Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) và xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) (họ La dơn (Iridaceae))

side B (EB-9), (R)-7- acetyl-3,6-dihydroxy-8-methyltetralone (EB-10), eleuthoside A (EB-11), eleuthoside B (EB-12), eleutherinoside D (EB-13), 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14). Trong số đó, (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1) là hợp chất mới và hợp chất 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14) lần đầu được phân lập từ loài này. 1.2 Từ thân rễ loài xạ can đã phân lập và xác định được cấu trúc của 14 hợp chất gồm: 7 hợp chất isoflavonoid là irisflorentin (BS-1), tectorigenin (BS-2), iristectorigenin 22 Chuột ở các lô thí nghiệm đều tăng cân rõ rệt sau 2 tuần và 4 tuần uống thuốc (ptr/s<0,01). Không thấy có sự khác biệt về mức độ tăng trọng lượng giữa lô chứng và các lô thử (p > 0,05). - Ảnh hưởng lên chức năng tạo máu Kết quả định lượng các thông số huyết học: số lượng hồng cầu (HC), nồng độ hemoglobin (Hb), tỷ lệ hematocrit (HCT), số lượng tiểu cầu (PLT) và số lượng bạch cầu (BC), tại các thời điểm sau khi cho uống thuốc 14 ngày (N14) và sau khi uống thuốc 28 ngày (N28) được trình bày ở bảng 4.23. Bảng 4.23. Ảnh hưởng của tectorigienin trên các thông số huyết học của chuột thực nghiệm Chỉ số nghiên cứu Thời điểm nghiên cứu Lô chứng (n = 10) Lô thử 1 (n = 10) Lô thử 2 (n = 10) p HC (1012/L) N14 8,16 ± 0,21 7,92 ± 0,33 6,87 ± 0,57 > 0,05 N28 7,99 ± 0,27 8,38 ± 0,22 8,51 ± 0,21 > 0,05 Hb (g/100mL) N14 13,35 ± 0,36 12,14 ± 0,49 11,34 ± 1,00 > 0,05 N28 13,34 ± 0,31 12,56 ± 0,43 13,17 ± 0,39 > 0,05 HCT (%) N14 37,59 ± 1,11 35,57 ± 1,49 32,72 ± 2,16 > 0,05 N28 37,89 ± 1,29 37,20 ± 1,13 38,28 ± 0,88 > 0,05 PLT N14 716,56± 31,88 721,00±40,46 694,60±47,05 > 0,05 N28 812,20± 38,41 792,90±35,59 793,78± 33,35 > 0,05 BC (109/L) N14 1,95 ± 0,20 1,80 ± 0,15 1,64 ± 0,21 > 0,05 N28 1,58 ± 0,19 1,99 ± 0,22 1,48 ± 0,11 > 0,05 Tại cả 3 thời điểm nghiên cứu, không thấy có sự biến đổi về số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, tỷ lệ hematocrit, số lượng tiểu cầu và số lượng bạch cầu giữa các lô thực nghiệm (p > 0,05). - Đánh giá chức năng gan Kết quả định lượng các thông số AST (aspartat aminotransferase), ALT (alanin amino transferase), cholesterol toàn phần, protein toàn phần tại các thời điểm N14, N28 được trình bày trong bảng 4.24. Bảng 4.24. Ảnh hưởng của tectorigienin đến các thông số AST, ALT, cholesterol toàn phần và protein toàn phần. Chỉ số nghiên cứu Thời điểm nghiên cứu Lô chứng (n = 10) Lô thử 1 (n = 10) Lô thử 2 (n = 10) p ALT (U/L) N14 176,28±9,38 156,75±7,11 155,13±7,54 > 0,05 N28 194,58±17,27 173,91±18,61 209,41±22,02 > 0,05 AST (U/L) N14 59,68 ± 4,79 64,74±3,15 64,80±5,93 > 0,05 N28 75,04 ±3,99 82,66±5,48 74,09±7,90 > 0,05 Cholesterol toàn phần (mmol/L) N14 1,88±0,10 2,06±0,11 2,05 ± 0,12 > 0,05 N28 2,04±0,14 1,79±0,13 1,76 ± 0,10 > 0,05 3 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu thực vật: củ sâm đại hành thu tại Chí Linh, Hải Dương vào tháng 1 năm 2011 và thân rễ cây xạ can thu vào tháng 1 đến tháng 3 năm 2010 tại Lạng Sơn. 2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký cột (CC) pha thường và pha đảo. 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất: kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại như: phổ khối lượng, phổ khối phân giải cao, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D, 2D NMR. 2.4 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học: Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vivo của các cặn chiết: - Theo đường bôi: theo phương pháp của Mrudula Kale (2007), Jaijoy K (2010). - Theo đường uống: theo phương pháp của Miklos Gabor (2009). Nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC (dendritic cells) sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS (lipopolysaccharide) của các hợp chất phân lập được từ cây sâm đại hành: được tiến hành tại Viện CN sinh học Hàn Quốc, các hợp chất được thử nghiệm ở các nồng độ 50,0; 25,0; 12,5 và 6,3 µM, dịch huyền phù được thu hoạch sau 16 giờ kích thích, phát hiện nồng độ murine IL-12p40, IL- 6 và TNF-α bằng máy ELISA. Nghiên cứu tác dụng dược lí in vivo và độ an toàn của tectorigenin phân lập được từ thân rễ cây xạ can - Nghiên cứu tác dụng kháng viêm, giảm đau của tectorigenin thực hiện tại bộ môn Dược lí, trường đại học Dược Hà Nội theo các phương pháp chuẩn thường qui. - Nghiên cứu độ an toàn của tectorigienin được tiến hành tại bộ môn Dược lí, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương: độc tính cấp, độc tính bán trường diễn được đánh giá theo phương pháp của OECD. CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM Chương này mô tả chi tiết các quá trình chiết, phân lập các hợp chất và đánh giá các hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập được. Quy trình phân lập các hợp chất từ củ sâm đại hành Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết etyl axetat của củ sâm đại hành SKC, SiO2 HX:Aceton (5:1) Cặn EB/Et SKC, SiO2, gradient HX:Aceton (40:1 -1:1) EB-A EB-D EB-B EB-C SKC, SiO2 CHCl3:Aceton 10:1) EB-14 (10mg) EB-B1 EB-B4 EB-B2 EB-B3 EB-2 (12mg) EB-10 (8mg) SKC, YMC RP-18, MeOH:H2O (6:1) EB-4 (5mg) EB-5 (9mg) EB-6 (15mg) SKC, YMC RP-18 MeOH:H2O (3:1) 4 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn nước của củ sâm đại hành Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành Hợp chất EB-1 (1) Chất bột màu vàng nhạt; 25][ Dα –58,1 (MeOH, c = 0,3); ESI-MS m/z 419 [M‒H]–; HR-ESI-MS m/z 455,1126 [M+Cl]– (C21H24O9Cl, 455,1114), m/z 419,1338 [M‒H]– (C21H23O9, 419,1348), m/z 257,0818 [M‒Glc]– (C15H13O4, 257,0819). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 4,87 (1H, ddq, J=4,0; 6,1; 12,0, H-2); 2,57 (1H, dd, J=4,0; 16,8, Hb-3); 2,62 (1H, dd, J=12,0; 16,8, Ha-3); 6,85 (1H, s, H-6); 6,67 (1H, s, H-7); 6,45 (1H, s, H-9); 1,46 (1H, d, J=6,1, 2-Me); 2,45 (1H, s, 5-Me); 4,93 (1H, d, J=7,2, H-1′); 3,40 (1H, H-2′); 3,47 (1H, H-3′); 3,31 (1H, d, J=8,5, H-4′); 3,42 (1H, H- 5′); 3,62 (1H, dd, J=5,6; 12,2, Hb-6′); 3,83 (1H, dd, J=2,2; 12,2, Ha-6′). