Luận án Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư các hợp chất lai coxib – combretastatin

M) 102 (10 µM) 102 (5 µM) 82 (20µM) 82 (10 µM) 82 (5 µM) Camptothecin (5µM) (-) Đối chứng Giá trị 1.36* 1.21* 1.01 1.08 1.12 1.11 1.67** 1.00 Độ lệch 0.033 0.013 0.037 0.023 0.056 0.040 0.020 0.070 - * P<0.05 and ** P<0.01 Kết quả thu được chỉ ra rằng chỉ có chất 102 làm tăng đáng kể tế bào apoptotic so với đối chứng âm ở cùng nồng độ, cụ thể tăng từ 1.21 và 1.36 lần tại nồng độ tương ứng là 10 µM (P <0.05) và 20 µM (P <0.01). Điều này chỉ ra rằng chất 102 đã kích hoạt con đường caspase để kích hoạt quá trình apoptosis của các tế bào MCF7 và sau đó dẫn đến sự ức chế sự tăng sinh. Nghiên cứu cảm ứng apoptosis bằng phƣơng pháp trắc lƣu tế bào nhuộm FITC-anexin V và PI Trong các tế bào apoptotic sớm, sự bất đối xứng của vỡ màng dẫn đến những thay đổi đáng kể trong các đặc tính sinh hóa của màng, chẳng hạn như sự phân phối lại của phosphatidylserin (PS) từ bên trong ra bên ngoài của huyết tương màng. Sự hình thành bên ngoài của các phân tử PS có thể được xác định thông qua khả năng gây apoptosis bằng kit Anexin V [128]. Anexin V là một protein gắn với phospholipid phụ thuộc vào ion Ca++ có ái lực mạnh với PS, vì vậy Anexin V được gắn với chất hiện mầu huỳnh quang FITC được sử dụng để xác định sự biểu hiện PS thông qua phương pháp trắc lưu tế bào. Sự dịch chuyển của PS thường xảy ra trước khi màng tế bào bị phá hủy trong quá trình chết của tế bào do apoptosis hoặc hoại tử. Vì vậy nhuộm 85 anexin V thường kết hợp với Propidium iodid (PI) để xác định apoptosis sớm và muộn. Thông qua phương pháp này, những tế bào sống không nhuộm với bất kì loại mầu nhuộm nào. Tế bào biểu hiện apoptosis sớm bắt màu với FITC-anexin V, tế bào biểu hiện apoptosis muộn bắt mầu với cả FITC-anexin V và PI; tế bào chết do hoại tử chỉ bắt mầu với thuốc nhuộm PI. Kết quả phân tích trắc lưu tế bào thể hiện ở Bảng 3.11 và Hình 3.6 cho thấy các hợp chất 82 và 102 tại nồng độ 5 µM, 10 µM và 20 µM thể hiện ảnh hưởng đến tế bào apoptotic (cả sớm và muộn qua các giai đoạn) trong các dòng tế bào ung thư vú MCF7, sau 24 giờ tiếp xúc. Dữ liệu chỉ ra rằng chỉ có hợp chất 102 cho kết quả làm tăng đáng kể tế bào apoptotic (P <0.05). Được ghi nhận qua sự thống kê sự sống sót của tế bào khối u MCF7 đã giảm khi xử lý bằng hợp chất 102 so với đối chứng âm, trong khi chất 102 tại nồng độ 20 µM làm tăng tốc độ tế bào apoptosis sớm và muộn từ 18.32% đến 42.24% và từ 1.90% đến 6.73%. Những kết quả này đã chứng minh khả năng của hợp chất 102 gây ra quá trình apoptosis, đặc biệt là trong giai đoạn đầu apoptosis của tế bào MCF7. Bảng 3.11. Tỉ lệ tế bào apoptosis Mẫu thí nghiệm % tế bào hoại tử % tế bào apoptosis sớm % tế bào apoptosis muộn % tế bào apoptosis ĐC âm 0.22 18.32 1.90 20.22 82 (20 µM) 1.39 18.49 4.08 22.57 82 (10 µM) 0.27 21.62 4.59 26.21 82 (5 µM) 0.16 22.74 3.27 26.01 102 (20 µM) 0.42 42.24 6.73 48.97* 102 (10 µM) 0.49 19.90 3.45 23.35 102 (5 µM) 0.27 15.84 2.17 18.01 Camptothecin (5µM) 0.08 73.83 4.96 78.79** Ghi chú: * là P<0.05; ** là P<0.01 86 Tế bào ủ với mẫu 82 (20 µg/ml) trong 48h Tế bào ủ với mẫu 82 (10 µg/ml) trong 48h Tế bào ủ với mẫu 82 (5 µg/ml) trong 48h Tế bào ủ với mẫu 102 (20 µg/ml) trong 48h Tế bào ủ với mẫu 102 (10 µg/ml) trong 48h Tế bào ủ với mẫu 102 (5 µg/ml) trong 48h Tế bào ủ với 0.5% DMSO trong 48h Tế bào ủ với 5 µM Camptothecin trong 48h Hình 3.5. Tác động của mẫu nghiên cứu đến quá trình apoptosis tế bào thông qua Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit. Các mẫu thử được phân 87 tích bằng hệ thống trắc lưu tế bào. Trục x thể hiện mức độ nhuộm mầu FITC-Anexin V, trục y thể hiện mức độ nhuộm mầu PI theo đơn vị Log. Phần kết luận xác định khả năng cảm ứng apoptosis của 2 mẫu nghiên cứu Qua việc xác định cảm ứng apoptosis qua ba phương pháp phát hiện apoptosis của hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, caspase - 3 và Flow cytometry có thể tổng kết:  Mẫu 82 ở các nồng độ thử nghiệm làm tăng nhẹ tỉ lệ tế bào ở giai đoạn apoptosis sớm và apoptosis muộn so với đối chứng âm, đạt từ 22.57- 26.21%.  Mẫu 102, ở nồng độ 20 µg/ml làm tăng cao tỉ lệ tế bào ở giai đoạn apoptosis sớm và muộn so với đối chứng âm từ 18.3% đến 42.2% và 1.90% đến 6.7%, một cách tương ứng. Ở nồng độ thấp hơn làm tăng nhẹ (10 µg/ml và 5µg/ml) tỉ lệ tế bào apoptosis so với đối chứng âm.  Camptothecin - đối chứng dương tăng tỷ lệ tế bào apoptosis, đạt từ 78.79%.  Mẫu 82 chưa thể hiện rõ khả năng cảm ứng apoptosis với các nồng độ nghiên cứu trong các thử nghiệm được thực hiện;  Mẫu 102 ở nồng độ 10 µM có khả năng cảm ứng apoptosis trên tế bào MCF7 thông qua cảm ứng sinh caspase 3 với hàm lượng tăng 1.21 lần so với đối chứng âm (P<0.05);  Mẫu 102 ở nồng độ 20 µM có khả năng cảm ứng apoptosis trên tế bào MCF7 thông qua: gây ra sự cô đặc hoặc phân mảnh nhân tế bào với tỉ lệ 12.386%; cảm ứng sinh caspase -3 với hàm lượng tăng 1.36 lần so với đối chứng âm (P<0.01); quần thể tế bào apoptosis tăng và đặc biệt là quần thể apoptosis sớm tăng 42.24% thông qua kĩ thuật trắc lưu tế bào (P<0.05) Qua đó, dựa trên kết quả thử hoạt tính độc tế bào, kháng viêm NO, PGE2 và cảm ứng apoptosis đã khẳng định được cơ chế và đặc điểm về hoạt tính của các hợp chất lai thu được. Kết quả chỉ ra phân tử lai cả về mặt cấu trúc phân tử lẫn hoạt tính sinh học theo mô hình mục tiêu thiết kế của phân tử lai ban đầu. Chúng tôi đã tiếp tục lựa chọn 88 phân tích docking phân tử để mô phỏng tương tác giữa chất lai thiết kế với các mục tiêu COX2 và tubulin. 