containing 0.3 g/l KNO3, 1 ml/l amino acid, 10 g/l sucrose, 20 g/l glucose, 50 mg/l kanamycin, 200 mg/l moxalactam. Geminated plantlets were transferred to the root development and maintenance medium (RD) containing 0.3 g/l KNO3, 5 g/l sucrose and 10 g/l glucose, 50 mg/l kanamycin, 200 mg/l moxalactam. The putative transgenic plants were screened using PCR for gus/gusplus or nptII genes. The efficient of our genetic transformation protocol was confirmed by three transgenic plants expressing gusplus gene. In order to production of transgenic cacao plants resistant to fungal disease, TcChi1 gene encoded chitinase was isolated from TD3 clone, constructed in the plant expression binary vector pCB301 under regulation of CaMV35S promoter, and transferred into TD8 cacao clone using an Agrobacterium-mediated genetic transformation protocol. Two transgenic plants were obtained and confirmed by PCR and Southern hybridization analysis. In conclussion, our study successfully established the procedure for in vitro plant regeneration of 6 cacao clones cultivated in Vietnam, in which TD8 gives the highest number of somatic embryo formation/explant. The genetic transformation protocol was also build up for one cacao clone and transgenic cacao plants harboring gene encoded chitinase class I TcChi1 were produced. The stable insertion of TcChi1 in genome of transgenic plant was confirmed by Sourthern hybridization. The obtained transgenic plants will be futher analysis for antifungal activity. This is the first report on in vitro plant regeneration and genetic transformation of cacao in Vietnam. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Công thức các môi trƣờng nuôi cấy in vitro cây ca cao Dưới đây là công thức một số môi trường chính yếu được sử dụng trong nuôi cấy in vitro cây ca cao thông qua phát sinh phôi soma từ nụ hoa chưa trưởng thành và từ trục mầm (Li et al., 1998; Maximova et al., 2003). 1. Môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo (Primary callus growth medium - PCG) Thành phần Hàm lượng DKW đa lượng A (10X) 100 ml/l DKW đa lượng B (10X) 100 ml/l DKW vi lượng (100X) 10 ml/l DKW vitamin (1000X) 1 ml/l Glucose 20 g/l Glutamine 250 mg/l Myo-Inositol 100 mg/l 2,4-D (1 mg/ml) 2 ml/l TDZ (0,2 mg/ml) 25 µl/l Chuẩn pH về 5,8 bằng dung dịch KOH 1M Phytagel 2 g/l Khử trùng ở 121ºC, 1 atm trong 15 phút Ghi chú:  Các dung dịch gốc DKW macro A, DKW macro B, DKW micro được giữ ở 40C và pha mới hàng tháng.  Dung dịch các vitamin DKW được giữ ở -200C dạng dung dịch, pha mới mỗi 3 - 4 tháng.  Các dung dịch gốc 2,4D và TDZ được giữ ở 40C và pha mới mỗi 2 tháng. 