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 163,4 (C-1); 78,0 (C-2); 45,9 (C-3); 194,3 (C-4); 114,6 (C-4a); 137,6 (C-5); 124,2 (C-6); 141,4 (C-6a); 103,6 (C-7); 161,4 (C-8); 103,5 (C-9); 158,7 (C-10); 109,9 (C-10a); 20,7 (2-Me); 23,3 (5-Me); 101,7 (C-1′); 74,8 (C-2′); 78,0 (C-3′); 71,4 (C-4′); 78,3 (C-5′); 62,5 (C-6′). Thuỷ phân hợp chất EB-1 Hoà tan hợp chất EB-1 trong dung dịch HCl 0,1 N (dioxane/H2O, 1:1, v/v, 1,0 ml) rồi đun cách thuỷ ở 800C trong 3h. Sau đó, dung dịch axit được trung hoà bởi Ag2CO3, và dung môi được loại bỏ triệt để bởi khí N2, sau đó chiết với CHCl3 được lớp CHCl3 và lớp nước. Lớp CHCl3 đem tiến hành sắc ký lớp mỏng điều chế với hệ dung môi CHCl3- MeOH (8:1, v/v) thu được hợp chất EB-1a. Lớp nước được làm khô kiệt bởi khí N2, phần cặn hoà tan trong 0,1 ml pyridine khô rồi thêm vào đó este L-cysteine methyl hydrochloride trong pyridin (0,06 M, 0,1 mL). Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt đến 600C trong 2 giờ rồi bổ sung thêm 0,1 ml dung dịch trimethylsilylimidazole và tiếp tục gia nhiệt đến 600C trong 1,5 giờ. Sản phẩm sau khi được làm khô được phân bố với n-hexan (0,1 ml) và H2O (0,1 ml), lớp n-hexan được phân tích bằng sắc ký khí GC (cột SPB-1 (0,25 mm×30 m), detector FID, nhiệt độ cột 2100C, nhiệt độ tiêm 2700C, nhiệt độ detector 3000C, khí mang He (2,0 ml/phút)). Thời gian lưu của peak được phát hiện ở 14,11 phút. Với những điều kiện trên thì peak của Cặn EB-W SKC, Dianion HP-20P, MeOH (0%, 25%, 50%, 75%, 100%) EB-E EB-K EB-G EB-H SKC, SiO2 CHCl3:MeOH:H2O (5:1:0,15) SKC, LH-20 MeOH EB-1 (5mg) EB-3 (9mg) EB-G1 EB-G3 EB-G2 EB-7 (12mg) EB-8 (15mg) SKC, YMC RP-18 Aceton:H2O (1:2) EB-9 (8mg) EB-12 (9mg) EB-13 (14mg) SKC, YMC RP-18 MeOH:H2O (1:1) EB-F EB-11 (19mg) 21 Lô thử uống tectorigienin liều 60mg/kg 313,48±40,52 p3/1<0,05 p3/2>0,05 35,67 56,49±5,01 p3/1<0,01 p3/2>0,05 43,54 Ghi chú: px/y: mức độ tin cậy của lô x so với lô y Từ bảng 4.20 ta thấy tectorigienin thể hiện rõ tác dụng chống viêm mạn khi cân khối lượng u hạt lúc ướt và lúc khô. Tỷ lệ ức chế u hạt của tectorigienin tương đối cao, khi cân ướt là 35,67%, khi cân khô là 43,54%. Tác dụng chống viêm của tectorigienin liều 60 mg/kg cân nặng tương đương với tác dụng chống viêm của prednisolon liều 5 mg/kg cân nặng. b. Nghiên cứu về tính an toàn của tectorigienin * Độc tính cấp Đã tiến hành nghiên cứu độc tính cấp của tectorigenin ở 5 mức liều khác nhau. Số lượng chuột chết ở các lô thử cụ thể được trình bày trong bảng 4.21. Bảng 4.21 Kết quả theo dõi động vật thí nghiệm Mức liều Liều thử (g mẫu thử/kg chuột) Số chuột chết/ sống thực tế Số chuột chết/ sống kỳ vọng % chết 1 1,0 0/10 0/21 0,00 2 1,5 4/6 4/11 26,67 3 2,0 7/3 11/5 68,75 4 2,5 8/2 19/2 90,48 5 3,0 10/0 29/0 100,00 Từ kết quả trên theo công thức tính của Behrens đã xác định được độc tính cấp của tectorigienin với giá trị LD50 = (1,78 ± 0,13) gam/kg chuột. * Độc tính bán trường diễn - Về tình trạng chung: Trong thời gian thử nghiệm, chuột ở cả 3 lô hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, ăn uống bình thường, phân khô, nước tiểu bình thường. Không thấy biểu hiện đặc biệt ở cả 3 lô chuột trong suốt thời gian nghiên cứu. Tiến hành cân chuột trước, trong và lúc kết thúc thí nghiệm. Mức độ tăng cân của chuột so với trước khi uống thuốc tại các thời điểm nghiên cứu như sau: Bảng 4.22. Ảnh hưởng của tectorigienin đến mức độ tăng cân của chuột (%) Thời điểm nghiên cứu Lô chứng (n = 10) Lô thử 1 (n = 10) Lô thử 2 (n = 10) p N0 24,00 ± 0,53 25,98 ± 0,63 ptr/s < 0,01 25,94±0,29 ptr/s 0,05 N14 26,40 ± 0,52 28,75 ± 0,64 ptr/s < 0,01 28,38±0,51 ptr/s < 0,01 >0,05 N28 27,96 ± 0,79 33,76 ± 0,97 ptr/s < 0,01 31,24±0,68 ptr/s 0,05 p: so với lô chứng ptr/s: so với thời điểm N0 Ghi chú: N0: lúc bắt đầu dùng thuốc; N14: thời gian dùng thuốc sau 14 ngày; N28: thời gian dùng thuốc sau 28 ngày 20 Tác dụng chống viêm cấp của tectorigienin được đánh giá qua tác dụng ức chế khả năng gây phù bàn chân chuột cống bằng carragenin, với liều thử nghiệm là 60 mg tectorigienin/kg cân nặng chuột cống (mức liều này tương đương với 100 mg tectorigienin/kgP chuột nhắt). Kết quả được trình bày tại bảng 4.18 và 4.19. Bảng 4.18 Tác dụng chống viêm cấp của tectorigienin Lô thí nghiệm Tỉ lệ phù chân chuột tại các thời điểm nghiên cứu ∆V1% ∆V3% ∆V4% ∆V5% ∆V7% ∆V24% Lô 1 (Chứng trắng) NaCMC 1% 12,24±1,67 40,27±2,72 46,62 ± 2,7146,9 ± 1,94 62,4±2,20 20,1± 1,66 Lô 2 (Chứng+) Indomethacin liều 10mg/kgP 4,69 ± 0,80 12,7± 1,19 22,9 ± 1,13 25,3±1,17 34,7±1,91 11,3±1,35 p2/1 > 0,05 p2/1 0,05 Lô 3 tectorigienin liều 60mg/kgP 1,6 ± 0,85 18,6 ± 2,66 23,5 ± 2,84 19,7±2,62 20,4±2,77 7,6±2,05 p3/1 > 0,05 p3/2 > 0,05 p3/1 > 0,05 p3/2 > 0,05 p3/1 > 0,05 p3/2 > 0,05 p3/1 < 0,05 p3/2 > 0,05 p3/1 < 0,05 p3/2 > 0,05 p3/1 > 0,05 p3/2 > 0,05 Ghi chú: px/y: so sánh lô x và lô y. Như vậy, với liều 60 mg/kg cân nặng chuột cống, tectorigenin thể hiện tác dụng chống viêm rõ nhất là sau 5-7 giờ gây viêm. Bảng 4.19 Tỷ lệ % ức chế phù chân chuột của tectorigienin so với lô chứng trắng Lô 1 giờ 2 giờ 4 giờ 5 giờ 7 giờ 24 giờ Lô chứng dương uống indomethacin liều 10mg/kg 61,69 68,39 50,86 46,31 44,32 43,89 Lô thử tectorigienin liều 60mg/kg 86,93 53,77 49,58 58,04 67,32 62,27 Từ bảng 4.19 cho thấy tỷ lệ ức chế phù chân chuột của tectorigienin liều 60mg/kg cân nặng khá cao và tương đương với tỷ lệ ức chế phù chân chuột của indomethacin liều 10 mg/kg cân nặng. Tỷ lệ ức chế cao nhất ở thời điểm 1 giờ sau gây viêm là 86,93%. Thậm chí, tỷ lệ ức chế phù chân chuột của tectorigienin liều 60 mg/kg cân nặng hầu như cao hơn tỷ lệ ức chế phù chân chuột của indomethacin ở các thời điểm 1 giờ, 4 giờ và 5 giờ sau khi gây viêm. * Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của tectorigienin Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của tectorigienin trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng amian được thể hiện trong bảng 4.20. Bảng 4.20 Tác dụng chống viêm mạn của tectorigienin trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng viên amian Lô MTB ướt (mg) % ức chế khi cân ướt MTB khô (mg) % ức chế khi cân khô Lô chứng trắng uống NaCMC 1% 487,33±65,87 - 100,06±12,92 - Lô chứng dương uống prednisolon liều 5mg/kg 280,05±24,43 p2/1<0,05 42,53 55,48±5,20 p2/1 <0,01 44,55 5 đường chuẩn D-glucose và L-glucose có thời gian lưu tương ứng là 14,11 và 14,26 phút. Do đó, có thể xác định được gốc đường của EB-1 là D-glucose. Hợp chất EB-1a Chất bột màu vàng nhạt; 25][ Dα –38,3 (MeOH, c = 0,3); HR-ESI-MS m/z 257,0810 [M-H]‒ (C15H13O4, 257,0819). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 4,88 (1H, H-2); 2,72 (1H, dd, J=3,7; 16,8, Hb- 3); 2,80 (1H, dd, J=12,0; 16,8, Ha-3); 6,90 (1H, s, H-6); 6,48 (1H, d, J=2,2, H-7); 6,35 (1H, d, J=2,2, H-9); 1,60 (1H, d, J=6,1, 2-Me); 2,59 (1H, s, 5-Me). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 163,8 (C-1); 77,9 (C-2); 46,0 (C-3); 194,0 (C-4); 113,7 (C-4a); 137,3 (C-5); 123,3 (C-6); 141,7 (C-6a); 102,6 (C-7); 162,0 (C-8); 102,9 (C-9); 158,9 (C-10); 108,3 (C-10a); 20,8 (2-Me); 23,4 (5-Me). Hợp chất EB-2 (2) Chất bột màu trắng, mp.>310oC, C15H12O4, ESI-MS m/z 257 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 6,18 (1H, s, H-3); 7,19 (1H, s, H-6); 6,56 (1H, s, H-7); 6,58 (1H, s, H-9); 2,37 (1H, s, 2-Me); 2,71 (1H, s, 5-Me); 10,05 (1H, s, 8-OH); 10,15 (1H, s, 10-OH). 13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 156,8 (C-1a), 163,5 (C-2); 112,1 (C-3); 178,6 (C-4); 116,3 (C-4a); 134,4 (C-5); 124,8 (C-6); 138,7 (C-6a); 102,9 (C-7); 156,9 (C-8); 101,2 (C-9); 159,3 (C-10); 107,2 (C-10a); 19,4 (2-Me); 23,0 (5-Me). Hợp chất EB-3 (3) Chất bột màu trắng, mp. 175-1760C, C21H22O9, ESI-MS m/z 417 [M-H]¯ . 1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 6,18 (1H, s, H-3); 7,27 (1H, s, H-6); 6,89 (1H, d, J=2,1 Hz, H-7); 6,66 (1H, d, J=2,1 Hz, H-9); 2,35 (1H, s, 2-Me); 2,70 (1H, s, 5-Me); 4,98 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,24 (1H, t, J=7,6 Hz, H-2′); 3,36 (1H, m, H-3′); 3,19 (1H, t, J=8,3 Hz, H-4′); 3,28 (1H, m, H-5′); 3,69 (1H, dd, J=1,2; 11,4 Hz, Ha-6′); 3,49 (1H, dd, J=5,5; 11,4 Hz, Hb-6′). 13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 156,3 (C-1a), 163,7 (C-2); 112,1 (C-3); 178,5 (C-4); 117,1 (C-4a); 134,7 (C-5); 125,5 (C-6); 138,1 (C-6a); 101,5 (C-7); 158,5 (C-8); 103,1 (C-9); 156,5 (C-10); 108,7 (C-10a); 19,5 (2-Me); 23,0 (5-Me); 100,0 (C-1′); 73,2 (C-2′); 77,1 (C-3′); 69,6 (C-4′); 76,7 (C-5′); 60,6 (C-6′). Hợp chất EB-4 (4) Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp. 175-176oC, C16H16O5, ESI-MS m/z 289 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,49 (1H, q, J=7,0 Hz, H-1); 4,69 (1H, q, J=7,0 Hz, H-3); 8,04 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,38 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 7,01 (1H, t, J=8,0 Hz, H-8); 1,64 (3H, d, J=7,0 Hz, 1-Me); 1,53 (3H, d, J=7,0 Hz, 3-Me); 4,07 (3H, s, 9-OMe); 12,82 (1H, s, 5-OH). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 67,4 (C-1); 69,5 (C-3); 202,9 (C-4); 153,4 (C- 5); 118,1 (C-6); 125,4 (C-7); 109,1 (C-8); 155,7 (C-9); 139,4 (C-10); 121,0 (C-11); 107,8 (C-12); 126,0 (C-13); 119,6 (C-14); 17,4 (CH3-1); 16,3 (CH3-3); 56,4 (OCH3-9). Hợp chất EB-5 (5) Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp. 175-1770C, C16H16O4, ESI-MS m/z 273 [M+H]+. 6 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 1,36 (3H, d, J=6,5 Hz, 3-CH3); 1,54 (3H, d, J=6,5 Hz, 1-CH3); 2,20 (1H, dd, J=10,1; 18,1 Hz, 4-Hß); 2,75 (1H, dd, J=2,1; 18,1 Hz, 4- Hα); 3,60 (1H, m, H-3); 3,96 (3H, s, 9-OCH3); 4,85 (1H, q, J=6,5 Hz, H-1); 7,27 (1H, d, J=7,5 Hz, H-8); 7,64 (1H, dd, J=8,0; 8,5 Hz, H-7), 7,73 (1H, d, J=8,5 Hz, H-6). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 70,2 (C-1); 68,7 (C-3); 29,8 (C-4); 183,9 (C- 5); 117,7 (C-6); 134,5 (C-7); 118,9 (C-8); 159,3 (C-9); 183,7 (C-10); 148,6 (C-11); 139,9 (C-12); 133,9 (C-13); 120,2 (C-14); 20,7 (1-CH3); 21,2 (3-CH3); 56,4 (9-OCH3). Hợp chất EB-6 (6) Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp 174-175oC, C16H16O4, ESI-MS m/z 273 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 1,35 (3H, d, J=6,0 Hz, 3-CH3); 1,53 (3H, d, J=7,0 Hz, 1-CH3); 2,24 (1H, dd, J=10,1; 16,0 Hz, 4-Hß); 2,71 (1H, dd, J=3,5 Hz, 18,5 Hz, 4-Hα); 3,98 (1H, m, H-3); 4,01 (3H, s, 9-OCH3); 5,02 (1H, q, J=6,5 Hz, H-1); 7,28 (1H, d, J=7,5 Hz, H-8); 7,65 (1H, t, J=7,5 Hz, H-7); 7,74 (1H, d, J=7,5 Hz, H-6). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 67,4 (C-1); 62,4 (C-3); 29,5 (C-4); 182,7 (C- 5); 117,7 (C-6); 134,7 (C-7); 119,0 (C-8); 159,7 (C-9); 184,2 (C-10); 148,0 (C-11); 139,4 (C-12); 134,0 (C-13); 119,6 (C-14); 19,7 (1-CH3); 21,5 (2-CH3); 56,4 (9-OCH3). Hợp chất EB-7 (7) Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O14, ESI-MS m/z 599 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 5,02 (1H, q, J=6,2 Hz, H-1); 3,42 (1H, H-3); 2,68 (1H, dd, J=11,7; 16,5 Hz, Hb-4); 3,00 (1H, Ha-4); 8,07 (1H, d, J=8,9 Hz, H-6); 7,28 (1H, dd, J=7,6; 8,9 Hz, H-7); 6,86 (1H, d, J=7,6 Hz, H-8); 1,49 (1H, d, J=6,2 Hz, 1-Me); 1,23 (1H, d, J=6,2 Hz, 3-Me); 3,99 (1H, s, 9-OMe); 9,60 (1H, s, 10-OH); 4,51 (1H, d, J=8,3 Hz, H-1′); 3,37 (1H, H-2′); 3,15 (1H, H-3′); 3,24 (1H, H-4′); 3,21 (1H, H-5′); 3,55 (1H, dd, J=5,5; 11,0 Hz, Hb-6′); 3,91 (1H, dd, J=1,4; 11,0 Hz, Ha-6′); 4,12 (1H, d, J=8,3 Hz, H-1ʺ); 2,92 (1H, H-2ʺ); 3,10 (1H, H-3ʺ); 3,03 (2H, H-4ʺ, H-5ʺ); 3,39 (1H, Hb-6ʺ); 3,61 (1H, br d, J=11,6 Hz, Ha-6ʺ). 13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 70,0 (C-1); 69,0 (C-3); 33,1 (C-4); 140,5 (C- 5); 115,5 (C-6); 125,7 (C-7); 104,2 (C-8); 155,9 (C-9); 146,3 (C-10); 120,5 (C-11); 129,6 (C-12); 128,3 (C-13); 113,1 (C-14); 21,8 (1-Me); 21,7 (3-Me); 56,4 (9-OMe); 105,3 (C- 1′); 74,1 (C-2′); 75,1 (C-3′); 69,9 (C-4′); 76,6 (C-5′); 68,6 (C-6′); 103,1 (C-1ʺ); 73,7 (C- 2ʺ); 76,7 (C-3ʺ); 70,0 (C-4ʺ); 76,9 (C-5ʺ); 61,1 (C-6ʺ). Hợp chất EB-8 (8) Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O14, ESI-MS m/z 599 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 5,21 (1H, q, J=6,8 Hz, H-1); 4,11 (1H, m, H- 3); 2,46 (1H, dd, J=11,0; 17,2 Hz, Hb-4); 3,50 (1H, Ha-4); 7,90 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,31 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 6,85 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8); 1,56 (1H, d, J=6,8 Hz, 1-Me); 1,32 (1H, d, J=6,2 Hz, 3-Me); 4,03 (1H, s, 9-OMe); 4,79 (1H, H-1′); 3,51 (1H, H-2′); 3.16 (1H, H-3′); 3,57 (1H, H-4′); 3,52 (1H, H-5′); 3,94 (1H, dd, J=4,8; 11,7 Hz, Hb-6′); 3,95 (1H, Ha-6′); 3,95 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 3,30 (1H, H-2ʺ); 3,22 (1H, H-3ʺ); 3,30 (1H, H-4ʺ); 3,30 (1H, m, H-5ʺ); 3,55 (1H, dd, J=6,2; 12,4 Hz, H-6aʺ); 3,53 (1H, dd, J=2,8; 12,4 Hz, H-6bʺ) . 