Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi Chòi Mòi (antidesma) ở Việt Nam

1 137,7 137,8 - 2 112,6 112,7 7,04 (d, 2,0) 3 150,8 150,8 - 4 147,2 147,2 - 5 117,9 118,0 7,15 (d, 8,0) 6 120,7 120,7 6,90 (dd, 2,0, 8,0) 7 64,9 65,0 4,56 (s) 4-OGlc 1′ 102,9 103,0 4,89 (d, 7,5) 2′ 74,9 74,9 3,51 (m) 3′ 77,8 77,8 3,49 (m) 4′ 71,3 71,4 3,43 (m) 5′ 78,1 78,2 3,43 (m) 6′ 62,5 62,5 3,70 (dd, 6,0, 12,0) 3,87 (dd, 2,0, 12,0) 3-OCH3 56,6 56,7 3,89 (s) a,#) đo trong CD3OD; #)C của hợp chất vanillyl alcohol-4-O-β-D-glucopyranoside [94]. 3.3.10. Hợp chất AG10: 4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzyl-O-β-D-glucopyranoside Hợp chất AG10 thu được dưới dạng chất bột, màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của AG10 xuất hiện tín hiệu của hai nhóm methoxy tại H 3,87 (6H, s); một proton anome tại H 4,33 (1H, d, J = 7,5 Hz) và hai proton thơm tại H 6,75 (2H, s). Bên cạnh đó, trên phổ 13C-NMR và DEPT của AG10 xuất hiện tín hiệu của 15 carbon, bao gồm: hai nhóm methoxy tại C 56,8 (2OCH3); một carbon oxymethylen tại C 71,8; sáu carbon đặc trưng của một đơn vị đường tại C 62,9 (CH2), 71,8 (CH), 75,1 (CH), 78,1 (2CH), 102,7 (CH) và sáu carbon thơm tại C 106,9 (2CH), 129,5 (C), 136,3 (C), 149,2 (2C). Giá trị độ dịch chuyển hóa học của phần đường và hằng số tương tác của proton anome JH-1-H-2 = 7,5 Hz gợi ý phần đường của AG10 là O-β-D- glucopyranose. Trên phổ HMBC xuất hiện tương tác giữa H-2/H-6 (H 6,75) với 143 C-1 (C 129,5), C-3/C-5 (C 149,2), C-4 (C 136,3)/ C-7 (C 71,8) cho phép quy kết giá trị độ dịch chuyển hóa học carbon tại các vị trí thuộc vòng thơm, đồng thời xác định vị trí gắn kết của nhóm oxymethylene (7-CH2-O) tại C-1. Vị trí của hai nhóm methoxy đối xứng tại C-3/C-5 và nhóm hydroxy tại C-4 được xác định dựa vào tương tác HMBC giữa nhóm methoxy (H 3,87) với C-3/C-5 (C 149,2) và giá trị độ dịch chuyển hóa học tại C-4 (C 136,3). Tương tự, vị trí của phần đường tại C-7 được xác định dựa vào tương tác giữa proton anome H-1 (H 4,33) với C-7 (C 71,8). Bảng 3.42. Số liệu phổ NMR của hợp chất AG10 và hợp chất tham khảo C δC# δCa DEPT δHa (độ bội, J, Hz) 1 129,4 129,5 C - 2 106,8 106,9 CH 6,75 (s) 3 149,2 149,2 C - 4 136,9 136,3 C - 5 149,2 149,2 C - 6 106,8 106,9 CH 6,75 (s) 7 71,8 71,8 CH2 4,62 (d, 11,5) 4,83 (d, 11,5) 3-OCH3 56,8 56,8 CH3 3,87 (s) 5-OCH3 56,8 56,8 CH3 3,87 (s) 7-OGlc 1′ 102,2 102,7 CH 4,33 (d, 7,5) 2′ 75,1 75,1 CH 3,26 (m) 3′ 78,0 78,1 CH 3,35 (m) 4′ 72,0 71,8 CH 3,31 (m) 5′ 75,6 78,1 CH 3,29 (m) 6′ 64,9 62,9 CH2 3,71 (dd, 6,0, 12,0) 3,92 (dd, 2,0, 12,0) a) đo trong CD3OD; #)C của hợp chất 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzyl-O-β-D-glucopyranoside đo trong CD3OD [95]. 144 Từ các bằng chứng phổ trên hợp chất AG10 được xác định là 4-hydroxy-3,5- dimethoxybenzyl-O-β-D-glucopyranoside. Kết luận này cũng được kiểm chứng khi so sánh số liệu phổ NMR của AG10 với tài liệu đã công bố [95]. Hợp chất này lần đầu tiên phân lập được từ chi Antidesma. Hình 3.77. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của AG10 3.3.11. Hợp chất AG11: 3-Hydroxy-4,5-dimethoxyphenyl-O-β-D-glucopyranoside Trên phổ 1H-NMR của AG11 xuất hiện tín hiệu sáu proton thuộc hai nhóm methoxy tại H 3,74 (3H, s), 3,82 (3H, s); hai proton meta tại H 6,30 (1H, d, J = 2,5 Hz), 6,36 (1H, d, J = 2,5 Hz). Trên phổ 13C-NMR và HSQC của AG11 xuất hiện tín hiệu của 14 carbon, bao gồm: hai carbon methoxy tại C 56,4, 61,1; sáu carbon đặc trưng của một đơn vị đường tại C 62,6 (CH2), 71,5 (CH), 74,9 (CH), 78,1 (CH), 78,2 (CH), 102,9 (CH) và sáu carbon thơm tại C 94,9 (CH), 98,8 (CH), 133,3 (C), 151,9 (C), 154,9 (C), 155,8 (C). Các tương tác HMBC giữa H-2 (H 6,30) với C-1 (C 155,8)/ C-3 (C 151,9)/ C-4 (C 133,3)/ C-6 (C 94,9) và H-6 (H 6,36) với C-2 (C 98,8)/ C-4 (C 133,3)/ C-5 (C 154,9) cho phép quy kết giá trị độ chuyển dịch carbon tại các vị trí của vòng thơm. Vị trí của nhóm hydroxy tại C-3 và hai nhóm methoxy tại C-4, C-5 được xác định dựa vào các tương tác HMBC giữa nhóm methoxy (H 3,74) với C-4 (C 133,3); giữa nhóm methoxy (H 3,82) với C-5 (C 154,9) và giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-3 (C 151,9). Tương tự, vị trí của phần đường tại C-1 được xác định dựa vào tương tác HMBC giữa proton anome H- 1 (H 4,81) với C-1 (C 155,8). Hình 3.78. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của AG11 145 Từ những phân tích trên kết hợp so sánh giá trị phổ 13C-NMR của AG11 với 3-hydroxy-4,5-dimethoxyphenyl-O-β-D-glucopyranoside [96] cho cho thấy số liệu hoàn toàn phù hợp. Điều này cho phép khẳng định hợp chất AG11 là 3-hydroxy- 4,5-dimethoxyphenyl-O-β-D-glucopyranoside. Hợp chất này lần đầu tiên phân lập được từ chi Antidesma. Bảng 3.43. Số liệu phổ NMR của hợp chất AG11 và hợp chất tham khảo C δC# δCa δHa (độ bội, J, Hz) 1 155,8 155,8 - 2 98,7 98,8 6,30 (d, 2,5) 3 151,8 151,9 - 4 133,2 133,3 - 5 154,9 154,9 - 6 94,8 94,9 6,36 (d, 2,5) 1-OGlc 1′ 102,9 102,9 4,81* 2′ 74,9 74,9 3,44 (m) 3′ 78,0 78,1 3,46 (m) 4′ 71,5 71,5 3,41 (m) 5′ 78,2 78,2 3,46 (m) 6′ 62,6 62,6 3,71 (dd, 6,0, 12,0) 3,92 (dd, 2,0, 12,0) 4-OCH3 61,1 61,1 3,74 (s) 5-OCH3 56,4 56,4 3,82 (s) a,#) đo trong CD3OD; #)C của hợp chất 3-hydroxy-4,5-dimethoxyphenyl-O-β-D-glucopyranoside [96]; *) tín hiệu bị che khuất. 3.3.12. Hợp chất AG12: 3,4,5-Trimethoxyphenyl-O-β-D-glucopyranoside Hợp chất AG12 thu được dưới dạng chất bột, màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của AG12 xuất hiện tín hiệu của hai proton thơm tại H 6,50 (2H, s), các proton thuộc một đơn vị đường tại H 3,35 – 4,85, bao gồm cả proton anome tại H (4,85 J = 7,5 Hz) và chín proton thuộc ba nhóm methoxy tại H 3,72 (3H, s), 3,83 (6H, s). Trên phổ 13C-NMR và DEPT của AG12 xuất hiện tín hiệu của 15 carbon. Trong đó, có sáu carbon thơm tại C 96,2 (2CH), 134,3 (C), 154,8 (2C), 156,0 (C); sáu carbon đặc trưng của một đơn vị đường tại C 62,7 (CH2), 71,7 (CH), 74,9 (CH), 78,1 (CH), 78,4 (CH), 103,2 (CH) và ba nhóm methoxy gắn với vòng thơm tại C 56,6 (2OCH3), 61,2 (OCH3). 