3.4. Nghiên cứu docking phân tử Do các hoạt động ức chế tiềm năng trong quá trình tăng sinh tế bào, tiến trình của chu kỳ tế bào và sản sinh PGE2. Các hợp chất 102 và 82 được chọn để đánh giá về khả năng tương tác của chúng với COX2 và tubulin trên mô hình docking phân tử. Các kết quả gắn kết có thể làm sáng tỏ cơ chế hoạt động của các hợp chất được nghiên cứu liên quan đến hoạt tính sinh học in vitro. Bước đầu tiên, chúng tôi đã docking ba hợp chất celecoxib, colchicine và combretastatin A4 lên COX2 và tubulin, sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6. Việc mô phỏng được tiến hành trên các cấu trúc tinh thể khác nhau của cả hai mục tiêu để tìm tương quan và nghiên cứu cảm ứng của chất trên các mục tiêu này. Bảng 3.12. Lựa chọn cấu trúc COX2 và tubulin tương ứng sử dụng cho chương trình docking Hợp chất Giá trị (Kcal/mol) COX2 Tubulin ∆G (1)-(4) 3LN1 (1) 1CX2 (2) 6BL3 (3) 1Z2B (4) 3DU7 (5) 3E22 (6) 102 -11.90 - 11.45 -11.40 - 8.06 - 7.92 -8.98 -3.84 82 -11.92 - 10.48 -11.78 - 9.37 -8.96 -8.70 -2.55 CA4 -9.63 - 7.83 -7.76 - 7.75 - 6.30 -6.71 -1.88 Colchicin - - - -8.06 -7.85 -7.18 - Celecoxib -11.50 -10.90 -11.03 - - - - Bảng 3.12 trình bày các giá trị năng lượng gắn kết của mỗi hợp chất với COX2 và mô hình tubulin. Trong tất cả các mô hình được docking, chỉ số liên kết của celecoxib với 3LN1 cho thấy khả năng hoạt tính gắn kết cao đối với mô hình này; do đó, nó đã được chọn cho phân tích sâu hơn. Đối với tubulin, mô hình 1Z2B đã được sử dụng với cùng một lý do. Giá trị ngưỡng của năng lượng docking (khả năng gắn kết) 89 cần được xác định và các phối tử tham chiếu được chọn cho quá trình này; do đó, các hợp chất có năng lượng gần với cả hai – 11.50 kcal /mol (COX2) và – 8.06 kcal /mol (tubulin) có thể được coi là như chất ức chế tiềm năng đối với hai mục tiêu protein này. Hợp chất 102 liên kết với mục tiêu COX2 với điểm docking – 11.90 kcal /mol cao hơn một chút so với cả celecoxib (- 11.50 kcal /mol) và combretastatin A-4 (- 9.63 kcal / mol) (Bảng 3.13). Phân tích định hướng liên kết cho thấy Val335, Leu345, Val509, Ala513 và Leu517 có tương tác alkyl và Pi-alkyl; tương tác hydro cacbon được quan sát đối với Gly512 và Ser516; hai liên kết Pi – sigma với Ser339 và Tyr371; sự tương tác là ổn định hơn nữa thông qua sự hình thành liên kết hydro với Gln178, Leu338, Phe504 (Hình 3.6, Hinhh 3.7). Những tương tác chính này phù hợp với các nghiên cứu trước đây [129-130]. Đối với thử nghiệm docking trên tubulin, hợp chất 102 có giá trị là – 8.06 kcal /mol, tương đương với colchicine và cao hơn so với combretastatin A-4 (- 7.75 kcal /mol). Phân tích docking của hợp chất 102 với tubulin chỉ ra rằng Asn101, Ala250, Asn258, Met259, Lys352 là chìa khóa khẳng định sự hình thành liên kết hydro và liên kết cộng hóa trị đã được thấy trong Val238, Cys241 (Halogen); Leu248, Leu255 và Ala316 (Loại liên kết pi-alkyl); Lys254 và Val351 (liên kết hydro cacbon) (Hình 3.7) Hợp chất 82 được quan sát thấy có giá trị năng lượng liên kết đáng kể với COX2 (- 11.92 kcal / mol), cao hơn celecoxib (- 11.50 kcal mol). Nó hình thành liên kết tương tự với Phe504 so với hợp chất 102 gợi ý tương tác này có thể là nguyên nhân của sự gia tăng hoạt tính. Liên kết hydro giữa nhóm cacbonyl của 82 với nhóm amin của Arg106 kết hợp với tương tác không cộng hóa trị với các gốc quan trọng Val335, Leu338, Val509, Ala513, Leu517 (loại liên kết Pi-alkyl) và Ser339, Arg499 (liên kết hydro cacbon) cũng góp phần vào tăng cường sự tương tác giữa phối tử và protein mục tiêu (Hình 3.7). Phân tích tương quan hợp chất 82 và vị trí liên kết colchicine trong protein tubulin thể hiện giá trị docking - 9.37 kcal / mol, cao hơn của colchicine và combretastatin A-4. Liên kết cộng hóa trị không quan sát thấy với hợp chất 82 bao gồm Leu242, Leu248, Lys254, Leu255, Ala316, Val318, Lys352, Ala354 (Loại liên kết pi- alkyl); Cys241 (loại liên kết Pi- S); Thr239 (liên kết hydro cacbon) và liên kết được ổn 90 định hơn nữa bằng một liên kết hydro với Ala250 là cùng năng lượng tương tác như hợp chất 102. Theo tiêu chí xếp hạng của AutoDock 4.2.6, giá trị càng âm của năng lượng thì khả năng liên kết của hợp chất với thụ thể nhắm mục tiêu càng tốt. Hợp chất 102 và 82 được chứng minh là hai ứng cử viên tiềm năng với năng lượng kết nối tốt cho cả hai mục tiêu và có thể được coi là chất ức chế kép COX2 / tubulin tiềm năng, các tương tác của chúng được phân tích thêm bằng cách sử dụng mô hình Studio Visualizer. Tính toán thu được kết quả có thể được sử dụng để dự đoán chất ức chế tốt hơn cho mô hình protein dựa trên độ lệch (Δ) giữa giá trị tương tác của COX2 và tubulin (Phương trình 1–2). Đặc biệt, tất cả các hợp chất có giá trị liên kết gắn với COX2 âm hơn là liên kết với tubulin (Bảng 3.14). Phối tử cho thấy tỷ lệ gắn kết năng lượng và tổng số nguyên tử (không kể nguyên tử hiđro) [130]. Điều này có thể được gây ra do sự khác biệt về cấu trúc giữa vị trí liên kết của hai protein và do đó gợi ý rằng các hợp chất được thiết kế này có lợi cho liên kết với COX2 nhiều hơn tubulin. Docking của hợp chất 102 với COX2 cho thấy ba tương tác liên kết hydro giữa nhóm sulfonamid (NH2) và Gln178, Leu338, Phe504 (khoảng cách = 2.71; 2.93; 3.33 Å, tương ứng), trong khi vị trí liên kết của tubulin chỉ ra rằng nhóm này tạo ra ba liên kết hydro với Asn258, Met259, Lys352 (khoảng cách = 2.91; 3.20; Tương ứng là 2.86 Å). Ngoài ra, sự tương tác giữa hợp chất 102 và tubulin được tăng cường hơn nữa thông qua hai liên kết hydro do trimethoxybenzen với Asn101, Ala250. Phân tích liên kết của hợp chất 82 cũng chỉ ra các liên kết hydro được hình thành bởi nhóm etyl este (CO2C2H5) với Arg106 của COX2 và Ala250 của tubulin (khoảng cách = 2.99; 3.18 Å, tương ứng); đặc biệt là NO2 của 82 đã liên kết với Phe504 của COX2. Liên kết này hỗ trợ giả định rằng nhóm sulfonamit và etyl este đóng vai trò quan trọng đối với hoạt động kép của các hợp chất 102 và 82. Mặt khác, trimethoxybenzen và các nhóm thế aryl được giả định là đặc trưng cho đặc điểm liên kết của mỗi hợp chất với mục tiêu protein. Bảng 3.13. Tập hợp các hợp chất được thiết kế với điểm kết nối tương ứng trên hai mô hình protein (kcal/mol) 91 Hợp chất Năng lƣợng (kcal/mol) COX2 (3LN1) Tubulin (1Z2B) 102 -11.90 -8.06 82 -11.92 -9.37 Combretastatin A-4 -9.63 -7.75 Colchicin - -8.06 Celecoxib -11.50 - (A) (B) (C) (D) Hình 3.6. Các dạng liên kết hydro của các hợp chất với protein COX2 (PDB ID: 3LN1) và tubulin (PDB ID: 1Z2B). (A) chất 102 với COX2; (B) Chất lượng 102 với tubulin; (C) chất 82 với COX2; (D) Hợp chất 82 với tubulin. 