13C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 69,8 (C-1); 64,4 (C-3); 62,4 (C-4); 141,8 (C- 5); 117,0 (C-6); 126,7 (C-7); 105,2 (C-8); 157,2 (C-9); 147,0 (C-10); 121,0 (C-11); 127,3 19 Bảng 4.16 Ảnh hưởng của tectorigienin lên số cơn đau quặn Thời gian Mẫu thử Số cơn đau quặn 0–5 phút 5-10 phút 10-15 phút 15–20 phút 20–25 phút 25–30 phút Lô 1 (Chứng trắng) dung dịch NaCl 0,9%) 10 ± 0,61 18 ± 0,47 18,1±0,39 13,77±0,35 14± 0,28 11,3± 0.32 Lô 2 (Chứng +) aspirin liều 240 mg/kgP 5,25± 0,54 11 ± 0,43 9,75±0,45 7,5 ± 0,22 7,25 ± 0,26 6,87 ± 0,24 p2/1> 0,05 p2/1< 0,05 p2/1< 0,05 p2/1< 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1< 0,05 Lô 3 tectorigienin liều 50 mg/kgP 8,2 ± 0,27 15,4 ± 0,29 11,7±0,33 10,3 ± 0,28 7,9 ± 0,36 6,3 ± 0,26 p3/1 > 0,05 p3/4 > 0,05 p3/1 > 0,05 p3/4 < 0,05 p3/1< 0,05 p3/4 <0,05 p3/1 < 0,05 p3/4 > 0,05 p3/1 < 0,05 p3/4 > 0,05 p3/1 < 0,05 p3/4 > 0,05 Lô 4 tectorigienin liều 100 mg/kgP 5,57 ± 0,49 11,1 ± 0,33 7,14±0,54 8,4 ± 0,33 7,14 ± 0,40 6,0 ± 0,28 p4/1>0,05 p4/2>0,05 p4/1<0,05 p4/2>0,05 p4/1<0,05 p4/2>0,05 p4/1<0,05 p4/2>0,05 p4/1<0,05 p4/2>0,05 p4/1 < 0,05 p4/2 > 0,05 Lô 5 tectorigienin liều 200 mg/kgP 7,77 ± 0,32 13,0 ± 0,27 12,1±0,20 10,2±0,25 7,5 ± 0,35 5,5 ± 0,17 p5/1 >0,05 p5/4 >0,05 p5/1 < 0,05 p5/4 > 0,05 p5/1 < 0,05 p5/4 < 0,05 p5/1 < 0,05 p5/4 > 0,05 p5/1 < 0,05 p5/4 > 0,05 p5/1 < 0,05 p5/4 > 0,05 Ghi chú: px/y: mức độ tin cậy của lô x so với lô y Tectorigenin thể hiện tác dụng giảm số cơn đau quặn rõ rệt ở cả 3 liều đã thử. Với liều 50 mg/kg cân nặng, tectorigenin bắt đầu thể hiện tác dụng từ giai đoạn thứ 3 của quá trình nghiên cứu (10-15 phút sau khi gây đau bằng acid acetic). Khi dùng liều 100 mg/kg và liều 200 mg/kg cân nặng, tectorigenin có tác dụng giảm đau sau 5 phút sau khi tiêm acid acetic và tác dụng này vẫn còn thể hiện rõ tại thời điểm 30 phút sau khi gây đau. Bảng 4.17 Ảnh hưởng của tectorigienin đến tỷ lệ giảm đau của các lô uống thuốc so với lô không uống thuốc qua các giai đoạn Lô Liều dùng (mg/kg) Tỷ lệ giảm đau (%) ở các giai đoạn 0-5 phút 5-10 phút 10-15 phút 15-20 phút 20-25 phút 25-30 phút Lô chứng dương uống aspirin 240 47,50 40,00 46,17 45,56 48,21 39,34 Lô thử uống tectorigienin 50 18,00 16,00 35,40 25,24 43,57 44,41 100 44,29 39,22 60,56 38,82 48,98 47,06 200 22,22 29,09 33,13 25,81 46,03 47,06 Tectorigenin có tác dụng giảm đau với tỷ lệ % ức chế số cơn đau khá cao, cao nhất là tectorigenin liều 100mg/kg cân nặng ở giai đoạn thứ 3 (10-15 phút), tỷ lệ giảm đau lên đến 60,56%. Với liều 100mg/kg cân nặng, tectorigenin có khả năng giảm số cơn đau tốt hơn so với liều 50 mg/kg cân nặng và liều 200 mg/kg cân nặng. Ở tất cả các giai đoạn và với liều này, tectorigenin có tác dụng ức chế tương đương với aspirin liều 240mg/kg cân nặng. * Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của tectorigienin 18 Tectorigenin 4’-O-β-D- glucopyranoside (BS-10) Kaempferol-3-O-β-D- glucopyranoside (BS-11) Lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can Isoquercetin (BS-12) Lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can 24E-stigmasta-5,22- dien-3β-ol (BS-13) Axit myristic (BS-14) Lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can 4.2.2 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm Hợp chất tectorigenin đã được phân lập từ thân rễ xạ can với hàm lượng tương đối lớn và là thành phần chính trong cây xạ can. Nhằm định hướng tạo cơ sở để phát triển, khai thác và sử dụng hợp chất này có hiệu quả, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sâu hơn về tác dụng dược lý (hoạt tính kháng viêm, giảm đau) và độ an toàn của tectorigenin trên động vật thực nghiệm. 4.2.2.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm các cặn chiết thân rễ xạ can Với hoạt tính kháng viêm theo đường bôi, cả 4 cặn chiết: methanol, hexan, etyl axetat và cặn nước của mẫu nghiên cứu đều không có khả năng ức chế khối viêm cục bộ theo đường bôi so với đối chứng Dexamethasone. Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm theo đường uống cho thấy có 2 mẫu ức chế được trên 50,0 % thể tích khối viêm so với đối chứng âm (không sử dụng hoạt chất), đó là cặn chiết etyl axetat (BS-Et) và cặn chiết nước (BS-W) với % ức chế khối viêm tương ứng là 70,0% và 64,26%. Chất đối chứng dương Indomethacine có hoạt tính ổn định và ức chế được 64,59% khối viêm. 4.2.2.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học và độ an toàn của tectorigenin phân lập được từ thân rễ xạ can a. Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm, giảm đau của tectorigenin * Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của tectorigienin Tác dụng giảm đau của tectorigenin được tiến hành trên chuột nhắt theo phương pháp gây đau bằng acid acetic. Kết quả được trình bày tại bảng 4.16 và 4.17. 7 (C-12); 130,3 (C-13); 114,4 (C-14); 19,5 (1-Me); 22,2 (3-Me); 56,9 (9-OMe); 105,2 (C- 1′); 75,5 (C-2′); 74,7 (C-3′); 71,2 (C-4′); 77,3 (C-5′); 70,8 (C-6′); 103,8 (C-1ʺ); 74,7 (C- 2ʺ); 77,3 (C-3ʺ); 71,2 (C-4ʺ); 77,3 (C-5ʺ); 62,4 (C-6ʺ). Hợp chất EB-9 (9) Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O15, ESI-MS m/z 615 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 5,1 (1H, q, J=6,8 Hz, H-1); 4,2 (1H, m, H-3); 4,10 (1H, dd, J=11,0; 17,2 Hz, H-4); 8,24 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,37 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 6,98 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8); 1,63 (1H, d, J=6,8 Hz, 1-Me); 1,06 (1H, d, J=6,2 Hz, 3-Me); 4,07 (1H, s, 9-OMe); 4,07 (1H, H-1′); 3,22 (1H, H-2′); 3,30 (1H, H-3′); 3,25 (1H, H-4′); 3,29 (1H, H-5′); 3,30 (1H, dd, J=4,8; 11,7 Hz, Hb-6′); 3,41 (1H, Ha-6′); 3,62 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 3,11 (1H, H-2ʺ); 3,16 (1H, H-3ʺ); 3,22 (1H, H-4ʺ); 3,29 (1H, m, H- 5ʺ); 3,30 (1H, dd, J=6,2, 12,4 Hz, H-6aʺ); 3,33 (1H, dd, J=2,8; 12,4 Hz, H-6bʺ) . 13C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 69,9 (C-1); 67,0 (C-3); 62,6 (C-4); 144,0 (C- 5); 117,7 (C-6); 127,0 (C-7); 106,2 (C-8); 157,6 (C-9); 148,0 (C-10); 120,8 (C-11); 128,0 (C-12); 130,4 (C-13); 116,2 (C-14); 17,8 (1-Me); 21,0 (3-Me); 56,9 (9-OMe); 106,2 (C- 1′); 77,3 (C-2′); 75,0 (C-3′); 71,2 (C-4′); 77,8 (C-5′); 71,8 (C-6′); 104,2 (C-1ʺ); 75,4 (C- 2ʺ); 77,6 (C-3ʺ); 71,6 (C-4ʺ); 77,7 (C-5ʺ); 62,6 (C-6ʺ). Hợp chất EB-10 (10) Bột vô định hình màu trắng, C13H14O4, ESI-MS m/z 233 [M-H]¯ . 