146 Bảng 3.44. Số liệu phổ NMR của hợp chất AG12 và hợp chất tham khảo C δC# δCa DEPT δHa (độ bội, J, Hz) 1 156,2 156,0 C - 2 96,2 96,2 CH 6,50 (s) 3 154,9 154,8 C - 4 134,4 134,3 C - 5 154,9 154,8 C - 6 96,2 96,2 CH 6,50 (s) 3-OCH3 56,7 56,6 CH3 3,83 (s) 4-OCH3 61,4 61,2 CH3 3,72 (s) 5-OCH3 56,7 56,6 CH3 3,83 (s) 1-OGlc 1′ 103,3 103,2 CH 4,85 (d, 7,5) 2′ 75,1 74,9 CH 3,45 (m) 3′ 78,2 78,1 CH 3,47 (m) 4′ 71,8 71,7 CH 3,35 (m) 5′ 78,6 78,4 CH 3,45 (m) 6′ 62,9 62,7 CH2 3,67 (dd, 6,0, 12,0) 3,93 (dd, 2,0, 12,0) a,#) đo trong CD3OD; #)C của hợp chất 3,4,5-trimethoxyphenyl-O-β-D-glucopyranoside [97]. Hình 3.79. Cấu trúc hóa học của AG12 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và DEPT gợi ý hợp chất AG12 có mặt một vòng thơm đối xứng, ba nhóm methoxy và một đơn vị đường O-β-D-glucopyranose. So sánh số liệu phổ 13C-NMR của AG12 với hợp chất 3,4,5-trimethoxyphenyl-O-β-D- glucopyranoside [97] cho thấy số liệu hoàn toàn phù hợp. Điều này, cho phép khẳng định hợp chất AG12 là 3,4,5-trimethoxyphenyl-O-β-D-glucopyranoside. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ chi Antidesma. 3.3.13. Hợp chất AG13: Sinapyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside Hợp chất AG13 thu được dưới dạng chất bột, màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của AG13 xuất hiện tín hiệu của hai proton thơm tại H 6,77 (2H, s); hai proton olefin tại H 6,34 (1H, dt, J = 5,5, 15,5 Hz), 6,57 (1H, d, J = 15,5 Hz) và hai proton oxymethyl tại 4,24 (1H, d, J = 5,5 Hz) gợi ý sự có mặt của một nhóm propenyl-3-ol; 147 sáu proton thuộc hai nhóm methoxy tại H 3,88 (6H, s) và một proton anome tại H 4,88 (1H, d, J = 7,5 Hz). Trên phổ 13C-NMR và DEPT của AG13 xuất hiện tín hiệu của 17 carbon, bao gồm: bốn carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại C 135,3 (2C), 154,3 (2C); chín carbon methine tại C 71,4, 75,7, 77,8, 78,4, 105,4, 105,5 (2CH), 130,1, 131,3; hai carbon methylene tại C 62,6, 63,6 và hai nhóm methoxy tại C 57,0. Số liệu phổ NMR cho thấy cấu trúc của AG13 có mặt một vòng thơm đối xứng, một nhóm propenyl-3-ol, hai nhóm methoxy đối xứng và một đơn vị đường. Hằng số tương tác của H-1′ và H-2′, JH-1′/H-2′ = 7,5 Hz và độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR của phần đường [C 62,6 (CH2), 71,4 (CH), 75,7 (CH), 77,8 (CH), 78,4 (CH), 105,4 (CH)] gợi ý phần đường của AG13 là O-β-D-glucopyranose. Ngoài ra, hằng số tương tác của H-7 và H-8, JH-7/H-8 = 15,5 Hz gợi ý cấu hình E của liên kết đôi thuộc nhóm propenyl-3-ol. Bảng 3.45. Số liệu phổ NMR của hợp chất AG13 và hợp chất tham khảo C δC# δCa DEPT δHa (độ bội, J, Hz) 1 135,5 135,3 C - 2 105,7 105,5 CH 6,77 (s) 3 154,6 154,3 C - 4 135,8 135,3 C - 5 154,6 154,3 C - 6 105,7 105,5 CH 6,77 (s) 7 131,5 131,3 CH 6,57 (d, 15,5) 8 130,2 130,1 CH 6,34 (dt, 5,5, 15,5) 9 63,8 63,6 CH2 4,24 (d, 5,5) 3-OCH3 57,4 57,0 CH3 3,88 (s) 5-OCH3 57,4 57,0 CH3 3,88 (s) 1′ 105,6 105,4 CH 4,89 (d, 7,5) 2′ 76,0 75,7 CH 3,43 (m) 3′ 78,5 78,4 CH 3,50 (m) 4′ 71,6 71,4 CH 3,27 (m) 5′ 78,0 77,8 CH 3,43 (m) 6′ 62,7 62,6 CH2 3,69 (dd, 6,0, 12,0) 3,81 (dd, 2,0, 12,0) a,#) đo trong CD3OD; #)C của hợp chất sinapyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside [98]. 148 Hình 3.80. Cấu trúc hóa học của AG13 So sánh số liệu phổ 13C-NMR của AG13 với hợp chất sinapyl alcohol 4-O-β- D-glucopyranoside [98] thấy hoàn toàn phù hợp. Do đó có thể khẳng định hợp chất AG13 là sinapyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ chi Antidesma. 3.3.14. Hợp chất AG14: (–)-Syringaresinol Hợp chất AG14 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, không màu. Trên phổ 1H-NMR của AG14 xuất hiện tín hiệu của sáu proton của hai nhóm methoxy tại H 3,91 (6H, s), một proton oxymethine tại H 4,73 (1H, d, 3,0) và hai proton thơm tại H 6,58 (2H, s). Trên phổ 13C-NMR và DEPT của AG14 xuất hiện tín hiệu 11 carbon. Trong đó, có một nhóm methine tại C 54,8; một nhóm oxymethylene tại C 72,2; một nhóm oxymethine tại C 86,5; sáu carbon thuộc vòng thơm đối xứng thế 1,3,4,5 tại C 103,2 (2CH), 132,5 (1C), 134,8 (1C), 147,2 (2C) và hai nhóm methoxy đối xứng tại C 56,8 (2OCH3). Hình 3.81. Cấu trúc hóa học của hợp chất AG14 149 Số liệu phổ 1D-NMR của AG14 cho thấy sự có mặt của một đơn vị C6-C3 gợi ý AG14 là hợp chất lignan có cấu trúc đối xứng. Tổng quan các hợp chất lignan phân lập được từ chi Antidesma cho thấy hợp chất (–)-syringaresinol phân lập được từ loài A. membranaceum [12] có cấu trúc phù hợp số liệu phổ NMR của AG14. So sánh số liệu phổ 13C-NMR của AG14 với hợp chất (–)- syringaresinol [99] cho thấy số liệu hoàn toàn phù hợp. Điều này cho phép xác định AG14 là (–)-syringaresinol. Bảng 3.46. Số liệu phổ NMR của hợp chất AG14 và hợp chất tham khảo C δC# δCa DEPT δHa (độ bội, J, Hz) 1, 1 132,1 132,5 C - 2, 2 102,7 103,2 CH 6,58 (s) 3, 3 147,1 147,2 C - 4, 4 134,3 134,8 C - 5, 5 147,1 147,2 C - 6, 6 102,7 103,2 CH 6,58 (s) 7, 7 86,0 86,5 CH 4,73 (d, 3,0) 8, 8 71,8 72,2 CH2 3,91 (m) 4,28 (m) 9, 9 54,3 54,8 CH 3,10 (m) 3, 3-OCH3 56,4 56,8 CH3 3,91 (s) 5, 5-OCH3 56,4 56,8 CH3 3,91 (s) a) đo trong CDCl3; #)C của hợp chất (–)-syringaresinol đo trong CDCl3 [99]. Kết luận: Từ loài A. ghaesembilla, sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký đã phân lâp̣ và xác định cấu trúc của 14 hơp̣ chất, bao gồm sáu hợp chất flavonoid (AG3- AG8), năm hợp chất phenolic (AG9-AG13), hai hợp chất alkaloid (AG1-AG2) và một hợp chất lignan (AG14). Cấu trúc hóa học và tên gọi của 14 hợp chất phân lập được từ loài A. ghaesembilla được trình bày trong hình dưới đây: 150 Hình 3.82. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ loài A. ghaesembilla Bảng 3.47. Thống kê các hợp chất phân lập được từ loài Antidesma ghaesembilla Kí hiệu Tên khoa học Tính mới AG1 Antidesoic acid A Hợp chất mới AG2 Antidesoic acid B Hợp chất mới AG3 Vitexin  AG4 Orientin  AG5 Isovitexin  AG6 Homoorientin  AG7 Luteolin-4′-O-β-D-glucopyranoside AG8 Amentoflavone AG9 Vanillyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside AG10 4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzyl-O-β-D- glucopyranoside * AG11 3-Hydroxy-4,5-dimethoxyphenyl-O-β-D- glucopyranoside * AG12 3,4,5-Trimethoxyphenyl-O-β-D-glucopyranoside  AG13 Sinapyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside * AG14 (–)-Syringaresinol *) Phân lập lần đầu tiên từ chi Antidesma 3.