2. Môi trƣờng nhân mô sẹo (Secondary callus growth medium - SCG) Thành phần Hàm lượng Muối McCown’s 2,3 g/l Vitamin B5 (1000x stock) 1 ml/l Glucose 20 g/l Nước dừa 50 ml/l 2,4-D (1 mg/ml) 2 ml/l Kinetin (1 mg/ml) 300 µl/l Chuẩn pH về 5,7 bằng dung dịch KOH 1M Phytagel 2,2 g/l Khử trùng ở 121ºC, 1 atm trong 18 phút Ghi chú:  Muối McCown (Sigma M-6774) hút ẩm rất mạnh. Vì thế, cần phải được bảo quản ở 4°C trong tủ sấy.  Dung dịch vitamin B5 được bảo quản ở -20°C trong các ống 1 ml và chuẩn bị lại mới sau 3 - 4 tháng.  Kinetin được chuẩn bị lại mới sau 3 - 4 tháng. Lọc vô trùng dung dịch này bằng màng lọc (0,2µm) và bổ sung vào môi trường đã được khử trùng (55°C).  Dung dịch gốc 2,4-D được bảo quản ở 4°C và chuẩn bị lại mới sau mỗi 2 tháng. 3. Môi trƣờng cảm ứng tạo phôi (Embryo development medium - ED) Thành phần Hàm lượng DKW đa lượng A (10X) 100 ml/l DKW đa lượng B (10X) 100 ml/l DKW vi lượng (100X) 10 ml/l DKW vitamin (1000X) 1 ml/l Glucose 1 g/l Sucrose 30 g/l Chuẩn pH về 5,7 bằng dung dịch KOH 1M Phytagel 2 g/l Khử trùng ở 121ºC, 1 atm trong 18 phút Ghi chú:  Các dung dịch gốc DKW đa lượng A, DKW đa lượng B, DKW vi lượng được bảo quản ở 4ºC và làm lại mới sau mỗi tháng.  Dung dịch vitamin DKW được bảo quản ở -20ºC trong các ống nhỏ và làm lại mới sau mỗi 3 - 4 tháng. 4. Môi trƣờng chuyển dạng phôi và tạo cây (Embryo development in light medium - EDL) Thành phần Hàm lượng DKW đa lượng A (10X) 100 ml/l DKW đa lượng B (10X) 100 ml/l DKW vi lượng (100X) 10 ml/l DKW vitamin (1000X) 1 ml/l KNO3 Dung dịch gốc AA (1000X) 0,3 g/l 1 ml/l Glucose 20 g/l Sucrose 10 g/l Chuẩn pH về 5,8 bằng dung dịch KOH 1M Phytagel 1,75 g/l Khử trùng ở 121ºC, 1 atm trong 18 phút Ghi chú:  Các dung dịch gốc DKW đa lượng A, DKW đa lượng B, DKW vi lượng được bảo quản ở 4ºC và làm lại mới sau mỗi tháng.  Dung dịch vitamin DKW được bảo quản ở -20ºC trong các ống nhỏ và làm lại mới sau mỗi 3 - 4 tháng.  Dung dịch gốc AA (Amino acid) 1000X được bảo quản ở -20ºC trong các ống nhỏ và làm lại mới sau mỗi 3 - 4 tháng. 5. Môi trƣờng hình thành và phát triển rễ (Root development and maintenance medium - RD) Thành phần Hàm lượng DKW đa lượng A (10X) 50 ml/l DKW đa lượng B (10X) 50 ml/l DKW vi lượng (100X) 5 ml/l DKW vitamin (1000X) 0,5 ml/l Glucose 10 g/l KN03 Sucrose 0,3 g/l 5 g/l Chuẩn pH về 5.7 bằng dung dịch KOH 1M Phytagel 1,75 g/l Khử trùng ở 121ºC, 1 atm trong 15 phút Ghi chú:  Các dung dịch gốc DKW đa lượng A, DKW đa lượng B, DKW vi lượng được bảo quản ở 4ºC và làm lại mới sau mỗi tháng.  Dung dịch vitamin DKW được bảo quản ở -20ºC trong các ống nhỏ và làm lại mới sau mỗi 3 tháng. 