1H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 2,52 (1H, dd, J=8,2; 16,5 Hz; Haq-2); 2,82 (1H, dd, J=3,4; 16,5 Hz, Heq-2); 4,22 (1H, m, H-3); 2,89 (1H, dd, J=7,5; 15,8 Hz, Haq- 4); 3,14 (1H, dd, J=3,4; 15,8 Hz, Heq-4); 6,60 (1H, s, H-5); 2,40 (3H, s, 8-CH3); 2,42 (3H, s, 7-CH3). 13C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 199,3 (C-1); 50,0 (C-2); 66,8 (C-3); 40,4 (C- 4); 114,7 (C-5); 158,8 (C-6); 132,2 (C-7); 140,4 (C-8); 124,9 (C-8a); 147,1 (C-4a); 19,2 (8-CH3); 208,4 (C=O); 32,6 (7-CH3). Hợp chất EB-11 (11) Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C20H22O9, ESI-MS m/z 407 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 6,05 (1H, q, J=6,6 Hz, H-1); 8,16 (1H, s, H- 4); 7,60 (1H, d, J=8,3 Hz, H-5); 7,47 (1H, t, J=8,3 Hz, H-6); 7,11 (1H, d, J=8,3 Hz, H-7); 1,70 (1H, d, J=6,6, 1-Me); 3,99 (1H, s, 8-Ome); 4,99 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,60 (2H, H-2′, Ha-6′); 3,10 (1H, m, H-3′); 3,39 (1H, t, J=9,3 Hz, H-4′); 3,47 (1H, t, J=9,3 Hz, H- 5′); 3,68 (1H, dd, J=2,1; 11,7 Hz, Hb-6′). 13C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 80,9 (C-1); 172,3 (C-3); 124,0 (C-4); 123,7 (C-5); 128,4 (C-6); 109,8 (C-7); 157,4 (C-8); 147,9 (C-9); 140,7 (C-10); 125,9 (C-11); 139,3 (C-12); 124,0 (C-13); 19,4 (1-Me); 56,1 (8-OMe); 106,2 (C-1′); 76,0 (C-2′); 77,8 (C-3′); 71,6 (C-4′); 78,3 (C-5′); 62,4 (C-6′). Hợp chất EB-12 (12) Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C26H32O14, ESI-MS m/z 569 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 6,12 (1H, q, J=6,9, H-1); 8,15 (1H, s, H-4); 7,60 (1H, d, J=7,6 Hz, H-5); 7,46 (1H, t, J=7,6 Hz, H-6); 7,10 (1H, d, J=7,6 Hz, H-7); 1,68 (1H, d, J=6,9 Hz, 1-Me); 3,98 (1H, s, 8-OMe); 4,98 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,60 (1H, dd, J=7,6; 8,9 Hz, H-2′); 3,47 (1H, t, J=8,9 Hz, H-3′); 3,56 (1H, H-4′); 2,32 (1H, H- 5′); 3,67 (1H, dd, J=4,9; 11,0 Hz, Hb-6′); 4,00 (1H, dd, J=2,0; 11,0 Hz, Ha-6′); 4,16 (1H, 8 d, J=8,3 Hz, H-1ʺ); 3,12 (1H, dd, J=7,6; 8,3 Hz, H-2ʺ); 3,25 (1H, H-3ʺ); 3,21 (1H, t, J=8,2 Hz, H-4ʺ); 3,17 (1H, H-5ʺ); 3,55 (1H, dd, J=4,1; 11,7 Hz, Hb-6ʺ); 3,81 (1H, dd, J=2,1; 11,7 Hz, Ha-6ʺ). 13C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 81,1 (C-1); 172,3 (C-3); 124,2 (C-4); 109,8 (C-5); 128,4 (C-6); 123,7 (C-7); 157,5 (C-8); 147,8 (C-9); 140,8 (C-10); 126,0 (C-11); 139,3 (C-12); 124,1 (C-13); 19,2 (1-Me); 56,1 (8-OMe); 106,0 (C-1′); 76,2 (C-2′); 77,4 (C-3′); 71,1 (C-4′); 78,0 (C-5′); 69,0 (C-6′); 104,3 (C-1ʺ); 75,1 (C-2ʺ); 76,6 (C-3ʺ); 71,7 (C-4ʺ); 78,0 (C-5ʺ); 62,9 (C-6ʺ). Hợp chất EB-13 (13) Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C26H34O14, ESI-MS m/z 571 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 5,33 (1H, q, J=6,2 Hz, H-1); 5,03 (1H, d, J=13,1 Hz, Hb-3); 5,40 (1H, q, J=13,1 Hz, Ha-3); 8,03 (1H, d, J=8,2 Hz, H-5); 7,31 (1H, t, J=8,2 Hz, H-6); 6,91 (1H, d, J=8,2 Hz, H-7); 1,45 (1H, d, J=6,2 Hz, 1-Me); 3,99 (1H, s, 8-OMe); 4,53 (1H, d, J=8,3 Hz, H-1′); 3,30 (2H, H-2′, H-5′); 3,08 (1H, m, H-3′); 3,20 (1H, H-4′); 3,56 (1H, dd, J=6,2, 11,0 Hz, Hb-6′); 3,95 (1H, d, J=11,0 Hz, Ha-6′); 4,11 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 2,94 (1H, m, H-2ʺ); 3,01 (2H, H-3ʺ, H-4ʺ); 3,20 (1H, H-5ʺ); 3,38 (1H, dd, J=4,8; 11,0 Hz, Hb-6ʺ); 3,62 (1H, dd, J=5,5; 11,0 Hz, Ha-6ʺ). 13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 78,3 (C-1); 70.6 (C-3); 137,6 (C-4); 115,7 (C-5); 125,8 (C-6); 104,6 (C-7); 156,2 (C-8); 143,8 (C-9); 124,8 (C-10); 130,9 (C-11); 130,4 (C-12); 114,9 (C-13); 20,1 (1-Me); 56,2 (8-OMe); 104,6 (C-1′); 73,8 (C-2′); 76,6 (C-3′); 69,9 (C-4′); 75,2 (C-5′); 68,7 (C-6′); 103,2 (C-1ʺ); 73,5 (C-2ʺ); 76,8 (C-3ʺ); 69,9 (C-4ʺ); 76,3 (C-5ʺ); 61,0 (C-6ʺ). Hợp chất EB-14 (14) Chất bột màu trắng, mp.>310oC, C15H10O5, ESI-MS m/z 271 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 2,61 (3H, s, 8-CH3); 6,40 (1H, d, J=2,7 Hz, H-2); 6,94 (1H, d, J=2,7 Hz, H-4); 6,80 (1H, d, J=2,7 Hz, H-7); 7,31 (1H, d, J=2,7 Hz, H-5); 13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 166,2 (C-1); 109,3 (C-2); 165,3 (C-3); 108,2 (C-4); 113,3 (C-5); 163,0 (C-6); 125,6 (C-7); 146,6 (C-8); 189,5 (C-9); 184,1 (C-10); 111,6 (C-9a); 135,8 (C-4a); 138,3 (C-10a); 124,3 (C-8a); 24,2 (8-CH3). 17 penta-substituted và một nhóm methoxyl tại δ 3,87 (3H, s, OCH3-6). Tín hiệu doublet doublet tại δ 6,84 (2H, dd, J = 8,5; 1,5 Hz, H-3′, 5′) và 7,35 (2H, dd, J = 8,5; 1,5 Hz, H- 2′, 6′) dự đoán nhóm thế của vòng thơm là para-substitued, Phổ 13C-NMR của BS-2 chỉ ra tín hiệu của 16 nguyên tử cacbon, gồm một nhóm methoxyl và 15 cac bon của khung isoflavone, các tín hiệu này đã được xác nhận thêm qua phổ DEPT 90, DEPT 135 và HSQC. Thêm vào đó, trên phổ ESI MS pic ion phân tử [M-H]+ của BS-2 xuất hiện tại m/z 299 hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử C16H12O6. Khi so sánh với tài liệu tham khảo, tất cả dữ liệu phổ của chất BS-2 đồng nhất với các dữ liệu phổ của 4′,5,7-trihydroxy-6-methoxyisoflavone hay tectorigenin vì vậy chất BS-2 được xác định là tectorigenin. Hình 4.18d Cấu trúc của hợp chất BS-2 (Tectorigenin) Bảng 4.13 Bảng tổng hợp các hợp chất BS-1→BS-14 phân lập được từ thân rễ cây xạ can Irisflorentin (BS-1) Tectorigenin (BS-2) Iristectorigenin A (BS-3) Irigenin (BS-4) Acetovanillone (BS-5) Lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can Rhamnocitrin (BS6-) Irilin D (BS-7) Daucosterol (BS-8) Tectoridin (BS-9) 16 Kết quả cho thấy hợp chất mới EB-1 và 3 hợp chất đã biết khác là EB-4, EB-5, và EB-6 thể hiện hoạt tính ức chế sự sản sinh IL-12p40 ở nồng độ 25 µM. Do vậy các hợp chất này được tiếp tục lựa chọn để làm các thử nghiệm tiếp theo ở nồng độ 6,3 đến 50,0 µM. SB203580 được sử dụng làm đối chứng dương, chất này ức chế sự sản sinh của IL- 12 p40, IL-6 và TNF-α với giá trị IC50 tương ứng là 5,2±0,1, 3,5±0,1 và 7,5±0,2 µM (Bảng 4.12). Bảng 4.12 Hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành trên tế bào tua sinh ra từ tủy xương được kích thích bởi LPS IC50 IL-12 p40 (µg/mL) IL-6 (µg/mL) TNF-α (µg/mL) Cặn chiết methanol 0,1 ± 0,05 16,2 ± 0,3 >50 SB203580a) 2,5 ± 0,1 1,7 ± 0,2 3,6 ± 0,2 Hợp chất IL-12 p40 (µM) IL-6 (µM) TNF-α (µM) EB-1 1,0 ± 0,1 5,0 ± 0,2 >50 EB-4 5,0 ± 0,4 8,7 ± 0,3 61,2 ± 1,5 EB-5 0,1 ± 0,08 1,7 ± 0,1 39,6 ± 2,0 EB-6 0,2 ± 0,1 2,6 ± 0,4 >50 SB203580a) 5,2 ± 0,1 3,5 ± 0,2 7,5 ± 0,2 a)đối chứng dương Kết quả cho thấy các hợp chất EB-1, EB-4, EB-5, EB-6 và cặn chiết EB-Me ức chế sự sản sinh IL-12 p40 được kích thích bởi LPS với giá trị IC50 từ 0,1±0,08 µM đến 5,0±0,4 µM. Các hợp chất EB-1, EB-5 và EB-6 cũng ức chế sự sản sinh IL-6 với giá trị IC50 từ 1,7±0,1 µM đến 5,0±0,2 µM. Tuy nhiên, chỉ có hai hợp chất EB-4 và EB-5 có hoạt tính ức chế ở mức độ trung bình sự sản sinh TNF-α với giá trị IC50 tương ứng là 61,2±1,5 µM và 39,6± 2,0 µM. Các hợp chất (–)-hongconin (EB-4), eleutherin (EB-5) và isoeleutherin (EB-6) được phân lập từ cây Eleutherine americana cũng ức chế sự sản sinh nitric oxide ở dòng tế bào đại thực bào ở chuột RAW 264,7 được hoạt hóa bởi LPS. Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của cây E. bulbosa được công bố. Như vậy, hợp chất mới EB-1 và 3 hợp chất đã biết EB-4, EB-5 và EB-6 phân lập từ củ sâm đại hành đã thể hiện hoạt tính ức chế sự sản sinh của TNF-α, IL-6 và IL-12 p40 trong tế bào DCs được kích thích bởi LPS. Kết quả nghiên cứu này cho thấy các hợp chất trên có thể được sử dụng như là chất kháng viêm tiềm năng trong tương lai. 4.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ LOÀI XẠ CAN 4.2.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ thân rễ cây xạ can Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc 14 hợp chất phân lập được từ thân rễ xạ can, trong đó có 4 hợp chất BS-5, BS-11, BS-12 và BS-14 lần đầu được phân lập từ cây xạ can và 2 hợp chất có hàm lượng lớn là tectoridin và tectorigienin. Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc hợp chất tectorigienin (BS-2): Chất BS-2 phân lập được dạng tinh thể màu vàng nhạt, điểm chảy 235-236°C. Sự có mặt của khung isoflavon trong phân tử chất BS-2 được dự đoán qua phổ hấp thụ tử ngoại UV tại λmax 259, 320nm. Phổ 1H-NMR của BS-2 chỉ ra sự có mặt một singlet tại δ 7,99 (1H, s) là của proton H-2, các tín hiệu singlet khác tại δ 6,41 (1H, s) dự đoán vòng A là 9 Quy trình phân lập các hợp chất từ thân rễ xạ can Hình 3.4 Sơ đồ phần lập các hợp chất từ cặn chiết etyl axetat cây xạ can Hình 3.5 Sơ đồ phần lập các hợp chất từ cặn nước cây xạ can Hằng số vật lý và dữ liệu phổ các hợp chất phân lập được từ cây xạ can Hợp chất BS-1 (15) Bột màu vàng nhạt, mp. 168-169oC, C20H18O8, ESI-MS m/z 385 [M-H]¯ . Cặn BS/W (4,7gam) SK cột, CH2Cl2 : MeOH (4:1) E1 E2 E3 E4 E5 SK cột CHCl3: MeOH : H2O (80:18:2) BS- 11 (12 mg) BS-12 (11 mg) SK cột RP 18 E4.2 E4.3 E4.1 BS-10 (7 mg) SKLMĐC RP 18 MeOH: H2O (5:5) BS-8 (12 mg) BS-7 (5 mg) F6 F7 SKC, RP18 MeOH:H2O (4:6) BS-6 (10 mg) BS-9 (42 mg) 1.SKC, RP18, MeOH:H2O (1:1) 2.SKLMĐC, RP18, MeOH:H2O (6:4) F7.1 F7.2 F7.3 Cặn BS-EtOAc SKC, SiO2, gradient CHCl3:MeOH (99:1 -50:50) F2 F3 F5 F6 F7 F3.1 F3.2 F3.3 F5.1 F5.2 F5.3 SKC, SiO2 CHCl3:MeOH SKC MeOH:CHCl3 (15:1) SKC, SiO2 CHCl3:MeOH (20:1) SKC, SiO2 CHCl3:MeOH (15:1) Kết tinh lại MeOH BS-13 (5 mg) BS-14 (15 mg) SKC, SiO2, HX:EtOAC 10:1 F1 BS-2 (480 mg) F4 BS-1 (8 mg) BS-5 (9 mg) BS-4 (8 mg) F5.2.1 SKLMĐC RP18 MeOH:H2O (7:3) BS-3 (20 mg) 10 1H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 7,77 (1H, s, H-2); 6,56 (1H, s, H-8); 6,67 (2H, s, H-2′, H-6′); 5,99 (2H, s, -O-CH2-O-); 4,00 (3H, s, OCH3-5); 3,81 (6H, s, OCH3-3′, 5′), và 3,77 (3H, s, OCH3-4′). 13C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 56,0 (OCH3-3′, 5′); 60,6 (OCH3-4′); 60,9 (OCH3-5); 92,9 (C-8); 102,1 (-O-CH2-O-); 106,6 (C-2′, 6′); 113,4 (C-10); 125,4 (C-3); 127,3 (C-1′); 135,2 (C-6); 137,9 (C-4′); 141,5 (C-5); 150,8 (C-2); 152,8 (C-3′, 5′); 152,9 (C-7); 154,5 (C-9); và 175,3 (C-4). Hợp chất BS-2 (16) Tinh thể màu vàng, mp. 235-236oC, C16H12O6, ESI-MS m/z 299 [M-H]¯ 1H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,87 (3H, s, OCH3-6); 6,41 (1H, s, H-8); 6,84 (2H, dd, J=8,5; 1,5Hz, H-3′, 5′); 7,35 (2H, dd, J=8,5; 1,5Hz, H-2′, 6′); và 7,99 (1H, s, H- 2). 13C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 60,9 (OCH3-6); 94,9 (C-8); 106,6 (C-10); 116,2 (C-2′,6′); 123,1 (C-3); 124,1 (C-1′); 131,3 (C-3′, 5′); 132,7 (C-6); 154,4 (C-5); 154,7 (C-7); 154,8 (C-2); 158,5 (C-9); 158,6 (C-4′); và 182,4 (C-4). Hợp chất BS-3 (17) Tinh thể màu vàng nhạt, mp. 237-238°C, C17H14O7, ESI-MS m/z 329 [M-H]¯ . 1H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3-6); 3,90 (3H, s, OCH3-3′); 6,46 (1H, s, H-8); 6,88 (1H, d, J=8,0 Hz, H-2′); 6,96 (1H, dd, J=8,0; 2,0 Hz, H-6′); 7,14 (1H, J=2,0Hz, H-5′); và 8,06 (1H, s, H-2). 13C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 56,4 (OCH3-3′); 60,9 (OCH3-6); 94,9 (C-8); 106,6 (C-10); 113,8 (C-5′); 116,1 (C-2′); 122,7 (C-6′); 123,5 (C-3); 124,2 (C-1′); 132,7 (C-6); 147,7 (C-4′); 148,6 (C-3′); 154,4 (C-5); 154,7 (C-7); 154,8 (C-2); 158,6 (C-9); và 182,4 (C-4). Hợp chất BS-4 (18) Bột màu vàng, mp. 184-185°C, C18H16O8, ESI-MS m/z 359 [M-H]¯ . 1H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ: (ppm) 3,88 (3H, s, OCH3-4′); 3,89 (3H, s, OCH3-5′); 3,94 (3H, s, OCH3-6); 6,48 (1H, s, H-8); 6,68 (2H, dd, J=6,0; 2,0 Hz, H-2′, 6′); và 7,90 (1H, s, H-2). 13C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 55,7 (OCH3-6); 60,3 (OCH3-4′); 60,4 (OCH3-5′); 93,9 (C-8); 104,9 (C-10); 105,7 (C-2′); 109,4 (C-6′); 122,9 (C-3); 126,4 (C- 1′); 131,2 (C-6); 136,2 (C-4′); 149,8 (C-3′); 152,7 (C-5′); 152,8 (C-5); 153,2 (C-9); 153,3 (C-2); 156,7 (C-7); và 180,7 (C-4). Hợp chất BS-5 (19) Bột màu trắng, mp. 113oC, C9H10O3, ESI-MS m/z 167 [M+H]+. 1H-NMR (CDCl3) δ (ppm): 2,56 (3H, s, CH3-8); 3,96 (3H, d, J=7,5Hz, OCH3-9); 6,06 (1H, s, OH); 6,94 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,54 (1H, dd, J=1,8; 8,0 Hz, H-7); và 7,53 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-3). 13C-NMR (CDCl3) δ (ppm): 196,7 (C=O); 130,3 (C-2); 124,1 (C-3); 146,6 (C-4); 150,4 (C-5); 113,8 (C-6); 109,8 (C-7); 26,17 (CH3-8) và 56,12 (CH3-9). Hợp chất BS-6 (20) Tinh thể màu vàng, mp.221-223°C, C16H12O6, ESI-MS m/z 299 [M-H]+. 1H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3); 6,54 (1H, s, H-8); 6,56 (1H, s, H-6); 6,93 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3′, 5′) và 7,82 (2H, d, J=9,0 Hz, H-2′, 6′). 