Luận án Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (pamam) biến tính có khả năng hướng đích đến tế bào ung thư

3 (a ) 2 ( j) 3 (a ) 2 H( C H ) H( C H ) ( C H ) ( C H ) S 0,322 S 2,866 x% .100% .100% 7,00% 32x3H 30x2 H            Số nhóm chuyển hóa: z = x%.32 = 7,00%.32 = 2,24  2 nhóm Khối lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C12-poC đƣợc tính toán nhƣ sau (sử dụng dữ liệu bảng 1.2, bảng 2.3): WtNMR = WtLT(dendrimer PAMAM 2.5) + z. WtLT(dodecylamine) – z. WtLT(MeOH) = 6045 + 2. 185,35 – 2. 32,04146 = 6352 (với dendrimer PAMAM G2.5 = 6045; H = 1,00784; O = 15,9994; C = 12,0107) Các dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C12-60o, G2.5-C12-80oC đƣợc tính toán tƣơng tự và lập thành bảng sau (bảng 3.14). Bảng 3.14: Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với dodecylamine Dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5 ( j) 3 (a ) 2 H( C H ) H( C H ) S S    ( j) 3 ( a ) 2 ( C H ) ( C H ) H H      độ chuyển hóa (x%) số nhóm chuyển hóa (z nhóm) Khối lƣợng phân tử (WtNMR) G2.5-C12-p 0 C 0,322 2,865 32x3 30x2 7,00 2 6352 102 G2.5-C12-60 0 1,117 4,191 32x3 30x2 16,66 5 6809 G2.5-C12-80 0 3,095 5,767 32x3 30x2 33,50 11 7727 Nhìn vào kết quả bảng 3.14 cho thấy, với nhiệt độ khảo sát lần lƣợt là nhiệt độ phòng, 60oC và 80oC của phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với tác nhân dodecylamine thì độ chuyển hóa của dẫn xuất ở 80oC là cao nhất (x ; 33,50 ), số chuyển hóa (n; 11 nhóm). Điều này đƣợc giải thích do phản ứng của dendrimer PAMAM G2.5 với dodecylamine là phản ứng thu nhiệt nên cần cung cấp nhiệt độ để phản ứng xảy ra. Tuy nhiên, ở nhiệt độ cao sản phẩm sẽ bị phân hủy, các tác chất bay hơi ảnh hƣởng đến khả năng thế cũng nhƣ hiệu suất phản ứng. Nhƣ vậy, độ chuyển hóa của dẫn xuất ở 80oC là tốt nhất trong dãy nhiệt độ khảo sát (đồ thị 3.5). Đồ thị 3.5: Kết quả khảo sát biến tính PAMAM G2.5 với dodecylamine theo nhiệt độ 3.2.4.2 Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine (butylamine, ocylamine, decylamine và dodecylamine )ở nhiệt độ 80oC Phổ 1H-NMR dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-C4, G2.5-C8, G2.5-C10 (G2.5-C10-80 o C ) và G2.5-C12 (500 MHz, MeOD, δppm) (phụ lục 20,21,22,19) xuất hiện tín hiệu proton các peak đặc trƣng của hợp chất: -CH2CH2N< (a); - CH2CH2CO- (b); -CH2CH2CONH- (c); -CONHCH2CH2N- (e); -CH2CH2COOCH3 (g); -COOCH3 (h) và -CH3 (j). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của 2 5 11 0 2 4 6 8 10 12 Nhiệt độ phòng 60 80 Dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-dodecylamine Số nhóm chuyển hóa (z) 103 Saovapakhiran , José L. Santos , Julia Morales-Sanfrutos và một số nghiên cứu về dẫn xuất dendrimer PAMAM . Sản phẩm tổng hợp đƣợc dạng sệt màu vàng nhạt, có công thức cấu tạo chung G2.5-(CO-NH-CH2(CH2)nCH3)z (hình 3.13) Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với các alkylamine đƣợc thống kê qua bảng 3.15. Bảng 3.15: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine Vị trí H H của nhóm Độ dịch chuyển hóa học (, ppm) G2.5-C4 G2.5-C8 G2.5-C10 G2.5-C12 a -CH2CH2N- (30 nhóm) 2,63 2,53-2,63 2,54-2,59 2,56-2,62 b -CH2CH2CO- (60 nhóm) 2,78-2,83 2,77-2,83 2,46-2,47 2,74-2,82 c -CH2CH2CONH- (28+z nhóm) 2,47-2,49 2,40 2,37 2,34-2,40 e -CONHCH2CH2- (28+z nhóm) 3,26-3,36 3,18-3,33 3,18-3,33 3,16-3,36 g -CH2CH2COO-CH3 (32-z nhóm) 2,51-2,59 2,47-2,49 2,47-2,49 2,47-2,51 h -COO-CH3 (32-z nhóm) 3,69 3,68-3,71 3,68-3,73 3,68 j -CO-NH-(CH2)n-CH3 (z nhóm) 0,92 0,92 0,90 0,92 Dựa vào độ dịch chuyển của các tín hiệu proton (a) và (j) trên phổ 1H-NMR (phụ lục 20,21,22,19) và áp dụng công thức (công thức 2.2) chúng tôi xác định đƣợc độ chuyển hóa (x ), số nhóm chuyển hóa (z nhóm) và khối lƣợng phân tử (WtNMR) của các dẫn xuất PAMAM G2.5 với alkylamine với: butylamine (sản phẩm: G2.5-C4), ocylamine(sản phẩm: G2.5-C8), decylamine (sản phẩm: G2.5-C10) và dodecylamine (sản phẩm: G2.5-C12). (bảng 3.16). 104 Bảng 3.16: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine Dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5 ( j) 3 (a ) 2 H( C H ) H( C H ) S S    ( j) 3 ( a ) 2 ( C H ) ( C H ) H H      độ chuyển hóa (x%) số nhóm chuyển hóa (z nhóm) Khối lƣợng phân tử (WtNMR) G2.5-C4 1,020 4,635 32x3 30x2 13,75 4 6208 G2.5-C8 0,286 1,894 32x3 30x2 14,38 5 6529 G2.5-C10 0,591 2,019 32x3 30x2 18,29 6 6794 G2.5-C12 3,095 5,767 32x3 30x2 33,50 11 7727 Các kết quả từ bảng 3.16 cho thấy, khả năng phản ứng của các alkylamine tăng dần theo chiều dài mạch cacbon. Điều này xảy ra do hiệu ứng cảm ứng dƣơng (I+) đẩy electron về phía nguyên tử N của các gốc hydrocarbon trong alkylamine làm tăng tính bazơ của amine [95]. Đồ thị 3.6: Kết quả biến tính PAMAM G2.5 với alkylamine 4 5 6 11 0 2 4 6 8 10 12 G2.5-C4 G2.5-C8 G2.5-C10G2.5-C12 Dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-alkylamine Số nhóm chuyển hóa (z) 105 Đây cũng là cơ sở biến tính cho những phản ứng giữa dendrimer PAMAM thế hệ lẻ có các nhóm –COO-CH3 bề mặt với tác nhân có chứa nhóm amine. 3.3 BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM G3.0 VỚI TÁC NHÂN HƢỚNG ĐÍCH – ACID FOLIC 3.4.1 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân hƣớng đích - acid folic Phân tích phổ 1H-NMR chúng tôi đo đƣợc của hợp chất dendrimer PAMAM G3.0-FA cho thấy bên cạnh sự xuất hiện các tín hiệu proton đặc trƣng của dendrimer PAMAM G3.0 còn có các tín hiệu proton đặc trƣng của các nhóm nguyên tử trong phân tử acid folic: k, m, r, p và q, điều này chứng tỏ có sự gắn kết acid folic vào dendrimer PAMAM G3.0 (hình 3.14, hình 3.15). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Durairaj Chandrasekar [79], Hong Zong [78], Yuanqing Zhang [106], Youngseon Choi [76] và một số báo cáo [3, 7, 85, 107]. Sản phẩm PAMAM G3.0-FA thu đƣợc dạng sánh dẻo màu vàng cam. Hình 3.14: Cấu trúc sản phẩm dendrimer PAMAM G 3.0-FA 106 Hình 3.15: Phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-FA Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid folic đƣợc thống kê qua bảng 3.17. Bảng 3.17: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm G3.0-FA Vị trí H H của nhóm Độ dịch chuyển hóa học (, ppm) a -CH2CH2N-(30 nhóm) 2,52 b -CH2CH2CO-(60 nhóm) 2,73-2,79 c -CH2CH2CONH-(60 nhóm) 2,19-2,34 i -CH2CH2CONH-(z nhóm) s -CH2CH(COOH)CO-NH- (z nhóm) d -CH2NH2 (32- z nhóm) 2,62 e -CONHCH2CH2- (60+z nhóm) 3,08-3,22 107 k (z nhóm) 8,54 m (2z nhóm) 7,62-7,63 p (z nhóm) 4,66 q -CH2CH(COOH)CO-NH- (z nhóm) 4,50 r (2z nhóm) 6,73-6,75 Dựa vào độ dịch chuyển của các tín hiệu proton (a) và (k) trên phổ 1H-NMR (hình 3.30), áp dụng công thức xác định đƣợc độ chuyển hóa: (k) (a ) 2 (k) (a ) 2 H( C H ) H( C H ) ( C H ) ( C H ) S 1,000 S 23,402 x% .100% .100% 8,01 32x % 1H 30x2 H              số nhóm chuyển hóa của sản phẩm: z = 8,01%.32  3 nhóm Khối lƣợng phân tử của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-FA: WtNMR = 8179 (với dendrimer PAMAM G3.0 = 6909; C = 12,0107; O = 15,9994; H = 1,00784) 108 Trong phép tính trên, giá trị: ( k ) ( a ) 2 ( C H ) ( C H ) H 32x1 H 30x2        đƣợc thế ứng với 32 nhóm (-CH=) ở vị trí (k), mỗi nhóm có 1 proton H và 30 nhóm methylen (-CH2-) ở vị trí (a), mỗi nhóm có 2 proton H; ứng trong công thức cấu tạo của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA, theo độ chuyển hóa sản phẩm của lý thuyết 100%. Vậy đã có khoảng 3 nhóm folate đƣợc gắn thành công lên bề mặt dendrimer PAMAM G3.0, kết luận sản phẩm: G3.0-(FA)3. Qui trình phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid folic sử dụng chất trung gian EDC khá đơn giản. Quá trình tinh chế sản phẩm sử dụng túi thẩm tách Cellulose MWCO 3.500-5.000D để loại bỏ các phân tử nhỏ. Trên cơ sở các dữ liệu phổ 1H-NMR đã xác định đƣợc độ chuyển hóa (x%; 8,01%), số nhóm chuyển hóa (z; 3 nhóm) và khối lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer (WNMR; 8179). 3.4.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hexanoyl chloride và tác nhân hƣớng đích - acid folic Phân tích phổ 1H-NMR (hình 3.17) của hợp chất dendrimer PAMAM G3.0-C6- FA cho thấy bên cạnh sự xuất hiện các tín hiệu proton đặc trƣng của dendrimer PAMAM G3.0 còn có các tín hiệu proton của các nhóm đặc trƣng của các nhóm nguyên tử trong phân tử acid folic (k, m, r, p và q) và các tín hiệu proton của nhóm alkyl (j) có trong hexanoyl chloride. Điều đó chứng tỏ có sự gắn kết nhóm folate và nhóm hexanoyl vào dendrimer PAMAM G3.0. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Durairaj Chandrasekar [79], Hong Zong [78], Yuanqing Zhang [106], Youngseon Choi [76] và một số báo cáo [3, 7, 85, 107]. Dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6- FA thu đƣợc có màu vàng cam. Công thức cấu tạo dẫn xuất dendrimer PAMAM G 3.0-C6-FA (hình 3.16). 109 Hình 3.16: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G 3.0-C6-FA Hình 3.17: Phổ của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA 110 Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hexanoyl chloride và tác nhân hƣớng đích - acid folic đƣợc thống kê qua bảng 3.18. Bảng 3.18: Dữ liệu phổ 1H-NMR của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA Vị trí H H của nhóm Độ dịch chuyển hóa học (, ppm) a -CH2CH2N-(30 nhóm) 2,52 b -CH2CH2CO-(60 nhóm) 2,81 c -CH2CH2CONH-(60+y nhóm) 2,10-2,34 i -CH2CH2CONH-(z nhóm) s -CH2CH(COOH)CO-NH- (z nhóm) d -CH2NH2 (32- z-ynhóm) 2,73 e -CONHCH2CH2- (60+z+y nhóm) 3,20 k (z nhóm) 8,54 m (2z nhóm) 7,61-7,63 p (z nhóm) 4,70 q -CH2CH(COOH)CO-NH- (z nhóm) 4,48 r 6,71-6,72 111 (2z nhóm) j -NHCO-CH2(CH2)3CH3 (y nhóm) 0,82 Dựa vào độ dịch chuyển của các tín hiệu proton (a) và (j) trên phổ 1H-NMR, áp dụng công thức (công thức 2.2) xác định đƣợc độ chuyển hóa của nhóm hecxanoyl: ( j) 3 (a ) 2 ( j) 3 (a ) 2 H( C H ) H( C H ) ( C H ) ( C H ) S 3,000 S 9,370 x% .100% .100% 20% 32x3H 30x2 H            Số nhóm chuyển hóa hecxanoyl: z = 20%.32  6 nhóm Vậy đã có 6 nhóm hecxanoyl đƣợc gắn lên bề mặt dendrimer PAMAM G3.0. Dựa vào độ dịch chuyển của các tín hiệu proton (a) và (k) trên phổ 1 H-NMR, áp dụng công thức xác định đƣợc độ chuyển hóa nhóm folat: (k) ( a ) 2 (k) ( a ) 2 H( C H ) H( C H ) ( C H ) ( C H ) S 0,406 S 9,370 x% .100% .100% 32x1H 30x2 H 8,01%              z = x%.32 = 8,01%.32 = 2,59  3 nhóm Vậy đã có 3 nhóm folat đƣợc gắn lên bề mặt PAMAM G3.0. Kết luận sản phẩm là G3.0-(C6)6-(FA)3. Khối lƣợng phân tử của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA: WtNMR = WtLT(dendrimer PAMAM 3.0) + 6. WtLT(hexanoyl chloride) – 6. WtLT(HCl) + 3. WtLT(acid folic) – 3. WtLT(nƣớc) = 6909 + 6. 134,60 – 6. 36,46084 + 3. 441,40 – 3. 18,01508 = 8768 Trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu thuộc viện công nghệ nano Michigan và trƣờng đại học Michigan họ đã gắn acid folic lên dendrimer PAMAM G5.0 với tỉ lệ 3:1 và mang lại hiệu quả hƣớng đích nhƣ mong đợi [78]. Từ kết quả thí nghiệm, chúng 112 tôi cũng đã gắn đƣợc 3 phân tử acid folic lên bề mặt dendrimer PAMAM G 3.0. Đây là kết quả khá khả quan cho các nghiên cứu về chất mang thuốc. Quá trình tinh chế sản phẩm sử dụng túi thẩm tách Cellulose MWCO 3.500- 5.000D để loại bỏ các phân tử nhỏ. Trên cơ sở các dữ liệu phổ 1H- NMR đã xác định đƣợc độ chuyển hóa (x ; 8,01 ), số nhóm chuyển hóa (z; 3) và khối lƣợng phân tử của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA (WtNMR; 8768). 3.4 KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO Khả năng ức chế sự tăng trƣởng tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 và các dẫn xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 đã đƣợc thử nghiệm trên các tế bào MCF-7 (Frederick, MD, USA) bằng EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit, tại trƣờng Đại học Ajou, TP. Suwon, Hàn Quốc. Trong thử nghiệm này, chúng tôi đã lựa chọn dendrimer PAMAM 3.0 và 4 dẫn xuất alkyl của dendrimer PAMAM G3.0, với số nguyên tử carbon của mạch alkyl tăng từ 2 đến 14 (dendrimer PAMAM G3.0-C2, G3.0-C6, G3.0-C10 và G3.0-C14) để khảo sát khả năng gây độc tế bào. Đồ thị 3.7: Kết quả thử độc tế bào của PAMAM G3.0, PAMAM G3.0-C2, PAMAM G3.0-C6, PAMAM G3.0-C10 và PAMAM G3.0-C14 trên tế bào MCF-7 113 Qua kết quả thử nghiệm thu đƣợc thể hiện trên đồ thị 3.7, chúng tôi đã chứng minh khi gắn nhóm alkyl lên bề mặt của dendrimer PAMAM 3.0 thì các dẫn chất này có tác dụng làm giảm khả năng gây độc tế bào so với