6. Môi trƣờng cảm ứng (Induction medium - IM) Thành phần Hàm lượng DKW đa lượng A (10X) 100 ml/l DKW đa lượng B (10X) 100 ml/l DKW vi lượng (100X) 10 ml/l DKW vitamin (1000X) 1 ml/l Sucrose 30 g/l Chuẩn pH về 5,8 bằng dung dịch KOH 1M Khử trùng ở 117ºC, 1 atm trong 15 phút Acetosyringone 0,1 mM Proline 0,13 mM 7. Môi trƣờng MS (Murashige and Skoog medium) Thành phần Hàm lượng MS I (10X) 20 ml/l MS II (10X) 10 ml/l MS III (10X) 10 ml/l MS IV (10X) MS V (10X) 10 ml/l 10 ml/l Sucrose 30 g/l Chuẩn pH về 5,8 bằng dung dịch NaOH 1M Agar 8 g/l Khử trùng ở 117ºC, 1 atm trong 15 phút Ghi chú: Bổ sung tất cả các thành phần (trừ agar), chỉnh pH, sau đó bổ sung agar, đun sôi trong bình, chia đều vào các bình tam giác và khử trùng. 8. Môi trƣờng CT1 Thành phần Hàm lượng MS I (10X) 20 ml/l MS II (10X) 10 ml/l MS III (10X) 10 ml/l MS IV (10X) MS V (10X) 10 ml/l 10 ml/l BAP (1 mg/l) 1 mg/l Sucrose 30 g/l Chuẩn pH về 5,8 bằng dung dịch NaOH 1M Agar 8 g/l Khử trùng ở 117ºC, 1 atm trong 15 phút Ghi chú: Bổ sung tất cả các thành phần (trừ agar), chỉnh pH, sau đó bổ sung agar, đun sôi trong bình, chia đều vào các bình tam giác và khử trùng. 9. Môi trƣờng CT2 Thành phần Hàm lượng MS I (10X) 20 ml/l MS II (10X) 10 ml/l MS III (10X) 10 ml/l MS IV (10X) MS V (10X) 10 ml/l 10 ml/l BAP (1 mg/l) 1 mg/l Sucrose 30 g/l Chuẩn pH về 5,8 bằng dung dịch NaOH 1M Agar 8 g/l Khử trùng ở 117ºC, 1 atm trong 15 phút Ghi chú: Bổ sung tất cả các thành phần (trừ agar), chỉnh pH, sau đó bổ sung agar, đun sôi trong bình, chia đều vào các bình tam giác và khử trùng. Bổ sung 500 mg/l cefotaxime, 50 mg/l kanamycin. 10. Môi trƣờng CT3 Thành phần Hàm lượng MS I (10X) 20 ml/l MS II (10X) 10 ml/l MS III (10X) 10 ml/l MS IV (10X) MS V (10X) 10 ml/l 10 ml/l NAA (1 mg/l) 0,1 mg/l Sucrose 30 g/l Chuẩn pH về 5,8 bằng dung dịch NaOH 1M Agar 8 g/l Khử trùng ở 117ºC, 1 atm trong 15 phút Ghi chú: Bổ sung tất cả các thành phần (trừ agar), chỉnh pH, sau đó bổ sung agar, đun sôi trong bình, chia đều vào các bình tam giác và khử trùng. Bổ sung 250 mg/l cefotaxime, 50 mg/l kanamycin. Phụ lục 2: Công thức chuẩn bị các dung dịch gốc 1. Các thành phần của dung dịch DKW đa lƣợng A & B (10X) Dung dịch A Thành phần Hàm lượng NH4NO3 14.16 g/l Ca(NO3)2.4H2O 19.69 g/l Dung dịch B Thành phần Hàm lượng CaCl2.2H2O 1.49 g/l (Luôn bổ sung đầu tiên) K2SO4 15.59 g/l MgSO4.7H2O 7.4 g/l KH2PO4 2.65 g/l Ghi chú:  Dung dịch A cần được khuấy lâu hơn dung dịch B. Dung dịch A trở nên trong khi bảo quản trong tủ lạnh.  Các dung dịch gốc DKW đa lượng A, DKW đa lượng B, DKW vi lượng được bảo quản ở 4ºC và làm lại mới sau mỗi tháng. Sử dụng 100 ml của mỗi loại cho 1 lit môi trường. 2. Các thành phần của dung dịch DKW vi lƣợng (100X) Thành phần Hàm lượng Zn(NO3)2.6H2O 1.7 g/l MnSO4.H2O 3.34 g/l CuSO4.5H2O 0.025 g/l H3BO3 0.48 g/l Na2MoO4.2H2O 0.039 g/l FeSO4.7H2O 3.38 g/l Na-EDTA 4.54 g/l Ghi chú: Dung dịch được bảo quản ở 4ºC và làm lại mới sau mỗi tháng. Sử dụng 10 ml cho 1 lit môi trường. 