Luận án Nghiên cứu thành phần hoá học có hoạt tính diệt tế bào ung thư của loài dâu tằm morus Alba l

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào (Bảng 4.12) của tất cả các hợp chất phân lập được trên ba dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư vú (MCF-7) và ung thư gan Hep-3B cho thấy hầu hết các hợp chất đều có hoạt tính tốt, đặc biệt 12 hợp chất thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 0,66 - 5,30 M. Các hợp chất prenyl flavonoid có hoạt tính mạnh hơn các flavone. Hợp chất 3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4- tetrahydroxyflavone ức chế mạnh cả ba dòng tế bào với giá trị IC50 là 1,32 μM (HeLa), 3,92 μM (MCF-7) và 5,22 μM (Hep-3B), trong khi hợp chất mới kuwanon J 2,4,10- trimethyl ether thể hiện hoạt tính trung bình với giá trị IC50 lần lượt là 8,44, 13,8 và 8,32 M. Trong ba dòng tế bào được thử nghiệm, các hợp chất prenyl flavonoid có tác dụng mạnh nhất đối với dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa). So sánh giá trị IC50 của các hợp chất được thử nghiệm cho thấy morusin (LM9) có khả năng kháng dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) lớn nhất với giá trị IC50 là 0,64 μM. Lee và cộng sự cũng phân lập được hợp chất này từ loài Morus australis và đã chứng minh tác dụng thúc đẩy sự chết theo chương trình theo cơ chế ức chế sự hoạt hóa NF-B trên dòng tế bào ung thư đại trực tràng người HT-29 [102]

pdf27 trang | Chia sẻ: tueminh09 | Ngày: 26/01/2022 | Lượt xem: 323 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu thành phần hoá học có hoạt tính diệt tế bào ung thư của loài dâu tằm morus Alba l, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
động đến biểu hiện của iNOS và sự phosphoryl hoá, giáng hoá của IκBα theo phương pháp Western blot. CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM Phần này mô tả chi tiết các quá trình chiết suất, phân lập chất và đánh giá các hoạt tính liên quan đến tác dụng diệt tế bào ung thư cùng dữ liệu phổ của các chất phân lập được. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất Hợp chất LM1: 3-prenyl-3-geranyl-5,7, 2,4-tetrahydroxyflavone (Hợp chất mới) Dạng bột màu vàng. UV (MeOH) max (log): 216,5 (4,49), 258,4 (4,37) và 328,5 (4,20) nm. IR (KBr) max (cm -1): 3412, 1653, 1616. ESI-MS m/z: 513,5 [M+Na]+, 491,6 4 [M+H]+, 489,6 [M-H]. HR-FAB-MS m/z: 491,2433 [M+H]+ phù hợp với tính toán lý thuyết đối với công thức C30H35O6 491,2434). 1H NMR (400 MHz, acetone-d6):  (ppm) 13,10 (1H, s, 5-OH), 7,01(1H, d, J = 8,4 Hz, H-6), 6,57 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5), 6,30 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-8), 6,23 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,32 (1H, t, J = 7,2 Hz, H-2), 5,08 (2H, m, H-10, 7), 3,46 (2H, br d, J = 7,2 Hz, H-1), 3,08 (2H, br d, J = 6,8 Hz, H-9), 2,05 (2H, m, H-6), 1,97 (2H, m, H-5), 1,78 (3H, br s, H-4), 1,61 (3H, br s, H-9), 1,55 (6H, br s, H-13, 10), 1,37 (3H, br s, H-12). 13C NMR (100 MHz, acetone-d6):  (ppm) 162,1 (C-2), 122,2 (C-3), 183,2 (C-4), 105,4 (C-4a), 159,4 (C-5), 99,2 (C-6), 164,8 (C-7), 94,3 (C-8), 163,4 (C-8a), 113,2 (C- 1), 154,5 (C-2), 117,0 (C-3), 158,8 (C-4), 108,2 (C-5), 128,8 (C-6), 24,6 (C-9), 122,4 (C-10), 132,3 (C-11), 25,9 (C-12), 17,7 (C-13), 23,1 (C-1), 123,6 (C-2), 135,4 (C-3), 16,4 (C-4), 40,6 (C-5), 27,5 (C-6), 125,2 (C-7), 131,7 (C-8), 25,9 (C-9), 17,7 (C-10). Hợp chất LM2: sanggenon J (Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài dâu tằm) Dạng bột màu vàng, [] : -18,3o (c 0,15, MeOH). ESI-MS m/z: 487,6 [M+H]+, 489,6 [M+Na]+, 419,4 [M-H]. 1H-NMR (500 MHz, acetone-d6):  (ppm) 7,10 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-6), 6,82 (1H, d, J = 10 Hz, H-1), 6,48 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5), 6,32 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,24 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6),5,73 (1H, d, J = 10 Hz, H-2), 5,12 (2H, m, H-10, 7), 3,10 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-9), 1,72 (2H, m, H-5), 2,11 (2H, m, H-6), 1,59 (3H, br s, H-10), 1,65 (3H, br s, H-9), 1,56 (3H, br s, H-13), 1,42 (3H, br s, H-12), 1,39 (3H, br s, H-4). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD):  (ppm) 162,9 (C-2), 122,3 (C-3), 183,7 (C-4), 105,6 (C-4a), 160,0 (C-5), 99,7 (C-6), 165,6 (C-7), 94,7 (C-8), 163,3 (C-8a), 111,8 (C- 1'), 152,0 (C-2'), 115,0 (C-3'), 157,4 (C-4'), 109,4 (C-5'), 131,3(C-6'), 23,8 (C-9), 122,6 (C-10), 132,9 (C-11), 26,0 (C-12), 17,7 (C-13), 118,2 (C-1''), 129,4 (C-2''), 79,7 (C-3''), 26,9 (C-4''), 42,3 (C-5''), 24,8 (C-6''), 125,3 (C-7''), 132,6 (C-8''), 26,0 (C-9''), 17,8 (C-10''). Hợp chất LM3: sanggenon K (Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài dâu tằm) Dạng bột màu vàng, [] : -22,7o (c 0,15, MeOH). ESI-MS m/z 489 [M+H]+, 511 [M+Na]+, 487 [M-H]. 1H-NMR (400 MHz, acetone-d6):  (ppm) 7,09 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6), 6,78 (1H, d, J = 10 Hz, H-1), 6,56 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,31 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,25 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,69 (1H, d, J = 10 Hz, H-2), 5,08 (2H, m, H-10 và H- 7), 3,10 (2H, br d, J = 7,0 Hz, H-9), 1,68 (2H, m, H-5), 2,08 (2H, m, H-6), 1,59 (3H, br s, H-9), 1,57 (3H, br s, H-10), 1,46 (3H, br s, H-13), 1,43 (3H, br s, H-12), 1,35 (3H, br s, H-4). 13C-NMR (100MHz, acetone-d6):  (ppm) 162,7 (C-2), 122,1 (C-3), 183,4 (C-4), 105,6 (C-4a), 159,6 (C-5), 99,7 (C-6), 165,2 (C-7), 94,6 (C-8), 163,6 (C-8a), 110,7 (C- 5 1'), 153,5 (C-2'), 114,2 (C-3'), 156,2 (C-4'), 108,8 (C-5'), 131,4 (C-6'), 23,7 (C-9), 123,1 (C-10), 132,7 (C-11), 26,3 (C-12), 18,1 (C-13), 118,3 (C-1''), 129,4 (C-2''), 80,2 (C-3''), 26,9 (C-4''), 42,3 (C-5''), 25,0 (C-6''), 125,4 (C-7''), 132,6 (C-8''), 26,2 (C-9''), 18,2 (C-10''). Hợp chất LM4: 8,3-diprenyl-5,7,4-trihydroxyflavone (Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài dâu tằm) Dạng bột màu vàng. ESI-MS m/z: 407,5 [M+H]+, 429,4 [M+Na]+, 405,5 [M-H]. HR-FAB-MS m/z: 407,1844 [M+H]+ phù hợp với tính toán lý thuyết đối với công thức C25H26O5). 1H-NMR (400 MHz, acetone-d6):  (ppm) 7,84 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-2), 7,76 (1H, dd, J = 2,4 và 8,4 Hz, H-6), 7,04 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5), 6,55 (1H, br s, H-3), 6,33 (1H br s, H-6), 5,41 (1H, m, H-10), 5,34 (1H, m, H-2), 3,57 (2H, br d, J = 7,0 Hz, H-9), 3,42 (2H, br d, J = 7,0 Hz, H-1), 1,82 (3H, br s, H-13 và H-5), 1,75 (3H, br s, H-4), 1,65 (3H, br s, H-12). 