dendrimer PAMAM G3.0. Bên cạnh đó, số lƣợng các nhóm alkyl và chiều dài của mạch carbon cũng ảnh hƣởng đến kết quả độc tính tế bào. Khi so sánh giữa dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C2 (10 nhóm chuyển hóa) với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C14 (11 nhóm chuyển hóa) thì khả năng gây độc tế bào của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C14 giảm đáng kể. Khi số lƣợng các nhóm alkyl càng nhiều càng làm giảm số lƣợng nhóm amine trên bề mặt phân tử dendrimer PAMAM G3.0. Chuỗi carbon càng dài càng làm giảm khả năng gây độc tế bào của dendrimer PAMAM G3.0 do độ che phủ và bao bọc các nhóm amine bề mặt tăng lên làm hạn chế khả năng tƣơng tác với màng tế bào. Độc tính của dendrimer gây ra cho sự tƣơng tác giữa bề mặt điện tích dƣơng của dendrimer PAMAM với màng tế bào tích điện âm, do đó khi làm giảm điện tích dƣơng của bề mặt dendrimer PAMAM bởi các nhóm alkyl sẽ làm giảm độc tính của các dendrimer [35, 36, 57, 71]. Rohit B. Kolhatkar và cộng sự [57] đã chứng minh khả năng gây độc giảm hơn 10 lần khi tăng các nhóm acetyl trên bề mặt dendrimer PAMAM. Báo cáo của Rachaneekorn Jevprasesphant [71] cũng đã cho thấy, khả năng gây độc tế bào của dẫn xuất dendrimer PAMAM giảm đáng kể khi chiều dài mạch carbon tăng lên. 3.5 KẾT QUẢ THÂM NHẬP TẾ BÀO Khả năng thâm nhập tế bào của G3.0-C6-FITC và G3.0-C6-FA-FITC đã đƣợc thử nghiệm trên dòng tế bào Hela bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu (Confocal laser scanning microscopy) tại trƣờng Đại học Ajou, TP. Suwon, Hàn Quốc. Kết quả phân tích bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu (confocal laser scanning microscopy) (hình 3.18). 114 Tế bào đối chứng Tế bào xử lý với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC Tế bào xử lý với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA-FITC Hình 3.18: Kết quả phân tích bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu 115 Qua phân tích hình ảnh thâm nhập tế bào bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu (hình 3.18), chúng tôi nhận thấy các tín hiệu huỳnh quang FITC tích lũy tập trung ở vùng xung quanh nhân tế bào xử lý với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA- FITC có gắn tác nhân hƣớng đích acid folic. Điều này thể hiện khả năng tƣơng tác mạnh với tế bào ung thƣ của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA-FITC có gắn tác nhân hƣớng đích acid folic, chứng minh khả năng hƣớng đích chủ động của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC [2, 25]. Khi quan sát tế bào đối chứng và tế bào đã xử lý với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC không gắn tác nhân hƣớng đích acid folic, chúng tôi nhận thấy tín hiệu huỳnh quang FITC không xuất hiện ở tế bào đối chứng nhƣng có xuất hiện với cƣờng độ thấp ở tế bào xử lý với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC không gắn tác nhân hƣớng đích acid folic, điều này cho thấy khả năng hƣớng đích thụ động của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC. Qua kết quả khảo sát thâm nhập tế bào của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0- C6-FITC và dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA-FITC, chúng tôi đã chứng minh đƣợc khả năng hƣớng đích chủ động của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6- FA-FITC có tác nhân hƣớng đích acid folic và khả năng hƣớng đích thụ động của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC không gắn tác nhân hƣớng đích acid folic. Kết quả trên cũng đã cho thấy khả năng thâm nhập tế bào của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA-FITC có tác nhân hƣớng đích acid folic là tốt hơn so với dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FITC không gắn tác nhân hƣớng đích acid folic. Chứng minh khả năng hƣớng đích của acid folic do tƣơng tác giữa folat với receptor folat chỉ có trên tế bào ung thƣ (khi tế bào tăng sinh mạnh) mà không có ở tế bào bình thƣờng. Đây là ƣu điểm vƣợt trội của chất mang thuốc hƣớng đích. Các nghiên cứu của Kukowska-Latallo JF [32], Youngseon Choi [76] và một số báo cáo [3, 4, 6, 35, 78-81, 103] cũng đã chứng minh khả năng hƣớng đích của chất mang thuốc có gắn tác nhân folate. Kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng của liệu pháp điều trị ung thƣ mới sử dụng các hệ mang thuốc có gắn tác nhân hƣớng đích acid folic. Các hệ mang thuốc này sẽ đến đúng vị trí tế bào ung thƣ thông qua các dấu hiệu chọn lọc (receptor folat), góp phần nâng cao hiệu quả và tính an toàn cho liệu pháp. 116 3.6 XÁC ĐỊNH KÍCH THƢỚC NANO CỦA DENDRIMER G3.0 VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT Kích thƣớc nano của dendrimer PAMAM G3.0 và một số dẫn xuất đƣợc xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, JEM 1010 (JEOL, Japan), Đại học Bách khoa, TP. HCM. Hình 3.19: Kết quả TEM của Dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6 Hình 3.20: Kết quả TEM của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA và G3.0-C6-FA Ảnh TEM của dendrimer PAMAM G3.0 (hình 3.19) cho thấy các hạt nano dendrimer PAMAM G3.0 đƣợc thành lập có dạng hình cầu và kích thƣớc hạt khác nhau từ 3 đến 4 nm. Sau khi biến tính với hexanoyl chloride và acid folic cho các sản 117 phẩm biến tính dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6, G3.0-FA, G3.0-C6-FA có kích thƣớc hạt từ 4 đến 6 nm (hình 3.19-20). Một số ảnh TEM điển hình của dendrimer G3.0 và các dẫn xuất cho thấy các hợp chất tổng hợp đƣợc có kích thƣớc nano phù hợp với lý thuyết phân tử. Với kích thƣớc nano này các dẫn xuất dendrimer có tiềm năng rất lớn trong các lĩnh vực y - dƣợc, nhƣ mang thuốc, vận chuyển gene, [17, 32, 87, 102, 108-110]. 