92 (A) (B) (C) (D) 93 Hình 3.7. Vị trí gắn kết 2D của các hợp chất được thiết kế với protein COX2 PDB ID: 3LN1) và tubulin (PDB ID: 1Z2B). (A) hợp chất 102 với COX2; (B) hợp chất 102 với tubulin; (C) hợp chất 82 với COX2; (D) hợp chất 82 với tubulin Docking 82 –COX2 Docking 82 – tubulin Docking 102 – COX2 Docking 102 -tubulin 94 82 –COX2 82 – tubulin 102- COX2 102 -tubulin Hinh 3.8. Hình ảnh stereo các mẫu chất Bảng 3.14. Tương tác bộ hợp chất, phối tử trên COX2 (ID: 3LN1) và mô hình protein tubulin (ID: 1Z2B) Hợp chất thiết kế Năng lượng liên kết (LE) COX2 Tubulin ΔLE 102 - 0.38 - 0.26 -0.12 82 - 0.38 - 0.30 -0.08 Combretatin A4 - 0.42 - 0.34 -0.08 95 Colchicin - - 0.28 - Celecoxib - 0.44 - - 3.5. Thảo luận Sản phẩm thu được là các dẫn xuất pyrazol được thay thế bằng aryl mới được tổng hợp cấu trúc giống với cis-diphenylethylen. Qua nghiên cứu hoạt tính sinh học và cơ chế kháng viêm cùng kháng ung thư cho thấy, trong các chất thu được có 2 chất, là các chất 82 và 102 thể hiện hoạt tính chống tăng sinh cũng như chống viêm mạnh. Hai chất lai này đều có tác dụng ức chế đồng thời sản xuất prostaglandin E2 (PGE2) trong các tế bào RAW 264,7 của đại thực bào được kích hoạt LPS và sự tiến triển chu kỳ tế bào bị ức chế của các tế bào MCF7 ở các pha G2 /M hoặc G0 /G1. Riêng chất 102 có hoạt tính gây apoptosis thông qua hoạt hóa caspase-3. Hơn nữa, qua mô hình docking phân tử cho thấy, cả hai chất cho thấy năng lượng gắn kết tốt với cả mục tiêu protein COX-2 và tubulin trong tương tác phân tử mẫu. Qua đó, có thể đưa ra một số điểm lưu ý về cấu trúc và hoạt tính của phân tử lai như sau: Cấu hình cis-diphenylethylene của celecoxib hoặc combretastatin A-4 cũng như các nhóm chức năng như ethyl nhóm este và sulfonamit, CF3 có thể được coi là đặc điểm tiềm năng cho hoạt tính kép của các hợp chất đã nghiên cứu và đối với sự có mặt của nhóm trimethoxybenzene vẫn là đặc điểm quan trọng để làm tăng hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất lai mới. Sản phẩm 2 chất lai 82 và 102 thể hiện những hoạt tính kháng viêm và kháng ung thư lý thú, nên được nghiên cứu và bổ sung thêm những dẫn chất có cấu hình tương tự. Tuy nhiên, do khối lượng công việc cũng như thời gian hạn chế trong khuôn khổ của luận án, do vậy nhóm nghiên cứu vẫn chưa tiến hành tổng hợp cũng như phát triển thêm được nhiều các dẫn chất mới xoay quanh cấu trúc thể hiện mạnh hoạt tính sinh học này. 96 KẾT LUẬN Luận án đã đạt đƣợc những kết quả chính nhƣ sau: 1. Đã thiết kế và tiến hành tổng hợp thành công 41 hợp chất lai mới. Trong đó có 20 chất lai coxib - combretastatin dạng este, 20 hợp chất lai coxib - combretastatin dạng axit, 01 hợp chất lai coxib – combretastatin chứa nhóm CF3 2. Đã đánh giá hoạt tính sinh học 22 chất trên các dòng tế bào ung thư ở người HT- 29, Hep-G2, MCF-7 và ức chế sản sinh NO. Trong đó có 12 chất 102, 96, 81, 82, 94, 93, 91, 92, 89, 90, 97, 85 thể hiện hoạt tính nổi trội so với chất gốc celecoxib, 05 chất 102, 96, 81, 82, 94 có hoạt tính IC50 < 10 µM 3. Đã đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO và ung thư vú MCF-7 đối với các chất lai coxib – combretastatin dạng gốc axit và tiến hành so sánh hoạt tính với các chất lai coxib – combretastatin dạng gốc este. Tuy nhiên, kết quả cho thấy chỉ có 02 chất 118 và 114 thể hiện độc tính tế bào trên các dòng MCF-7 mạnh hơn celecoxib và 02 chất 116 và 111 là tương đương với hoạt tính ức chế sản sinh NO của celecoxib. 4. Đã đánh giá hoạt tính kháng ung thư và kháng viêm 05 chất 102, 96, 81, 82, 94 và celecoxib thông qua xác định khả năng ức chế sản sinh PEG2, phân tích chu kỳ tế bào và hoạt tính gây apotosis thông qua xác định khả năng gây apotosis nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, bằng chỉ thị caspase ‑ 3 và trắc lưu tế bào. 5. Đã thu được 2 chất tiêu biểu là 82 và 102 là những phân tử đa đích sinh học, có hoạt tính nổi trội về hoạt tính kháng ung thư so với combretastatin và kháng viêm so với celecoxib, 6. Trên mô hình docking phân tử, đã khảng định hai chất 82 và 102 thể hiện hoạt tính kép với hai đích tác dụng tubulin và COX2 theo đúng mục tiêu thiết kế của luận án. 7. Các chất thu được đã được chứng minh là không độc với tế bào thường trên mô hình in vitro. Kiến nghị:. Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính kháng ung thư và kháng viêm của các hợp chất lai thu được và thử nghiệm lâm sàng để đưa ra các loại thuốc chống ung thư mới. 97 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Đã tổng hợp thành công 41 phân tử lai đa đích sinh học coxib – combretatastatin theo đúng mục tiêu thiết kế ban đầu. 2. Đã sàng lọc hoạt tính kháng viêm NO và kháng ung thư HepG2, HT-29, MCF7 của lớp chất lai mới. 3. Đã chứng minh cơ chế hoạt tính sinh học của các hợp chất lai với các mô hình in vitro 4. Đã khẳng định về mặt hoạt tính và phân tích tương tác sinh học với các đích tác dụng là tubulin và COX2 trên mô hình docking phân tử 98 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 1. Thuy Hang Nguyen Thi, Yen Tran Thi, Le Anh Nguyen, Ngoc Binh Vo, Quoc Anh Ngo. “Design, Synthesis and Biological Activities of New Pyrazole Derivatives Possessing Both Coxib and Combretastatins Pharmacophores”. Chem. Biodiversity, 2019. 