Luận án Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit lamp ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng

from Vientiane Province, Lao PDR", Parasit Vectors, 7, tr. 551. 48. T. T. Zhao, Y. J. Feng, P. N. Doanh và các cộng sự. (2021), "Model- based spatial-temporal mapping of opisthorchiasis in endemic countries of Southeast Asia", Elife, 10. 49. W. P. P. Aung, T. T. Htoon, H. H. Tin và các cộng sự. (2017), "First report and molecular identification of Opisthorchis viverrini infection in human communities from Lower Myanmar", PLoS One, 12(5), tr. e0177130. 50. W. M. Sohn, B. K. Jung, S. J. Hong và các cộng sự. (2019), "Low-Grade Endemicity of Opisthorchiasis, Yangon, Myanmar", Emerg Infect Dis, 25(7), tr. 1435-1437. 51. P. Sithithaworn, R. H. Andrews, V. D. Nguyen và các cộng sự. (2012), "The current status of opisthorchiasis and clonorchiasis in the Mekong Basin", Parasitol Int, 61(1), tr. 10-6. 52. O. S. Fedorova, M. M. Fedotova, O. I. Zvonareva và các cộng sự. (2020), "Opisthorchis felineus infection, risks, and morbidity in rural Western Siberia, Russian Federation", PLoS Negl Trop Dis, 14(6), tr. e0008421. 53. O. S. Fedorova, M. M. Fedotova, T. S. Sokolova và các cộng sự. (2018), "Opisthorchis felineus infection prevalence in Western Siberia: A review of Russian literature", Acta Trop, 178, tr. 196-204. 54. O. S. Fedorova, Y. V. Kovshirina, A. E. Kovshirina và các cộng sự. (2017), "Opisthorchis felineus infection and cholangiocarcinoma in the Russian Federation: A review of medical statistics", Parasitol Int, 66(4), tr. 365-371. 55. M. Y. Pakharukova và V. A. Mordvinov (2016), "The liver fluke Opisthorchis felineus: biology, epidemiology and carcinogenic potential", Trans R Soc Trop Med Hyg, 110(1), tr. 28-36. 56. R. J. Traub, J. Macaranas, M. Mungthin và các cộng sự. (2009), "A new PCR-based approach indicates the range of Clonorchis sinensis now extends to Central Thailand", PLoS Negl Trop Dis, 3(1), tr. e367. 57. M. B. Qian, Y. D. Chen, S. Liang và các cộng sự. (2012), "The global epidemiology of clonorchiasis and its relation with cholangiocarcinoma", Infect Dis Poverty, 1(1), tr. 4. 58. N. V. De, K. D. Murrell, D. Cong le và các cộng sự. (2003), "The food- borne trematode zoonoses of Vietnam", Southeast Asian J Trop Med Public Health, 34 Suppl 1, tr. 12-34. 59. Nguyễn Văn Đề và Lê Khánh Thuận (2004), Sán lá gan, NXB Y học, Hà Nội. 60. Nguyễn Văn Chương (1994), Nghiên cứu một số đặc điểm của ổ bệnh sán lá gan nhỏ mới được phát hiện ở ven biển miền Trung Việt Nam. 61. Chuong NV và Tuan BV (2012), Infection situation and small liver fluke species in Thuan Hanh commune, Dak Song district, Dak Nong province, Record of Scientific Research Works, Ho Chi Minh Institute of Malariology, Parasitology and Entomology. 62. Viện sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương (2019), Báo cáo tổng kết công tác phòng chống sốt rét, ký sinh trùng - côn trùng năm 2019 và triển khai kế hoạch năm 2020. 63. Đoàn Thúy Hòa (2020), Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ, thành phần loài sán lá gan nhỏ, sán lá ruột nhỏ tại hai huyện Kim Sơn và Yên Khánh, tỉnh Ninh Bình (2016-2019), Luận án Tiến sỹ y học, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng trung ương. 64. Nguyễn Văn Chương, Bùi Văn Tuấn và Triệu Nguyên Trung và cộng sự (2008), "Tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini sau thời gian can thiệp tại hai tỉnh Phú Yên và Bình Định", Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, 1, tr. 78–83. 