3.7 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG MANG VÀ NHẢ THUỐC 3.7.1 Khảo sát khả năng mang (nang hóa) thuốc chống ung thƣ 5-fluorouracil Trong khảo sát thực nghiệm này, chúng tôi sử dụng HPLC để xác định hàm lƣợng thuốc 5-FU tự do không nang hóa bằng phƣơng pháp HPLC, dựa vào diện tích peak của sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dendrimer PAMAM G3.0 (216,39), dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA (176,02) và đƣờng chuẩn ta tính đƣợc hàm lƣợng thuốc tự do không nang hóa trong quá trình nhả thuốc, từ đó ta tính đƣợc lƣợng thuốc nang hóa bằng hiệu lƣợng thuốc ban đầu (40mg) và lƣợng thuốc tự do không nang hóa dendrimer G3.0 (17,406mg) và dẫn xuất dendrimer G3.0-C6-FA (13,296mg). Do cấu trúc gốc hexyl xoắn và gốc folate gấp khúc tạo ra các khoảng trống giữ các phân tử 5-FU nên dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA mang thuốc (26,704 mg) nhiều hơn dendrimer PAMAM G3.0 (22,594mg). Lƣợng 5-FU nang hóa trong cấu trúc dendrimer PAMAM và dẫn xuất đƣợc tính toán gián tiếp thông qua nồng độ 5-FU tự do không nang hóa bằng phƣơng pháp đo HPLC. 5-FU đƣợc pha với 6 nồng độ khác nhau từ 0.00125 – 1 (mg/ml), sau đó đo HPLC để xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn: y = 14732x + 45.442 (R2 =0.9999) (phụ lục 25). 118 Hình 3.21: Sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dendrimer PAMAM G3.0 Hình 3.22: Sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA Diện tích tín hiệu của các mẫu 5-Fu không nang hóa trong : dendrimer PAMAM G3.0 là 216,39 và dẫn xuât dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA là 176,02. Tính toán đƣợc kết quả là 1gam chất mang dendrimer PAMAM G3.0 mang đƣợc 112.97mg thuốc 5-FU và 1gam chất mang dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA mang đƣợc 133,52mg thuốc 5-FU. Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng mang thuốc hiệu quả của dendrimer PAMAM: 119 - 1 gam chất mang dendrimer PAMAM G3.0 mang đƣợc 112,97mg thuốc 5-FU tƣơng ứng với 6 phân tử thuốc 5-FU đƣợc mang bên trong 1 cấu trúc phân tử PAMAM G3.0. - 1 gam chất mang dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA mang đƣợc 133,52mg thuốc 5-FU tƣơng ứng với 9 phân tử thuốc 5-FU đƣợc mang trong 1 cấu trúc phân tử PAMAM G3.0-C6-FA. 3.7.2 Khảo sát khả năng nhả thuốc chống ung thƣ 5-FU đƣợc nhả ra của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3-C6-FA/5-FU và 5-FU tự do đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo HPLC. Đồ thị 3.8: Đồ thị biểu hiện lƣợng thuốc đƣợc giải phóng của G3-C6-FA/5FU và 5-FU tự do Kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy khả năng phát hành chậm của thuốc từ hệ thống PAMAM G3-C6-FA/5-FU và nhả chậm hơn so với 5-FU tự do. Đây cũng là một cải tiến đáng kể trong việc kéo dài sinh khả dụng thuốc, vì chống ung thƣ 5-FU đã đƣợc báo cáo là có thời gian lƣu thông trong máu rất ngắn [47]. 0 20 40 60 80 100 120 1h 3h 7h 12h 24h 5-FU % G3.0-C6-FA/5FU % 120 KẾT LUẬN Nhìn lại mục tiêu ban đầu của luận án: “Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (PAMAM) biến tính có khả năng hƣớng đích đến tế bào ung thƣ”. Một số kết quả mới của luận án đạt đƣợc có thể tóm tắt nhƣ sau: 1. Đã tổng hợp thành công các thế hệ dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 (hiệu suất phản ứng từ 71-89%), với mục đích thu đƣợc các dendrimer PAMAM G2.5 và dendrimer PAMAM G3.0 sử dụng cho các biến tính bề mặt của dendrimer PAMAM. 2. Xây dựng thành công phƣơng pháp tính toán mới trên cơ sở dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H NMR và khối phổ MS ở các dendrimer PAMAM thế hệ thấp từ G-0.5 đến G2.0 để tính khối lƣợng phân tử của các dendrimer PAMAM thế hệ cao (từ thế hệ G3.0 trở đi). Hiệu số sai lệch so với lý thuyết của phƣơng pháp này khoảng từ 0-6 , tƣơng đƣơng với kết quả sử dụng phƣơng pháp khối phổ MALDI-TOF-MS. 3. Tổng hợp thành công các hợp chất dendrimer PAMAM G3.0 biến tính với các dãy alkyl hóa nhƣ acyl chloride, acid carboxylic, alcohol và dendrimer PAMAM G2.5 với các alkylamine. 4. Đã xây dựng thành công phƣơng pháp tính toán mới trên cơ sở dữ liệu phổ 1H- NMR để xác định độ chuyển hóa (x ), số nhóm chuyển hóa (z nhóm), khối lƣợng phân tử của các dẫn xuất dendrimer PAMAM-alkyl. 5. Đã khảo sát độc tính tế bào trên tế bào MCF-7 của dendrimer PAMAM G3.0 và các dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0, với số nguyên tử carbon của mạch alkyl tăng từ 2 đến 14 (dendrimer PAMAM G3.0-C2, G3.0-C6, G3.0-C10 và G3.0- C14). Kết quả cho thấy sau khi đƣợc alkyl hóa, độc tính tế bào của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alkyl giảm đáng kể so với dendrimer PAMAM G3.0 chƣa biến tính. Mạch alkyl càng dài thì sau khi gắn vào dendrimer PAMAM càng làm giảm độc tính của dendrimer. 121 6. Đã gắn thành công tác nhân hƣớng đích acid folic lên hệ mang thuốc dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6 tạo thành hệ chất mang thuốc dendrimer PAMAM G3.0-FA và dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA. 7. Bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu đã chứng minh đƣợc khả năng hƣớng đích chủ động của hệ mang thuốc dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA 8. Đã khảo sát kích thƣớc của dendrimer PAMAM G3.0 và các dẫn suất dendrimer PAMAM G3.0-C6; PAMAM G3.0-FA; PAMAM G3.0-C6-FA bằng hình ảnh TEM. Kích thƣớc của các hệ chất này nằm trong khoảng 4-6nm. 9. Đã khảo sát thành công khả năng mang và nhả thuốc chống ung thƣ 5-FU của dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA. Kết quả phân tử dendrimer PAMAM G3.0 mang đƣợc 6 phân tử 5-FU, trong khi đó dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA mang đƣợc nhiều hơn (9 phân tử 5- FU). Và trong môi trƣờng PBS, thuốc 5-FU đƣợc nhả từ hệ mang thuốc PAMAM G3.0-C6-FA/5FU chậm hơn so với đối chứng 5-FU. 122 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục đề tài này với các thế hệ dendrimer PAMAM cao hơn, để đạt hiệu quả mang thuốc tốt hơn. - Nghiên cứu biến tính các dẫn xuất dendrimer PAMAM với các tác nhân hƣớng đích khác nhƣ Arg-Gly-Asp (RGD); epidermal growth factor receptor (EGFR); và kháng thể HER-2, ... 123 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 1. Nguyễn Thị Bích Trâm, Trần Ngọc Quyển, Nguyễn Cửu Khoa, Ứng dụng phổ cộng hƣởng từ hạt nhân trong phân tích đánh giá các polyaminoamin dendrimer và dẫn xuất, Tạp chí Hóa học, 51(4AB), pp 276-279, 2013. 2. Thị Bich Tram Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Cuu Khoa Nguyen, Biocompatible and cellular uptake enhancement of polyamidoamine dendrimer via fatty alkyl conjugation, Tạp chí Hóa học, 51(4AB), pp 259-263, 2013. 