13C-NMR (100 MHz, acetone-d6):  (ppm) 165,5 (C-2), 104,0 (C-3), 183,6 (C-4), 105,1 (C-4a), 161,0 (C-5), 100,0 (C-6), 165,0 (C-7), 108,1 (C-8), 156,5 (C-8a), 123,4 (C-1), 129,2 (C-2), 130,3 (C-3), 160,3 (C-4), 116,8 (C-5), 127,1 (C-6), 22,9 (C-9), 123,4 (C-10), 132,3 (C-11), 18,4 (C-12), 26,4 (C-13), 29,5 (C-1), 124,3 (C-2), 133,5 (C-3), 18,7 (C-4), 26,4 (C-5). Hợp chất LM6: 8-geranylapigenin (Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài dâu tằm) Dạng bột màu vàng. ESI-MS m/z: 407,5 [M+H]+, 429,4 [M+Na]+, 405,5 [M-H]. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD):  (ppm) 7,82 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2 và H-6), 6,91 (2H, d, J = 8,4 Hz, H-3 và H-5), 6,56 (1H, br s, H-3), 6,47 (1H, br s, H-6), 5,23 (1H, br t, J = 6,0 Hz, H-2), 5,05 (1H, br t, J = 6,4 Hz, H-7), 3,31 (2H, br d, J = 7,0 Hz, H-1), 2,06 (2H, m, H-5), 1,96 (2H, m, H-6), 1,77 (3H, br s, H-4), 1,49 (3H, s, H-10), 1,54 (3H, br s, H-9). 13C-NMR (100 MHz, acetone-d6): (ppm) 165,0 (C-2), 103,8 (C-3), 183,7 (C-4), 105,6 (C-4ª), 161,2 (C-5), 99,9 (C-6), 164,4 (C-7), 108,5 (C-8), 156,4 (C-8a), 123,2 (C-1'), 129,3 (C-2'), 116,7 (C-3'), 162,5 (C-4'), 116,7 (C-5'), 129,3 (C-6'), 24,1 (C-1''), 123,7 (C-2''), 135,2 (C-3''), 16,5 (C-4''), 40,2 (C-5''), 27,5 (C-6''), 125,2 (C-7''), 131,7 (C-8''), 25,8 (C-9''), 17,5 (C-10'') Hợp chất LM7: cyclomulberrin Dạng bột màu vàng, điểm nóng chảy 247 oC. ESI-MS m/z: 421,4 [M+H]+, 443,4 [M+Na]+, 419,4 [M-H]. 1H-NMR (400 MHz, acetone-d6):  (ppm) 7,67 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-6), 6,62 (1H, dd, J = 2,0 và 8,4 Hz, H-5), 6,41 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-3), 6,32 (1H, s, H-6), 6,17 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-9), 5,46 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-10), 5,33 (1H, m, H-15), 3,57 (2H, m, H-14), 1,93 (3H, s, H-12), 1,84 (3H, s, H-13), 1,67 (3H, s, H-18), 1,66 (3H, s, H-17). 6 13C-NMR (100 MHz, acetone-d6):  (ppm) 159,1 (C-2), 107,8 (C-3), 179,0 (C-4), 104,7 (C-4a), 155,3 (C-5), 99,7 (C-6), 164,1 (C-7), 107,7 (C-8), 165,6 (C-8a), 109,1 (C-1), 156,3 (C-2), 105,1 (C-3), 160,7 (C-4), 111,3 (C-5), 126,0 (C-6), 70,4 (C-9), 122,5 (C-10), 138,3 (C-11), 18,7 (C-12), 18,2 (C-13), 22,4 (C-14), 124,0 (C-15), 131,6 (C-16), 25,9 (C-17, 18). Hợp chất LM8: cyclomorusin Dạng bột màu vàng, điểm nóng chảy 258 oC. ESI-MS m/z 417,5 [M-H]. 1H-NMR (400 MHz, acetone-d6):  (ppm) 7,79 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-6), 6,92 (1H, d, J = 10 Hz, H-14), 6,64 (1H, d, J = 7,6 Hz, H-5), 6,43 (1H, s, H-3), 6,19 (1H, d, J = 9,2 Hz, H-9), 6,15 (1H, s, H-6), 5,77 (1H, d, J = 10 Hz, H-15), 5,48 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-10), 1,94 (3H, s, H-12), 1,68 (3H, br s, H-13), 1,47 (6H, s, H-17, 18). 13C-NMR (100 MHz, acetone-d6):  (ppm) 159,7 (C-2), 108,6 (C-3), 179,8 (C-4), 101,6 (C-4a), 152,5 (C-5), 100,8 (C-6), 165,1 (C-7), 106,5 (C-8), 165,1 (C-8a), 110,4 (C-1), 157,1 (C-2), 105,4 (C-3), 160,4 (C-4), 111,6 (C-5), 126,9 (C-6), 70,8 (C-9), 122,6 (C-10), 139,4 (C-11), 19,1 (C-13), 26,3 (C-12), 115,9 (C-14), 129,2 (C-15), 79,3 (C-16), 28,7 (C-17, C-18). Hợp chất LM10: atalantoflavone (Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài dâu tằm) Dạng bột màu vàng. ESI-MS m/z 337,3 [M+H]+, 359,4 [M+Na]+, 335,3 [M-H]. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6):  (ppm) 7,96 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2, 6), 6,92 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, 5), 6,87 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-9), 6,85 (1H, s, H-3), 6,22 (1H, s, H-6), 5,79 (1H, d, J = 10 Hz, H-10), 1,44 (6H, s, H-12, 13). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  (ppm) 163,7 (C-2), 104,5 (C-3), 181,9 (C-4), 102,9 (C-4a), 161,3 (C-5), 99,2 (C-6), 158,6 (C-7), 100,9 (C-8), 151,2 (C-8a), 120,9 (C-1), 128,5 (C-2, C-6), 116,0 (C-3, C-5), 160,8 (C-4), 114,3 (C-9), 128,0 (C-10), 78,0 (C-11), 27,7 (C-12, C-13). Hợp chất LM12: steppogenin (Hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài dâu tằm) Dạng bột màu vàng, điểm nóng chảy 255oC,  25D : -3,5 o (c 0,12, MeOH). 1H-NMR (500 MHz, acetone-d6):  (ppm) 7,31 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6), 6,47 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-3), 6,43 (1H, dd J = 2,0 và 8,0 Hz, H-5), 5,96 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,95 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 5,71 (1H, dd J = 3,0 và 13,0 Hz, H-2), 3,18 (1H, dd, J = 13,0 và 17,0 Hz, H-3a), 2,72 (1H, dd, J = 2,5 và 17,0 Hz, H-3b), 12,2 (5-OH). 13C-NMR (125 MHz, acetone-d6):  (ppm) 75,3 (C-2), 42,5 (C-3), 197,7 (C-4), 103,1 (C-4a), 165,2 (C-5), 96,7 (C-6), 167,2 (C-7), 95,7 (C-8), 164,8 (C-8a), 117,3 (C- 1), 156,7 (C-2), 103,4 (C-3), 159,5 (C-4), 107,8 (C-5), 128,9 (C-6). Hợp chất LM13: moracin M Dạng tinh thể màu nâu nhạt, điểm nóng chảy 235-237oC. ESI-MS (negative) m/z 241 [M-H]. 7 1H-NMR (500MHz, CD3OD):  (ppm) 7,35 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-4), 6,93 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 6,92 (1H, s, H-3), 6,80 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, 6), 6,75 (1H, dd, J = 2,0 và 8,5 Hz, H-5), 6,29 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-4). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD):  (ppm) 156,1 (C-2), 98,4 (C-3), 123,0 (C-3a), 122,0 (C-4), 113,2 (C-5), 157,1 (C-6), 103,5 (C-7), 156,7 (C-7a), 133,8 (C-1), 103,9 (C-2 và C-6), 159,8 (C-3 và C-5), 102,2 (C-4). Hợp chất LM14: moracin P Dạng bột màu nâu nhạt, điểm nóng chảy > 300 oC. ESI-MS (negative) m/z 325,3 [M-H]. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD):  (ppm) 7,22 (1H, s, H-4), 6,87 (1H, s, H-3), 6,86 (1H, s, H-7), 6,74 (2H, d, J = 2,4 Hz, H-2, 6), 6,26 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-4), 3,78 (1H, dd, J = 5,6 và 8,4 Hz, H-2), 3,08 (1H, dd, J = 5,2 và 16,4 Hz, H-1b), 2,85 (1H, dd, J= 8,4 và 16,4 Hz, H-1a), 1,37 (3H, s, H-5), 1,28 (3H, s, H-4). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD):  (ppm) 156,5 (C-2), 101,8 (C-3), 124,1 (C-3a), 121,7 (C-4), 117,6 (C-5), 152,5 (C-6), 99,6 (C-7), 155,9 (C-7a), 133,7 (C-1), 104,0 (C- 2 và C-6), 159,9 (C-3 và C-5), 103,6 (C-4), 32,4 (C-1), 70,6 (C-2), 78,2 (C-3), 21,0 (C-4), 25,9 (C-5). Hợp chất LM15: moracin O Bột vô định hình màu nâu nhạt. ESI-MS (negative) m/z 325 [M-H]. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD):  (ppm) 7,29 (1H, s, H-4), 6,88 (1H, s, H-3), 6,85 (1H, s, H-7), 6,74 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, 6), 6,35 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-4), 4,62 (1H, t, J = 8,4 Hz, H-2), 3,23 (2H, m, H-1), 1,26 (3H, s, H-5), 1,22 (3H, s, H-4). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD):  (ppm) 156,3 (C-2), 102,4 (C-3), 123,9 (C-3a), 116,9 (C-4), 125,0 (C-5), 159,8 (C-6), 93,2 (C-7), 156,1 (C-7a), 133,8 (C-1), 103,8 (C- 2 và C-6), 159,9 (C-3 và C-5), 102,4 (C-4), 31,1 (C-1), 91,3 (C-2), 72,5 (C-3), 25,2 (C-4), 25,3 (C-5). Hợp chất LM16: mulberrofuran K Dạng bột màu nâu đỏ, điểm nóng chảy 176 oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD):  (ppm) 7,35 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-4), 7,12 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-20), 7,00 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-14), 6,94 (1H, s, H-3), 6,92 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 6,91 (1H, d, 1,5 Hz, H-2), 6,84 (1H, d, 1,5 Hz, H-6), 6,75 (1H, dd, J = 2,5 và 8,5 (Hz, H-5), 6,66 (1H, d, J = 10 Hz, H-21), 6,48 (1H, dd, J = 2,5 và 8,5 Hz, H-19), 6,42 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-2), 6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-17), 6,19 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-13), 5,61 (1H, d, J = 10, Hz, H-22), 3,33 (1H, t, J = 6,0 Hz, H-4), 3,30 (1H, dd, J = 6,0 và 11,0 Hz, H-3), 2,95 (1H, dt, J = 6,0 và 11,0 Hz, H-5), 2,70 (1H, dd, J = 6,0 và 17,0 Hz, H-6a), 2,01 (1H, dd, J = 12,0 và 17,0 Hz, H-6b), 1,80 (3H, s, H-7), 1,34 (3H, s, H-24), 1,32 (3H, s, H-25). 8 13C-NMR (125 MHz, CD3OD):  (ppm) 155,1 (C-2), 102,2 (C-3), 123,1 (C-3a), 121,9 (C-4), 113,3 (C-5), 156,8 (C-6), 98,5 (C-7), 152,9 (C-7a), 131,7 (C-1'), 104,8 (C-2'), 155,1 (C-3'), 118,2 (C-4'), 155,7 (C-5'), 105,5 (C-6'), 133,9 (C-1''), 123,2 (C-2''), 38,2 (C-3''), 35,1 (C-4''), 28,7 (C-5''), 37,0 (C-6''), 23,9 (C-7''), 102,6 (C-8''), 113,7 (C-9''), 158,5 (C-10''), 111,6 (C-11''), 157,3 (C-12''), 107,6 (C-13''), 129,2 (C- 14''), 119,1 (C-15''), 153,5 (C-16''), 104,0 (C-17''), 157,8 (C-18''), 109,9 (C-19''), 128,0 (C-20''), 118,3 (C-21''), 129,5 (C-22''), 76,9 (C-23''), 27,7 (C-24''), 27,6 (C-25''). Hợp chất RM1: kuwanon J 2,4,10-trimethyl ether (Hợp chất mới) Dạng bột màu vàng,  25D : + 102,5 o (c 0,1, MeOH). UV (MeOH) max (log): 225 (3,95), 292 (3,46) và 384 (3,77) (nm). IR (KBr) max (cm -1): 3375, 1707, 1628 và 1221. HR-ESI-MS m/z: 721,3023 [M+H]+ (tính toán lý thuyết đối với công thức C43H45O10 721,3013). 1H-NMR (500 MHz, acetone-d6):  (ppm) 14,30 (1H, s, 2-OH), 8,49 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-14), 8,10 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-), 7,86 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-6), 7,80 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6), 7,74 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-α), 6,97 (1H, d, J = 8,5Hz, H- 20), 6,62 (1H, d, J = 2,5Hz, H-3), 6,59 (1H, dd, J = 2,5 và 8,5 Hz, H-5), 6,55 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-13), 6,51 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-17), 6,34 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5), 6,30 (1H, dd, J = 2,5 và 8,5 Hz, H-19), 5,66 (1H, s, H-2), 5,08 (1H, t, J = 7,0 Hz, H- 22), 4,67 (1H, t, J = 4,4 Hz, H-4), 4,15 (1H, s, H-3), 3,93 (3H, br s, 10-OMe), 3,87 (3H, br s, 4-OMe), 3,85 (3H, br s, 2-OMe), 3,83 (overlap, H-5), 3,20 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 2,27 và 2,50 (mỗi 1H, d, J = 18,7 Hz, H-6), 1,92 (3H, s, H-7), 1,69 (3H, s, H-25), 1,57 (3H, s, H-24). 13C-NMR (125 MHz, acetone-d6 ):  (ppm) 117,4 (C-1), 161,3 (C-2), 98,9 (C-3), 164,4 (C-4), 107,0 (C-5), 131,2 (C-6), 114,5 (C-1), 165,2 (C-2), 117,0 (C-3), 164,0 (C-4), 110,0 (C-5), 130,9 (C-6), 134,9 (C-1), 123,2 (C-2), 32,8 (C-3), 47,7 (C- 4), 36,1 (C-5), 32,8 (C-6), 23,7 (C-7), 209,6 (C-8), 114,5 (C-9), 163,8 (C-10), 117,4 (C-11), 162,7 (C-12), 103,2 (C-13), 132,4 (C-14), 121,8 (C-15), 156,4 (C- 16), 103,6 (C-17), 157,8 (C-18), 107,4 (C-19), 128,7 (C-20), 22,1 (C-21), 123,0 (C-22), 131,5 (C-23), 25,7 (C-24), 17,7 (C-25), 118,8 (C-α), 139,8 (C-), 193,0 (C=O), 55,9 (2-OMe), 56,1 (4-OMe), 56,2 (10-OMe). Hợp chất RM3: sanggenon C Dạng bột vô định hình màu vàng tươi,  25D : +265,2 o (c 0,1, MeOH). UV (MeOH) max (log): 283 (4,16), 308 (3,97) (nm). ESI-MS m/z 731,6 [M+Na] +, 707,6 [M-H]¯. 1H-NMR (400 MHz, acetone-d6):  (ppm) 8,34 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-27), 7,30 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6), 6,92 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-33), 6,47 (1H, dd, J = 2,0 và 8,0 Hz, H-5), 6,44 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-30), 6,35 (1H, dd, J = 2,4 và 9,0 Hz, H-26), 6,32 9 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-3), 6,27 (1H, dd, J = 2,4 và 8,4 Hz, H-32), 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-24), 5,74 (1H, s, H-8), 5,52 (1H, br s, H-15), 5,17 (1H, m, H-10), 4,55 (1H, dd, J = 5,6 và 6,0 Hz, H-20), 4,10 (1H, br s, H-14), 3,85 (1H, dd, J = 5,6 và 5,0 Hz, H-19), 2,70 và 3,08 (1H, m, H-9), 2,24 và 2,37 (1H, m, H-18), 1,84 (3H, br s, H-17), 1,57 (3H, br s, H-12), 1,49 (3H, br s, H-13). 13C-NMR (100 MHz, acetone-d6 ):  (ppm) 91,9 (C-2), 103,5 (C-3), 188,2 (C-4), 99,5 (C-4a), 163,9 (C-5), 108,8 (C-6), 167,7 (C-7), 96,5 (C-8), 161,1 (C-8a), 122,2 (C- 1), 161,1 (C-2), 99,9 (C-3), 161,9 (C-4), 109,7 (C-5), 125,6 (C-6), 32,0 (C-9), 118,5 (C-10), 136,8 (C-11), 18,1 (C-12), 26,0 (C-13), 32,8 (C-14), 122,8 (C-15), 134,9 (C-16), 23,8 (C-17), 33,9 (C-18), 35,8 (C-19), 48,3 (C-20), 208,7 (C-21), 113,9 (C-22), 166,0 (C-23), 103,7 (C-24), 166,8 (C-25), 107,6 (C-26), 129,1 (C-27), 121,3 (C-28), 156,4 (C-29), 102,4 (C-30), 157,7 (C-31), 109,0 (C-32), 134,7 (C-33). Hợp chất RM4: sanggenon O Dạng bột màu vàng tươi,  25D : 15,7 o (c 0,1, MeOH). UV (MeOH) max (nm): 287 (3,24), 309 (3,22). ESI-MS m/z 731,6 [M+Na]+. 707,7 [M-H]¯. 1H-NMR (400 MHz, acetone-d6):  (ppm) 8,36 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-27), 7,33 (1H, d, J = 8,2 Hz, H-6), 6,93 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-33), 6,50 (1H, dd, J = 2,4 và 8,2 Hz, H-5), 6,46 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-30), 6,36 (1H, dd, J = 2,4 và 9,0 Hz, H-26), 6,36 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-3), 6,27 (1H, dd, J = 2,4 và 8,4 Hz, H-32), 6,20 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-24), 5,72 (1H, s, H-8), 5,55 (1H, br s, H-15), 5,06 (1H, m, H-10), 4,56 (1H, dd, J = 5,6 và 6,0 Hz, H-20), 4,09 (1H, br s, H-14), 3,84 (1H, dd, J = 5,6 và 5,0 Hz, H-19), 2,69 và 3,09 (1H, m, H-9), 2,27 và 2,42 (1H, m, H-18), 1,87 (3H, br s, H-17), 1,53 (3H, br s, H-12), 1,20 (3H, br s, H-13). 