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được 3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ loài A. acidum Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư máu cấp HL-60 và dòng tế bào mô phổi thường HEL-299 (Bảng 2.1.) cho thấy tám hợp chất 151 AC1, AC3-AC8, AC10 thể hiện hoạt tính gây độc đáng kể trên dòng tế bào ung thư HL-60 với giá trị % ức chế >50% sự phát triển của dòng tế bào này. Bốn hợp chất còn lại (AC2, AC9, AC11, AC12) có hoạt tính yếu với giá trị % ức chế >50%. Vì vậy, tám hợp chất AC1, AC3-AC8, AC10 được lựa chọn để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào HL-60 theo nồng độ. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của tám hợp chất AC1, AC3-AC8, AC10 trên dòng tế bào ung thư HL-60 và dòng tế bào thường HEL-299 (Bảng 2.2.) cho thấy, các hợp chất AC1 và AC4 thể hiện hoạt tính gây độc mạnh với dòng tế bào ung thư HL-60 với giá trị IC50 lần lượt là 4,8 µM và 8,0 µM (tương đương với chất đối chứng dương mitoxantrone, IC50 là 6,8 µM). Các hợp chất AC3, AC5-AC8 có hoạt tính ức chế dòng tế bào HL-60 ở mức độ trung bình với giá trị IC50 trong khoảng từ 22,5 đến 28,1 µM và hợp chất AC10 có hoạt tính yếu hơn với giá trị IC50 là 44,7 µM. Trong các hợp chất phân lập được từ loài A. acidum, các hợp chất carbazole alkaloid có mặt nhóm CHO tại C-3 (AC1, AC3-AC5) có hoạt tính gây độc tế bào ung thư HL-60 hơn hẳn so với hợp chất carbazole alkaloid không có mặt nhóm CHO tại C-3 (AC2). Như vậy, trong các hợp chất carbazole alkaloid phân lập được, sự có mặt của nhóm CHO tại C-3 làm tăng hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư HL-60. Tất cả tám hợp chất (AC1, AC3-AC8, AC10) đều không gây độc đối với dòng tế bào thường HEL-299 với giá trị IC50 >100 µM. Với hoạt tính mạnh nhất và chọn lọc trên dòng tế bào ung thư HL-60, hợp chất AC1 được chọn để đánh giá khả năng kích thích tế bào HL-60 chết theo chương trình. Phân tích tế bào cho thấy phần trăm các tế bào siêu lưỡng bội tăng lên ở giai đoạn sub-G1 lần lượt là 12,78 và 18,65% (Hình 3.83) khi được xử lý với hợp chất AC1 (4,8 µM) trong 24 giờ và 48 giờ. Trong khi đó, phần trăm các tế bào này ở mẫu đối chứng là 5,90%. Chứng tỏ hợp chất AC1 làm tăng số tế bào siêu lưỡng bội tăng bị bắt giữ ở giai đoạn sửa chữa (sub-G1) theo thời gian. Các tế bào này đã không trải qua được giai đoạn sao chép DNA và bị các đại thực bào tiêu thụ. Điều này cho thấy, hợp chất AC1 đã gây chết tế bào HL-60 bằng cách tác động đến chu kỳ tế bào ở giai đoạn sub-G1. Tế bào chết theo chương trình là một quá trình có thứ tự, được lập trình và hiện diện trong tất cả các hoạt động ở cấp độ phân tử. Các tế bào chết theo chương 152 trình thường có những đặc trưng hình thái như sự co lại của tế bào, các chất nhiễm sắc cô đặc tối đa, trở thành một khối dính vào lớp màng bao quanh nhân. Lớp màng nhân trở nên không liên tục và DNA trong nhân bị phân rã thành các tiểu thể nhiễm sắc trước khi bị đại thực bào tiêu thụ. Hình 3.83. Tác động của AC1 đến chu kỳ tế bào HL-60 Hình 3.84. Mức độ tế bào chết theo chương trình thể hiện thông qua ảnh huỳnh quang của nhân tế bào HL-60 nhuộm bằng Hoechst 33342 (độ phóng đại 200 lần) Kết quả kiểm tra hình thái nhân tế bào ung thư HL-60 khi xử lý với hợp chất AC1 ở nồng độ 4,8 µM trong 24 giờ và 48 giờ rồi nhuộm với Hoechst 33342 (Hình 3.84) cho thấy ở mẫu thử xử lý với hợp chất AC1 trong 24 giờ đã xuất hiện các thể đặc trưng cho quá trình tế bào chết theo chương trình như sự co lại và sáng hơn của một số nhân tế bào HL-60 (do sự cô đặc của các nhiễm sắc thể) và các thể đặc trưng này xuất hiện nhiều hơn ở mẫu thử được xử lý với hợp chất AC1 trong 48 giờ. 153 Một số protein đặc trưng cho quá trình tế bào chết theo chương trình như: Bcl-2, Bax, Caspase-3, Caspase-9, PARP Họ cytokine Bcl-2 được chia thành 2 dạng: dạng 1 có khả năng kìm hãm tế bào chết theo chương trình (Bcl-2) và dạng 2 thúc đẩy tế bào chết theo chương trình (Bax). Bax kích thích tế bào chết theo chương trình thông qua việc giải phóng cytochrome c từ ti thể, từ đó tạo nên quá trình phân cắt và hoạt hóa Caspase-9. Khi Caspase-9 được hoạt hóa, nó sẽ khởi động enzym phân cắt protein của hệ thống caspase dẫn tới sự hoạt hóa nhanh chóng của Caspase-3 và PARP, các loại protease tham gia vào quá trình phân mảnh DNA [100]. Ở cấp độ protein, khi xử lý với hợp chất AC1 (4,8 µM) trong 24 giờ và 48 giờ, chúng tôi quan sát thấy sự thay đổi trong biểu hiện của các protein liên quan đến quá trình tự chết của tế bào như: tăng cường biểu hiện của Bax, Caspase-3 và PARP, giảm độ biểu hiện của Bcl-2 (Hình 3.85.). Những kết quả này cho thấy hợp chất AC1 gây nên quá trình chết theo chương trình của tế bào thông qua làm thay đổi mức độ biểu hiện của các protein liên quan trong tế bào ung thư HL-60 (tăng biểu hiện của Bax, Caspase-3, PARP và giảm biểu hiện Bcl-2). Hình 3.85. Ảnh hưởng của hợp chất AC1 đến các biểu hiện ở cấp độ protein trên dòng tế bào HL-60 ở nồng độ 4,8 µM trong 24 giờ và 48 giờ 154 Con đường tín hiệu PI3K/AKT điều hòa sự sống, tăng trưởng và quá trình chết của tế bào. Đặc biệt, AKT dạng hoạt hóa tham gia vào quá trình sống và tăng trưởng của tế bào ung thư thông qua protein c-myc, một loại protein thường biểu hiện mạnh ở nhiều dạng khối u. Nhằm tìm hiểu xem con đường tín hiệu nội bào nào bị ảnh hưởng bởi AC1, chúng tôi phân tích quá trình photphorin hóa của AKT và độ biểu hiện của c-myc bằng thí nghiệm Western-blot. Kết quả cho thấy, sau khi xử lý với hợp chất AC1, quá trình photphorin hóa của AKT bị giảm đi, dẫn đến các tế bào tự chết. Hơn nữa, mức độ biểu hiện của c-myc cũng đồng thời thấp hơn. Đây là những bằng chứng cho thấy tác dụng làm các tế bào chết theo chương trình của hợp chất AC1 là thông qua sự giảm mức độ biểu hiện của p-AKT và c-myc (Hình 3.85.). 3.4.2. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập từ loài A. hainanensis Quá trình sản sinh NO là một trong các phản ứng tự bảo vệ của cơ thể tuy nhiên sự sản sinh quá mức lượng NO được cho là nguyên nhân dẫn đến sự tổn thương của các tế bào và mô, thúc đẩy quá trình viêm và gây ra các bệnh viêm cấp và mãn tính. Do vậy mức độ sản sinh NO có thể phản ánh mức độ gây viêm và được coi là một trong những yếu tố chỉ thị cho quá trình viêm xảy ra. Các hợp chất ức chế sự sản sinh NO có thể được coi là các tác nhân chống viêm. Kết quả đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS của 18 hợp chất (AH1-AH18) phân lập được từ loài A. hainanensis (Bảng 2.3.) cho thấy ở nồng độ 80 µM, các hợp chất AH1-AH3, AH5, AH7, AH8, AH14, AH15 và AH18 gây giảm đáng kể sự sản sinh NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS (tỷ lệ ức chế >50%), các hợp chất còn lại có hoạt tính kém (tỷ lệ ức chế <50%). Hoạt tính ức chế sự sản sinh NO theo nồng độ của chín hợp chất (AH1-AH3, AH5, AH7, AH8, AH14, AH15 và AH18) (Bảng 2.4.) cho thấy, các hợp chất AH8, AH14, AH15 và AH18 gây ức chế sự sản sinh NO trên tế bào BV2 mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 5,3 µM, 8,6 µM, 5,0 µM và 7,4 µM so với chất đối chứng dương (butein, IC50 = 3,8 µM). Các hợp chất AH1- AH3, AH5 và AH7 cũng thể hiện hoạt tính yếu hơn với các giá trị IC50 từ 10,8 µM đến 26,3 µM. Trong các hợp chất phân lập được từ loài A. hainanensis, các hợp chất lignan glycoside (AH1-AH3, AH5) có hoạt tính ức chế sự sản sinh NO tốt hơn so 155 với hợp chất lignan không có phần glycoside (AH4). Bên cạnh đó, các hợp chất megastigmane có nhóm carbonyl tại C-9 (AH14, AH15) thể hiện hoạt tính mạnh hơn hẳn so với các hợp chất megastigmane không có nhóm carbonyl tại C-9 (AH11-AH13). Như vậy trong các hợp chất phân lập được, đối với các hợp chất ligan sự có mặt của phần đường và nhóm carbonyl tại C-9 của các hợp chất dạng khung megastigmane làm tăng hoạt tính ức chế sự sản sinh NO trong tế bào BV2. 3.4.3. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập từ loài A. ghaesembilla Theo kết quả đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS (Bảng 2.5.) cho thấy, ở nồng độ 80 µM, ngoại trừ hợp chất AG14 thể hiện khả năng ức chế kém (tỷ lệ ức chế <50%), các hợp chất AG1-AG13 đều có hoạt tính ức chế ở các mức độ khác nhau sự sản sinh NO trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh NO theo nồng độ của 13 hợp chất (AG1-AG13) (Bảng 2.6.) cũng chỉ ra rằng hợp chất AG4 và AG8 thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 9,5 và 5,4 µM so với chất đối chứng dương (butein, IC50 = 3,8 µM). Mười một hợp chất còn lại (AG1-AG3, AG5-AG7, AG9-AG13) có hoạt tính ức chế sự sản sinh NO ở mức yếu hơn với giá trị IC50 trong khoảng 21,4 µM đến 72,7 µM. 156 KẾT LUẬN Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài A. hainanensis, A. acidum và A. ghaesembilla ở Việt Nam. 1. Nghiên cứu về thành phần hóa học Sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký và các phương pháp phổ hiện đại đã phân lập và xác định cấu trúc 44 hợp chất từ các loài A. hainanensis, A. acidum, A. ghaesembilla. Cụ thể: - Từ loài A. hainanensis đã phân lập và xác định cấu trúc 18 hợp chất. Trong đó, có hai hợp chất mới là (7S,7R,8S,8R)-3,3- dimethoxy-7,7-epoxylignan- 4,4,9-triol 4-O-β-D-glucopyranoside (AH1) và 9-O-formylaviculin (AH2); ba hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ họ Euphorbiaceae là β-D-glucopyranosyl phaseate (AH11), megastigm-7-ene-3-ol-9-one 3-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→6)- O-β-D-glucopyranoside (AH15) và lotusanine B (AH18); ba hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Antidesma là (+)-isolariciresinol 9-O-β-D-glucopyranoside (AH3), (+)-lyoniresinol-9-O-β-D-glucopyranoside (AH5), ampelopsisionoside (AH12) và 10 hợp chất đã biết khác (–)-lyoniresinol (AH4), 1-O-(2,4-dihydroxy- 6-methoxyphenyl)-6-O-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)-β-D- glucopyranoside (AH6), 4-O-[6-O-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)-β-D- glucopyranosyl]-3-hydroxy phenethyl alcohol (AH7), 4-hydroxymethyl-2- methoxyphenyl-6-O-syringoyl-β-D-glucopyranoside (AH8), phenethyl α-L- arabinofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside (AH9), syringoyl-O-β-D- glucopyranoside (AH10), alangioside A (AH13), alangionoside L (AH14), N– trans-feruloyloctopamide (AH16) và trans-linalool-3,6-oxide 7-O-β-D- glucopyranoside (AH17). - Từ loài A. acidum đã phân lập và xác định cấu trúc 12 hợp chất. Trong đó, có một hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ tự nhiên là 5-demethyltoddaculin (AC6); bảy hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Antidesma là clauszoline B (AC1), clauszoline H (AC2), mukonal (AC3), 7-methoxymukonal (AC4), heptaphyline (AC5), xanthoxyletin (AC7), alloxanthoxyletin (AC8) và bốn hợp chất đã biết khác là (E)-p-propenylphenol O-β-D-glucopyranoside (AC9), p-methoxycinnamaldehyde (AC10), trans-4-methoxycinnamyl alcohol (AC11), vanilin (AC12). 157 - Từ loài A. ghaesembilla đã phân lập và xác định cấu trúc 14 hợp chất. Trong đó, có hai hợp chất mới là antidesoic acid A (AG1) và antidesoic acid B (AG2); tám hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Antidesma là vitexin (AG3), orientin (AG4), isovitexin (AG5), homoorientin (AG6), 4-hydroxy-3,5- dimethoxybenzyl-O-β-D-glucopyranoside (AG10), 3-hydroxy-4,5-dimethoxyphenyl- O-β-D-glucopyranoside (AG11), 3,4,5-trimethoxyphenyl-O-β-D-glucopyranoside (AG12), sinapyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside (AG13) và bốn hợp chất đã biết khác là luteolin-4′-O-β-D-glucopyranoside (AG7), amentoflavone (AG8), vanillyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside (AG9), (–)-syringaresinol (AG14). 2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học - Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu HL-60 của 12 hợp chất (AC1- AC12) phân lập được từ loài A. acidum. Kết quả cho thấy, các hợp chất AC1 và AC4 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 4,8 µM và 8,0 µM (tương đương với đối chứng dương mitoxantrone, IC50 = 6,8 µM). Các hợp chất AC3, AC5-8 có hoạt tính ức chế dòng tế bào HL-60 ở mức độ trung bình với giá trị IC50 trong khoảng từ 22,5 đến 28,1 µM và hợp chất AC10 có hoạt tính yếu hơn với giá trị IC50 = 44,7±3,3 µM. Nghiên cứu cơ chế gây chết tế bào ung thư HL-60 của hợp chất AC1 theo hình thái tế bào cũng như nghiên cứu ở cấp độ phân tử đã chỉ ra hợp chất này gây chết theo chương trình thông qua sự thay đổi trong biểu hiện của các protein liên quan đến quá trình tự chết của tế bào như: tăng cường biểu hiện của Bax, Caspase-3 và PARP, giảm độ biểu hiện của Bcl-2, p-AKT và c-myc. - Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh NO trong tế bào BV2 của 18 hợp chất (AH1- AH18) phân lập được từ loài A. hainanensis. Kết quả cho thấy các hợp chất AH8, AH14, AH15 và AH18 thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 5,3 µM, 8,6 µM, 5,0 µM và 7,4 µM so với chất đối chứng dương butein (IC50 = 3,8 µM). - Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh NO trong tế bào BV2 của 14 hợp chất (AG1-AG14) phân lập được từ loài A. ghaesembilla. Kết quả cho thấy các hợp chất AG4 và AG8 thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 9,5 và 5,4 µM so với chất đối chứng dương butein (IC50 = 3,8 µM). 