3. Ngoc Quyen Tran, Ngoc Hoa Nguyen, Thị Bich Tram Nguyen, Nguyen Cuu Khoa, Positive effect of dendrimers nanocarriers on reducing cytotoxicity of anticancer drugs, Tạp chí Hóa học, 51(4AB), pp 270-275, 2013. 4. Thị Bich Tram Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Cuu Khoa Nguyen, Cytotoxic behaviors of pamam-based dendrimers loading platinium compounds, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 51(5A), pp 334-341, 2013. 5. Cuu Khoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Thi Bich Tram Nguyen, Kim Ngoc Phan, Dendrimer-based nanocarriers demonstrating a high efficiency for loading and releasing anticancer drugs against cancer cells in vitro and in vivo, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 51(5A), pp 224-232, 2013. 6. Thi Bich Tram Nguyen, Phuc Thinh Nguyen, Minh Nhật Hồ, Cuu Khoa Nguyen, and Ngoc Quyen Tran, 5-Fluororacil loading and releasing behavior from alkylated polyamidoamine G3.0, the 7 th International Workshop on Advanced Materials Science and nanotechnology, Hạ Long City, VN, 2014. 7. Nguyen Thi Bich Tram, Phuc Thinh Nguyen, Nguyen Đại Hải, Nguyen Cuu Khoa, Tran Ngoc Quyen, 5-Fluororacil loading and releasing behavior from alkylated polyamidoamine G3.0 dendrimer - folate, Tạp chí Hóa học, 53(4e3), pp 168-173, 2015. 124 8. Thi Bich Tram Nguyen, Thi Tram Chau Nguyen, Hoang Chinh Tran, Cuu Khoa Nguyen, and Ngoc Quyen Tran, 1-H NMR Spectroscopy as an Effective Method for Predicting Molecular Weight of Polyaminoamine Dendrimers and Their Derivatives, International Journal of Polymer Analysis and Characterization, International Journal of Polymer Anal. Charact., 20: 57–68, 2015. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Jevprasesphant, R., et al., 2003, The influence of surface modification on the cytotoxicity of PAMAM dendrimers. International Journal of Pharmaceutics. 252(1–2): p. 263-266. 2. Jain, K., et al., 2010, Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge. International Journal of Pharmaceutics. 394(1–2): p. 122-142. 3. Singh, P., et al., 2008, Folate and Folate−PEG−PAMAM Dendrimers: Synthesis, Characterization, and Targeted Anticancer Drug Delivery Potential in Tumor Bearing Mice. Bioconjugate Chemistry. 19(11): p. 2239-2252. 4. Chandrasekar, D., et al., 2007, Folate coupled poly (ethyleneglycol) conjugates of anionic poly (amidoamine) dendrimer for inflammatory tissue specific drug delivery. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 82(1): p. 92-103. 5. Yang, W., et al., 2009, Targeting cancer cells with biotin–dendrimer conjugates. European Journal of Medicinal Chemistry. 44(2): p. 862-868. 6. Wang, Y., et al., 2011, Targeted delivery of doxorubicin into cancer cells using a folic acid–dendrimer conjugate. Polymer Chemistry. 2(8): p. 1754-1760. 7. Wang, S. and P.S. Low, 1998, Folate-mediated targeting of antineoplastic drugs, imaging agents, and nucleic acids to cancer cells. Journal of Controlled Release. 53(1–3): p. 39-48. 8. Boas, U., J.B. Christensen, and P.M. Heegaard, 2006. Dendrimers in medicine and biotechnology: new molecular tools. Royal Society of Chemistry. 9. Thomas, T.P., et al., 2011, Folate‐targeted nanoparticles show efficacy in the treatment of inflammatory arthritis. Arthritis & Rheumatism. 63(9): p. 2671- 2680. 10. Qi, R., et al., 2015, Folate receptor-targeted dendrimer-methotrexate conjugate for inflammatory arthritis. Journal of biomedical nanotechnology. 11(8): p. 1431-1441. 11. Dutta, T., M. Garg, and N.K. Jain, 2008, Targeting of efavirenz loaded tuftsin conjugated poly(propyleneimine) dendrimers to HIV infected macrophages in vitro. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 34(2–3): p. 181-189. 12. Astruc, D., E. Boisselier, and C. Ornelas, 2010, Dendrimers designed for functions: from physical, photophysical, and supramolecular properties to applications in sensing, catalysis, molecular electronics, photonics, and nanomedicine. Chemical Reviews. 110(4): p. 1857-1959. 13. Tomalia, D.A., et al., 1985, A new class of polymers: starburst-dendritic macromolecules. Polymer Journal. 17(1): p. 117-132. 14. Challa, T., A. Goud.B, and e. al, 2011, Dendrimers: A novel polymer for drug delivery. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. Vol. 9(1): p. 88-99. 15. Tomalia, D.A., A.M. Naylor, and W.A. Goddard, 1990, Starburst dendrimers: molecular‐level control of size, shape, surface chemistry, topology, and flexibility from atoms to macroscopic matter. Angewandte Chemie International Edition in English. 29(2): p. 138-175. 16. Prajapati, S.K., et al., 2016, Dendrimers in drug delivery, diagnosis and therapy: Basics and potential applications. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 6(1): p. 67-92. 17. Esfand, R. and D.A. Tomalia, 2001, Poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers: from biomimicry to drug delivery and biomedical applications. Drug Discovery Today. 6(8): p. 427-436. 18. Kresge, C., M. Leonowicz, and W. Roth, Dendrimers and Dendrons. Concepts, Syntheses, Applications. 2001, VCH: Weinheim. 19. Klajnert, B., et al., 2003, Interactions between PAMAM dendrimers and bovine serum albumin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1648(1–2): p. 115-126. 20. Fréchet, J.M., 2003, Dendrimers and other dendritic macromolecules: From building blocks to functional assemblies in nanoscience and nanotechnology. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 41(23): p. 3713-3725. 21. Cloninger, M.J., 2002, Biological applications of dendrimers. Current Opinion in Chemical Biology. 6(6): p. 742-748. 22. Wang, Z., et al., 2003, Mechanism of enhancement effect of dendrimer on transdermal drug permeation through polyhydroxyalkanoate matrix. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96(6): p. 537-540. 23. Tomalia, D.A., et al., 2000, Dendrimers as reactive modules for the synthesis of new structure-controlled, higher-complexity megamers. Pure and applied chemistry. 72(12): p. 2343-2358. 