13C-NMR (100 MHz, acetone-d6 ):  (ppm) 91,9 (C-2), 103,5 (C-3), 188,3 (C-4), 99,5 (C-4a), 163,8 (C-5), 108,8 (C-6), 167,9 (C-7), 96,7 (C-8), 161,3 (C-8a), 122,2 (C- 1), 161,3 (C-2), 99,8 (C-3), 161,9 (C-4), 109,7 (C-5), 125,6 (C-6), 32,0 (C-9), 118,5 (C-10), 136,9 (C-11), 18,1 (C-12), 25,5 (C-13), 32,7 (C-14), 122,9 (C-15), 135,3 (C-16), 23,8 (C-17), 33,9 (C-18), 35,7 (C-19), 48,1 (C-20), 208,7 (C-21), 114,0 (C-22), 166,2 (C-23), 103,7 (C-24), 166,8 (C-25), 107,6 (C-26), 129,3 (C-27), 121,4 (C-28), 156,5 (C-29), 102,3 (C-30), 157,8 (C-31), 109,0 (C-32), 134,7 (C-32). CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. CHIẾT TÁCH CÁC PHÂN ĐOẠN CHỌN LỌC Lựa chọn các phần chiết thô và phân đoạn nhỏ có mức độ ức chế  50% trong các phép thử ức chế sự hoạt động của NF-B và gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung người (HeLa) (Hình 4.1, 4.2 và Bảng 4.1, 4.2). 10 Hình 4.1: Sơ đồ chiết tách các phân đoạn có hoạt tính từ lá dâu tằm Hình 4.2: Sơ đồ chiết tách các phân đoạn có hoạt tính từ vỏ rễ dâu tằm Bảng 4.1: Kết quả thử hoạt tính ức chế NF-B trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) của các phân đoạn chiết từ lá và vỏ rễ dâu tằm. Phân đoạn chiết từ lá (10 g/ml) % ức chế Phân đoạn chiết từ vỏ rễ (10 g/ml) % ức chế Methanol (LM) 61,4 Methanol (RM) 68,5 Bột khô lá dâu tằm (LM) Morus alba L.(3 kg) Cao MeOH tổng (250g) Chiết MeOH Chiết n-Hexane/H2O: 2/1 Bổ sung 2 lít nước LM-H Cao n-hexane (74g) Chiết EtOAc/H2O: 1/1 LM-W Lớp nước LM-E Cao EtOAc (55 g) Lớp nước Bổ sung n-Hexane Bổ sung EtOAc LM-E3 LM-E4 Gradient C.M (100-0 V) LM-E1 LM-E2 LM-E7 LM-E8LM-E5 LM-E6 Bột khô vỏ rễ dâu tằm (RM) Morus alba L.(2 kg) Cao MeOH tổng (185g) Chiết MeOH Chiết n-Hexane/H2O: 2/1 Bổ sung 2 lít nước RM-H Cao n-hexane (27,5g) Chiết EtOAc/H2O: 1/1 RM-W Lớp nước RM-E Cao EtOAc(85,2 g) Lớp nước Bổ sung n-Hexane Bổ sung EtOAc RM-E3 RM-E4 Gradient C.M (100-0 V) RM-E1 RM-E2 RM-E5 RM-E6 11 Hexane (LM-H) 35,7 Hexane (RM-H) 40,4 Ethyl acetate (LM-E) 74,5 Ethyl acetate (RM-E) 72,3 Nước (LM-W) 22,5 Nước (RM-W) 47,4 LM-E1 8,5 RM-E1 17,0 LM-E2 32,9 RM-E2 26,2 LM-E3 57,2 RM-E3 87,0 LM-E4 59,8 RM-E4 51,6 LM-E5 44,5 RM-E5 75,6 LM-E6 72,4 RM-E6 79,4 LM-E7 64,8 Deguelin (1μg/ml) 92,9 LM-E8 78,4 Bảng 4.2: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) của các phân đoạn chiết từ lá và vỏ rễ dâu tằm. Phân đoạn chiết từ lá (10 g/ml) % ức chế Phân đoạn chiết từ vỏ rễ (10 g/ml) % ức chế Methanol (LM) 65,5 Methanol (RM) 55,2 Hexane (LM-H) 43,1 Hexane (RM-H) 42,8 Ethyl acetate (LM-E) 86,5 Ethyl acetate (LM-E) 68,5 Nước (LM-W) 32,5 Nước (RM-W) 31,7 LM-E1 14,2 RM-E1 29,5 LM-E2 38,0 RM-E2 33,6 LM-E3 60,4 RM-E3 80,5 LM-E4 62,1 RM-E4 62,7 LM-E5 50,6 RM-E5 70,5 LM-E6 69,5 RM-E6 68,0 LM-E7 66,7 Deguelin (1μg/ml) 29,8 LM-E8 82,1 Các phân đoạn LM-E3, LM-E4, LM-E6, LM-E7 và LM-E8 từ lá và các phân đoạn RM-E3, RM-E4, RM-E5 và RM-E6 từ vỏ rễ dâu tằm được lựa chọn để phân lập các hợp chất tinh khiết. 12 4.2. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN CHỌN LỌC CỦA LÁ VÀ VỎ RỄ LOÀI DÂU TẰM 4.2.1. Phân lập các hợp chất từ phân đoạn chọn lọc của lá Các phân đoạn chọn lọc của lá được phân tách tiếp theo sơ đồ trình bày ở Hình 4.3 Hình 4.3:Sơ đồ phân lập các hợp chất từ các phân đoạn chọn lọc của lá Từ phân đoạn LM-E3 phân lập được các hợp chất LM3, LM7 và LM9. Từ phân đoạn LM-E4 phân lập được các hợp chất LM4, LM5, LM6 và LM10. Từ phân đoạn LM-E6 phân lập được các hợp chất LM1, LM2 và LM8. Từ phân đoạn LM-E7 phân lập được các hợp chất LM11, LM12, LM13, LM14, LM15, LM16 và LM17. Từ phân đoạn LM-E8 phân lập được hai hợp chất LM18 và LM19. 4.2.2. Phân lập các hợp chất từ các phân đoạn chọn lọc của vỏ rễ Từ phân đoạn RM-E3 phân lập được các hợp chất RM1 và RM8. Từ phân đoạn RM-E4 phân lập được các hợp chất RM5, RM6 và RM7. Từ phân đoạn RM-E5 phân lập được hợp chất RM2. Từ phân đoạn RM-E6 phân lập được các hợp chất RM3, RM4. Sephadex C.M 1/1 LM-E6 LM2 (70 mg) LM1 (32,4 mg) Chất mới LM8 (3,6 mg) LM9 (8,1 mg) LM3 (6,2 mg) LM7 (5,5 mg) H.E 4/1 LM-E3 LM5 (18,5 mg) LM6 (3,6 mg) LM4 (3,0 mg) H.E 4/1 LM-E4 LM10 (6,6 mg) LM-E8 C.M 10/1 LM-E8.1 LM-E8.2 LM18 (30 mg) LM-E8.3 M.W 3/1 LM19 (7,0 mg) LM-E7 LM-E LM-E7.1 LM-E7 H.E 1/1 LM-E7.1.1 M.W 2/1 LM-E7.3 C.M 1/1 LM-E7.3.1 LM-E7.3.2 LM-E7.3.3.1 LM-E7.3.2.2 Sephadex M.W 1/1 LM12 (22mg) LM13 (34mg) LM-E7.3.3 H.C.M 0,5/1/0,1 LM14 (70mg) LM15 (80mg) LM17 (5,4 mg) LM-E7.1.2 H.C.M 0,5/1/0.12 LM16 (100mg) LM-E7.1.3 LM-E7.2 LM-E7.5 LM-E7.4 LM11 (11mg) 13 Hình 4.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ các phân đoạn chọn lọc của vỏ rễ 4.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập từ lá và vỏ rễ loài dâu tằm, trong đó có 2 hợp chất hợp chất mới lần đâu tiên được công bố (LM1và RM1) và 6 hợp chất LM2, LM3, LM4, LM6, LM10 và LM12 là các hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài dâu tằm. 3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4-tetra- hydroxyflavon (LM1-chất mới) Sanggenon J (LM2) Sanggenon K (LM3) Kuwanon S (LM5) Ge: 3,8-diprenyl- 4',5,7- trihydroxyflavone (LM4) 8-geranylapigenin (LM6) Cyclomulberrin (LM7) O OOH O OH O Cyclomorusin (LM8) Morusin (LM9/RM8) Atalantoflavone (LM10) Keampferol (LM11) Steppogenin (LM12) RM1 (11,6mg) Chất mới RM8 (6,1 mg) C.M 10/1 RM-E3 RM-E4 RM-E4.3.3 H.C.M 0,5/1/0,1 RM6 (16mg) RM7 (24mg) RM-E4.1 H.A 2/1 RM-E4.3 C.M 1/1 RM-E4.3.1 RM-E4.3.2 Sephadex M.W 1/1 RM5 (22mg) RM-E4.2 RM-E4.4 RM-E4.5 RM2 (6,8 mg) M .W 2 /1 RM-E5 RM-E6 C.M 10/1 RM-E6.1 RM-E6.2 RM3 (18 mg) RM-E6.3 M .W 3 /1 RM4 (5,5 mg) RM-E 14 Moracin M (LM13/RM5) Moracin O (LM14/RM6) Moracin P (LM15/RM7) Mulberrofuran K (LM16) Sanggenon C (LM18/RM3) Sanggenon O (LM19/RM4) Kuwanon R(LM17/RM2) Kuwanon J 2,4,10''- trimethyl ether (RM1) Chất mới Hình 4.22:Tổng hợp cấu trúc các hợp chất phân lập được từ các phân đoạn chọn lọc của là và vỏ rễ dâu tằm * Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của 2 hợp chất mới là: 3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4-tetrahydroxyflavone (LM1) (phân lập từ lá dâu tằm) và kuwanon J 2,4,10-trimethyl ether (RM1) (phân lập được từ vỏ rễ dâu tằm): Hợp chất 3-prenyl-3-geranyl-5,7, 2,4-tetrahydroxyflavon (LM1) Hợp chất LM1 phân lập được dưới dạng chất bột màu vàng. Phổ khối lượng phân giải cao HR-FAB-MS xuất hiện pic ion tại m/z 491,2433 [M+H]+ phù hợp với tính toán lý thuyết đối với công thức C30H35O6. Điều này khẳng định LM1 có công thức phân tử C30H34O6. Phổ IR của hợp chất LM1 cho các vân đặc trưng của các nhóm hydroxy (3412 cm-1), carbonyl (1653 cm-1) và vòng thơm (1616 cm-1). Phổ 1H-NMR đặc trưng cho một hợp chất flavone với sự hiện diện một tín hiệu đơn ở vùng trường thấp δH 13,10 