3. Dung dịch DKW vitamin (1000X) Thành phần Hàm lượng (100 ml) Myo-Inositol 10 g Thiamine-HCl Nicotinic acid Glycine 0.2 g 0.1 g 0.2 g Ghi chú: Dung dịch được bảo quản ở -20ºC trong các ống nhỏ và làm lại mới sau mỗi 3 - 4 tháng. Sử dụng 1 ml cho 1 lit môi trường. 4. Dung dịch B5 vitamin (1000X) Thành phần Hàm lượng (50 ml) Myo-Inositol 5 g Nicotinic acid Pyridoxine 50 mg 50 mg Thiamine 500 mg Ghi chú: Dung dịch được bảo quản ở -20ºC trong các ống nhỏ và làm lại mới sau mỗi 3 - 4 tháng. Sử dụng 1 ml cho 1 lit môi trường. 5. Dung dịch amino acid gốc (1000X) Thành phần Hàm lượng (100 ml) Arginine 43.55 mg Glycine Leucine 18.76 mg 32.8 mg Lysine Tryptophane 45.65 mg 51.05 mg Ghi chú: Dung dịch được bảo quản ở -20ºC trong các ống nhỏ và làm lại mới sau mỗi 3 - 4 tháng. Sử dụng 1 ml cho 1 lit môi trường. 6. Các dung dịch điều hòa sinh trƣởng thực vật gốc Theo chỉ dẫn pha hóa chất mua của Hãng Sigma 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (dung dịch gốc 1 mg/ml): Mỗi 2 tháng chuẩn bị một lần 25 ml hay 50 ml. Hòa bột trong 5 ml (tổng 25 ml) hoặc 10 ml (tổng 50 ml) ethanol 95%, sau đó dẫn bằng nước Milli Q đến thể tích cuối cùng. Dung dịch được bảo quản ở 4oC. Kinetin (dung dịch gốc 1 mg/ml): Kinetin được hòa tan trong khoảng 1 ml NaOH 1N và dẫn bằng nước Milli Q đến thể tích cuối cùng. Thidiazuron [1-Phenyl-3(1,2,3-Thiadiazol-5-YL)Urea]: Thidiazuron gốc được pha với nồng độ 0.2 mg/ml 2 tháng một lần và bảo quản ở 4oC. 1 mg Thidiazuron được hòa trong 1 ml DMSO và sau đó hòa trong 4 ml nước Milli Q để đạt thể tích cuối cùng là 5 ml. Sau đó, dung dịch được chia sang các ống nhỏ (1 ml/ống). Phụ lục 3: Thành phần hóa chất pha đệm chiết DNA tổng số từ lá ca cao Hóa chất Nồng độ gốc Nồng độ trong đệm chiết Thể tích đệm chiết (30 ml) Thế tích đệm chiết (50 ml) Tris-HCl pH 8.0 1 M 100 mM 3 ml 5 ml NaCl 6 M 1,4 M 6,97 ml 11,63 ml EDTA pH 8.0 0,5 M 20 mM 1,2 ml 2 ml β- mercaptoethanol 100% 0,2% (v/v) 60 µl 100 µl PVP Dạng bột 1% 0,6 g 1 g CTAB Dạng bột 2% 0,6 g 1 g Nước đến 30 ml đến 50 ml * Chú ý: Cần hòa tan hoàn toàn PVP và CTAB trong nước ở nhiệt độ 60°C trong khoảng 15 phút trước khi thêm các thành phần khác của đệm chiết. Phụ lục 4. Thành phần hóa chất tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn Môi tường Thành phần LB 5 g/l cao nấm men; 10 g/l trypton; 10 g/l NaCl; 15 g/l agar YEP 10 g/l cao nấm men; 10 g/l pepton; 5 g/l NaCl; 15 g/l agar; 5g/l sacarose; 2 mM MgSO4.7H2O Dung dịch I 25 mM Tris-Cl (pH 8,0); 10 mM EDTA; 50 mM glucose Dung dịch II 0,2 N NaOH; 1% (w/v) SDS Dung dịch III 3 M potassium; 5 M acetate;4°C Dung dịch rửa Agrobacterium 0,5 M NaCl; 50 mM Tris-Cl; 20 mM EDTA; 0,1% sarkosyl Dung dịch GTE 50 mM glucose; 25 mM Tris-Cl; 10 mM EDTA, pH 8,0 Môi trường lỏng SOC 5 g cao nấm men; 20 g