65. T. T. Dao, T. V. Bui, E. N. Abatih và các cộng sự. (2016), "Opisthorchis viverrini infections and associated risk factors in a lowland area of Binh Dinh Province, Central Vietnam", Acta Trop, 157, tr. 151-7. 66. Abhay R. Satoskar, Simon G.L., Hotez P.J. và các cộng sự. (2009), Medical parasitology, CRC Press. 67. V. Bouvard, R. Baan, K. Straif và các cộng sự. (2009), "A review of human carcinogens--Part B: biological agents", Lancet Oncol, 10(4), tr. 321-2. 68. Toledo R và Fried B. (2019), Digenetic Trematodes, Advances in Experimental Medicine and Biology, Cham, Springer International Publishing. 69. Organization World Health (1991), Basic laboratory methods in medical parasitology, chủ biên, World Health Organization, Geneva. 70. "Prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis" (2002), World Health Organ Tech Rep Ser, 912, tr. i-vi, 1-57, back cover. 71. L. Charoensuk, I. Subrungruang, M. Mungthin và các cộng sự. (2019), "Comparison of stool examination techniques to detect Opisthorchis viverrini in low intensity infection", Acta Trop, 191, tr. 13-16. 72. S. T. Hong và Y. Fang (2012), "Clonorchis sinensis and clonorchiasis, an update", Parasitol Int, 61(1), tr. 17-24. 73. W. Chaicumpa, L. Ybanez, V. Kitikoon và các cộng sự. (1992), "Detection of Opisthorchis viverrini antigens in stools using specific monoclonal antibody", Int J Parasitol, 22(4), tr. 527-31. 74. Xian-Quan Cai, Hai-Qiong Yu, Rong Li và các cộng sự. (2014), "Rapid detection and differentiation of Clonorchis sinensis and Opisthorchis viverrini using real-time PCR and high resolution melting analysis", TheScientificWorldJournal, 2014, tr. 893981-893981. 75. J. Keiser và J. Utzinger (2009), "Food-borne trematodiases", Clin Microbiol Rev, 22(3), tr. 466-83. 76. T. Notomi, H. Okayama, H. Masubuchi và các cộng sự. (2000), "Loop- mediated isothermal amplification of DNA", Nucleic Acids Res, 28(12), tr. E63. 77. T. Notomi, Y. Mori, N. Tomita và các cộng sự. (2015), "Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects", J Microbiol, 53(1), tr. 1-5. 78. Retrieved from Eiken Genome (2018), The principle of LAMP method, truy cập ngày, tại trang web 79. Huỳnh Hồng Quang (2018), Nghiên cứu ứng dụng quan kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán và phát hiện các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Quy Nhơn, truy cập ngày, tại trang web jsp?area= 58&cat=1101&ID=11471. 80. Y. Arimatsu, Kaewkes, S., Laha, T., Hong, S.J., Sripa, B. ( 2012), "Rapid detection of Opisthorchis viverrini copro-DNA using loop- mediated isothermal amplification (LAMP)", Parasitology International 61, tr. 178–182. 81. T. H. Le, N. T. Nguyen, N. H. Truong và các cộng sự. (2012), "Development of mitochondrial loop-mediated isothermal amplification for detection of the small liver fluke Opisthorchis viverrini (Opisthorchiidae; Trematoda; Platyhelminthes)", J Clin Microbiol, 50(4), tr. 1178-84. 82. S. M. M. Rahman, H. B. Song, Y. Jin và các cộng sự. (2017), "Application of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay targeting cox1 gene for the detection of Clonorchis sinensis in human fecal samples", PLoS Negl Trop Dis, 11(10), tr. e0005995. 83. Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương (2021), Nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ, giun lươn đường ruột tại thực địa, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương. 84. D. M. Naeger, M. P. Kohi, E. M. Webb và các cộng sự. (2013), "Correctly using sensitivity, specificity, and predictive values in clinical practice: how to avoid three common pitfalls", AJR Am J Roentgenol, 200(6), tr. W566-70. 