ppm do proton của nhóm hydroxy tạo liên kết cầu hydro với nhóm carbonyl (C-4) và hai tín hiệu proton ghép cặp meta δH (ppm) ở 6,23 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,30 (1H, d, J = 2,0 Hz) thuộc vào hai proton H-6 và H-8 ứng với cấu trúc 5,7-dihydroxy của vòng A. Hai tín hiệu proton thơm ở vị trí ortho δH (ppm) tại 6,57 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,01 (1H, d, J = 8,4 Hz) thuộc về hai proton ở vị trí H-5' và H-6' cho phép dự đoán vòng B có thế ở vị trí 2, 3, 4. Ngoài ra, trên phổ còn có các tín hiệu đặc trưng của một nhóm ,-dimethylallyl và một nhóm geranyl bao gồm 3 proton olefin tại 5,08 (2H, m, H-10, 7) và 5,32 (1H, t, J = 7,2 Hz, H-2) và các proton của hai nhóm methylene liên kết với vòng thơm tại 3,08 (2H, br d, J = 6,8 Hz, H-9) và 3,46 (2H, br d, J = 7,2 Hz, H-1), hai nhóm methylene tại 1,97 (2H, m, H-5) và 2,05 (2H, m, H-6), năm nhóm methyl tại 1,37 (3H, br s, H-12), 1,55 (6H, br s, H-13, 10), 1,61 (3H, br s, H-9) và 1,78 (3H, br s, H-4). Sự vắng mặt tín hiệu đơn ứng với H-3 cho phép dự đoán một trong hai nhóm thế sẽ được gắn vào C-3. 15 Phổ UV của LM1 trong methanol cho các cực đại tại  216,5, 258,4 và 328,5 nm. Khi bổ sung NaOAc phổ có các cực đại tại  220, 267 và 398 nm. Sự chuyển dịch mạnh cực đại ứng với hệ cinnamoyl vòng B (328 – 398 nm) chứng tỏ có nhóm OH tự do ở C-4 [109]. Kết quả phân tích chi tiết phổ 13C-NMR và HMQC hoàn toàn phù hợp với nhận xét trên. Ngoài các tín hiệu ứng với khung flavone trong đó có 4 cacbon aromatic liên kết trực tiếp với nhóm hydroxy là C-5 (C 159,4), C-7 (C 164,8), C-2 (C 154,5) và C-4 (C 158,8) [14] và 2 cacbon aromatic liên kết với cacbon của nhóm thế là C-3 (C 122,2) và C-3 (C 117,0) còn có mặt các tín hiệu của một nhóm ,-dimethylallyl tại C (ppm) 24,6 (C-9), 122,4 (C-10), 132,3 (C-11), 25,9 (C-12) và 17,7 (C-13) cùng các tín hiệu của một nhóm geranyl tại C (ppm) 23,1 (C-1), 123,6 (C-2), 135,4 (C-3), 16,4 (C-4), 40,6 (C-5), 27,5 (C-6), 125,2 (C-7), 131,7 (C-8), 25,9 (C-9), 17,7 (C-10). Cấu trúc của khung flavone, các nhóm thế prenyl và sự gắn kết giữa chúng được khẳng định qua các tương tác trên phổ HMBC (Hình 4.5f). Các tương tác xa của H-6 với C-4a và C-8, H-8 với C-4a và C-6, H-5 với C-1 và C-3, H-6 với C-2 cũng như tương tác giữa proton của nhóm 5-OH với C-4, C-4a và C-5 đã khẳng định cấu trúc 5,7,2,4-tetrahydroxyflavone có hai nhóm thế không liên kết với vòng thơm qua oxy tại C-3 và C-3. Cấu trúc nhóm thế prenyl dạng ,-dimethylallyl được khẳng định qua các tương tác của H-12 và H-13 với C-11 cùng tương tác của H-9 với C-10 và C-11. Cấu trúc nhóm thế geranyl được khẳng định qua các tương tác của H-1 với C-2, C-3 và C- 4, H-4 với C-2, H-5 với C-3, H-9 với C-7 cùng tương tác của H-10 với C-7 và C-8. Sự xuất hiện tương tác của proton H-9 (H 3,08) với các cacbon C-2 (C 162,1), C- 3 (C 122,2) và C-4 (C 183,2) chứng tỏ nhóm prenyl được gắn kết vào vị trí C-3. Đồng thời tương tác giữa proton H-1 (H 3,46) với C-2 (C 154,5), C- 3 (C 117,0) và C-4 (C 158,8) khẳng định vị trí gắn kết nhóm geranyl là C-3. Bằng cách phân tích chi tiết các tương tác nhận được trên phổ HMBC (Hình 4.5e) cho phép khâu nối các mảnh cấu trúc lại với nhau và xác định được toàn bộ cấu trúc phẳng của hợp chất LM1 như đã được mô tả trong hình 4.5f. Như vậy LM1 có cấu trúc 3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4-tetrahydroxyflavone. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được công bố. Hợp chất kuwanon J 2,4,10-trimethyl ether (RM1) Hợp chất RM1 phân lập được dưới dạng chất bột màu vàng, [ ] + 102,5o (c 0,1 MeOH). O OO HO OH OH H 2 3 5 6 8 8a 1' 2' 4'6' 9 10 12 13 1'' 2'' 4'' 5'' 7'' 8'' 9'' 10'' Hình 4.5f:Cấu trúc và các tương tácHMBC của hợp chất LM1 16 Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại pic m/z 721,3023 [M+H]+ phù hợp với tính toán lý thuyết đối với công thức C43H45O10. Phổ IR của hợp chất RM1 cho các vân đặc trưng của nhóm hydroxy (3375 cm-1), nhóm cacbonyl (1707 cm-1) và vòng thơm (1628 cm-1). Phổ UV có các cực đại hấp thụ tại 225 (3,95), 292 (3,46) và 384 (3,77) nm. Phổ 1H-NMR của RM1 có các tín hiệu của 2 hệ proton ABX vòng thơm ở H 6,62 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-3), 6,59 (1H, dd, J = 2,5 và 8,5 Hz, H-5) và 7,80 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6) và 6,51 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-17), 6,30 (1H, dd, J = 8,5 và 2,5 Hz, H-19), 6,97 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-20) cùng 4 tín hiệu của 2 cặp proton liền kề tại 6,34 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5), 7,86 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-6), 6,55 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-13) và 8,49 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-14). Hai tín hiệu kép ở H (ppm) 7,74 (1H, d, J = 15,5 Hz) và 8,10 (1H, d, J = 15,5 Hz) cho thấy đặc trưng của hai proton liên kết đôi trans ở vị trí H- và H- của khung chalcone,và một tín hiệu đơn ở vùng trường thấp H = 14,30 ppm được cho là do nhóm hydroxy (2-OH) tạo liên kết cầu hydro với nhóm carbonyl. Dữ liệu này cho phép nhận định hợp chất RM1 có một phần cấu trúc khung chalcone và một nhóm prenyl tại H = 3,20 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 5,08 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-22), 1,57 (3H, s, H-24), và 1,69 (3H, br s, H-25). Ngoài ra, còn xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng từ của vòng methylcyclohexene gồm bốn proton của nhóm methine ở H = 5,66 (1H, s, H-2), 4,15 (1H, s, H-3), 4,67 (1H, t, J = 4,4 Hz, H-4), 3,83 (overlap, H-5), hai tín hiệu proton của nhóm methylene ở H 2,27 và 2,50 (mỗi 1H, d, J = 18,7 Hz, H-6) cùng tín hiệu proton của nhóm methyl ở H 1,92 (3H, s, H-7). Những nhận định trên hoàn toàn phù hợp với các tín hiệu thu được trên phổ 13C- NMR và DEPT (Hình 4.19c và Bảng 4.9) bao gồm 43 tín hiệu đặc trưng cho 2 nhóm ketone, 3 nhóm methoxy, một nhóm prenyl, hai vòng benzene bị thế ở vị trí 1, 2, 3, 4 và 2 vòng benzene bị thế ở vị trí 1, 2, 4 cùng với vòng methylcyclohexene. Phân tích chi tiết phổ 13C-NMR cho thấy RM1 có độ dịch chuyển hóa học tương tự như kuwanon J (Bảng 4.9). Từ dữ liệu này cho phép xác định hợp chất RM1 có cấu trúc giống kuwanon J ngoại trừ việc có thêm 3 nhóm methoxy [14], [77], [156]. Các phổ NMR cho thấy ba nhóm methoxy này qua các tín hiệu cộng hưởng ở H (ppm) 3,85 (3H, br s, 2-OMe)/ C 161,3 (C-2), H 3,87 (3H, br s, 4-OMe)/ C 164,4 (C-4) và H 3,93 (3H, br, s, 10''-OMe)/C 163,8 (C-10). Vị trí gắn kết được xác định bằng phổ HMBC (Hình 4.19e) qua các tương tác giữa tín hiệu proton của nhóm