trypton; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgSO4; 10 mM MgCl2; 20 mM glucose Phụ lục 5: Một số dòng ca cao vô tính đã đƣợc cấp phép ở Việt Nam TD1 1. Tên thông dụng: TD 1 - Cha mẹ: PA 35 x NA 32 - Dạng thân: Thẳng đứng - Màu lá: Xanh nhạt 2. Vỏ - Rãnh: vừa - Mặt vỏ: Ghồ ghề - Dạng: Tròn ở chóp - Màu sắc: Trái non: Xanh; Trái chín: Vàng - Kích cỡ trái: rộng 1777,8 mm; đường kính 75,4 mm. - Chỉ số trái: 24,6 3. Hạt: - 1,11 g/Hạt - Hạt khô/hạt ướt (% trọng lượng): 37 - 42 - Hạt/trái: 37,75 - Hàm lượng chất béo (%): 57,7 4. Kháng nấm - Kháng nấm Oncobasidium theobromae - Mẫn cảm với nấm Phytophthora palmivora - Mẫn cảm với nấm Corticium salmonicolor 5. Năng suất (hạt khô/ha): 2,4 tấn TD2 1. Tên thông dụng: TD 2 - Dạng thân: Thẳng đứng - Màu lá: Xanh nhạt 2. Vỏ - Rãnh: Trung bình - Mặt vỏ: Ghồ ghề - Đầu nhọn - Màu sắc: Trái non: Xanh; Trái chín: Vàng - Kích cỡ trái: dài 187,8 mm; đường kính 72,1 mm. - Chỉ số trái: 23,2 3. Hạt: - 1,10 g/Hạt - Hạt khô/hạt ướt (% trọng lượng): 38 - 40 - Hạt/trái: 38,5 - Hàm lượng chất béo (%): 56,6 4. Kháng nấm - Kháng nấm Oncobasidium theobromae - Mẫn cảm với nấm Phytophthora palmivora - Mẫn cảm với nấm Corticium salmonicolor 5. Năng suất (hạt khô/ha): 2,2 tấn TD3 1. Tên thông dụng: TD 3 - Dạng thân: Thẳng đứng - Màu lá: Đỏ 2. Vỏ - Rãnh: Nông - Mặt vỏ: Láng - có sáp - Đầu nhọn - Màu sắc: Trái non: Đỏ đậm; Trái chín: Đỏ cam - Kích cỡ trái: dài 150 mm; đường kính 100 mm. - Chỉ số trái: 23,2 3. Hạt: - 1,27 g/Hạt - Hạt khô/hạt ướt (% trọng lượng): 42 - Hạt/trái: 40 - Hàm lượng chất béo (%): 57 4. Kháng nấm - Kháng nấm Oncobasidium theobromae - Kháng nấm Phytophthora palmivora 5. Năng suất (hạt khô/ha): 2,6 tấn TD5 1. Tên thông dụng: TD 5 - Cha mẹ: UAWA 18*T>>S>15/43.352 - Dạng thân: Bán thẳng đứng - Màu lá: đỏ nhạt 2. Vỏ - Rãnh: Nông - Mặt vỏ: Láng - Đầu nhọn - Màu sắc: Trái non: Đỏ; Trái chín: Vàng - Chỉ số trái: 24 3. Hạt: - 1,09 g/Hạt - Hạt/trái: 38,2 - Hàm lượng chất béo (%): 56,9 4. Kháng nấm - Kháng nấm Oncobasidium theobromae - Mẫn cảm với nấm Phytophthora palmivora - Mẫn cảm với nấm Corticium salmonicolor 5. Năng suất (hạt khô/ha): 2,8 tấn TD6 1. Tên thông dụng: TD 6 - Dạng thân: Thẳng đứng - Màu lá: Đỏ sáng 2. Vỏ - Rãnh: Nông - Mặt vỏ: Láng - Đầu nhọn - Màu sắc: Trái non: Đỏ xanh; Trái chín: Đỏ cam - Kích cỡ trái: dài 187,8 mm; đường kính 72,1 mm. - Chỉ số trái: 23 3. Hạt: - 1,04 g/Hạt - Hạt khô/hạt ướt (% trọng lượng): 32,8 - Hạt/trái: 42 - Hàm lượng chất béo (%): 53 4. Kháng nấm - Kháng nấm Oncobasidium theobromae - Kháng nấm Phytophthora palmivora 5. Năng suất (hạt khô/ha): 2,4 tấn TD8 1. Tên thông dụng: TD 8 - Dạng hình: Thẳng đứng - Màu lá: Xanh nhạt 2. Vỏ - Rãnh: Nông - Mặt vỏ: Láng - Đầu nhọn - Màu sắc: Trái non: Xanh; Trái chín: Vàng - Kích cỡ tái: dài 187,8 mm; đường kính 72,1 mm. - Chỉ số trái: 23 3. Hạt: - 1,04 g/Hạt - Hạt khô/hạt ướt (% trọng lượng): 32,8 - Hạt/trái: 42 - Hàm lượng chất béo (%): 53 4. Kháng nấm - Kháng nấm Oncobasidium theobromae - Kháng nấm Phytophthora palmivora 5. Năng suất (hạt khô/ha): 2,4 tấn (Nguồn: Agrifood Consulting International, Inc., 2008) Phụ lục 6: Tỷ lệ các dòng ca cao vô tính đƣợc sản xuất ở Việt Nam trong năm 2008 (%) Dòng VT Tỉnh Bến Tre Tiền Giang Bình Phƣớc Bà Rịa – Vũng Tàu Đăk Lăk Đăk Nông Đồng Nai Tổng cộng TD1 6.2 - 11.9 - 8.4 7.8 0.1 4.6 TD2 4.9 - 7.4 - 6.1 7.8 5.0 5.2 TD3 19.9 - 14.0 30.0 17.8 29.0 15.8 18.3 TD5 19.5 - 14.0 30.0 16.5 21.7 25.0 21.1 TD6 15.9 - 8.6 20.0 16.7 7.8 7.5 12.3 TD8 7.2 - 7.7 20.0 7.7 7.8 15.8 10.6 TD10 14.9 - 12.9 - 9.9 7.8 15.8 14.2 TD14 2.6 - 6.8 9.3 10.5 15.1 7.7 TD7 - - 4.5 3.5 - - 0.6 TD9 0.4 - 2.7 4.1 - - 0.6 TD11 8.6 - 2.7 - - - 4.3 Các dòng TD khác - - 6.7 - - - 0.6 Tổng cộng 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 (Nguồn: Agrifood Consulting International, Inc., 2008) Phụ lục 7. Ảnh hƣởng của kiểu gen đến tỷ lệ tạo mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa ở một số dòng ca cao nghiên cứu Tên mẫu Số mảnh mô Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Nhị Cánh Nhị Cánh TD1 1220 1012 91,5 ± 1,32 80,3 ± 1,04 TD2 553 458 89,7 ± 1,75 82,5 ± 0,50 TD3 3021 1507 80,0 ± 0,50 72,2 ± 1,25 TD4 406 311 90,3 ± 0,76 69,5 ± 1,32 TD5 3623 1410 91,2 ± 1,04 63,5 ± 1,32 TD6 470 408 91,7 ± 1,04 55,2 ± 1,60 TD7 958 735 85,2 ± 0,76 70,0 ± 2,00 TD8 11150 7024 88,0 ± 0,43 82,2 ± 0,76 TD9 555 509 89,2 ± 0,91 58,3 ± 1,08 Phụ lục 8. Kết quả tái sinh phôi soma sau 1 năm nuôi cấy trên môi trƣờng ED Tên mẫu Tỷ lệ mô sẹo tạo phôi (%) Nhị Cánh TD1 10,5 ± 0,76 0 TD2 0 0 TD3 22,0 ± 2,29 2,6 ± 1,32 TD4 0 0 TD5 38,0 ± 1,50 8,5 ± 1,80 TD6 0 0 TD7 11,5 ± 1,50 0 TD8 44,0 ± 1,50 12,1 ± 1,44 TD9 4,7 ± 0,41 0 Phụ lục 9. Tái sinh phôi soma thứ cấp sau 6 tháng nuôi cấy trên môi trƣờng ED Tên mẫu Tỷ lệ tạo phôi thứ cấp (%) Trục mầm Lá mầm TD1 7,0 ± 1,32 10,0 ± 1,32 TD3 13,0 ± 2,64 25,5 ± 0,86 TD5 12,0 ± 0,86 35,3 ± 2,36 TD7 5,0 ± 1,80 13,0 ± 1,32 TD8 18,6 ± 0,85 48,5 ± 2,50 Phụ lục 10. Khả năng tạo chồi và ra rễ từ các phôi soma sơ cấp Tên mẫu Tỷ lệ phôi tạo chồi (%) (trên môi trƣờng EDL) Tỷ lệ phôi ra rễ (%) (trên môi trƣờng RD) TD1 60,5 ± 2,29 40,9 ± 2,15 TD3 64,0 ± 1,52 50,3 ± 1,09 TD5 63,3 ± 1,63 54,5 ± 1,13 TD7 57,5 ± 1,86 37,5 ± 1,32 TD8 80,0 ± 1,12 75,0 ± 2,10 TD9 53,8 ± 2,08 34,6 ± 0,76 Phụ lục 11. Tỷ lệ cây con sống trên các loại giá thể khác nhau sau 30 ngày Loại giá thể Tỷ lệ cây sống (%) TD1 TD3 TD5 TD7 TD8 TD9 Đất + trấu 80 ± 1,52 85 ± 1,15 82± 1,90 70 ± 1,75 85± 1,34 75± 2,05 Đất + xơ dừa 60 ± 1,75 70 ± 1,25 70 ± 2,10 60 ± 1,45 71± 1,22 55± 1,80