85. R. M. Nishikawa và L. L. Pesce (2013), "Estimating sensitivity and specificity for technology assessment based on observer studies", Acad Radiol, 20(7), tr. 825-30. 86. N. Suksumek, K. Leelawat, S. Leelawat và các cộng sự. (2008), "TaqMan real-time PCR assay for specific detection of Opisthorchis viverrini DNA in Thai patients with hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma", Exp Parasitol, 119(2), tr. 217-24. 87. X. Q. Cai, H. Q. Yu, J. S. Bai và các cộng sự. (2012), "Development of a TaqMan based real-time PCR assay for detection of Clonorchis sinensis DNA in human stool samples and fishes", Parasitol Int, 61(1), tr. 183-6. 88. W. Maleewong, P. Intapan, S. Wongwajana và các cộng sự. (1992), "Prevalence and intensity of Opisthorchis viverrini in rural community near the Mekong River on the Thai-Laos border in northeast Thailand", J Med Assoc Thai, 75(4), tr. 231-5. 89. Luơng Thị Phương Lan (2016), Đánh giá hiệu quả can thiệp cộng đồng phòng chống nhiễm sán lá gan nhỏ của người dân tại thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định năm 2009 - 2012, Luận án Tiến sỹ Y Tế Công cộng, Đại học Y Tế công cộng. 90. Rafael Fried Bernard Toledo (2014), Digenetic trematodes. 91. Ngọ Văn Thanh Vũ Hồng Cương, Nguyễn Thị Lệ và cộng sự (2015. ), Đánh giá thực trạng nhiễm sán lá trên người, một số yếu tố liên quan nhiễm bệnh và đề xuất giải pháp phòng chống tại vùng ven biển tỉnh Thanh Hóa, năm 2014, Sở Khoa học và Công nghệ Thanh Hóa. 92. Bui Thi Dung, Henry Madsen và Dang Tat The (2010), "Distribution of freshwater snails in family-based VAC ponds and associated waterbodies with special reference to intermediate hosts of fish-borne zoonotic trematodes in Nam Dinh Province, Vietnam", Acta Tropica, 116(1), tr. 15-23. 93. H. M. Nguyen, Y. V. Tatonova và H. Madsen (2018), "Infections by Hepatic Trematodes in Cats from Slaughterhouses in Vietnam", J Parasitol, 104(3), tr. 306-309. 94. N. T. T. Phi, T. T. B. Nguyen, T. T. H. Le và các cộng sự. (2022), "Foodborne zoonotic trematode infections in Yen Bai, Vietnam: a situational analysis on knowledge, attitude, and practice (KAP) and risk behaviors", J Prev Med Hyg, 63(2), tr. E310-e319. 95. V. T. Phan, A. K. Ersbøll, D. T. Do và các cộng sự. (2011), "Raw-fish- eating behavior and fishborne zoonotic trematode infection in people of northern Vietnam", Foodborne Pathog Dis, 8(2), tr. 255-60. 96. A. Yajima, D. T. Cong, D. D. Trung và các cộng sự. (2009), "Cost comparison of rapid questionnaire screening for individuals at risk of clonorchiasis in low- and high-prevalence communities in northern Vietnam", Trans R Soc Trop Med Hyg, 103(5), tr. 447-51. 97. X. Meng, Y. Jian-Hai, C. Sheng-Kui và các cộng sự. (2019), "[Comparison of efficiency of Kato-Katz technique and PCR assay for detecting Clonorchis sinensis infection]", Zhongguo Xue Xi Chong Bing Fang Zhi Za Zhi, 31(2), tr. 165-168. 98. Y. I. Jeong, H. E. Shin, S. E. Lee và các cộng sự. (2016), "Prevalence of Clonorchis sinensis Infection among Residents along 5 Major Rivers in the Republic of Korea", Korean J Parasitol, 54(2), tr. 215-9. 99. Pacific World Health Organization. Regional Office for the Western (2008), Review on the epidemiological profile of helminthiases and their control in the Western Pacific region, 1997-2008, WHO Regional Office for the Western Pacific, Manila. 100. Jitrada Boondit, Picha Suwannahitatorn, Suradej Siripattanapipong và các cộng sự. (2020), "An Epidemiological Survey of Opisthorchis viverrini Infection in a Lightly Infected Community, Eastern Thailand", The American journal of tropical medicine and hygiene, 102(4), tr. 838-843. 