methoxy với C-2 (C161,3), C-4 (C164,4), và C-10'' (C 163,8). Điều này cho thấy 3 nhóm methoxy nằm ở vị trị C-2, C-4 và C-10''. Cấu hình tương đối của vòng methylcyclohexene được xác định đầu tiên bằng cách so sánh số liệu phổ 1H -NMR cùng giá trị hằng số tương tác J proton-proton với các số liệu đã được công bố cho hợp chất kuwanon J có cấu trúc tương tự [77], [156] và được khẳng định thêm bởi các tương tác không gian nhận được trên phổ NOESY (Hình 4.19f). Hằng số tương tác nhỏ giữa H-3''/H-4'' và H-4''/H-5'' chỉ ra mối quan hệ pseudo –diequatorial hoặc equatorial-axial của các proton này. Tương tác giữa H-3'' và H-4'' 17 trên phổ NOESY của hợp chất RM1 chỉ ra rằng 2 proton này nằm cùng một phía mặt phẳng của vòng cyclohexene. Như vậy, vòng cyclohexen có dạng cis-trans như hình 4.19g. Từ các số liệu thu được từ phổ NMR một chiều và 2 chiều, kết hợp với số liệu thu được từ phổ khối lượng phân giải cao và phổ hồng ngoại xác định được hợp chất RM1 là kuwanon J 2,4,10''-trimethyl ether (Hình 4.19h) và đây là một chất mới lần đầu tiên được công bố. 4.3.3. Nhận xét Bằng mô hình chiết tách hoạt chất theo sự dẫn đường của phép thử hoạt tính ức chế NF-B trên dòng tế bào ung thư HeLa đã phân lập được 19 hợp chất LM1 – LM19 từ lá và 8 hợp chất RM1 – RM8 từ vỏ rễ loài dâu tằm Morus alba L. ở Việt Nam (Hình 4.22). Trong số đó các hợp chất 3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4-tetrahydroxyflavone (LM1) và kuwanon J 2,4,10-trimethylether (RM1) là những hợp chất mới lần đầu tiên được công bố. Các hợp chất sanggenon J (LM2), sanggenon K (LM3), 8,3- diprenyl-5,7,4-trihydroxyflavone (LM4), 8-geranylapigenin (LM6), atalantoflavone (LM10) và steppogenin (LM12) lần đầu tiên được tìm thấy ở loài Morus alba L. Tất cả các hợp chất phân lập được đều thuộc lớp polyphenol bao gồm các flavonoid, benzofuran và sản phẩm cộng hợp Diels-Alder. Ngoại trừ keampferol (LM11), steppogenin (LM12) và moracin M (LM13) các hợp chất đều có nhóm thế prenyl, yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính sinh học của lớp chất polyphenol và các thực vật thuộc chi Dâu tằm (Morus L.). Sự hiện diện các cặp đồng phân LM2/LM3, LM4/LM5/LM6, LM7/LM9, LM14/LM15 và RM3/RM4 cùng các hợp chất được tạo thành do phản ứng đóng vòng của nhóm prenyl với nhóm hydroxy phenolic như LM2, LM3, LM7, LM8, LM9, LM10 chứng tỏ tính đa dạng về cấu trúc hóa học của loài Morus alba L. do sự xuất hiện nhóm thế prenyl. 4.4. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC 4.4.1 Hoạt tính ức chế NF-B Xác định khả năng ức chế NF-B trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) theo phương pháp SEAP hoặc dùng kit thử sẽ đánh giá được ảnh hưởng của các chất Hình 4.19g: Các tương tác HMBC () và NOESY () của hợp chất RM1 18 thử đến hoạt động của yếu tố NF-B. Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng 4.11. Khả năng ức chế hoạt động NF-B được đánh giá thông qua giá trị IC50. Bảng 4.11: Kết quả thử hoạt tính ức chế NF-B và tỷ lệ sống sót của tế bào của các hợp chất phân lập được Chất NF-B (IC50 µM) Tỷ lệ tế bào sống sót (%) 3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4-tetrahydroxyflavone (LM1) 1,51 ± 0,13 52,4 Sanggenon J (LM2) 1,47 ± 0,12 23,9 Sanggenon K (LM3) 0,58 ± 0,04 50,2 8,3′-diprenyl-5,7,4′-trihydroxyflavone (LM4) 8,47 ± 0,66 18,1 Kuwanon S (LM5) 0,41 ± 0,01 92,5 8-geranylapigenin (LM6) 1,59 ± 0,4 58,3 Cyclomulberrin (LM7) 0,042 ± 0,01 88,2 Cyclomorusin (LM8) 0,37 ± 0,02 85,7 Morusin (LM9/RM8) 0,32 ± 0,02 40,2 Atalantoflavone (LM10) 3,09 ± 0,07 41,6 Kaempferol (LM11) 78,23 ± 11,4 100 Steppogenin (LM12) 36,5 100 Moracin M (LM13/RM5) >100 100 Moracin P (LM14/RM6) >100 100 Moracin O (LM15/RM7) >100 100 Mulberrofuran K (LM16) 53,8 100 Kuwanon R (LM17/RM2) 7,38 ± 1,05* 88,1 Sanggenon C (LM18/RM3) 1,82 ± 0,27 98,3 Sanggenon O (LM19/RM4) 1,02 ± 0,15 96,7 Kuwanon J 2,4,10′′-trimethyl ether (RM1) 4,65 ± 0,94* 90,0 Deguelin 0,22 ± 0,04 100 Celastrol 0,15±0,03* * Đánh giá theo TransAM NF-B p65 Chemi Kit Ngoại trừ moracin M, O, P tất cả các hợp chất đều có tác dụng ức chế hoạt động của NF-B trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa). Các hợp chất chứa nhóm thế “prenyl” thể hiện hoạt tính mạnh hơn. Các hợp chất kuwanon S, cyclomulberrin, cyclomorusin, sanggenon C và sanggenon O có hoạt tính rất mạnh (IC50 0,042 – 1,82 M). Hợp chất mới LM1 có IC50 là 1,51 M, còn hợp chất mới RM1 có IC50 là 4,65 M. 19 4.4.2. Tác dụng gây độc tế bào Thử hoạt tính gây độc tế bào của tất cả các hợp chất đã phân lập được từ lá và vỏ rễ loài dâu tằm trên các dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư vú (MCF-7) và ung thư gan (Hep-3B). Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện bằng phương pháp tạo phức formazan với 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) sử dụng deguelin làm chất so sánh. Bảng 4.12: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được Chất Hoạt tính gây độc tế bào (IC50 µM) HeLa MCF-7 Hep-3B 3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4- tetrahydroxyflavone (LM1) 1,32 ± 0,51 3,92 ± 0,91 5,22 ± 0,95 Sanggenon J (LM2) 2,28 ± 0,40 4,56 ± 0,71 5,30 ± 1,45 Sanggenon K (LM3) 2,29 ± 1,64 3,51 ± 0,59 3,09 ± 0,67 8,3-diprenyl-5,7,4-trihydroxyflavone (LM4) 1,66 ± 0,27 5,27 ± 1,02 4,71 ± 1,04 Kuwanon S (LM5) 1,64 ± 0,21 7,02 ± 1,66 8,47 ± 2,07 8-geranylapigenin (LM6) 2,24 ± 0,48 3,21 ± 0,87 3,65 ± 0,81 Cyclomulberrin (LM7) 3,69 ± 0,86 7,19 ± 0,77 6,64 ± 1,23 Cyclomorusin (LM8) 1,66 ± 0,27 7,85 ± 1,30 7,55 ± 2,14 Morusin (LM9/RM8) 0,64 ± 0,14 7,88 ± 1,89 9,21 ± 2,06 Atalantoflavone (LM10) 1,25 ± 0,46 6,54 ± 1,23 4,33 ± 0,75 Kaempferol (LM11) 23,05 ± 4,15 21,47 ± 3,92 36,18 ± 6,86 Steppogenin (LM12) >100 >100 >100 Moracin M (LM13/RM5) >100 >100 >100 Moracin P (LM14/RM6) >100 >100 >100 Moracin O (LM15/RM7) >100 >100 >100 Mulberrofuran K (LM16) >100 >100 >100 Kuwanon R (LM17/RM2) 15,6 ± 4,21 27,3 ± 6,16 7,35 ± 2,08 Sanggenon C (LM18/RM3) 2,64 ± 0,43 3,14 ± 0,82 5,55 ± 1,62 Sanggenon O (LM19/RM4) 1,87 ± 0,36 3,03 ± 0,53 4,16 ± 0,97 Kuwanon J 2,4,10′′-trimethyl ether (RM1) 8,44 ± 1,68 13,8 ± 3,05 8,32 ± 1,65 Deguelin 6,40 ± 1,68 5,3 ± 1,32 29,3 ± 3,14 20 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào (Bảng 4.12) của tất cả các hợp chất phân lập được trên ba dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư vú (MCF-7) và ung thư gan Hep-3B cho thấy hầu hết các hợp chất đều có hoạt tính tốt, đặc biệt 12 hợp chất thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 0,66 - 5,30 M. Các hợp chất prenyl flavonoid có hoạt tính mạnh hơn các flavone. Hợp chất 3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4- tetrahydroxyflavone