158 KIẾN NGHỊ Từ các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài A. acidum, A. hainanensis và A. ghaesembilla chúng tôi nhận thấy: Hợp chất AC4 có hoạt tính gây độc mạnh dòng tế bào ung thư máu cấp (HL- 60). Vì vậy, cần thêm các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế gây độc tế bào HL-60 của các hợp chất này. Trong thí nghiệm của chúng tôi, các hợp chất AH8, AH14, AH15, AH18, AG4 và AG8 thể hiện hoạt tính ức chế mạnh đối với sự sản sinh NO trong BV2 được kích thích bởi LPS với giá trị IC50 trong khoảng từ 5,0 µM đến 9,5 µM. Do vậy, cần nghiên cứu thêm các thí nghiệm kháng viêm của hợp chất này để định hướng cho thực nghiệm in vivo. 159 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 1. Phan Van Kiem, Le Canh Viet Cuong, Do Thi Trang, Nguyen Xuan Nhiem, Hoang Le Tuan Anh, Bui Huu Tai, Le Mai Huong, Chau Van Minh, Taek Hwan Leeb, Sun Yeou Kim, and Seung Hyun Kim. New Alkaloids and Anti-inflammatory Constituents from the Leaves of Antidesma ghaesembilla. Natural Products Communications, 2017, 12 (1), 11-14. 2. Phan V Kiem, Le C. V. Cuong, Nguyen T. Cuc, Nguyen X. Nhiem, Hoang L.T. Anh, Bui H. Tai, Tran H. Quang, Chau V. Minh, Le M. Huong, Eun-Ji Kim, Hee K. Kang, and Young H. Kim. Alkaloids from the leaves of Antidesma acidum and their cytotoxic activity. Letters in Organic Chemistry, 2016, 13, 297-301. 3. Phan Van Kiem, Le Canh Viet Cuong, Bui Huu Tai, Nguyen Xuan Nhiem, Hoang Le Tuan Anh, Tran Hong Quang, Nguyen Thi Thanh Ngan, Hyuncheol Oh, and Youn Chul Kim. New lignans from Antidesma hainanensis inhibit NO production in BV2 microglial cells. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2016, 64, 1707–1712. 4. Le Canh Viet Cuong, Bui Huu Tai, Nguyen Xuan Nhiem, Pham Hai Yen, Hoang Le Tuan Anh, Le Mai Huong, Phan Van Kiem. Phenyl derivatives from Antidesma haianensis. Journal of Science and Technology, 2017, 55 (1), 8-14. 5. Le Canh Viet Cuong, Do Thi Trang, Nguyen Thi Cuc, Nguyen Xuan Nhiem, Pham Hai Yen, Hoang Le Tuan Anh, Le Mai Huong, Chau Van Minh, and Phan Van Kiem. Flavonoid glycosides from Antidesma ghaesembilla. Vietnam Journal of Chemistry, 2015, 53 (2e), 94-97. 6. Le Canh Viet Cuong, Do Thi Trang, Nguyen Xuan Nhiem, Pham Hai Yen, Bui Huu Tai, Hoang Le Tuan Anh, Le Mai Huong, Nguyen Quoc Binh, Chau Van Minh, and Phan Van Kiem. Phenolic glycosides from Antidesma ghaesembilla. Vietnam Journal of Chemistry ,2016, 54(2), 170-174. 7. Le Canh Viet Cuong, Do Thi Trang, Nguyen Xuan Nhiem, Pham Hai Yen, Bui Huu Tai, Hoang Le Tuan Anh, Le Mai Huong, Chau Van Minh, Phan Van Kiem. Cyclopeptide alkaloid and lignans from Antidesma hainanensis Merr.. Vietnam Journal of Chemistry, 2016, 54(6), 663-666. 8. Le Canh Viet Cuong, Do Thi Trang, Nguyen Xuan Nhiem, Pham Hai Yen, Bui Huu Tai, Hoang Le Tuan Anh, Le Mai Huong, Chau Van Minh, Phan Van Kiem. Megastigmans and other compounds from Antidesma hainanensis Merr.. Vietnam Journal of Chemistry, 2016, 54(6) 678-682. 160 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] P.H. Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản trẻ, 2003, Tập 2 223-231. [2] V.V. Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuẩt bản Y học, 2002, Tập 2 441- 446. [3] J. Ming-Jer, Y. Ching-Long, Some supplements on the Antidesma pleuricum Tul. (Euphorbiaceae), a neglected species in the flora of Taiwan, Taiwania, 2010, 55 (3), 318-323. [4] N.T. Bân, Danh mục các loài thực vật Việt Nam, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội, 2003, Tập 2 578-583. [5] G. Bringmann, H. Rischer, M. Wohlfarth, J. Schlauer, Biosynthesis of antidesmone in cell cultures of Antidesma membranaceum (Euphorbiaceae): An unprecedented class of glycine-derived alkaloids, Journal of the American Chemical Society, 2000, 122 (41), 9905-9910. [6] A. Buske, S. Busemann, J. Mühlbacher, J. Schmidt, A. Porzel, G. Bringmann, G. Adam, Antidesmone, a novel type isoquinoline alkaloid from Antidesma membranaceum (Euphorbiaceae), Tetrahedron, 1999, 55 (4), 1079-1086. [7] D. Arbain, W.C. Taylor, Cyclopeptide alkaloids from Antidesma montana, Phytochemistry, 1993, 33 (5), 1263-1266. [8] B. Elya, R.C. Forestrania, M. Ropi, S. Kosela, K.O. Awang, Hanita, A.H. A. Hadi, The new alkaloids from Antidesma cuspidatum MA, Records of Natural Products, 2014, 8 (4), 342-347. [9] J.J. Magadula, D.A. Mulholland, N.R. Crouch, The isolation of important biosynthetic intermediate; presqualene alcohol and its acetate derivative from Antidesma venosum, Journal of Advanced Scientific Research, 2012, 3 32-35. [10] Y.-C. Chen, M.-J. Cheng, S.-J. Lee, I.-L. Tsai, I.-S. Chen, Chemical constituents from the root of Antidesma Pentandrum var. Barbatum, Journal of the Chinese Chemical Society, 2007, 54 (5), 1325-1332. [11] S. Kaennakam, J. Sichaem, P. Siripong, S. Tip-Pyang, A new cytotoxic phenolic derivative from the roots of Antidesma acidum, Nat Prod Commun, 2013, 8 (8), 1111-1113. 