101. S. Han, X. Zhang, J. Wen và các cộng sự. (2012), "A combination of the Kato-Katz methods and ELISA to improve the diagnosis of clonorchiasis in an endemic area, China", PLoS One, 7(10), tr. e46977. 102. Ngọ Văn Thanh (2016), Thực trạng nhiễm sán lá truyền qua cá trên người, yếu tố liên quan và hiệu quả một số giải pháp can thiệp tại huyện Nga Sơn, Thanh Hóa, năm 2013-2014, Đại học Y Hà Nội. 103. D. S. Park, S. J. Na, S. H. Cho và các cộng sự. (2014), "Prevalence and risk factors of clonorchiasis among residents of riverside areas in Muju- gun, Jeollabuk-do, Korea", Korean J Parasitol, 52(4), tr. 391-7. 104. Y. Huang, D. Huang, Y. Geng và các cộng sự. (2017), "An Integrated Control Strategy Takes Clonorchis sinensis Under Control in an Endemic Area in South China", Vector Borne Zoonotic Dis, 17(12), tr. 791-798. 105. Nguyễn Văn Thọ và Nguyễn Thị Hoàng Yến Trần Văn Quyên (2012), "Một số đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá gan nhỏ do Clonorchis sinensis", Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 106. T. K. Tran, K. D. Murrell, H. Madsen và các cộng sự. (2009), "Fishborne zoonotic trematodes in raw fish dishes served in restaurants in Nam Dinh Province and Hanoi, Vietnam", J Food Prot, 72(11), tr. 2394-9. 107. J. Hedegaard Clausen, H. Madsen, K. D. Murrell và các cộng sự. (2012), "Prevention and control of fish-borne zoonotic trematodes in fish nurseries, Vietnam", Emerg Infect Dis, 18(9), tr. 1438-45. 108. N. M. Hung, T. Dung do, N. T. Lan Anh và các cộng sự. (2015), "Current status of fish-borne zoonotic trematode infections in Gia Vien district, Ninh Binh province, Vietnam", Parasit Vectors, 8, tr. 21. 109. T. C. Dang, A. Yajima, V. K. Nguyen và các cộng sự. (2008), "Prevalence, intensity and risk factors for clonorchiasis and possible use of questionnaires to detect individuals at risk in northern Vietnam", Trans R Soc Trop Med Hyg, 102(12), tr. 1263-8. 110. S. Wongratanacheewin, W. Pumidonming, R. W. Sermswan và các cộng sự. (2002), "Detection of Opisthorchis viverrini in human stool specimens by PCR", J Clin Microbiol, 40(10), tr. 3879-80. 111. Y. Arimatsu, S. Kaewkes, T. Laha và các cộng sự. (2015), "Specific diagnosis of Opisthorchis viverrini using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) targeting parasite microsatellites", Acta Trop, 141(Pt B), tr. 368-71. 112. M. Hu và R. B. Gasser (2006), "Mitochondrial genomes of parasitic nematodes--progress and perspectives", Trends Parasitol, 22(2), tr. 78-84. 113. LTD FIND – EIKEN Chemical co (2012), "Manual of Standard Operating Proceduce for malaria LAMP. 30 p". 114. P. Gill và A. Ghaemi (2008), "Nucleic acid isothermal amplification technologies: a review", Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 27(3), tr. 224-43. 115. New England BioLab, "Typical LAMP Protocol". 116. S. M. Mazidur Rahman, Hyun Beom Song, Yan Jin và các cộng sự. (2017), "Application of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay targeting cox1 gene for the detection of Clonorchis sinensis in human fecal samples", PLOS Neglected Tropical Diseases, 11(10), tr. e0005995. 117. M. X. Chen, L. Ai, R. L. Zhang và các cộng sự. (2011), "Sensitive and rapid detection of Paragonimus westermani infection in humans and animals by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)", Parasitol Res, 108(5), tr. 1193-8. 118. L. Ai, C. Li, H. M. Elsheikha và các cộng sự. (2010), "Rapid identification and differentiation of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay", Vet Parasitol, 174(3-4), tr. 228-33. 