2. Quoc Anh Ngo, Thuy Hang Nguyen Thi, Minh Quan Pham, Domenico Delfno, Thi Thao Do. “Antiproliferative and antiinfammatory coxib–combretastatin hybrids suppress cell cycle progression and induce apoptosis of MCF7 breast cancer cells” Molecular Diversity, 2020. 3. Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Lê Anh, Trần Thị Yến, Võ Ngọc Bình, Vũ Đình Hoàng, Ngô Quốc Anh. “Nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất lai ghép giữa combretastatin và celecoxib”. Tạp chí hóa học, 2017, 55(4E23), 235-239. 4. Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Lê Anh, Trần Thị Yến, Võ Ngọc Bình, Đỗ Trung Sỹ, Vũ Đình Hoàng, Ngô Quốc Anh. “Nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất lai ghép mới mô phỏng cấu trúc combretastatin”. Tạp chí hóa học, 2017, 55(5e34) 349-353. 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bode, A. M.; Dong, Z., Cancer prevention research—then and now. Nature Reviews Cancer, 2009, 9, (7), 508-516. 2. Zhan, P.; Liu, X., Designed multiple ligands: an emerging anti-HIV drug discovery paradigm. Current pharmaceutical design, 2009, 15, (16), 1893-1917. 3. Gediya, L. K.; Njar, V. C., Promise and challenges in drug discovery and development of hybrid anticancer drugs. Expert opinion on drug discovery, 2009, 4, (11), 1099-1111. 4. Dai, Z.-J.; Ma, X.-B.; Kang, H.-F.; Gao, J.; Min, W.-L.; Guan, H.-T.; Diao, Y.; Lu, W.-F.; Wang, X.-J., Antitumor activity of the selective cyclooxygenase-2 inhibitor, celecoxib, on breast cancer in vitro and in vivo. Cancer cell international, 2012, 12, (1), 1-8. 5. Grösch, S.; Tegeder, I.; Niederberger, E.; Bräutigam, L.; Geisslinger, G., COX‐2 independent induction of cell cycle arrest and apoptosis in colon cancer cells by the selective COX‐2 inhibitor celecoxib. The FASEB journal, 2001, 15, (14), 1-22. 6. Viegas-Junior, C.; Danuello, A.; da Silva Bolzani, V.; Barreiro, E. J.; Fraga, C. A. M., Molecular hybridization: a useful tool in the design of new drug prototypes. Current medicinal chemistry, 2007, 14, (17), 1829-1852. 7. Morphy, R.; Kay, C.; Rankovic, Z., From magic bullets to designed multiple ligands. Drug discovery today, 2004, 9, (15), 641-651. 8. Hulsman, N.; Medema, J. P.; Bos, C.; Jongejan, A.; Leurs, R.; Smit, M. J.; de Esch, I. J.; Richel, D.; Wijtmans, M., Chemical insights in the concept of hybrid drugs: the antitumor effect of nitric oxide-donating aspirin involves a quinone methide but not nitric oxide nor aspirin. Journal of medicinal chemistry, 2007, 50, (10), 2424-2431. 9. Lane, M. E.; Yu, B.; Rice, A.; Lipson, K. E.; Liang, C.; Sun, L.; Tang, C.; McMahon, G.; Pestell, R. G.; Wadler, S., A novel cdk2-selective inhibitor, SU9516, induces apoptosis in colon carcinoma cells. Cancer research, 2001, 61, (16), 6170- 6177. 100 10. Ma, J.; Li, S.; Reed, K.; Guo, P.; Gallo, J. M., Pharmacodynamic-mediated effects of the angiogenesis inhibitor SU5416 on the tumor disposition of temozolomide in subcutaneous and intracerebral glioma xenograft models. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2003, 305, (3), 833-839. 11. Sabet, R.; Mohammadpour, M.; Sadeghi, A.; Fassihi, A., QSAR study of isatin analogues as in vitro anti-cancer agents. European journal of medicinal chemistry, 2010, 45, (3), 1113-1118. 12. Singh, P.; Sharma, P.; Anand, A.; Bedi, P.; Kaur, T.; Saxena, A.; Kumar, V., Azide-alkyne cycloaddition en route to novel 1H-1, 2, 3-triazole tethered isatin conjugates with in vitro cytotoxic evaluation. European journal of medicinal chemistry, 2012, 55, 455-461. 13. Guibourt, N. J. B. G., Histoire abrégée des drogues simples. Société encyclographique des sciences médicales: 1839; Vol. 2. 14. Piazzi, L.; Cavalli, A.; Colizzi, F.; Belluti, F.; Bartolini, M.; Mancini, F.; Recanatini, M.; Andrisano, V.; Rampa, A., Multi-target-directed coumarin derivatives: hAChE and BACE1 inhibitors as potential anti-Alzheimer compounds. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2008, 18, (1), 423-426. 15. Amin, K. M.; Eissa, A. A.; Abou-Seri, S. M.; Awadallah, F. M.; Hassan, G. S., Synthesis and biological evaluation of novel coumarin–pyrazoline hybrids endowed with phenylsulfonyl moiety as antitumor agents. European Journal of Medicinal Chemistry, 2013, 60, 187-198. 16. Belluti, F.; Fontana, G.; Dal Bo, L.; Carenini, N.; Giommarelli, C.; Zunino, F., Design, synthesis and anticancer activities of stilbene-coumarin hybrid compounds: Identification of novel proapoptotic agents. Bioorganic & medicinal chemistry, 2010, 18, (10), 3543-3550. 17. Singh, K. Phytochemical determination and antibacterial activity of Trichosanthes dioica Roxb (Patal), Cucurbita Maxima (pumpkin) and Abelmoschus esculentus Moench (Okra) plant seeds. 2012. 101 18. Gupta, A.; Saha, P.; Descôteaux, C.; Leblanc, V.; Asselin, É.; Bérubé, G., Design, synthesis and biological evaluation of estradiol–chlorambucil hybrids as anticancer agents. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2010, 20, (5), 1614-1618. 19. Kuduk, S. D.; Zheng, F. F.; Sepp-Lorenzino, L.; Rosen, N.; Danishefsky, S. J., Synthesis and evaluation of geldanamycin-estradiol hybrids. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 1999, 9, (9), 1233-1238. 20. Kuduk, S. D.; Harris, C. R.; Zheng, F. F.; Sepp-Lorenzino, L.; Ouerfelli, Q.; Rosen, N.; Danishefsky, S. J., Synthesis and evaluation of geldanamycin–testosterone hybrids. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2000, 10, (11), 1303-1306. 21. Kumar, R.; Lown, J., Recent developments in novel pyrrolo [2, 1-c][1, 4] benzodiazepine conjugates: synthesis and biological evaluation. Mini reviews in medicinal chemistry, 2003, 3, (4), 323-339. 