161 [12] A. Buske, J. Schmidt, A. Porzel, G. Adam, Benzopyranones and ferulic acid derivatives from Antidesma membranaceum, Phytochemistry, 1997, 46 (8), 1385- 1388. [13] A. Buske, J. Schmidt, A. Porzel, G. Adam, Alkaloidal, megastigmane and lignan glucosides from Antidesma membranaceum (Euphorbiaceae), European Journal of Organic Chemistry, 2001, 2001 (18), 3537-3543. [14] M.E.S. Kassem, A.N. Hashim, Bioactivity of Antidesma bunius leaves (Euphorbiaceae) and their major phenolic constituents, European Scientific Journal, 2013, 9 (18), 1857 – 7881. [15] A.T. Tchinda, A. Teshome, E. Dagne, N. Arnold, L.A. Wessjohann, Squalene and amentoflavone from Antidesma laciniatum, Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia, 2006, 20 325-328. [16] S. Jorjong, L. Butkhup, S. Samappito, Phytochemicals and antioxidant capacities of Mao-Luang (Antidesma bunius L.) cultivars from Northeastern Thailand, Food chemistry, 2015, 181 248-255. [17] N. Nuengchamnong, K. Ingkaninan, On-line HPLC–MS–DPPH assay for the analysis of phenolic antioxidant compounds in fruit wine: Antidesma thwaitesianum Muell., Food chemistry, 2010, 118 (1), 147-152. [18] M.G. Djouossi, F.D. Mabou, P.L. Foning Tebou, D. Ngnokam, L.A. Tapondjou, D. Harakat, L. Voutquenne-Nazabadioko, Chevalierinoside B and C: Two new isoflavonoid glycosides from the stem bark of Antidesma laciniatum Muell. Arg (syn. Antidesma chevalieri Beille), Phytochemistry Letters, 2014, 9 149- 152. [19] M.G. Djouossi, P.L.F. Tebou, F.D. Mabou, D. Ngnokam, L.A. Tapondjou, D. Harakat, L.V. and Nazabadioko, Chevalierinoside A: A new isoflavonoid glycoside from the stem bark of Antidesma chevalieri Beille (Euphorbiaceae) Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia, 2014, 28 (2), 309-314. [20] A. Iha, K. Matsunami, H. Otsuka, M. Kawahata, K. Yamaguchi, Y. Takeda, Three new aliphatic glycosides from the leaves of Antidesma japonicum Sieb. et Zucc, Journal of Natural Medicines, 2012, 66 (4), 664-670. 162 [21] Y.-C. Chen, M.-J. Cheng, S.-J. Lee, A.-K. Dixit, T. Ishikawa, I.-L. Tsai, I.-S. Chen, Coumarinolignans from the root of Formosan Antidesma pentandrum var. barbatum, Helvetica Chimica Acta, 2004, 87 (11), 2805-2811. [22] T. Yoshida, O. Namba, C.-F. Lu, L.-L. Yang, K.-Y. Yen, T. Okuda, Tannins of Euphorbiaceous plants. X. Antidesmin a, a new dimeric hydrolyzable tannin from Antidesma pentandrum var. Barbatum, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1992, 40 (2), 338-342. [23] S. Maria, F. Islam, N. Qais, C.M. and Hasan, Isolation of Vomifoliol: A megastigmane from leaves of Antidesma ghaesembilla, Asian Journal of Chemical, 2013, 25 (6), 3533-3534. [24] S.H. Rizvi, A. Shoeb, R.S. Kapil, S.P. Popli, Antidesmanol-a new pentacyclic triterpenoid from Antidesma menasu Miq. ex. Tul, Experientia, 1980, 36 (2), 146- 147. [25] S.H. Rizvi, A. Shoeb, R.S. Kapil, S.P. Popli, Two diuretic triterpenoids from Antidesma menasu, Phytochemistry, 1980, 19 (11), 2409-2410. [26] H. Kikuchi, A. Tensho, I. Shimizu, H. Shiokawa, A. Kuno, S. Yamada, T. Fujiwarat, K.-i. Tomitat, Lupeolactone, a new Beta-lactone from Antidesma pentandrum Merr., Chemistry Letters, 1983, (4), 603-606. [27] Y.-C. Wu, G.-Y. Chang, F.-N. Ko, C.M. and Teng, Bioactive constitutents from the stems of Annona montana, Planta medica, 1995, 61 (2), 146-149. [28] B.-Y. Park, S.-R. Oh, K.-S. Ahn, O.-K. Kwon, H.-K. Lee, (–)-Syringaresinol inhibits proliferation of human promyelocytic HL-60 leukemia cells via G1 arrest and apoptosis, International Immunopharmacology, 2008, 8 (7), 967-973. [29] V. Steenkamp, T.L. Mokoele, C.E.J.V. Rensburg, Toxicity testing of two medicinal plants, Bridelia micrantha and Antidesma venosum, The Open Toxicology Journal, 2009, 3 (1), 35-38. [30] R. Vazquez, M.E. Riveiro, M. Vermeulen, C. Mondillo, P.H. Coombes, N.R. Crouch, F. Ismail, D.A. Mulholland, A. Baldi, C. Shayo, C. Davio, Toddaculin, a natural coumarin from Toddalia asiatica, induces differentiation and apoptosis in U-937 leukemic cells, Phytomedicine : international journal of phytotherapy and phytopharmacology, 2012, 19 (8-9), 737-746. 163 [31] P. Hansakul, B. Dechayont, P. Phuaklee, O. Prajuabjinda, T. Juckmeta, A. Itharat, Cytotoxic and antioxidant activities of Antidesma thwaitesianum Müll Arg (Euphorbiaceae) fruit and fruit waste extracts, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2015, 14 627-634. [32] D. Puangpronpitag, P. Areejitranusorn, P. Boonsiri, M. Suttajit, P. Yongvanit, Antioxidant activities of polyphenolic compounds isolated from Antidesma thwaitesianum Mull. Arg. seeds and marcs, Journal of food science, 2008, 73 (9), 648-653. [33] R. Habib, M. Rahman, K. Hamid, O. Raihan, M.A. Sayeed, Phytochemical screening, cytotoxicity, antioxidant capacity and antibacterialpotentiality of methanol extract of Antidesma ghaesembilla Gaertn., Advances in Natural and Applied Sciences, 2011, 5 (2), 69-74. [34] M.F. Gargantiel, M.C. Ysrael, Antioxidant activity and hypoglycemic potential of Antidesma ghaesembilla Gaertn (Phyllantaceae), International Journal of Scientific and Technology Research, 2014, 3 422-431. [35] L. Xiang, Y. Wang, X. Yi, X. Wang, X. He, Chemical constituent and antioxidant activity of the husk of Chinese hickory, Journal of Functional Foods, 2016, 23 378-388. [36] O.A. Fawole, J.F. Finnie, J. Van Staden, Antimicrobial activity and mutagenic effects of twelve traditional medicinal plants used to treat ailments related to the gastro-intestinal tract in South Africa, South African Journal of Botany, 2009, 75 (2), 356-362. [37] S.A. Adegoke, F.D. Agada, L.O. Ogundipe, Antibacterial activity of methanol and ethanol leaf extracts of Antidesma venosum and Lannea barteri, African Journal of Microbiology Research, 2013, 7 (27), 3442-3447. [38] D.T. Mwangomo, M.J. Moshi, J.J. Magadula, Antimicrobial activity and phytochemical screening of Antidesma venosum root and stem bark ethanolic extracts, International Journal of Research in Phytochemistry and Pharmacology, 2012, 2 (2), 90-95. [39] W.H. El-Tantawy, N.D. Soliman, D. El-naggar, A. Shafei, Investigation of antidiabetic action of Antidesma bunius extract in type 1 diabetes, Archives of physiology and biochemistry, 2015, 121 (3), 116-122. 