15 methylchroman-4-one có độ quay cực là D][α = +53,2. Điều này xác nhận hợp chất EB- 1a có cấu hình ở C-2 là S. Do vậy, hợp chất EB-1 được xác định là (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên. Hình 4.1d, h Cấu trúc của hợp chất EB-1a và EB-1 4.1.2 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm 4.1.2.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của các cặn chiết của củ sâm đại hành Với hoạt tính kháng viêm theo đường bôi, cả 4 cặn chiết methanol, n-hexan, ethyl axetat và cặn chiết nước của củ sâm đại hành đều không có khả năng ức chế khối viêm cục bộ theo đường bôi so với đối chứng Dexamethasone. Kết quả nghiên cứu theo đường uống cho thấy chỉ có cặn chiết etyl axetat (EB-Et) ức chế được trên 50,0 % thể tích khối viêm so với đối chứng âm (không sử dụng hoạt chất) với % ức chế khối viêm là 52,12%. Chất đối chứng dương Indomethacine có hoạt tính ổn định và ức chế được 64,59% khối viêm. 4.1.2.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS của các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành Đầu tiên, chúng tôi đã sử dụng phương pháp nhuộm màu MTT để đánh giá ảnh hưởng đến khả năng sống sót của tế bào của 14 hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành. Sau đó đã tiến hành thử hoạt tính ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS của các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành. Hình 4.15 Tác dụng của hợp chất EB-1-EB-14 ở nồng độ 25,0 µm đến sự sản sinh IL- 12p40 từ tế bào tua DC được kích thích bởi LPS 14 Dưới đây trình bày phương pháp xác định cấu trúc hợp chất mới Dihydroeleutherinol- 8-O-β-D-glucopyranoside (EB1) được phân lập từ củ sâm đại hành: Hợp chất EB-1 thu được dưới dạng chất bột màu vàng nhạt; 25][ Dα –58,1 (MeOH, c = 0,3); phổ tử ngoại UV (MeOH) có các cực đại hấp thụ tại λmax (log ε) 223 (4,2), 261 (4,0) nm. Phổ hồng ngoại IR cho các đỉnh hấp thụ tại 3495 cm-1 đặc trưng cho tín hiệu của nhóm –OH, 1640 cm-1 đặc trưng cho tín hiệu của nhóm C=O và 1610 cm-1 đặc trưng cho tín hiệu của C-O-C. Phổ ESI-MS cho pic ion cơ bản negative ở m/z 419 [M–H]–. Phổ phân giải cao HR- ESI-MS với pic ion cluster tại m/z 419,1338 [M–H]– (C21H23O9, 419,1342) phù hợp với công thức phân tử là C21H24O9. Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của hợp chất EB-1 cho thấy các tín hiệu sau: 1 nhóm methyl bậc ba ở δH 2,45 ppm, 1 nhóm methyl bậc hai ở δH 1,46 ppm (d, J=6,1 Hz), 3 proton thơm singlet ở δH 6,45 ppm (s, H-9), δH 6,67 ppm (s, H-7) và δH 6,85 ppm (s, H-6), và proton anomeric ở δH 4,93 ppm (d, J=7,2 Hz, H-1'). Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất EB-1 cho thấy tín hiệu của 21 nguyên tử C, tín hiệu cộng hưởng của 12 nguyên tử cacbon thơm hoặc olefin, 1 tín hiệu của nhóm cacbonyl ở δC 194,3 ppm (C-4), 5 tín hiệu của 5 nguyên tử cacbon ở δC từ 62,5 đến 78,3 ppm và 1 tín hiệu của nguyên tử cacbon ở δC 101,7 ppm (C-1') thuộc phần đường monosaccharide; 2 tín hiệu của hai nhóm methyl ở δC 20,7 ppm (2-Me) và 23,3 ppm (5- Me). Phân tích các dữ liệu phổ trên cho thấy phần aglycone của EB-1 được xác định là dihydroeleutherinol (EB-1a) (hình 4.1d). Phổ HMBC của EB-1 cho thấy tương tác giữa H-2 (δH 4,87) với C-1a (δC 163,4), C- 3 (δC 45,9), C-4 (δC 194,3), và 2-Me (δC 20,7); giữa H-3 (δH 2,57 và 2,62) với C-2 (δC 78,0), C-4 (δC 194,3), và 2-Me (δC 20,7) gợi ý nhóm methyl và nhóm carbonyl tương ứng ở vị trí C-2 và C-4 của vòng dihydropyrone. Mặt khác, trên phổ HMBC còn xuất hiện tương tác giữa 5-Me (δH 2,45 ppm) với C-4a (δC 114,6 ppm), C-5 (δC 137,6 ppm), và C-6 (δC 124,2 ppm); giữa H-7 (δH 6,67) với C-6 (δC 124,2), C-8 (δC 161,4), C-9 (δC 103,5), và C-10a (δC 109,9); giữa H-9 (δH 6,45) với C-7 (δC 103,6), C-8 (δC 161,4), C-10 (δC 158,7), và C-10a (δC 109,9). Những dữ kiện này chứng tỏ vị trí nhóm methyl và hai nhóm hydroxyl tương ứng ở các vị trí C-5, C-8, và C-10. Sự có mặt của một phân tử đường trong phân tử hợp chất EB-1 được khẳng định thêm bằng việc thủy phân EB-1 trong môi trường axit thu được 1 đơn vị đường D- glucose và aglycone EB-1a. Ngoài ra, vị trí của đường glucose ở C-8 được khẳng định thêm bởi tương tác giữa H-1' glc (δH 4,93) và C-8 (δC 161,4) trên phổ HMBC. Để xác định cấu hình tuyệt đối của C-2 trong phân từ hợp chất EB-1 chúng tôi đã tiến hành ghi phổ CD của EB-1. Phổ CD của hợp chất EB-1 cho thấy hiệu ứng cotton xung quanh 319 nm, tương tự như hợp chất (2S)-5-hydroxy-6,8-dimethoxy-2-methyl-4H- 2,3-dihydronaphtho[2,3-b]-pyran-4-one, điều này gợi ý cấu hình ở C-2 của EB-1 là cấu hình S. Thêm vào đó để khẳng định thêm cấu hình của EB-1, chúng tôi đã xác định cấu hình aglycone EB-1a bằng cách so sánh độ quay cực của EB-1a với hợp chất 2- methylchroman-4-one và hợp chất (R)-dihydroeleutherinol ( 25][ Dα =+8,8). Độ quay cực của EB-1a đo được là 25][ Dα = –38,3, trong khi đó hợp chất (S) 5,7-dihydroxy-2- methylchroman-4-one có độ quay cực là D][α = –58,6 và hợp chất (R) 7-methoxy-2- 11 13C-NMR (CD3OD) δ (ppm): 60,9 (OCH3-7); 92,1 (C-8); 104,3 (C-10); 115,6 (C- 3′,5′); 135,6 (C-3); 121,8 (C-1′); 129,5 (C-2’, 6’); 97,6 (C-6); 160,3 (C-5); 164,8 (C-7); 147,4 (C-2); 156,3 (C-9); 159,5 (C-4′); và 176,8 (C-4). Hợp chất BS-7 (21) Dạng bột vô định hình màu vàng, C16H12O7, ESI-MS m/z 315 [M-H]+. 1H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3-6); 6,46 (1H, s, H-8); 6,85 (2H, d, J = 2,0Hz, H-2′, 6′), 7,02 (1H, d, J =1,5 Hz, H-5′), và 8,01 (1H, s, H-2). 13C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 60,9 (OCH3-6); 94,9 (C-8); 106,6 (C-10); 116,2 (C-2′); 117,3 (C-5′); 121,6 (C-1′); 123,5 (C-3); 124,2 (C-6′); 132,6 (C-6); 146,0 (C- 3′); 146,5 (C-4′); 154,4 (C-5); 154,6 (C-7); 154,8 (C-2); 158,5 (C-9) và 182,4 (C-4). Hợp chất BS-8 (22) Dạng bột màu trắng, mp. 285-286oC, C35H60O6, ESI-MS m/z 575 [M-H]¯ . 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6, TMS) δ (ppm): 0,77 (3H, s, CH3-18); 0,81 (3H, d, J=7,0 Hz, CH3-27); 0,82 (3H, d, J=7,0 Hz, CH3-26); 0,83 (3H, t, J=7,0 Hz, CH3-29); 0,90 (3H, d, J=6,0 Hz, CH3-21); 0,96 (3H, s, CH3-19); 3,46 (1H, m, H-3); 5,33 (1H, d, J=5,0 Hz, H-6); 2,90 (1H, m, H-2′-glc); 3,02 (1H, m, H-4′-glc); 3,07 (1H, m, H-5′-glc); 3,12 (1H, m, H-3′-glc); 3,41 (1H, m, H-6′a-glc); 3,65 (1H, m, H-6′b-glc); 4,22 (1H, d, J=7,0 Hz, H-1′-glc); 4,39 (1H, t, J=6,0 Hz, OH-6′-glc); 4,82 (1H, d, J=2,0 Hz, OH-4′-glc); 4,83 (1H, d, J=2,0 Hz, OH-2′-glc) và 4,85 (1H, d, J=5Hz, OH-3′-glc). 