22. Bose, D. S.; Idrees, M.; Todewale, I. K.; Jakka, N.; Rao, J. V., Hybrids of privileged structures benzothiazoles and pyrrolo [2, 1-c][1, 4] benzodiazepin-5-one, and diversity-oriented synthesis of benzothiazoles. European journal of medicinal chemistry, 2012, 50, 27-38. 23. Kamal, A.; Srikanth, Y.; Ramaiah, M. J.; Khan, M. N. A.; Reddy, M. K.; Ashraf, M.; Lavanya, A.; Pushpavalli, S.; Pal-Bhadra, M., Synthesis, anticancer activity and apoptosis inducing ability of bisindole linked pyrrolo [2, 1-c][1, 4] benzodiazepine conjugates. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2012, 22, (1), 571-578. 24. Kim, M.-Y.; Na, Y.; Vankayalapati, H.; Gleason-Guzman, M.; Hurley, L. H., Design, synthesis, and evaluation of psorospermin/quinobenzoxazine hybrids as structurally novel antitumor agents. Journal of medicinal chemistry, 2003, 46, (14), 2958-2972. 25. Nepali, K.; Sharma, S.; Kumar, D.; Budhiraja, A.; L Dhar, K., Anticancer hybrids-a patent survey. Recent patents on anti-cancer drug discovery, 2014, 9, (3), 303-339. 26. Yang, X.-D.; Wan, W.-C.; Deng, X.-Y.; Li, Y.; Yang, L.-J.; Li, L.; Zhang, H.- B., Design, synthesis and cytotoxic activities of novel hybrid compounds between 2- 102 phenylbenzofuran and imidazole. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2012, 22, (8), 2726-2729. 27. Jordan, M. A.; Wilson, L., Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer, 2004, 4, (4), 253-265. 28. Ducki, S.; Mackenzie, G.; Greedy, B.; Armitage, S.; Chabert, J. F. D.; Bennett, E.; Nettles, J.; Snyder, J. P.; Lawrence, N. J., Combretastatin-like chalcones as inhibitors of microtubule polymerisation. Part 2: Structure-based discovery of alpha- aryl chalcones. Bioorganic & medicinal chemistry, 2009, 17, (22), 7711-7722. 29. Downing, K. H., Structural basis for the interaction of tubulin with proteins and drugs that affect microtubule dynamics. Annual review of cell and developmental biology, 2000, 16, (1), 89-111. 30. Kaur, R.; Kaur, G.; Gill, R. K.; Soni, R.; Bariwal, J., Recent developments in tubulin polymerization inhibitors: An overview. European journal of medicinal chemistry, 2014, 87, 89-124. 31. Airy Shaw, H., A dictionary of the flowering plants and ferns. Cambridge: CUP, 1973. 32. Watt, J. M.; Breyer-brandwijk, M. G., The Medicinal and Poisonous Plants of Southern and Eastern Africa being an Account of their Medicinal and other Uses, Chemical Composition, Pharmacological Effects and Toxicology in Man and Animal. E. & S. Livingstone Ltd.: 16-17, Teviot Place, Edinburgh, 1962; p xii + 1457 pp. 33. Hartwell, J., Plants used against cancer (A survey) Quarterman Publications. Inc. Lawrence, Massachu setts, 1982, 408. 34. Cushman, M.; Nagarathnam, D.; Gopal, D.; Chakraborti, A. K.; Lin, C. M.; Hamel, E., Synthesis and evaluation of stilbene and dihydrostilbene derivatives as potential anticancer agents that inhibit tubulin polymerization. Journal of medicinal chemistry, 1991, 34, (8), 2579-2588. 35. Sackett, D. L., Podophyllotoxin, steganacin and combretastatin: natural products that bind at the colchicine site of tubulin. Pharmacology & therapeutics, 1993, 59, (2), 163-228. 103 36. Tozer, G. M.; Kanthou, C.; Parkins, C. S.; Hill, S. A., The biology of the combretastatins as tumour vascular targeting agents. International journal of experimental pathology, 2002, 83, (1), 21-38. 37. Parihar, S.; Kumar, A.; Chaturvedi, A. K.; Sachan, N. K.; Luqman, S.; Changkija, B.; Manohar, M.; Prakash, O.; Chanda, D.; Khan, F., Synthesis of combretastatin A4 analogues on steroidal framework and their anti-breast cancer activity. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 2013, 137, 332- 344. 38. Shen, L.; Yang, X.; Yang, B.; He, Q.; Hu, Y., Novel hybrids from lamellarin D and combretastatin A 4 as cytotoxic agents. European journal of medicinal chemistry, 2010, 45, (1), 11-18. 39. Kamal, A.; Mallareddy, A.; Ramaiah, M. J.; Pushpavalli, S.; Suresh, P.; Kishor, C.; Murty, J.; Rao, N. S.; Ghosh, S.; Addlagatta, A., Synthesis and biological evaluation of combretastatin-amidobenzothiazole conjugates as potential anticancer agents. European journal of medicinal chemistry, 2012, 56, 166-178. 40. Rasolofonjatovo, E.; Provot, O.; Hamze, A.; Bignon, J.; Thoret, S.; Brion, J.-D.; Alami, M., Regioselective hydrostannation of diarylalkynes directed by a labile ortho bromine atom: An easy access to stereodefined triarylolefins, hybrids of combretastatin A-4 and isocombretastatin A-4. European journal of medicinal chemistry, 2010, 45, (9), 3617-3626. 41. Nam, N.-H., Combretastatin A-4 analogues as antimitotic antitumor agents. Current medicinal chemistry, 2003, 10, (17), 1697-1722. 42. Levy, M.; Spino, M.; Read, S. E., Colchicine: a state‐of‐the‐art review. Pharmacotherapy: The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy, 1991, 11, (3), 196-211. 43. Bourdron, J.; Commeiras, L.; Barbier, P.; Bourgarel-Rey, V.; Pasquier, E.; Vanthuyne, N.; Hubaud, J.-C.; Peyrot, V.; Parrain, J.-L., Caulerpenyne–colchicine hybrid: Synthesis and biological evaluation. Bioorganic & medicinal chemistry, 2006, 14, (16), 5540-5548. 104 44. Malysheva, Y. B.; Combes, S.; Allegro, D.; Peyrot, V.; Knochel, P.; Gavryushin, A. E.; Fedorov, A. Y., Synthesis and biological evaluation of novel anticancer bivalent colchicine–tubulizine hybrids. Bioorganic & medicinal chemistry, 2012, 20, (14), 4271-4278. 45. Zefirova, O. N.; Nurieva, E. V.; Shishov, D. V.; Baskin, I. I.; Fuchs, F.; Lemcke, H.; Schröder, F.; Weiss, D. G.; Zefirov, N. S.; Kuznetsov, S. A., Synthesis and SAR requirements of adamantane–colchicine conjugates with both microtubule depolymerizing and tubulin clustering activities. Bioorganic & medicinal chemistry, 2011, 19, (18), 5529-5538. 