24. Goyal, P., 2008. Development of dendritic and polymeric scaffolds for biological and catalysis applications. ProQuest. 25. Khoa, N.C., 2015. Dendrimer - tổng hợp và ứng dụng trong y- dược. NXB Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ. 26. Yoo, H.-S., T. Watanabe, and A. Hirao, 2009, Precise Synthesis of Dendrimer- Like Star-Branched Polystyrenes and Block Copolymers Composed of Polystyrene and Poly(methyl methacrylate) Segments by an Iterative Methodology Using Living Anionic Polymerization. Macromolecules. 42(13): p. 4558-4570. 27. Boo, W.J., Characterization of thin film properties of melamine based dendrimer nanoparticles. 2003, Texas A&M University. 28. Klajnert, B. and M. Bryszewska, 2000, Dendrimers: properties and applications. Acta biochimica polonica. 48(1): p. 199-208. 29. de la Campa, J.G., 2004, Synthetic Methods in Step‐Growth Polymers. Macromolecular Chemistry and Physics. 205(5): p. 700-700. 30. Vögtle, F., 2003. Dendrimers II: architecture, nanostructure and supramolecular chemistry. Vol. 210: Springer. 31. Svenson, S. and D.A. Tomalia, 2005, Dendrimers in biomedical applications- reflections on the field. Advanced Drug Delivery Reviews. Vol. 57(15): p. 2106- 2129. 32. Kukowska-Latallo, J.F., et al., 2005, Nanoparticle targeting of anticancer drug improves therapeutic response in animal model of human epithelial cancer. Cancer research. 65(12): p. 5317-5324. 33. Yellepeddi, V.K., K.K. Vangara, and S. Palakurthi, 2013, Poly (amido) amine (PAMAM) dendrimer–cisplatin complexes for chemotherapy of cisplatin- resistant ovarian cancer cells. Journal of nanoparticle research. 15(9): p. 1-15. 34. Kalomiraki, M., K. Thermos, and N.A. Chaniotakis, 2016, Dendrimers as tunable vectors of drug delivery systems and biomedical and ocular applications. International journal of nanomedicine. 11: p. 1. 35. Morales-Sanfrutos, J., et al., 2011, Alkyl sulfonyl derivatized PAMAM-G2 dendrimers as nonviral gene delivery vectors with improved transfection efficiencies. Organic & biomolecular chemistry. 9(3): p. 851-864. 36. Santos, J.L., et al., 2010, Functionalization of poly(amidoamine) dendrimers with hydrophobic chains for improved gene delivery in mesenchymal stem cells. Journal of Controlled Release. 144(1): p. 55-64. 37. Kobayashi, H., et al., 2001, 3D‐micro‐MR angiography of mice using macromolecular MR contrast agents with polyamidoamine dendrimer core with reference to their pharmacokinetic properties. Magnetic resonance in medicine. 45(3): p. 454-460. 38. Wiener, E., et al., 1994, Dendrimer‐based metal chelates: A new class of magnetic resonance imaging contrast agents. Magnetic resonance in medicine. 31(1): p. 1-8. 39. Deriu, M.A., et al., 2016, Iron oxide/PAMAM nanostructured hybrids: combined computational and experimental studies. Journal of Materials Science. 51(4): p. 1996-2007. 40. Campos, B.B., et al., 2016, Carbon dots on based folic acid coated with PAMAM dendrimer as platform for Pt(IV) detection. Journal of Colloid and Interface Science. 465: p. 165-173. 41. Palecz, B., et al., 2016, Thermodynamic interaction between PAMAM G4- NH2, G4-OH, G3. 5-COONa dendrimers and gemcitabine in water sotutions. International Journal of Secondary Metabolite (IJSM). 3(1). 42. Nikakhtar, A. and A. Nasehzadeh, 2007, Structural effects of DNA on thermodynamic stability of DNA-dendronized polymer nanoclusters and nanoclusteration process. Journal of the Iranian Chemical Society. 4(3): p. 310- 317. 43. Wakabayashi, Y., et al., 2000, Infrared Absorption Characteristics of Large- Sized Spherical Aryl-Ether Dendrimers. Analytical sciences. 16(12): p. 1323- 1326. 44. Emran, S., et al., 2001, Viscoelastic properties and phase behavior of 12‐tert‐ butyl ester dendrimer/poly (methyl methacrylate) blends. Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics. 39(12): p. 1381-1393. 45. Saad, M., et al., 2008, Receptor targeted polymers, dendrimers, liposomes: Which nanocarrier is the most efficient for tumor-specific treatment and imaging? Journal of Controlled Release. 130(2): p. 107-114. 46. Ward, M.A. and T.K. Georgiou, 2011, Thermoresponsive polymers for biomedical applications. Polymers. 3(3): p. 1215-1242. 47. Ly, T.U., et al., 2013, Pegylated dendrimer and its effect in fluorouracil loading and release for enhancing antitumor activity. Journal of biomedical nanotechnology. 9(2): p. 213-220. 48. Angajala, G. and R. Subashini, 2014, Transdermal Nanocarriers: New Challenges and Prospectives in the Treatment of Diabetes mellitus. Journal of Chemistry & Applied Biochemistry. 1(2-2014). 49. Xu, X., et al., A novel doxorubicin loaded folic acid conjugated PAMAM modified with borneol, a nature dual-functional product of reducing PAMAM toxicity and boosting BBB penetration. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50. Licata, N.A. and A.V. Tkachenko, 2008, Kinetic limitations of cooperativity- based drug delivery systems. Physical review letters. 100(15): p. 158102. 51. Chen, J., et al., 2016, Substrate-Triggered Exosite Binding: Synergistic Dendrimer/Folic Acid Action for Achieving Specific, Tight-Binding to Folate Binding Protein. Biomacromolecules. 17(3): p. 922-927. 52. Gosk, S., VCAM-directed Immunoliposomes Loaded with Vascular Disrupting Agents for Selective Targeting and Occlusion of the Tumor Vasculature: As a Novel Therapeutic Strategy. 2008, Universitäts-und Landesbibliothek Bonn. 53. Daniels, T.R., et al., 2012, The transferrin receptor and the targeted delivery of therapeutic agents against cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1820(3): p. 291-317. 54. Pourianazar, N.T., P. Mutlu, and U. Gunduz, 2014, Bioapplications of poly (amidoamine)(PAMAM) dendrimers in nanomedicine. Journal of Nanoparticle Research. 16(4): p. 1-38. 55. Saovapakhiran, A., et al., 2009, Surface Modification of PAMAM Dendrimers Modulates the Mechanism of Cellular Internalization. Bioconjugate Chemistry. 20(4): p. 693-701. 56. Kono, K., et al., 2008, Preparation and cytotoxic activity of poly(ethylene glycol)-modified poly(amidoamine) dendrimers bearing adriamycin. Biomaterials. 29(11): p. 1664-1675. 