ức chế mạnh cả ba dòng tế bào với giá trị IC50 là 1,32 μM (HeLa), 3,92 μM (MCF-7) và 5,22 μM (Hep-3B), trong khi hợp chất mới kuwanon J 2,4,10- trimethyl ether thể hiện hoạt tính trung bình với giá trị IC50 lần lượt là 8,44, 13,8 và 8,32 M. Trong ba dòng tế bào được thử nghiệm, các hợp chất prenyl flavonoid có tác dụng mạnh nhất đối với dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa). So sánh giá trị IC50 của các hợp chất được thử nghiệm cho thấy morusin (LM9) có khả năng kháng dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) lớn nhất với giá trị IC50 là 0,64 μM. Lee và cộng sự cũng phân lập được hợp chất này từ loài Morus australis và đã chứng minh tác dụng thúc đẩy sự chết theo chương trình theo cơ chế ức chế sự hoạt hóa NF-B trên dòng tế bào ung thư đại trực tràng người HT-29 [102]. So sánh hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư cổ tử cung của hai hợp chất LM8 và LM9. Hai hợp chất này có cấu trúc gần giống nhau và chứa nhóm isoprenyl ở vị trí C- 3 và C-8, tuy nhiên có thể sự khác biệt về nhóm thế “prenyl” ở các vị trí C-3 và C-8 đã dẫn đến sự khác biệt về hoạt tính. Hoạt tính của hợp chất LM9 (IC50 là 0,64 μM) cao hơn so với hợp chất LM8 (IC50 là 1,66 μM) có thể là do hợp chất LM9 có nhóm prenyl đóng vòng ở C-8 làm tăng sự liên hợp. Ngoài ra, có thể sự có mặt nhóm prenyl dạng vòng ở C-3 có tác dụng làm giảm hoạt tính, đồng thời các nhóm cho điện tử (-OH) ở vị trí C-2 (như ở chất LM9) lại làm tăng hoạt tính dẫn đến hoạt tính của hợp chất LM9 lớn hơn hợp chất LM8. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Mazimba (2011) [108] về hoạt tính chống oxi hóa và kháng khuẩn của một số prenyl flavonoid ở loài Morus nigra. Điều này chỉ ra rằng các nhóm prenyl hoặc geranyl cũng như sự đóng vòng của các nhóm này với nhóm hydorxy phenolic đã làm tăng hoạt tính gây độc tế bào của các flavone. 4.4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của sanggenon C và sanggenon O 4.4.3.1. Tác dụng ức chế sự sản sinh NO Nitric oxide (NO) là tác nhân tham gia điều chỉnh các quá trình sinh lý khác nhau trong động vật có vú và sự sản sinh NO quá mức gây ra các bệnh lý viêm, ung thư và tiểu đường. Tác dụng ức chế sự sản sinh NO của hai hợp chất sanggenon C và sanggenon O trên dòng tế bào RAW264.7 kích thích bằng LPS được thực hiện trong 24 giờ theo phương pháp Griess. Kết quả chỉ ra rằng sanggenon C và sanggenon O ức chế mạnh sự sản sinh NO với giá trị IC50 là 2,82 và 1,15 μM (Hình 23aA). Kết quả đánh giá khả năng sống sót của tế bào theo phương pháp MTT cho thấy cả hai hợp chất không có biểu hiện gây độc ở nồng độ ức chế sự sản sinh NO. 21 4.4.3.2. Tác dụng ức chế hoạt động NF-B trên dòng tế bào RAW264.7 Một số nghiên cứu cho thấy sự hoạt động của NF-B liên quan mật thiết đến sự sản sinh NO, vì vậy sự ức chế NF-B có thể ngăn chặn sự sản sinh NO. Tác dụng ức chế mạnh sự hoạt hoá NF- κB ở nồng độ tương đương với nồng độ ức chế sự sản sinh NO của hai hợp chất sanggenon C và sanggenon O trên dòng tế bào RAW264.7 kích thích bằng LPS (1 μg/mL) được thực hiện theo phương pháp SEAP. Kết quả cho thấy sanggenon C và sanggenon O ức chế mạnh sự hoạt hoá NF- κB với giá trị IC50 là 3,38 và 1,29 μM (Hình 4.23aB). Hoạt tính ức chế NF-B của hai hợp chất này trên dòng tế bào RAW264.7 cũng mạnh như trên dòng tế bào HeLa. 4.4.3.3. Tác dụng ức chế biểu hiện iNOS trên dòng tế bào RAW264.7 Sự sản sinh NO phụ thuộc vào hoạt động của các enzyme tổng hợp nitơ oxit (NOS) trong đó đáng chú ý là enzyme iNOS. Kích thích biểu hiện iNOS là một phản ứng cơ bản của sự sản sinh NO. Bình thường, iNOS không xuất hiện trong các tế bào không hoạt động tích cực, nhưng trong điều kiện sinh bệnh thì các iNOS xuất hiện và sản sinh ra một lượng lớn NO tương ứng với các tín hiệu viêm, ví dụ như cytokines và lipopolysaccharides (LPS) [169]. Trong hầu hết các loại tế bào, yếu tố phiên mã NF- B là một yếu tố chính điều chỉnh biểu hiện iNOS tương ứng với các tín hiệu viêm. Vì vậy, sự ức chế NF-B có thể ngăn chặn sự sản sinh NO và sự biểu hiện của iNOS đã trở thành mục tiêu quan trọng trong điều trị các bệnh liên quan [169]. Vì sanggenon C và sanggenon O có khả năng giảm mạnh sự sản sinh NO và hoạt Hình 4.23a: Tác dụng của sanggenon C và O đến sự sản sinh NO (A) và hoạt tính NF-κB (B) ở dòng tế bào RAW264.7. 22 hóa NF-κB nên chúng tôi đã đánh giá tác dụng của các hợp chất này đến biểu hiện iNOS ở dòng tế bào RAW264.7 kích thích bằng 1 μg/mL LPS trong 24 giờ theo phương pháp phân tích Western blot. Hình 4.23b chỉ ra rằng ở nồng độ 1 và 10µM hai hợp chất này làm giảm mạnh biểu hiện iNOS. 4.4.3.4. Tác dụng ngăn chặn sự phosphoryl hoá, giáng hoá IκBα Do sự hoạt hoá NF-κB bởi những yếu tố kích thích khác nhau xảy ra trước quá trình phosphoryl hoá và sự giáng hoá của protein IκBα trên tế bào RAW264.7 bị kích thích bởi LPS [25] nên tiếp tục đánh giá tác dụng của hai hợp chất này đến sự phosphoryl hoá và giáng hoá IκB. LPS kích thích sự giáng hoá và phosphoryl hoá IκBα được chỉ ra trong hình 4.23b (làn 1 và 2). Sự giáng hoá và phosphoryl hoá này giảm đáng kể khi có mặt sanggenon C và sanggenon O (làn 36). Như vậy tác dụng ức chế NF-κB của sanggenon C và sanggenon O là do sự bất hoạt protein IκBα. Hình 4.23b: Tác dụng của sanggenon C và O đến biểu hiện của iNOS và sự phosphoryl hoá, giáng hoá của IκBα ở tế bào RAW264.7 được kích thích bằng LPS (1 μg/mL) Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng sanggenon C ức chế sự sản sinh NO và biểu hiện iNOS bằng cách ngăn chặn sự hoạt hóa NF-κB thông qua tác dụng ức chế quá trình phosphoryl hóa IB và ngăn cản sự giáng hóa IB khỏi phức hợp với NF-B. Điều thú vị là sanggenon C và sanggenon O là các đồng phân lập thể ở vị trí C-2 và C- 3 và tác dụng ức chế NF-κB và sản sinh NO của sanggenon O mạnh hơn của sanggenon C cho phép giả thiết rằng cấu hình lập thể ở vị trí C-2 và C-3 có thể đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế sự sản sinh NO và hoạt động của NF-κB. Đây là nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính ức chế sự sản sinh NO của sanggenon C và sanggenon O và cũng là nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính ức chế NF-B của sanggenon O ở mức độ phân tử. Qua nghiên cứu này có thể thấy cả hai hợp chất đều có thể là những tác nhân kháng viêm và ung thư đầy tiềm năng. 1 2 3 4 5 6 Làn Protein đối chứng 23 4.4.4. Nhận xét Ngoại trừ các hợp chất moracin M, O, P không thể hiện hoạt tính cùng hợp chất steppogenin và mulberrofuran K có hoạt tính yếu, tất cả các hợp chất phân lập được đều ức chế mạnh hoạt động NF-B trên dòng tế bào ung thư HeLa. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào HeLa, MCF-7 và Hep-3B. Điều này chứng tỏ mô hình sàng lọc các chất có tác dụng diệt tế bào ung thư theo sự dẫn đường của phép thử hoạt tính ức chế hoạt động NF-B trên dòng tế bào ung thư là hữu hiệu. Đáng chú ý là cả hai hợp chất mới 3-prenyl-3- geranyl-5,7,2,4-tetrahydroxyflavone (LM1) và kuwanon J 2,4,10-trimethyl ether (RM1) đều có hoạt tính ức chế mạnh hoạt động của NF-B và sự phát triển của ba dòng tế bào ung thư HeLa, MCF-7, Hep-3B. Các hợp chất có nhóm thế prenyl thường có hoạt tính mạnh hơn và hoạt lực ức chế còn phụ thuộc vào vị trí gắn kết với vòng thơm cũng như khả năng tạo vòng với nhóm hydroxy phenolic như LM1/LM2/LM3, LM7, LM8, LM9, LM10. Các hợp chất moracin M, P, O tuy không thể hiện hoạt tính ở các thử nghiệm ức chế NF-B và gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư HeLa, MCF-7 và Hep-3B nhưng theo những nghiên cứu của các tác giả trước đây chúng được xem làm những phytoalexin bởi tác dụng kháng khuẩn mạnh [19], [108] tác dụng ức chế sự phát triển của virus viêm gan C (HCV) [171] và có tác dụng kích thích miễn dịch. Moracin M cũng đã được chứng minh hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư máu chuột P-388 [49]. Ngoài ra, moracin M và steppogenin còn ức chế mạnh enzyme tyrosinase ở cả hai phản ứng oxy hóa trong quá trình tạo thành melamin. Các kết quả nghiên cứu này chứng tỏ các hợp chất này cũng có thể là những tác nhân phòng chống ung thư theo những cơ chế khác. KẾT LUẬN 1.Về thành phần hóa học Đây là công trình đầu tiên phân lập các hợp chất có tác dụng chống ung thư từ lá và vỏ rễ loài dâu tằm Morus alba L. theo sự dẫn đường của phép thử hoạt tính ức chế yếu tố phiên mã NF-B trên dòng tế bào ung thư. 1.1 Từ phần lá của loài dâu tằm (Morus alba L.) thu hái tại Mỹ Đức, Hà Nội đã phân lập và xác định được cấu trúc của 19 hợp chất là: 3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4- tetrahydroxyflavone (LM1), sanggenon J (LM2), sanggenon K (LM3), 8,3-diprenyl- 5,7,4-trihydroxyflavone (LM4), kuwanon S (LM5), 8-geranylapigenin (LM6), cyclomulberrin (LM7), cyclomorusin (LM8), morusin (LM9), atalantoflavone (LM10), kaempferol (LM11), steppogenin (LM12), moracin M (LM13), moracin P (LM14), moracin O (LM15), mulberrofuran K (LM16), kuwanon R (LM17), sanggenon C (LM18), sanggenon O (LM19). Trong số đó, hợp chất 3-prenyl-3- 24 geranyl-5,7,2,4-tetrahydroxyflavone (LM1) là hợp chất mới lần đầu tiên được công bố và lần đầu tiên các hợp chất sanggenon J (LM2), sanggenon K (LM3), 8,3- diprenyl-5,7,4-trihydroxy-flavone (LM4), 8-geranylapigenin (LM6), atalantoflavone (LM10) và steppogenin (LM12) và được tìm thấy ở loài dâu tằm. 1.2. Từ phần vỏ rễ của loài dâu tằm (Morus alba L.) thu hái tại Mỹ Đức, Hà Nội đã phân lập được 8 hợp chất là: kuwanon J 2,4,10-trimethyl ether (RM1), kuwanon R (RM2), sanggenon C (RM3), sanggenon O (RM4), moracin M (RM5), moracin P (RM6), moracin O (RM7), morusin (RM8). Trong số đó, hợp chất kuwanon J 2,4,10- trimethyl ether (RM1) là hợp chất mới, lần đầu tiên được công bố. 2. Về nghiên cứu hoạt tính sinh học 2.1. Ngoại trừ moracin M, O, P tất cả các hợp chất đều có tác dụng ức chế hoạt động của NF-B trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa). Các hợp chất chứa nhóm thế “prenyl” thể hiện hoạt tính mạnh hơn. Các hợp chất kuwanon S, cyclomulberrin, cyclomorusin, sanggenon C và sanggenon O có hoạt tính rất mạnh (IC50 0,042 – 1,82 M). Hợp chất mới LM1 có IC50 là 1,51 M, còn hợp chất mới RM1 có IC50 là 4,65 M. 2.2. Hầu hết các hợp chất đều có hoạt tính gây độc tế bào trên tất cả các dòng tế bào HeLa, MCF-7 và Hep-3B. Đặc biệt 12 hợp chất thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 0,66 - 5,30 M. Hợp chất mới 3-prenyl-3-geranyl-5,7,2,4-tetrahydroxyflavone (LM1) ức chế mạnh cả ba dòng tế bào với giá trị IC50 là 1,32 M (HeLa), 3,92 M (MCF-7) và 5,22 M (Hep-3B) và hợp chất mới kuwanon J 2,4,10-trimethyl ether (RM1) có các giá trị IC50 lần lượt là 8,44, 13,8 và 8,32 M. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào đã chứng tỏ mô hình sàng lọc các hợp chất có tác dụng diệt tế bào ung thư theo sự dẫn đường của phép thử hoạt tính ức chế NF-B là hữu hiệu. 2.3. Lần đầu tiên nghiên cứu tác dụng và cơ chế ức chế sự sản sinh NO theo con đường ức chế sự hoạt hóa NF-B của cặp đồng phân lập thể sanggenon C và sanggenon O. Cả hai hợp chất đều làm giảm hoạt động phiên mã gen quy định tổng hợp protein iNOS theo hướng chọn lọc cũng như ức chế quá trình phosphoryl hóa, giáng hóa của IB. Đây cũng là công bố đầu tiên về nghiên cứu hoạt tính ức chế NF- B của sanggenon O ở mức độ phân tử. Các kết quả nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học cũng góp phần lý giải công dụng chữa bệnh trong y học dân tộc của loài dâu tằm. KIẾN NGHỊ Nghiên cứu tiếp thành phần có hoạt tính từ phân đoạn n-hexane. Nghiên cứu hoạt tính chống ung thư in vivo của các phần chiết ethyl acetate. CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Nguyen Tien Dat, Phung Thi Xuan Binh, Le Thi Phuong Quynh, Chau Van Minh, Hoang Thanh Huong, Jung Joon Lee, Cytotoxic prenylated flavonoids from Morus alba, Fitoterapia (SCIE), 2010, p. 1224-1227. 2. Nguyen Tien Dat, Phung Thi Xuan Binh, Le Thi Phuong Quynh, Hoang Thanh Huong, and Chau Van Minh, Sanggenon C and O inhibit NO production, iNOS expression and NF-κB activation in LPS-induced RAW264.7 cells, Immunopharmacology and Immunotoxicology (SCI), 2012, 34(1), 84–88. 3. Thi Xuan Binh Phung, Thi Hong Hanh Tran, Thi Thuy Hang Dan, Van Minh Chau, Thanh Huong Hoang & Tien Dat Nguyen, Chalcone- derived Diels–Alder adducts as NF-B inhibitors from Morus alba, Journal of Asian Natural Products Research (SCIE), vol. 14, No. 6, June 2012, 596–600. 4. Phùng Thị Xuân Bình, Nguyễn Minh Châu, Hoàng Thanh Hương, Trần Thượng Quảng, Châu Văn Minh, Nguyễn Tiến Ðạt, Hoạt tính ức chế NF-κB của hợp chất Kuwanon S phân lập từ lá dâu tằm, Tạp chí Khoa học & Công nghệ các trường đại học kỹ thuật, số 89, 2012, trang 97-100. 5. Phùng Thị Xuân Bình, Trần Thị Hồng Hạnh, Phạm Thanh Bình, Lê Hoàng Trâm, Nguyễn Thị Luyến, Hoàng Thanh Hương, Nguyễn Tiến Đạt, Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất 2-arylbenzofuran từ lá dâu tằm. Tạp chí Hóa học, tập 50, số 4A, 2012, trang 144-146. 6. Phùng Thị Xuân Bình, Hoàng Thanh Hương, Nguyễn Tiến Đạt, Cấu trúc và hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH của hợp chất mulberrofuran K và steppogenin phân lập từ lá dâu tằm, Tạp chí Dược liệu, tập 19,số 4, 2014, trang 207-210.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_co_hoat_tinh_diet_te_b.pdf
Luận văn liên quan