119. Nguyễn Thị Hương Bình Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Nguyễn Thu Hương và cộng sự (2020), "Phát triển kỹ thuật LAMP phát hiện sán lá gan lớn Fasciola spp", ạp chí khoa học và công nghệ Việt Nam, T.62(7), tr. 23-28. 120. S. Chen, F. Wang, J. C. Beaulieu và các cộng sự. (2011), "Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification", Appl Environ Microbiol, 77(12), tr. 4008-16. 121. H. Y. Yeh, C. A. Shoemaker và P. H. Klesius (2005), "Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri", J Microbiol Methods, 63(1), tr. 36-44. 122. D. Zhou, J. Guo, L. Xu và các cộng sự. (2014), "Establishment and application of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) system for detection of cry1Ac transgenic sugarcane", Sci Rep, 4, tr. 4912. 123. I. P. Oscorbin, E. A. Belousova, A. I. Zakabunin và các cộng sự. (2016), "Comparison of fluorescent intercalating dyes for quantitative loop- mediated isothermal amplification (qLAMP)", Biotechniques, 61(1), tr. 20-5. 124. M. Goto, E. Honda, A. Ogura và các cộng sự. (2009), "Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue", Biotechniques, 46(3), tr. 167-72. 125. N. W. Lucchi, D. Ljolje, L. Silva-Flannery và các cộng sự. (2016), "Use of Malachite Green-Loop Mediated Isothermal Amplification for Detection of Plasmodium spp. Parasites", PLoS One, 11(3), tr. e0151437. 126. LTD EIKEN Chemical co, " Instructions for Use LoopampTM MALARIA Pan Detection Kit". 127. Nguyễn Văn Chương (2007), Kết quả nghiên cứu các bệnh giun sán tại khu vực miền Trung – Tây Nguyên giai đoạn 1989-2006, định hướng chiến lược phòng chống giun sán 2007-2010, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học 2001-2006, tr. 402-409. PHỤ LỤC 1 BỘ CÂU HỎI PHỎNG VẤN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Họ và tên người được phỏng vấn:............................. Ngày phỏng vấn:....................................................... Địa chỉ: Phần I: Thông tin chung về đối tượng nghiên cứu Q1 Tuổi (ghi rõ số tuổi) ............./................./......... Q2 Giới Nam Nữ 1 0 Q3 Nghề nghiệp Nông dân Công nhân Cán bộ, công chức, hưu trí Khác (Đi học, buôn bán,) 1 2 3 4 Q4 Trình độ học vấn Tiểu học Trung học cơ sở Trung học Phổ thông Trung học chuyên nghiệp, Cao đẳng, Đại học (THCN, CĐ, ĐH) 1 2 3 4 Phần II: Đặc điểm gia đình của đối tượng nghiên cứu Q5 Nhà tiêu hợp vệ sinh (Nhà vệ sinh 2 ngăn, tự hoại, có nước,) Có Không 1 2 Q6 Sử dụng phân tươi (người/động vật) để nuôi cá, trồng trọt Có Không 1 2 Q7 Có ao nuôi cá không? Có Không 1 2 Q8 Có nuôi chó, mèo không Có Không 1 2 Phần III: Tình hình tiếp xúc với nguồn lây nhiễm Q9 Tiền sử ăn gỏi cá (sống) Đã từng ăn gỏi cá (sống) Không ăn 1 0 Q10 Tần suất ăn gỏi cá (sống) Ít nhất 1 lần/1 tuần Ít nhất 1 lần/1 tháng 2-3 lần/6 tháng 1 2 3 Q11 Lý do ăn gỏi cá (sống) Vì nó tốt cho sức khỏe Vì nó ngon Do thói quen 1 2 3 Q12 Nguồn cá sử dụng chế biến gỏi cá (sống)? Từ ao của gia đình Từ ao của hàng xóm Cá từ sông hoặc kênh Mua cá ngoài chợ (thị trường) 1 2 3 4 Cảm ơn đối tượng đã trả lời phỏng vấn! NGƯỜI PHỎNG VẤN (Ký và ghi rõ họ tên) PHỤ LỤC 2 Bảng pha loãng dãy nồng độ dùng để khảo sát ngưỡng phát hiện của kít LAMP chẩn đoán O. viverrini TT Nồng độ ban đầu (ng/μl) Số bản sao gen ban đầu (bản sao gen/μl) Lượng plasmid sử dụng (μl) Lượng nước sử dụng (μl) Nồng độ cuối (ng/μl) Số bản sao gen (bản sao gen/μl) Mã số ống mẫu chuẩn dương 1 4 µg 3,08x1010 Toàn bộ 40 1x102 3,08x1010 OVP-0 2 1x102 3,08x1010 5 495 1x100 3,08x108 OVP-1 3 1x100 3,08x108 5 495 