164 [40] N.F. Utami, B.E. Katrin, Isolation of a-glucosidase inhibitory active compounds from ethanol extract of kayu tuah (Antidesma celebicum Miq.) leaves, International Research Journal of Pharmacy, 2015, 6 (1), 22-24. [41] P.C. Patil, V.D. Jadhav, S.D. Mahadkar, Pharmacognostical studies on leaf of Antidesma ghaesembilla Gaertn, A promising wild edible plant, Der Pharmacia Sinica, 2013, 4 (3), 136-142 [42] N.X. Nhiem, N.H. Tung, P.V. Kiem, C.V. Minh, Y. Ding, J.H. Hyun, H.K. Kang, Y.H. Kim, Lupane triterpene glycosides from leaves of Acanthopanax koreanum and their cytotoxic activity, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2009, 57 986-989. [43] T. Mosmann, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays, Journal of Immunological Methods, 1983, 65 (1), 55-63. [44] M.C. Alley, D.A. Scudiero, A. Monks, M.L. Hursey, M.J. Czerwinski, D.L. Fine, B.J. Abbott, J.G. Mayo, R.H. Shoemaker, M.R. Boyd, Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay, Cancer research, 1988, 48 (3), 589-601. [45] J.-H. Hyun, S.-C. Kim, J.-I. Kang, M.-K. Kim, H.-J. Boo, J.-M. Kwon, Y.-S. Koh, J.-W. Hyun, D.-B. Park, E.-S. Yoo, H.-K. Kang, Apoptosis inducing activity of fucoidan in HCT-15 colon carcinoma cells, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2009, 32 (10), 1760-1764. [46] N.T.T. Hien, N.X. Nhiem, D.T.H. Yen, D.T.T. Hang, B.H. Tai, T.H. Quang, H.L.T. Anh, P.V. Kiem, C.V. Minh, E.-J. Kim, S.H. Kim, H.K. Kang, Y.H. and Kim, Chemical constituents of the Annona glabra fruit and their cytotoxic activity, Pharmaceutical Biology, 2015, 53 (11), 1602-1607. [47] K.H. Altmann, J. Gertsch, Anticancer drugs from nature--natural products as a unique source of new microtubule-stabilizing agents, Natural product reports, 2007, 24 (2), 327-357. [48] R.C. Martins, L.R. Latorre, P. Sartorelli, M.J. Kato, Phenylpropanoids and tetrahydrofuran lignans from Piper solmsianum, Phytochemistry, 2000, 55 (7), 843- 846. 165 [49] C.-Q. Liang, J. Hu, R.-H. Luo, Y.-M. Shi, S.-Z. Shang, Z.-H. Gao, R.-R. Wang, Y.-T. Zheng, W.-Y. Xiong, H.-B. Zhang, W.-L. Xiao, H.-D. Sun, Six new lignans from the leaves and stems of Schisandra sphenanthera, Fitoterapia, 2013, 86 171-177. [50] Y. Li, W. Cheng, C. Zhu, C. Yao, L. Xiong, Y. Tian, S. Wang, S. Lin, J. Hu, Y. Yang, Y. Guo, Y. Yang, Y. Li, Y. Yuan, N. Chen, J. Shi, Bioactive neolignans and lignans from the bark of Machilus robusta, Journal of Natural Products, 2011, 74 (6), 1444-1452. [51] H.J. Park, J.C. Lee, Efficient and solvent-free preparation of formate esters from alcohols under microwave irradiation, Bulletin of the Korean Chemical Society, 2008, 29 (4), 856-858. [52] Y.-W. Chin, H.-B. Chai, W.J. Keller, A.D. Kinghorn, Lignans and other constituents of the fruits of Euterpe oleracea (Açai) with antioxidant and cytoprotective activities, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56 (17), 7759-7764. [53] Z.-H. Jiang, T. Tanaka, M. Sakamoto, T. Jiang, I. Kouno, Studies on a medicinal parasitic plant: Lignans from the stems of Cynomorium songaricum, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2001, 49 (8), 1036-1038. [54] H.J. Kim, E.-R. Woo, H. Park, A novel lignan and flavonoids from Polygonum aviculare, Journal of Natural Products, 1994, 57 (5), 581-586. [55] Q. Wen, X. Lin, Y. Liu, X. Xu, T. Liang, N. Zheng, Kintoko, R. Huang, Phenolic and lignan glycosides from the butanol extract of Averrhoa carambola L. root, Molecules, 2012, 17 (10), [56] K. Ohashi, H. Watanabe, Y. Okumura, T. Uji, I. Kitagawa, Indonesian medicinal plants. XII. Four isomaric lignan-glucosides from the bark of Aegle marmelos (Rutaceae), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1994, 42 (9), 1924- 1926. [57] J. Bicker, F. Petereit, A. Hensel, Proanthocyanidins and a phloroglucinol derivative from Rumex acetosa L., Fitoterapia, 2009, 80 (8), 483-495. [58] E. Hiltunen, T.T. Pakkanen, L. Alvila, Phenolic compounds in silver birch (Betula pendula Roth) wood, Holzforschung, 2006, 60 (5), 519-527. 166 [59] S. Watanabe, I. Hashimoto, K. Hayashi, K. Yagi, T. Asai, H. Knapp, M. Straubinger, P. Winterhalter, N. Watanabe, Isolation and identification of 2- phenylethyl disaccharide glycosides and mono glycosides from rose flowers, and their potential role in scent formation, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2001, 65 (2), 442-445. [60] S. Klick, K. Herrmann, Glucosides and glucose esters of hydroxybenzoic acids in plants, Phytochemistry, 1988, 27 (7), 2177-2180. [61] Q. Ma, H. Xie, Y. Jiang, X. Wei, Phenolics and sesquiterpenes from Litchi pericarp, Journal of Functional Foods, 2014, 9 156-161. [62] N. Hirai, S. Kondo, H. Ohigashi, Deuterium-labeled phaseic acid and dihydrophaseic acids for internal standards, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2003, 67 (11), 2408-2415. [63] N.J. Carrington, G. Vaughan, B.V. Milborrow, β-D-glucopyranosyl phaseic acid from shoots of Lycopersicon esculentum, Phytochemistry, 1988, 27 (3), 673- 676. [64] Y. Zhang, S. Nakamura, Y. Pongpiriyadacha, H. Matsuda, M. Yoshikawa, Absolute structures of new megastigmane glycosides, foliasalaciosides E(1), E(2), E(3), F, G, H, and I from the leaves of Salacia chinensis, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2008, 56 (4), 547-553. [65] S. De Marino, N. Borbone, F. Zollo, A. Ianaro, P. Di Meglio, M. Iorizzi, Megastigmane and phenolic components from Laurus nobilis L. leaves and their inhibitory effects on nitric oxide production, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52 (25), 7525-7531. [66] H. Otsuka, M. Yao, K. Kamada, Y. Takeda, Alangionosides G-M: glycosides of megastigmane derivatives from the leaves of Alangium premnifolium, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1995, 43 (5), 754-759. [67] G.-P. Li;, J.-F. Zhao;, Y.-Q. Tu;, X.-D. Yang;, H.-B. Zhang;, a.L. Li, Chemical constituenrs of Schisandra rubriflora Refd. Et Wils., Journal of Integrative Plant Biology, 2005, 47 (3), 362−367. [68] G.-P. Li, J.-F. Zhao, Y.-Q. Tu, X.-D. Yang, H.-B. Zhang, L. Li, Chemical constituents of Schisandra rubriflora Rehd. et Wils, Journal of Integrative Plant Biology, 2005, 47 (3), 362-367. 167 [69] J.X. Ma, M.S. Lan, S.J. Qu, J.J. Tan, H.F. Luo, C.H. Tan, D.Y. Zhu, Arylnaphthalene lignan glycosides and other constituents from Phyllanthus reticulatus, Journal of Asian natural products research, 2012, 14 (11), 1073-1077. [70] R.R. King, L.A. Calhoun, Characterization of cross-linked hydroxycinnamic acid amides isolated from potato common scab lesions, Phytochemistry, 2005, 66 (20), 2468-2473. [71] L. Jiang, H. Kojima, K. Yamada, A. Kobayashi, K. Kubota, Isolation of some glycosides as aroma precursors in young leaves of japanese pepper (Xanthoxylum piperitum DC.), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49 (12), 5888- 5894. [72] Y.