57. Kolhatkar, R.B., et al., 2007, Surface Acetylation of Polyamidoamine (PAMAM) Dendrimers Decreases Cytotoxicity while Maintaining Membrane Permeability. Bioconjugate Chemistry. 18(6): p. 2054-2060. 58. Bullen, H.A., et al., 2011, Evaluation of biotinylated PAMAM dendrimer toxicity in models of the blood brain barrier: a biophysical and cellular approach. Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology. 2(05): p. 485. 59. Wang, W., et al., 2009, The decrease of PAMAM dendrimer-induced cytotoxicity by PEGylation via attenuation of oxidative stress. Nanotechnology. 20(10): p. 105103. 60. Garin-Chesa, P., et al., 1993, Trophoblast and ovarian cancer antigen LK26. Sensitivity and specificity in immunopathology and molecular identification as a folate-binding protein. The American journal of pathology. 142(2): p. 557. 61. Caliceti, P., et al., 2003, Synthesis and Physicochemical Characterization of Folate−Cyclodextrin Bioconjugate for Active Drug Delivery. Bioconjugate Chemistry. 14(5): p. 899-908. 62. De Jesus, E., et al., 2015, Comparison of Folate Receptor Targeted Optical Contrast Agents for Intraoperative Molecular Imaging. International journal of molecular imaging. 2015. 63. Winkler, J., 2013, Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Therapeutic Delivery. 4(7): p. 791-809. 64. Lo, Y.-L., et al., 2015, Folic Acid Linked Chondroitin Sulfate- Polyethyleneimine Copolymer Based Gene Delivery System. Journal of biomedical nanotechnology. 11(8): p. 1385-1400. 65. Zhuo, R.X., B. Du, and Z.R. Lu, 1999, In vitro release of 5-fluorouracil with cyclic core dendritic polymer. Journal of Controlled Release. 57(3): p. 249-257. 66. Waite, C.L., et al., 2009, Acetylation of PAMAM dendrimers for cellular delivery of siRNA. BMC Biotechnology. 9(1): p. 1-10. 67. Majoros, I.J., et al., 2003, Acetylation of Poly(amidoamine) Dendrimers. Macromolecules. 36(15): p. 5526-5529. 68. Majoros, I.J., et al., 2005, Poly (amidoamine) dendrimer-based multifunctional engineered nanodevice for cancer therapy. Journal of medicinal chemistry. 48(19): p. 5892-5899. 69. Yanez Arteta, M., et al., 2013, Interactions of PAMAM dendrimers with SDS at the solid–liquid interface. Langmuir. 29(19): p. 5817-5831. 70. Menjoge, A.R., R.M. Kannan, and D.A. Tomalia, 2010, Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15(5–6): p. 171-185. 71. Jevprasesphant, R., et al., 2003, Engineering of dendrimer surfaces to enhance transepithelial transport and reduce cytotoxicity. Pharmaceutical Research. 20(10): p. 1543-1550. 72. Dung, H.T.K., N.C. Khoa, and N.C. Trực, 2009, Tổng hợp các Dendrime Polyamidoamin (Pamam). 73. Ito, M., et al., 2002, In Situ Investigation of Adlayer Formation and Adsorption Kinetics of Amphiphilic Surface-Block Dendrimers on Solid Substrates. Langmuir. 18(25): p. 9757-9764. 74. Quintana, A., et al., 2002, Design and function of a dendrimer-based therapeutic nanodevice targeted to tumor cells through the folate receptor. Pharmaceutical research. 19(9): p. 1310-1316. 75. Baker, J.R., et al., 2001, The synthesis and testing of anti-cancer therapeutic nanodevices. Biomedical Microdevices. 3(1): p. 61-69. 76. Choi, Y., et al., 2005, Synthesis and Functional Evaluation of DNA-Assembled Polyamidoamine Dendrimer Clusters for Cancer Cell-Specific Targeting. Chemistry & Biology. 12(1): p. 35-43. 77. Myc, A., et al., 2007, Dendrimer-Based Targeted Delivery of an Apoptotic Sensor in Cancer Cells. Biomacromolecules. 8(1): p. 13-18. 78. Zong, H., et al., 2012, Bifunctional PAMAM Dendrimer Conjugates of Folic Acid and Methotrexate with Defined Ratio. Biomacromolecules. 13(4): p. 982- 991. 79. Chandrasekar, D., et al., 2007, The development of folate-PAMAM dendrimer conjugates for targeted delivery of anti-arthritic drugs and their pharmacokinetics and biodistribution in arthritic rats. Biomaterials. 28(3): p. 504-512. 80. Leroueil, P.R., et al., 2015, Characterization of Folic Acid and Poly(amidoamine) Dendrimer Interactions with Folate Binding Protein: A Force-Pulling Study. The Journal of Physical Chemistry B. 119(35): p. 11506- 11512. 81. Kesharwani, P., R.K. Tekade, and N.K. Jain, 2015, Generation dependent safety and efficacy of folic acid conjugated dendrimer based anticancer drug formulations. Pharmaceutical research. 32(4): p. 1438-1450. 82. Konda, S.D., et al., 2001, Specific targeting of folate–dendrimer MRI contrast agents to the high affinity folate receptor expressed in ovarian tumor xenografts. Magnetic resonance materials in physics, Biology and Medicine. 12(2-3): p. 104-113. 83. Karabulut, B., O. Kerimoğlu, and T. Uğurlu, 2015, Dendrimers-drug delivery systems. Journal of Marmara University Institute of Health Sciences. 5(1): p. 31-40. 84. Majoros, I.J., et al., 2009, Methotrexate delivery via folate targeted dendrimer‐ based nanotherapeutic platform. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 1(5): p. 502-510. 85. Mullen, D.G., et al., 2011, Design, synthesis, and biological functionality of a dendrimer-based modular drug delivery platform. Bioconjugate chemistry. 22(4): p. 679-689. 86. Caminade, A.-M., R. Laurent, and J.-P. Majoral, 2005, Characterization of dendrimers. Advanced drug delivery reviews. 57(15): p. 2130-2146. 87. Biricova, V. and A. Laznickova, 2009, Dendrimers: Analytical characterization and applications. Bioorganic chemistry. 37(6): p. 185-192. 88. Hong, S., et al., 2004, Interaction of poly (amidoamine) dendrimers with supported lipid bilayers and cells: hole formation and the relation to transport. Bioconjugate chemistry. 15(4): p. 774-782. 89. Zhao, Y.-F., et al., 2005, Synthesis and characterization of diblock copolymers based on crystallizable poly(ε-caprolactone) and mesogen-jacketed liquid crystalline polymer block. Polymer. 46(14): p. 5396-5405. 90. Izunobi, J.U. and C.L. Higginbotham, 2011, Polymer Molecular Weight Analysis by 1H NMR Spectroscopy. Journal of Chemical Education. 88(8): p. 1098-1104. 91. Dizman, C., et al., 2010, Synthesis, characterization and photoinduced curing of polysulfones with (meth) acrylate functionalities. Beilstein journal of organic chemistry. 