46. Li, W.; Li, M.-f.; Yang, D.; Xu, R.; Zhang, Y.-r., Production of podophyllotaxin by root culture of Podophyllum hexandrum Royle. Electron J Biol, 2009, 5, (2), 34-9. 47. Hartwell, J.; Schrecker, A., The chemistry of Podophyllum. In Fortschritte der Chemie organischer Naturstoffe/Progress in the Chemistry of Organic Natural Products/Progrès dans la Chimie des Substances Organiques Naturelles, Springer: 1958; pp 83-166. 48. Damayanthi, Y.; Lown, J. W., Podophyllotoxins: current status and recent developments. Current medicinal chemistry, 1998, 5, 205-252. 49. Kamal, A.; Laxman, E.; Khanna, G. R.; Reddy, P.; Rehana, T.; Arifuddin, M.; Neelima, K.; Kondapi, A. K.; Dastidar, S. G., Design, synthesis, biological evaluation and QSAR studies of novel bisepipodophyllotoxins as cytotoxic agents. Bioorganic & medicinal chemistry, 2004, 12, (15), 4197-4209. 50. Kamal, A.; Suresh, P.; Ramaiah, M. J.; Mallareddy, A.; Kumar, B. A.; Raju, P.; Gopal, J. V.; Pushpavalli, S.; Lavanya, A.; Sarma, P., Synthesis and biological evaluation of 4β-acrylamidopodophyllotoxin congeners as DNA damaging agents. Bioorganic & medicinal chemistry, 2011, 19, (15), 4589-4600. 51. Sapra, S.; Bhalla, Y.; Sharma, S.; Singh, G.; Nepali, K.; Budhiraja, A.; Dhar, K. L., Colchicine and its various physicochemical and biological aspects. Medicinal Chemistry Research, 2013, 22, (2), 531-547. 105 52. Kamal, A.; Ramakrishna, G.; Raju, P.; Viswanath, A.; Ramaiah, M. J.; Balakishan, G.; Pal-Bhadra, M., Synthesis and anti-cancer activity of chalcone linked imidazolones. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2010, 20, (16), 4865-4869. 53. Nagaraju, M.; Deepthi, E. G.; Ashwini, C.; Vishnuvardhan, M.; Nayak, V. L.; Chandra, R.; Ramakrishna, S.; Gawali, B., Synthesis and selective cytotoxic activity of novel hybrid chalcones against prostate cancer cells. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2012, 22, (13), 4314-4317. 54. Overmeyer, J. H.; Young, A. M.; Bhanot, H.; Maltese, W. A., A chalcone- related small molecule that induces methuosis, a novel form of non-apoptotic cell death, in glioblastoma cells. Molecular Cancer, 2011, 10, (1), 69. 55. Nepali, K.; Ojha, R.; Sharma, S.; MS Bedi, P.; L Dhar, K., Tubulin inhibitors: a patent survey. Recent patents on anti-cancer drug discovery, 2014, 9, (2), 176-220. 56. Wittman, M. D.; Kadow, J. F.; Vyas, D. M.; Lee, F. L.; Rose, W. C.; Long, B. H.; Fairchild, C.; Johnston, K., Synthesis and antitumor activity of novel paclitaxel– chlorambucil hybrids. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2001, 11, (6), 811- 814. 57. Smith, A. B.; Sugasawa, K.; Atasoylu, O.; Yang, C.-P. H.; Horwitz, S. B., Design and Synthesis of (+)-Discodermolide–Paclitaxel Hybrids Leading to Enhanced Biological Activity. Journal of Medicinal Chemistry, 2011, 54, (18), 6319-6327. 58. Smith III, A. B.; Sugasawa, K.; Atasoylu, O.; Yang, C.-P. H.; Horwitz, S. B., Design and synthesis of (+)-discodermolide–paclitaxel hybrids leading to enhanced biological activity. Journal of medicinal chemistry, 2011, 54, (18), 6319-6327. 59. Huang, G. S.; Lopez-Barcons, L.; Freeze, B. S.; Smith, A. B.; Goldberg, G. L.; Horwitz, S. B.; McDaid, H. M., Potentiation of taxol efficacy by discodermolide in ovarian carcinoma xenograft-bearing mice. Clinical cancer research, 2006, 12, (1), 298-304. 60. Khrapunovich-Baine, M.; Menon, V.; Verdier-Pinard, P.; Smith III, A. B.; Angeletti, R. H.; Fiser, A.; Horwitz, S. B.; Xiao, H., Distinct pose of discodermolide in taxol binding pocket drives a complementary mode of microtubule stabilization. Biochemistry, 2009, 48, (49), 11664-11677. 106 61. Ngo, Q. A.; Roussi, F.; Cormier, A.; Thoret, S.; Knossow, M.; Guénard, D.; Guéritte, F., Synthesis and biological evaluation of vinca alkaloids and phomopsin hybrids. Journal of Medicinal Chemistry, 2009, 52, (1), 134-142. 62. Nogales, E., A structural view of microtubule dynamics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, 1999, 56, (1-2), 133-142. 63. Wilson, L.; Jordan, M.; Morse, A.; Margolis, R., Interaction of vinblastine with steady-state microtubules in vitro. Journal of molecular biology, 1982, 159, (1), 125- 149. 64. Passarella, D.; Giardini, A.; Peretto, B.; Fontana, G.; Sacchetti, A.; Silvani, A.; Ronchi, C.; Cappelletti, G.; Cartelli, D.; Borlak, J., Inhibitors of tubulin polymerization: Synthesis and biological evaluation of hybrids of vindoline, anhydrovinblastine and vinorelbine with thiocolchicine, podophyllotoxin and baccatin III. Bioorganic & medicinal chemistry, 2008, 16, (11), 6269-6285. 65. Lin, C. M.; Singh, S.; Chu, P.; Dempcy, R.; Schmidt, J.; Pettit, G.; Hamel, E., Interactions of tubulin with potent natural and synthetic analogs of the antimitotic agent combretastatin: a structure-activity study. Molecular pharmacology, 1988, 34, (2), 200-208. 66. Pettit, G. R.; Lippert, J. W., 3rd, Antineoplastic agents 429. Syntheses of the combretastatin A-1 and combretastatin B-1 prodrugs. Anticancer Drug Des, 2000, 15, (3), 203-16. 67. Pinney, K. G.; Jelinek, C.; Edvardsen, K.; Chaplin, D. J.; Pettit, G. R., The discovery and development of the combretastatins. Anticancer agents from natural products, 2005, 23-46. 68. Pettit, G.; Lippert, J., Preparation of combretastatin A-1 phosphate and combretastatin B-1 phosphate prodrugs with increased solubility, PCT Int. Application WO2001081355 A, 1, 2001. 69. Pettit, G.; Minardi, M., Preparation of combretastatin A3 diphosphate prodrugs for the treatment of cancer, PCT Int. Application WO2002102766 A, 2, 2002. 