1x10-2 3,08x106 OVP-2 4 1x10-2 3,08x106 5 45 1x10-3 3,08x105 OVP-3 5 1x10-3 3,08x105 50 450 1x10-4 3,08x104 OVP-4 6 1x10-4 3,08x104 50 450 1x10-5 3,08x103 OVP-5 7 1x10-5 3,08x103 50 450 1x10-6 3,08x102 OVP-6 8 1x10-6 3,08x102 50 450 1x10-7 3,08x101 OVP-7 9 1x10-7 3,08x101 50 50 5x10-8 1,54x101 OVP-8 10 5x10-8 1,54x101 50 50 2,5x10-8 0,77x101 OVP-9 11 1x10-7 3,08x101 50 450 1x10-8 3,08x100 OVP-10 12 1x10-8 3,08x100 50 450 1x10-9 3,08x10-1 OVP-11 13 1x10-9 3,08x10-1 50 450 1x10-10 3,08x10-2 OVP-12 14 1x10-10 3,08x10-2 50 450 1x10-11 3,08x10-3 OVP-13 Bảng pha loãng dãy nồng độ dùng để khảo sát ngưỡng phát hiện của kít LAMP chẩn đoán C. sinensis TT Nồng độ ban đầu (ng/μl) Số bản sao gen ban đầu (bản sao gen/μl) Lượng plasmid sử dụng (μl) Lượng nước sử dụng (μl) Nồng độ cuối (ng/μl) Số bản sao gen (bản sao gen/μl) Mã số ống mẫu chuẩn dương 1 4 µg 3,06x1010 Toàn bộ 40 1x102 3,06x1010 CSP-0 2 1x102 3,06x1010 5 495 1x100 3,06x108 CSP-1 3 1x100 3,06x108 5 495 1x10-2 3,06x106 CSP-2 4 1x10-2 3,06x106 5 45 1x10-3 3,06x105 CSP-3 5 1x10-3 3,06x105 50 450 1x10-4 3,06x104 CSP-4 6 1x10-4 3,06x104 50 450 1x10-5 3,06x103 CSP-5 7 1x10-5 3,06x103 50 450 1x10-6 3,06x102 CSP-6 8 1x10-6 3,06x102 50 450 1x10-7 3,06x101 CSP-7 9 1x10-7 3,06x101 50 50 5x10-8 1,53x101 CSP-8 10 5x10-8 1,53x101 50 50 2,5x10-8 0,765x101 CSP-9 11 1x10-7 3,06x101 50 450 1x10-8 3,06x100 CSP-10 12 1x10-8 3,06x100 50 450 1x10-9 3,06x10-1 CSP-11 13 1x10-9 3,06x10-1 50 450 1x10-10 3,06x10-2 CSP-12 14 1x10-10 3,06x10-2 50 450 1x10-11 3,06x10-3 CSP-13 PHỤ LỤC 3 Bảng 1. Các trình tự gen nad1 trên ngân hàng gen NCBI sử dụng cho thiết kế bộ mồi LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini. No Chủng/Nguốc gốc Mã số trên ngân hàng gen 1 Opthorchis viverrini, Việt Nam MF287778.1 2 Opthorchis viverrini, Việt Nam DQ882172.1 3 Opthorchis viverrini, Việt Nam DQ882173.1 4 Opthorchis viverrini, Việt Nam DQ882174.1 5 Opthorchis viverrini, Lào GQ401038.1 6 Opthorchis viverrini, Lào DQ882175.1 7 Opthorchis viverrini, Lào GQ401046.1 8 Opthorchis viverrini, Lào GQ401077.1 9 Opthorchis viverrini, Lào GQ401059.1 10 Opthorchis viverrini, Lào GQ401030.1 11 Opthorchis viverrini, Lào GQ401053.1 12 Opthorchis viverrini, Lào GQ401052.1 13 Opthorchis viverrini, Lào GQ401033.1 14 Opthorchis viverrini, Lào GQ401029.1 15 Opthorchis viverrini, Lào GQ401025.1 16 Opthorchis viverrini, Lào GQ401050.1 17 Opthorchis viverrini, Lào GQ401042.1 18 Opthorchis viverrini, Lào GQ401041.1 19 Opthorchis viverrini, Lào GQ401037.1 20 Opthorchis viverrinii, Lào GQ401040.1 21 Opthorchis viverrini, Thái Lan MF287781.1 22 Opthorchis viverrini, Thái Lan EU022347.1 23 Opthorchis viverrini, Thái Lan DQ119551.1 24 Opthorchis viverrini, Thái Lan EU022349.1 25 Opthorchis viverrini, Thái Lan EU022343.1 26 Opthorchis viverrini, Thái Lan EU022337.1 27 Opthorchis viverrini, Thái Lan GQ401098.1 28 Opthorchis viverrini, Campuachia GQ401087.1 29 Opthorchis viverrini, Campuachia GQ401085.1 30 Opthorchis viverrini, Campuachia GQ401095.1 Hình 1. Ảnh phân tích trình tự gen Nad1 của O. viverrini bằng phần mềm Bioedit v.2.6.7 Bảng 2. Các trình tự gen Nad1 trên ngân hàng gen sử dụng cho thiết kế bộ mồi LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis. No Chủng/Nguốc gốc Mã số trên ngân hàng gen 1 Clonorchis sinensis, Việt Nam MF287784.1 2 Clonorchis sinensis, Trung Quốc FJ965413.1 3 Clonorchis sinensis, Trung Quốc FJ965415.1 4 Clonorchis sinensis, Trung Quốc FJ965416.1 5 Clonorchis sinensis, Trung Quốc FJ965417.1 6 Clonorchis sinensis, Trung Quốc FJ965419.1 7 Clonorchis sinensis, Trung Quốc FJ965423.1 8 Clonorchis