-L. Li, J.-G. Zhang, P. Yu, B.-L. Ke, J. Ye, X.-W. Yang, H.-Z. Jin, W.-D. Zhang, New monoterpenes, diterpenes, and lignans from Abies recurvata, Planta medica, 2012, 78 (14), 1574-1578. [73] Y. Zhang, C. Tang, S.V.T. Sob, C. Ke, Y. Ye, Two new cyclopeptides from Podocarpus nagi, Chinese Journal of Chemistry, 2012, 30 (6), 1361-1364. [74] M.A. Zarga, S. Sabri, A. Al-Aboudi, M.S. Ajaz, N. Sultana, R. Atta ur, New cyclopeptide alkaloids from Zizyphus lotus, Journal of Natural Products, 1995, 58 (4), 504-511. [75] K.K. Julich-Gruner, O. Kataeva, A.W. Schmidt, H.-J. Knölker, Total synthesis of 7- and 8-oxygenated pyrano[3,2-a]carbazole and pyrano[2,3-a]carbazole alkaloids via boronic acid-catalyzed annulation of the pyran ring, Chemistry – A European Journal, 2014, 20 (28), 8536-8540. [76] C. Ito, H. Ohta, H.T.W. Tan, H. Furukawa, Constituents of Clausena excavata. Isolation and structural elucidation of seven new carbazole alkaloids and a new coumarin, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1996, 44 (12), 2231-2235. [77] C. Ito, S. Katsuno, H. Ohta, M. Omura, I. Kajiura, H. Furukawa, Constituents of Clausena excavata. Isolation and structural elucidation of new carbazole alkaloids, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1997, 45 (1), 48-52. [78] T. Thongthoom, U. Songsiang, C. Phaosiri, C. Yenjai, Biological activity of chemical constituents from Clausena harmandiana, Archives of Pharmacal Research, 2010, 33 (5), 675-680. 168 [79] C. Chaichantipyuth, S. Pummangura, K. Naowsaran, D. Thanyavuthi, J.E. Anderson, J.L. McLaughlin, Two new bioactive carbazole alkaloids from the root bark of Clausena harmandiana, Journal of Natural Products, 1988, 51 (6), 1285- 1288. [80] T. Thongthoom, P. Promsuwan, C. Yenjai, Synthesis and cytotoxic activity of the heptaphylline and 7-methoxyheptaphylline series, European Journal of Medicinal Chemistry, 2011, 46 (9), 3755-3761. [81] J.O. Kokwaro, I. Messana, C. Galeffi, M. Patamia, G.B.M. Bettolo, Research on African medicinal plants, Planta medica, 1983, 47 (04), 251-253. [82] R.D.H. Murray, T.C. Hogg, Synthesis of the coumarin, toddaculin, Tetrahedron letters, 1972, 2 185-186. [83] T. Nakamura, N. Kodama, Y. Arai, T. Kumamoto, Y. Higuchi, C. Chaichantipyuth, T. Ishikawa, K. Ueno, S. Yano, Inhibitory effect of oxycoumarins isolated from the Thai medicinal plant Clausena guillauminii on the inflammation mediators, iNOS, TNF-α, and COX-2 expression in mouse macrophage RAW 264.7, Journal of Natural Medicines, 2009, 63 (1), 21-27. [84] E. Melliou, P. Magiatis, S. Mitaku, A.-L. Skaltsounis, E. Chinou, I. Chinou, Natural and synthetic 2,2-dimethylpyranocoumarins with antibacterial activity, Journal of Natural Products, 2005, 68 (1), 78-82. [85] K. Nakano, K. Nishizawa, I. Takemoto, K. Murakami, Y. Takaishi, T. Tomimatsu, Flavonol and phenylpropanoid glycosides from Lilium cordatum, Phytochemistry, 1989, 28 (1), 301-303. [86] R.R. Stange Jr, J.J. Sims, S.L. Midland, R.E. McDonald, Isolation of a phytoalexin, trans-p-coumaryl aldehyde, from Cucurbita maxima, Cucurbitaceae, Phytochemistry, 1999, 52 (1), 41-43. [87] L. Pouységu, T. Sylla, T. Garnier, L.B. Rojas, J. Charris, D. Deffieux, S. Quideau, Hypervalent iodine-mediated oxygenative phenol dearomatization reactions, Tetrahedron, 2010, 66 (31), 5908-5917. [88] N.X. Nhiem, N.T.T. Hien, B.H. Tai, H.L.T. Anh, D.T.T. Hang, T.H. Quang, P.V. Kiem, C.V. Minh, W. Ko, S. Lee, H. Oh, S.H. Kim, Y.H. Kim, New ent- kauranes from the fruits of Annona glabra and their inhibitory nitric oxide 169 production in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2015, 25 (2), 254-258. [89] H.A. Priestap, A.E. Velandia, J.V. Johnson, M.A. Barbieri, Secondary metabolite uptake by the Aristolochia-feeding papilionoid butterfly Battus polydamas, Biochemical Systematics and Ecology, 2012, 40 126-137. [90] D.C. Burns, D.A. Ellis, R.E. March, A predictive tool for assessing 13C NMR chemical shifts of flavonoids, Magnetic Resonance in Chemistry, 2007, 45 (10), 835-845. [91] C.-N. Lin, S.-H. Kuo, M.-I. Chung, F.-N. Ko, C.-M. Teng, A new flavone C- glycoside and antiplatelet and vasorelaxing flavones from Gentiana arisanensis, Journal of Natural Products, 1997, 60 (8), 851-853. [92] M.H. Lee, Y.K. Son, Y.N. Han, Tissue factor inhibitory flavonoids from the fruits of Chaenomeles sinensis, Archives of Pharmacal Research, 2002, 25 (6), 842- 850. [93] M.V. Bahia, J.P. David, J.M. David, Occurrence of biflavones in leaves of Caesalpinia pyramidalis specimens, Química Nova, 2010, 33 (6), 1297-1300. [94] H. Kanho, S. Yaoya, N. Kawahara, T. Nakane, Y. Takase, K. Masuda, M. Kuroyanagi, Biotransformation of benzaldehyde-type and acetophenone-type derivatives by pharbitis nil hairy roots, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2005, 53 (4), 361-365. [95] Y.-X. Li, X. Yu, S.-J. Yu, A.-Y. Ma, Z.-W. Deng, W.-H. Lin, Phenolic glucopyranosides from the Chinese mangrove plant Excoecaria agallocha L., Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2010, 19 256–259. [96] K. Takara, D. Matsui, K. Wada, T. Ichiba, Y. Nakasone, New antioxidative phenolic glycosides isolated from Kokuto non-centrifuged cane sugar, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2002, 66 (1), 29-35. [97] H.-G. Jin, A.R. Kim, H.J. Ko, E.-R. Woo, A new megastigmane glycoside from Akebia quinata, Archives of Pharmacal Research, 2015, 38 (5), 591-597. [98] M.D. Greca, M. Ferrara, A. Fiorentino, P. Monaco, L. Previtera, Antialgal compounds from Zantedeschia aethiopica, Phytochemistry, 1998, 49 (5), 1299- 1304. 170 [99] Y.D. Min, S.U. Choi, K.R. Lee, Aporphine alkaloids and their reversal activity of multidrug resistance (MDR) from the stems and rhizomes of Sinomenium acutum, Archives of Pharmacal Research, 2006, 29 (8), 627632. [100] S. Elmore, Apoptosis: A review of programmed cell death, Toxicologic pathology, 2007, 35 (4), 495-516.