70. Pinney, K. G.; Mejia, M. P.; Villalobos, V. M.; Rosenquist, B. E.; Pettit, G. R.; Verdier-Pinard, P.; Hamel, E., Synthesis and biological evaluation of aryl azide 107 derivatives of combretastatin A-4 as molecular probes for tubulin. Bioorganic & medicinal chemistry, 2000, 8, (10), 2417-2425. 71. Ohsumi, K.; Hatanaka, T.; Nakagawa, R.; Fukuda, Y.; Morinaga, Y.; Suga, Y.; Nihei, Y.; Ohishi, K.; Akiyama, Y.; Tsuji, T., Synthesis and antitumor activities of amino acid prodrugs of amino-combretastatins. Anti-Cancer Drug Design, 1999, 14, (6), 539-548. 72. Hadimani, M. B., Studies toward the discovery of new classes of privileged molecules as colchicine-site binding ligands for tubulin: Structure-based design, synthesis and bioactivity of small ligands targeted at tumor vasculature. Baylor University: 2004. 73. Pettit, G. R.; Anderson, C. R.; Herald, D. L.; Jung, M. K.; Lee, D. J.; Hamel, E.; Pettit, R. K., Antineoplastic agents. 487. Synthesis and biological evaluation of the antineoplastic agent 3, 4-methylenedioxy-5, 4 ‘-dimethoxy-3 ‘-amino-Z-stilbene and derived amino acid amides. Journal of medicinal chemistry, 2003, 46, (4), 525-531. 74. Lawrence, N. J.; Hepworth, L. A.; Rennison, D.; McGown, A. T.; Hadfield, J. A., Synthesis and anticancer activity of fluorinated analogues of combretastatin A-4. Journal of fluorine chemistry, 2003, 123, (1), 101-108. 75. Davis, P. D., Compositions with vascular damaging activity. Google Patents: 2006. 76. Gaukroger, K.; Hadfield, J. A.; Lawrence, N. J.; Nolan, S.; McGown, A. T., Structural requirements for the interaction of combretastatins with tubulin: how important is the trimethoxy unit? Organic & biomolecular chemistry, 2003, 1, (17), 3033-3037. 77. Cragg, G. M.; Kingston, D. G.; Newman, D. J., Anticancer agents from natural products. CRC press: 2011. 78. Janik, M. E.; Bane, S. L., Synthesis and antimicrotubule activity of combretatropone derivatives. Bioorganic & medicinal chemistry, 2002, 10, (6), 1895- 1903. 79. Pinney, K.; Mocharla, V.; Chen, Z.; Garner, C.; Ghatak, A.; Hadimani, M.; Kessler, J.; Dorsey, J.; Edvardsen, K.; Chaplin, D., 8. Preparation of aryl and 108 arylcarbonylbenzothiophenes,-benzofurans,-indenes, and-indoles as tubulin binding ligands and corresponding prodrug constructs thereof useful as antitumor agents. US Patent Appl. Publ. 20040043969 A, 2004, 1. 80. Álvarez, R.; Álvarez, C.; Mollinedo, F.; Sierra, B. G.; Medarde, M.; Peláez, R., Isocombretastatins A: 1,1-Diarylethenes as potent inhibitors of tubulin polymerization and cytotoxic compounds. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2009, 17, (17), 6422- 6431. 81. Jiménez, C.; Ellahioui, Y.; Álvarez, R.; Aramburu, L.; Riesco, A.; González, M.; Vicente, A.; Dahdouh, A.; Ibn Mansour, A.; Jiménez, C.; Martín, D.; Sarmiento, R. G.; Medarde, M.; Caballero, E.; Peláez, R., Exploring the size adaptability of the B ring binding zone of the colchicine site of tubulin with para-nitrogen substituted isocombretastatins. European journal of medicinal chemistry, 2015, 100, 210-222. 82. Holwell, S.; Cooper, P.; Thompson, M.; Pettit, G.; Lippert, J.; Martin, S.; Bibby, M., Anti-tumor and anti-vascular effects of the novel tubulin-binding agent combretastatin A-1 phosphate. Anticancer research, 2002, 22, (6 C), 3933-3940. 83. Hill, S. A.; Toze, G.; Pettit, G. R.; Chaplin, D. J., Preclinical evaluation of the antitumour activity of the novel vascular targeting agent Oxi 4503. Anticancer research, 2002, 22, (3), 1453-1458. 84. Shnyder, S.; Cooper, P.; Pettit, G.; Bibby, M., Combretastatin A-1 phosphate potentiates the antitumour activity of cisplatin in a murine adenocarcinoma model. Anticancer research, 2003, 23, (2B), 1619-1623. 85. Hua, J.; Sheng, Y.; Pinney, K. G.; Garner, C. M.; Kane, R. R.; Prezioso, J. A.; Pettit, G. R.; Chaplin, D. J.; Edvardsen, K., Oxi4503, a novel vascular targeting agent: effects on blood flow and antitumor activity in comparison to combretastatin A-4 phosphate. Anticancer research, 2003, 23, (2B), 1433-1440. 86. Kirwan, I. G.; Loadman, P. M.; Swaine, D. J.; Anthoney, D. A.; Pettit, G. R.; Lippert, J. W.; Shnyder, S. D.; Cooper, P. A.; Bibby, M. C., Comparative preclinical pharmacokinetic and metabolic studies of the combretastatin prodrugs combretastatin A4 phosphate and A1 phosphate. Clinical Cancer Research, 2004, 10, (4), 1446-1453. 109 87. Guerram, M.; JIANG, Z.-Z.; Zhang, L.-Y., Podophyllotoxin, a medicinal agent of plant origin: past, present and future. Chinese Journal of Natural Medicines, 2012, 10, (3), 161-169. 88. Banday, A. H.; Kulkarni, V. V.; Hruby, V. J., Design, synthesis, and biological and docking studies of novel epipodophyllotoxin–chalcone hybrids as potential anticancer agents. MedChemComm, 2015, 6, (1), 94-104. 89. Ameen, D.; Snape, T. J., Chiral 1, 1-diaryl compounds as important pharmacophores. MedChemComm, 2013, 4, (6), 893-907. 90. Patterson, D.; Rustin, G.; Serradell, N.; Rosa, E.; Bolos, J., Combretastatin A-4 phosphate. Drugs Future, 2007, 32, 1025-1032. 91. Rimando, A. M.; Suh, N., Biological/chemopreventive activity of stilbenes and their effect on colon cancer. 2008. 92. Griggs, J.; Metcalfe, J. C.; Hesketh, R., Targeting tumour vasculature: the development of combretastatin A4. The lancet oncology, 2001, 2, (2), 82-87. 93. Kluza, J.; Gallego, M.-A.; Loyens, A.; Beauvillain, J.-C.; Sousa-Faro, J.-M. F.; Cuevas, C.; Marchetti, P.; Bailly, C., Cancer cell mitochondria are direct proapoptotic targets for the marine antitumor drug lamellarin D. Cancer Research, 2006, 66, (6), 3177-3187. 94. Banwell, M. G.; Hamel, E.; Hockless, D. C.; Verdier-Pinard, P.; Willis, A. C.; Wong, D. J., 4, 5-Diaryl-1H-pyrrole-2-carboxylates as combretastatin A-4/lamellarin T hybrids: Synthesis and evaluation as anti-mitotic and cytotoxic agents. Bioorganic & medicinal chemistry, 2006, 14, (13), 4627-4638. 