6(1): p. 56. 92. Ahmed, S.M., et al., 2001, Preparation and characterisation of a chromophore- bearing dendrimer. Polymer. 42(3): p. 889-896. 93. Marder, O. and F. Albericio, 2003, Industrial application of coupling reagents in peptides. Chimica oggi. 21(6): p. 35-40. 94. Tran, N.Q., et al., 2011, RGD-conjugated in situ forming hydrogels as cell- adhesive injectable scaffolds. Macromolecular Research. 19(3): p. 300-306. 95. PGS TS Thái Doãn, T., 2002, Cơ sở Hóa hữu cơ tập 2. 96. Majoros, I. and J.R. Baker Jr, 2008. Dendrimer-based nanomedicine. Pan Stanford Publishing. 97. Yu, G.S., et al., 2011, Synthesis of PAMAM dendrimer derivatives with enhanced buffering capacity and remarkable gene transfection efficiency. Bioconjugate chemistry. 22(6): p. 1046-1055. 98. Yu, G.S., et al., 2011, Sequential Conjugation of 6-Aminohexanoic Acids and L-Arginines to Poly (amidoamine) Dendrimer to Modify Hydrophobicity and Flexibility of the Polymeric Gene Carrier. Bull. Korean Chem. Soc. 32(2): p. 651. 99. Oddone, N., et al., 2013, Cell uptake mechanisms of PAMAM G4-FITC dendrimer in human myometrial cells. Journal of nanoparticle research. 15(7): p. 1-14. 100. Inapagolla, R., 2007. Dendrimer based delivery of therapeutic agents for thrombolysis and asthma. ProQuest. 101. Mozafari, M.R., 2007. Nanomaterials and nanosystems for biomedical applications. Springer Science & Business Media. 102. Kumar, P., et al., 2010, Dendrimer: a novel polymer for drug delivery. JITPS. 1(6): p. 252-269. 103. Wang, Y., et al., 2009, Polyamidoamine Dendrimers with a Modified Pentaerythritol Core Having High Efficiency and Low Cytotoxicity as Gene Carriers. Biomacromolecules. 10(3): p. 617-622. 104. Gomez, M.V., et al., 2009, NMR Characterization of Fourth-Generation PAMAM Dendrimers in the Presence and Absence of Palladium Dendrimer- Encapsulated Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 131(1): p. 341-350. 105. Majoros, I.n.J. and e. al, 2003, Acetylation of Poly(amidoamine) Dendrimers. Macromolecules. Vol. 36: p. 5526-5529. 106. Zhang, Y., et al., 2013, Dendrimer–folate–copper conjugates as bioprobes for synchrotron X-ray fluorescence imaging. Chemical Communications. 49(88): p. 10388-10390. 107. Zhao, Y., et al., 2010, Synthesis and grafting of folate–PEG–PAMAM conjugates onto quantum dots for selective targeting of folate-receptor-positive tumor cells. Journal of Colloid and Interface Science. 350(1): p. 44-50. 108. Kesharwani, P., et al., 2015, PAMAM dendrimers as promising nanocarriers for RNAi therapeutics. Materials Today. 18(10): p. 565-572. 109. Werengowska-Ciećwierz, K., et al., 2015, The chemistry of bioconjugation in nanoparticles-based drug delivery system. Advances in Condensed Matter Physics. 2015. 110. Ciolkowski, M., et al., 2012, Surface modification of PAMAM dendrimer improves its biocompatibility. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8(6): p. 815-817. P1 4 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ MS của dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G2.0 Phổ MS của dendrimer PAMAM G-0.5 Phổ MS của dendrimer PAMAM G0.0 P2 Phổ MS của dendrimer PAMAM G0.5 Phổ MS của dendrimer PAMAM G1.0 P3 Phổ MS của dendrimer PAMAM G1.5 Phổ MS của dendrimer PAMAM G2.0 P4 P h ụ lụ c 2 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 1 0 -1 2 h P5 P h ụ lụ c 3 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 1 0 -2 4 h P6 P h ụ lụ c 4 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 1 0 -3 6 h P7 P h ụ lụ c 5 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 1 0 -4 8 h P8 P h ụ lụ c 6 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 2 P9 P h ụ lụ c 7 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 6 P10 P h ụ lụ c 8 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 1 4 P11 P h ụ lụ c 9 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 2 -E D C P12 P h ụ lụ c 1 0 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 6 -E D C P13 P h ụ lụ c 1 1 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 1 0 -E D C P14 P h ụ lụ c 1 2 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 1 4 -E D C P15 P h ụ lụ c 1 3 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 2 -N P C P16 P h ụ lụ c 1 4 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 6 -N P C P17 P h ụ lụ c 1 5 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 8 -N P C P18 P h ụ lụ c 1 6 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -C 1 2 -N P C P19 P h ụ lụ c 1 7 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 2 .5 -C 1 2 -p oC P20 P h ụ lụ c 1 8 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 2 .5 -C 1 2 -6 0 oC P21 P h ụ lụ c 1 9 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 2 .5 -C 1 2 -8 0 oC P22 P h ụ lụ c 2 0 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 2 .5 -C 4 P23 P h ụ lụ c 2 1 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 2 .5 -C 8 P24 P h ụ lụ c 2 2 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 2 .5 -C 1 0 P25 P h ụ lụ c 2 3 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 .0 -F A P26 P h ụ lụ c 2 4 : P h ổ 1H -N M R củ a d ẫn x u ất d en d rim er P A M A M G 3 -C 6 -F A P27 Phụ lục 25: Xây dựng sơ đồ đƣờng chuẩn của 5-FU 5-FU đƣợc pha với 6 nồng độ khác nhau từ 0.00125 -1 (mg/mL), ở bƣớc sóng 260 nm; tiêm mẫu 5µL; tốc độ dòng 1mL/phút.sau đó đo HPLC để xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn. Bảng P1: Số liệu đƣờng chuẩn STT Nồng độ dung dịch chuẩn C(mg/ml) Area[ ] 1 0.00125 29.189 2 0.0025 51.429 3 0.005 97.886 4 0.01 201.425 5 0.1 1605.171 6 1 14 800.000 Từ đó ta dựng đƣợc đồ thị nhƣ sau: Hình P1: Đồ thị đƣờng chuẩn của 5-FU. Từ đồ thị ta có phƣơng trình đƣờng chuẩn: y = 14732x + 45.442 (R2 =0.9999) P28 Phụ lục 26: Số liệu nhả thuốc của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA Bảng P2: Số liệu nhả thuốc của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA Thời gian 5-FU (mg) G3.0-C6-FA/5FU (mg) 5-FU % G3.0-C6/5FU % 1 1.981 1.16 90,046 73,6 3 2.111 1.88 95,956 85,6 7 2.132 1.93 96,955 87,5 12 2.133 2.12 96,954 96,5 24 2.163 2.12 98,322 96,5