sinensis, Trung Quốc FJ965427.1 9 Clonorchis sinensis, Trung Quốc FJ965430.1 10 Clonorchis sinensis, Trung Quốc FJ965431.1 11 Clonorchis sinensis, Trung Quốc JN936239.1 12 Clonorchis sinensis, Trung Quốc JN936242.1 13 Clonorchis sinensis, Trung Quốc JN936243.1 14 Clonorchis sinensis, Trung Quốc JN936246.1 15 Clonorchis sinensis, Trung Quốc JN936250.1 16 Clonorchis sinensis, Trung Quốc JN936246.1 17 Clonorchis sinensis, Trung Quốc JN936251.1 18 Clonorchis sinensis, Trung Quốc JN936252.1 19 Clonorchis sinensis, Trung Quốc JN936254.1 20 Clonorchis sinensis, Trung Quốc AF229851.1 21 Clonorchis sinensis, Trung Quốc MT292291.1 22 Clonorchis sinensis, Trung Quốc MT292160.1 23 Clonorchis sinensis, Hàn Quốc JF729304.1 24 Clonorchis sinensis, Hàn Quốc KY564177.1 Hình 2. Ảnh phân tích 24 trình tự gen Nad1 của C. sinensis bằng phần mềm Bioedit v.2.6.7 PHỤ LỤC 4 Bảng 1. Trình tự mồi LAMP thiết kế để chẩn đoán O. viverrini. Số TT Tên mồi Vị trí 5’ Vị trí 3’ Chiều dài mồi (nu) Nhiệt độ nóng chảy Tm (oC) 5'dG 3'dG Tỷ lệ GC Trình tự mồi 1 F3 53 70 18 57.40 -6.73 -4.41 0.50 GTGCGTTCTGCATTCAGT 2 B3 222 241 20 56.74 -6.02 -4.90 0.50 CGGAGTACGATTACACTCAC 3 FIP 42 ATTTCCGCACACCAAAGCAC TTTTTCTGTGACCTTTGAGGCT 4 BIP 44 TATGGATCTTTTGTGCTGCTGGT TTTTACCAACCAGTCACACGA F2 71 88 18 57.11 -4.91 -5.93 0.50 TCTGTGACCTTTGAGGCT F1c 114 133 20 61.52 -4.01 -5.40 0.50 ATTTCCGCACACCAAAGCAC B2 198 215 18 57.02 -4.25 -5.74 0.50 TACCAACCAGTCACACGA B1c 134 155 22 60.70 -3.99 -6.25 0.45 TATGGATCTTTTGTGCTGCTGG Bảng 2. Trình tự mồi LAMP thiết kế để chẩn đoán C. sinensis. Số TT Tên mồi Vị trí 5’ Vị trí 3’ Chiều dài mồi (nu) Nhiệt độ nóng chảy Tm (oC) 5'dG 3'dG Tỷ lệ GC Trình tự mồi 1 F3 40 58 19 56.50 -4.51 -4.33 0.47 GTTCAGTGACGCTTTTGTG 2 B3 208 227 20 55.96 -3.24 -4.61 0.45 GTAATCACCACACACCAAAG 3 FIP 48 TATACGACCCCCAACCAACC- GTTGCTTTTAATTACTAGGTTGAC 4 BIP 48 AAGTTTGCTCTTATAAGTTGTGTGC- AATGCACATAAAACAGGCC F2 59 82 24 55.93 -5.40 -4.67 0.33 GTTGCTTTTAATTACTAGGTTGAC F1c 101 120 20 60.96 -4.06 -5.61 0.55 TATACGACCCCCAACCAACC B2 176 194 19 55.78 -4.96 -6.69 0.42 AATGCACATAAAACAGGCC B1c 123 147 25 60.14 -4.01 -6.06 0.36 AAGTTTGCTCTTATAAGTTGTGTGC PHỤ LỤC 5 Hình 1. Kết quả blast tính đặc hiệu của cặp mồi F3-B3 của O. viverrini trên NCBI. Hình 2. Kết quả blast tính đặc hiệu của cặp mồi F3-B3 của C.sinensis trên NCBI. PHỤ LỤC 6 Kết quả so sánh độ tương đồng giữa sản phẩm PCR F3-B3 với trình tự gen ty thể của sán lá gan nhỏ trên ngân hàng gen. L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PHỤ LỤC 7 KHẢO SÁT, TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG LAMP Trong đó: L: Ladder 100 bp Giếng 1-12: Phản ứng LAMP ở với gradient nhiệt độ bắt cặp mồi từ 59-680C Hình 1. Ảnh điện di sản phẩm khảo sát nhiệt độ ủ mồi của phản ứng LAMP chẩn đoán C. sinensis Hình 2. Sản phẩm LAMP chẩn đoán O. viverrini với các nồng độ betaine thêm vào phản ứng Hình 3. Sản phẩm LAMP chẩn đoán C. sinensis với các nồng độ betaine thêm vào phản ứng Trong đó: L: Thang đo 100 bp 1: Sản phẩm phản ứng LAMP của mẫu chứng âm 2: Sản phẩm LAMP không bổ sung betaine 3: Sản phẩm LAMP bổ sung betaine với nồng độ 0,2 M 4: Sản phẩm LAMP bổ sung betaine với nồng độ 0,4 M 5: Sản phẩm LAMP bổ sung betaine với nồng độ 0,6 M 6: Sản phẩm LAMP bổ sung betaine với nồng độ 0,8 M 7: Sản phẩm LAMP bổ sung betaine với nồng độ 1 M Trong đó: L: Thang đo 100 bp Giếng 1: Chứng âm Giếng 2: Lượng ADN đưa vào là 2 µl Giếng 3: Lượng ADN đưa vào là 3 µl Giếng 4: Lượng ADN đưa vào là 4 µl Giếng 5: Lượng ADN đưa vào là 5 µl Hình 4. Sản phẩm LAMP với lượng ADN tổng số ban đầu đưa vào phản ứng từ 2-5µ/phản ứng PHỤ LỤC 8 Bảng 1. Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện sơ cấp của kít LAMP chẩn đoán O. viverrini Nồng độ (ng/µl) Kết quả Lần 1 Lần 2 Lần 3 1x10-3 (+) (+) (+) 1x10-4 (+) (+) (+) 1x10-5 (+) (+) (+) 1x10-6 (+) (+) (+) 1x10-7 (+) (+) (+) 1x10-8 (-) (-) (-) 1x10-9 (-) (-) (-) 1x10-10 (-) (-) (-) x10-11 (-) (-) (-) Neg1 (-) (-) (-) Bảng 2. Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện sơ cấp của bộ mồi LAMP chẩn đoán C. sinensis Nồng độ (ng/µl) Kết quả Lần 1 Lần 2 Lần 3 1x10-3 (+) (+) (+) 1x10-4 (+) (+) (+) 1x10-5 (+) (+) (+) 1x10-6 (+) (+) (+) 1x10-7 (+) (+) (+) 1x10-8 (-) (-) (-) 1x10-9 (-) (-) (-) 1x10-10 (-) (-) (-) 1x10-11 (-) (-) (-) Neg1 (-) (-) (-) PHỤ LỤC 9 Bảng 1. Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện thứ cấp của bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini TT Nồng độ (ng/μl) Số lượng bản sao gen/µl Số lần lặp lại Số lần dương tính Tỷ lệ dương tính (%) 1 1x10-3 3,08x105 12 12 100 2 1x10-4 3,08x104 12 12 100 3 1x10-5 3,08x103 12 12 100 4 1x10-6 3,08x102 12 12 100 5 1x10-7 3,08x101 12 12 100 6 5x10-8 1,54x101 12 8 66,67 7 2,5x10-8 0,77x101 12 4 33,33 8 1x10-8 3,08x100 12 2 16,67 9 1x10-9 3,08x10-1 12 0 0 10 1x10-10 3,08x10-2 12 0 0 11 1x10-11 3,08x10-3 12 0 0 12 0 0 12 0 0 Bảng 2. Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện thứ cấp của bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis TT Nồng độ (ng/μl) Số lượng bản sao gen/µl Số lần lặp lại Số lần dương tính Tỷ lệ dương tính (%) 1 1x10-3 3,06x105 12 12 100 2 1x10-4 3,06x104 12 12 100 3 1x10-5 3,06x103 12 12 100 4 1x10-6 3,06x102 12 12 100 5 1x10-7 3,06x101 12 12 100 6 5x10-8 1,53x101 12 6 50,00 7 2,5x10-8 0,765x101 12 4 33,33 8 1x10-8 3,06x100 12 2 16,67 9 1x10-9 3,06x10-1 12 0 0 10 1x10-10 3,06x10-2 12 0 0 11 1x10-11 3,06x10-3 12 0 0 12 0 0 12 0 0 PHỤ LỤC 10 Bảng 1. Thông tin trên các ống thành phần của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini STT Nhãn in trên thành ống Nhãn in trên nắp ống Ống 1 Viện Sốt rét – KST - CTTƯ DW - 01 800 µl Lot: OV HSD: . Bảo quản: -250C đến -150C DW - 01 Ống 2 Viện Sốt rét – KST - CTTƯ OV-BM - 02 500 µl Lot: OV HSD: . Bảo quản: -250C đến -150C OB - 02 Ống 3 Viện Sốt rét – KST - CTTƯ OV-PM - 03 140 µl Lot: OV HSD: . Bảo quản: -250C đến -150C OP - 03 Ống 4 Viện Sốt rét – KST - CTTƯ Bst-E- 04 55 µl Lot: OV HSD: . Bảo quản: -250C đến -150C Bst-E- 04 Ống 5 Viện Sốt rét – KST - CTTƯ OV-HNB - 05 55 µl Lot: OV HSD: . Bảo quản: -250C đến -150C OH - 05 Ống 6 Viện Sốt rét – KST - CTTƯ OV-PC - 06 220 µl Lot: OV HSD: . Bảo quản: -250C đến -150C PCV - 06 Bảng 2. Thông tin cụ thể trên các ống thành phần của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis STT Nhãn in trên thành ống Nhãn in trên nắp ống Ống 1 Viện Sốt rét – KST - CTTƯ DW - 01 800 µl Lot: CS HSD: . Bảo quản: -250C đến -150C DW - 01 Ống 2 Viện Sốt rét – KST - CTTƯ CS-BM - 02 400 µl Lot: CS HSD: . Bảo quản: -250C đến -150C CB - 02 Ống 3 Viện Sốt rét – KST - CTTƯ CS-PM - 03 140 µl Lot: CS HSD: . Bảo quản: -250C đến -150C CP - 03 Ống 4 Viện Sốt rét – KST - CTTƯ Bst-E- 04 55 µl Lot: CS HSD: . Bảo quản: -250C đến -150C Bst-E- 04 Ống 5 Viện Sốt rét – KST - CTTƯ CS-HNB - 05 55 µl Lot: CS HSD: . Bảo quản: -250C đến -150C CH - 05 Ống 6 Viện Sốt rét – KST - CTTƯ CS-PC - 06 220 µl Lot: CS HSD: . Bảo quản: -250C đến -150C PCS - 06 PHỤ LỤC 12 PHỤ LỤC 13 PHỤ LỤC 14 PHỤ LỤC 15 PHỤ LỤC 16 HÌNH ẢNH TRỨNG VÀ CON SÁN LÁ GAN NHỎ TRONG PHÂN THU ĐƯỢC TẠI ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Kỹ thuật Kato-Katz Xét nghiệm chẩn đoán SLGN bằng kit LAMP Đãi phân thu SLGN trưởng thành