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6, TMS) δ (ppm): 11,7 (CH3-18); 19,0 (CH3-27); 19,7 (CH3-26); 11,73 (CH3-29); 18,6 (CH3-21); 18,90 (CH3-19); 20,6 (C-11); 22,6 (C- 28); 23,2 (C-15); 25,4 (C-23); 27,7 (C-16); 28,7 (C-25); 29,2 (C-2); 31,3 (C-7); 31,4 (C-8); 33,3 (C-22); 35,4 (C-20); 36,2 (C-10); 36,8 (C-1); 38,3 (C-4); 39,2 (C-12); 41,8 (C-13); 45,1 (C-24); 49,6 (C-9); 55,4 (C-17); 56,1 (C-14); 76,9 (C-3); 121,1 (C-6); 140,4 (C-5); 60,1 (C-6′-glc); 70,1 (C-4′-glc); 73,3 (C-2′-glc); 76,4 (C-3′-glc); 76,7 (C- 5′-glc); 100,7 (C-1′-glc). Hợp chất BS-9 (23) Dạng bột, màu trắng, mp. 256-257oC, C22H22O11, ESI-MS m/z 463 [M+H]+ 1H-NMR (500 MHz, DMSO) δ (ppm): 8,43 (1H, s, H-2), 7,40 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,83 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′), 6,88 (1H, s, H-8), 5,08 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1ʺ), 3,73 (1H, d, J=7,5 Hz, Ha-6ʺ), 3,45 (1H, d, J=10,5 Hz, Hb-6ʺ), 3,36 (1H, m, H- 2ʺ), 3,34 (1H, m, H-3ʺ), 3,19 (1H, m, H-4ʺ), 3,44 (1H, m, H-5ʺ), 3,80 (3H, s, OCH3). 13C-NMR (125 MHz, DMSO) δ (ppm): 154,6 (C-2), 121,09 (C-3), 180,7 (C-4), 152,8 (C-5), 132,4 (C-6), 156,5 (C-7), 94,0 (C-8), 152,4 (C- 9), 106,44 (C-10), 122,04 (C-1′), 130,11 (C-2′, 6′), 115,05 (C-3′, 5′), 157,40 (C-4′), 100,17 (C-1ʺ), 73,11 (C-2ʺ), 76,67 (C-3ʺ), 69,64 (C-4ʺ), 77,26 (C-5ʺ), 60,64 (C-6ʺ), 60,24 (OCH3). Hợp chất BS-10 (24) Dạng bột vô định hình màu vàng, C22H22O11, ESI-MS m/z 485 [M+Na]+ 1H-NMR (500 MHz, DMSO) δH (ppm): 3,75 (3H, s, 6-OCH3), 6,87 (1H, s, H-8), 6,83 (2H, dd, J = 8,0, 1,5 Hz, H-3′, 5′), 7,38 (2H, dd, J = 8,0, 1,5 Hz, H-2′, 6′), 8,43 (1H, s, H-2), 5,45 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1″), 3,32 (m, H-2″), 3,41 (m, H-3″), 3,34 (m, H-4″), 3,38 (m, H-5″), 3,44 (m, Ha-6″), and 3,65 (m, Hb-6″). 13C-NMR (125 MHz, DMSO) δC (ppm): 154,7 (C-2), 121,0 (C-3), 180,8 (C-4), 152,9 (C-5), 132,5 (C-6), 157,5 (C-7), 94,1 (C-8), 152,5 (C-9), 106,5 (C-10), 122,1 (C- 12 1′), 130,2 (C-2′), 115,1 (C-3′), 156,6 (C-4′), 115,1 (C-5′), 130,2 (C-6′), 100,2 (C-1″), 73,3 (C-2″), 76,7 (C-3″), 69,7 (C-4″), 77,3 (C-5″), 60,7 (C-6″), 60,3 (OCH3 -6). Hợp chất BS-11 (25) Dạng bột vô định hình màu vàng, C21H20O11, ESI-MS m/z 471 [M+Na]+ 1H-NMR (500 MHz, DMSO) δH (ppm): 5,45 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1″), 6,20 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,43 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,88 (2H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-3′, H-5′) và 8,03 (2H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-2′, H-6′). 13C- NMR (125 MHz, DMSO) δC (ppm): 158,5 (C-2), 135,3 (C-3), 179,5 (C-4), 163,0 (C-5), 99,9 (C-6), 165,9 (C-7), 94,8 (C-8), 159,0 (C-9), 105,7 (C-10), 122,7 (C-1′), 132,3 (C-2′), 116,1 (C-3′), 161,5 (C-4′), 116,1 (C-5′), 132,3 (C-6′), 104,1 (C-1″), 75,7 (C-2″), 78,0 (C-3″), 71,3 (C-4″), 78.0 (C-5″), 62,6 (C-6″). Hợp chất BS-12 (26) Dạng bột màu vàng, mp. 240-242oC, C21H20O12, ESI-MS m/z 487 [M+Na]+ 1H -NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 5,23 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1″), 6,15 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,88 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′), 7,71 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′) và 7,56 (1H, d, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6′). 13C NMR (125 MHz, CD3OD) δC (ppm): 158,4 (C-2), 135,6 (C-3), 179,4 (C-4), 162,9 (C-5), 100,0 (C-6), 166,4 (C-7), 94,8 (C-8), 158,8 (C-9), 104,3 (C-10), 123,2 (C-1′), 115,9 (C-2′), 145,8 (C-3′), 149,9 (C-4′), 117,5 (C-5′), 123,0 (C-6′), 104,4 (C-1″), 75,7 (C- 2″), 78,3 (C-3″), 71,1 (C-4″), 78,0 (C-5″), 62,5 (C-6″). Hợp chất BS-13 (27) Bột vô định hình màu trắng, C29H48O, ESI-MS m/z 412 [M+Na]+ 1H -NMR (500 MHz, CD3OD) δH ppm: 3,51 (1H, tt, 11,0, 5,0, H-3), 5,35 (1H, brs, H- 6), 0,70 (3H, s, H-19), 5,13 (1H, m, H-20), 5,35 (1H, m, H-21), 0,83 (3H, t, 6,0, H-24), 0,79 (3H, d, 7,0, H-26), 0,82 (3H, d, 6.5, H-27), 0,80 (3H, d, 6,0, H-28), 1,03 (3H, s, 6,0, H-29). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 11,2 (C-24), 11,7 (C-21), 18,4 (C-26), 18,8 (C- 27), 20,4 (C-18), 20,5 (C-19), 20,6 (C-11), 23,7 (C-16), 24,8 (C-15), 28,3 (C-24), 31,0 (C-20), 31,2 (C-8), 31,3 (C-7), 35,9 (C-25), 36,7 (C-12), 39,0 (C-1), 39,4 (C-2), 40,0 (C- 10), 41,5 (C-13), 41,7 (C-24), 49,5 (C-9), 50,6 (C-4), 55,2 (C-14), 56,2 (C-17), 70,5 (C- 3), 120,6 (C-6), 128,5 (C-22), 137,7 (C-23), 140,4 (C-5). Hợp chất BS-14 (28) Chất bột màu trắng, mp. 53-54oC, C14H28O2, EI-MS m/z 228 [M]+. 1H -NMR (500 MHz, CD3OD) δH ppm: 0,89 (t, H-1), 1,26 (m, H-2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11), 1,64 (m, H-12), 2,36 (t, H-13). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 180,62 (C-1), 34,20 (C-2), 24,74 (C-3), 29,72 (C-4), 29,42 (C-5), 29,49 (C-6, 7, 8, 9, 10), 29,31 (C-11), 31,99 (C-12), 22,74 (C-13), 14,12 (C-14). CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ LOÀI SÂM ĐẠI HÀNH 4.1.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 14 hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành, trong đó có hợp chất EB-1 là hợp chất mới và hợp chất EB-14 lần đầu được phân lập từ cây sâm đại hành. 13 Bảng 4.9 Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập được từ cây sâm đại hành Dihydroeleutherinol-8-O-β- D-glucopyranoside (EB1) (Chất mới) Eleutherinol (EB2) Eleutherinoside A (EB3) (–)-hongconin (EB4) Eleutherin (EB5) Isoeleutherin (EB6) Eleuthoside C (EB7) Eleutherinoside C (EB8) Eleutherinoside B (EB9) (R) 7-acetyl-3,6-dihydroxy- 8-methyltetral-1-one (EB10) Eleuthoside A (EB11) Eleuthoside B (EB12) Eleutherinoside D (EB13) Deoxyerythrolaccin (EB14) Lần đầu tiên phân lập được từ cây sâm đại hành 2 4a 45 6a 7 10 10a 1a O OMe Me OHGlcO 6 O OH HO HO HO Glc O OMe Me OHHO 2 4a 45 6a 7 10 10a 1a O OMe Me OHGlcO 6 O OH HO HO HO Glc OMe OH OH O Me O OMe O Me H O O OMe O Me(α) H O O 1 3 4 OMe OH ODsac 5 14 9 10 11 1213 O 6 H Me(β) O O OH HOHO O OH HO HO HO Dsac 1 3 4 OMe OH ODsac 5 14 9 10 11 1213 O 6 H Me(α) O O OH HOHO O OH HO HO HO Dsac 1 3 4 OMe OH ODsac 5 14 9 10 11 1213 O 6 OH Me(α) O O OH HOHO O OH HO HO HO Dsac 1 3 4 Me 5 8 9 O OH6HO Me O O OH HO HO HO Glc O OMe OGlc Me O O O OH HOHO O OH HO HO HO O OMe ODsac Me O Dsac O OMe OH Me ODSac OH O O Me OHHO H