95. Sharma, V.; Bhatia, P.; Alam, O.; Javed Naim, M.; Nawaz, F.; Ahmad Sheikh, A.; Jha, M., Recent advancement in the discovery and development of COX-2 inhibitors: Insight into biological activities and SAR studies (2008–2019). Bioorganic Chemistry, 2019, 89, 103007. 96. Xu, X.-C., COX-2 inhibitors in cancer treatment and prevention, a recent development. Anti-cancer drugs, 2002, 13, (2), 127-137. 110 97. Fustero, S.; Sanchez-Rosello, M.; Barrio, P.; Simon-Fuentes, A., From 2000 to mid-2010: a fruitful decade for the synthesis of pyrazoles. Chemical reviews, 2011, 111, (11), 6984-7034. 98. Ansari, A.; Ali, A.; Asif, M., Biologically active pyrazole derivatives. New Journal of Chemistry, 2017, 41, (1), 16-41. 99. Murahari, M.; Mahajan, V.; Neeladri, S.; Kumar, M. S.; Mayur, Y. C., Ligand based design and synthesis of pyrazole based derivatives as selective COX-2 inhibitors. Bioorganic Chemistry, 2019, 86, 583-597. 100. Brullo, C.; Massa, M.; Rapetti, F.; Alfei, S.; Bertolotto, M. B.; Montecucco, F.; Signorello, M. G.; Bruno, O., New hybrid pyrazole and imidazopyrazole antinflammatory agents able to reduce ROS production in different biological targets. Molecules, 2020, 25, (4), 899. 101. Punganuru, S. R.; Madala, H. R.; Mikelis, C. M.; Dixit, A.; Arutla, V.; Srivenugopal, K. S., Conception, synthesis, and characterization of a rofecoxib- combretastatin hybrid drug with potent cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibiting and microtubule disrupting activities in colon cancer cell culture and xenograft models. Oncotarget, 2018, 9, (40), 26109. 102. Nayak, N.; Ramprasad, J.; Dalimba, U., Synthesis and antitubercular and antibacterial activity of some active fluorine containing quinoline–pyrazole hybrid derivatives. Journal of Fluorine Chemistry, 2016, 183, 59-68. 103. Alegaon, S. G.; Hirpara, M. B.; Alagawadi, K. R.; Hullatti, K. K.; Kashniyal, K., Synthesis of novel pyrazole–thiadiazole hybrid as potential potent and selective cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2014, 24, (22), 5324-5329. 104. Zhang, X.; Chen, J.; Davis, B.; Kiechle, F., Hoechst 33342 induces apoptosis in HL-60 cells and inhibits topoisomerase I in vivo. Archives of Pathology and Laboratory Medicine, 1999, 123, (10), 921-927. 105. Mcmartin, C.; Bohacek, R. S., QXP: powerful, rapid computer algorithms for structure-based drug design. Journal of computer-aided molecular design, 1997, 11, (4), 333-344. 111 106. Schnecke, V.; Kuhn, L. A., Virtual screening with solvation and ligand-induced complementarity. In Virtual Screening: An Alternative or Complement to High Throughput Screening?, Springer: 2000; pp 171-190. 107. Fu, R.-g.; Sun, Y.; Sheng, W.-b.; Liao, D.-f., Designing multi-targeted agents: an emerging anticancer drug discovery paradigm. European journal of medicinal chemistry, 2017, 136, 195-211. 108. Ohsumi, K.; Hatanaka, T.; Fujita, K.; Nakagawa, R.; Fukuda, Y.; Nihei, Y.; Suga, Y.; Morinaga, Y.; Akiyama, Y.; Tsuji, T., Syntheses and antitumor activity of cis-restricted combretastatins: 5-membered heterocyclic analogues. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 1998, 8, (22), 3153-3158. 109. Kurumbail, R. G.; Stevens, A. M.; Gierse, J. K.; McDonald, J. J.; Stegeman, R. A.; Pak, J. Y.; Gildehaus, D.; Penning, T. D.; Seibert, K.; Isakson, P. C., Structural basis for selective inhibition of cyclooxygenase-2 by anti-inflammatory agents. Nature, 1996, 384, (6610), 644-648. 110. Lala, P. K.; Chakraborty, C., Role of nitric oxide in carcinogenesis and tumour progression. The lancet oncology, 2001, 2, (3), 149-156. 111. Del Grosso, E.; Boschi, D.; Lazzarato, L.; Cena, C.; Di Stilo, A.; Fruttero, R.; Moro, S.; Gasco, A., The Furoxan System: Design of Selective Nitric Oxide (NO) Donor Inhibitors of COX‐2 Endowed with Anti‐Aggregatory and Vasodilating Activities. Chemistry & biodiversity, 2005, 2, (7), 886-900. 112. Boschi, D.; Lazzarato, L.; Rolando, B.; Filieri, A.; Cena, C.; Di Stilo, A.; Fruttero, R.; Gasco, A., Nitrooxymethyl‐Substituted Analogues of Celecoxib: Synthesis and Pharmacological Characterization. Chemistry & Biodiversity, 2009, 6, (3), 369- 379. 113. Bozzo, F.; Bassignana, A.; Lazzarato, L.; Boschi, D.; Gasco, A.; Bocca, C.; Miglietta, A., Novel nitro-oxy derivatives of celecoxib for the regulation of colon cancer cell growth. Chemico-biological interactions, 2009, 182, (2-3), 183-190. 114. Bocca, C.; Bozzo, F.; Bassignana, A.; Miglietta, A., Antiproliferative effects of COX-2 inhibitor celecoxib on human breast cancer cell lines. Molecular and cellular biochemistry, 2011, 350, (1-2), 59-70. 112 115. Bennett, A., The production of prostanoids in human cancers, and their implications for tumor progression. Progress in lipid research, 1986, 25, 539-542. 116. Fulton, A. M.; Heppner, G. H., Relationships of prostaglandin E and natural killer sensitivity to metastatic potential in murine mammary adenocarcinomas. Cancer research, 1985, 45, (10), 4779-4784. 117. Schrey, M.; Patel, K., Prostaglandin E 2 production and metabolism in human breast cancer cells and breast fibroblasts. Regulation by inflammatory mediators. British Journal of Cancer, 1995, 72, (6), 1412-1419. 118. Rakesh, K.; Wang, S.-M.; Leng, J.; Ravindar, L.; Asiri, A. M.; Marwani, H. M.; Qin, H.-L., Recent development of sulfonyl or sulfonamide hybrids as potential anticancer agents: a key review. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents), 2018, 18, (4), 488-505. 119. Zhai, J.; Gu, C.; Jiang, J.; Zhang, S.; Liao, D.; Wang, L.; Zhu, D.; Ji, Y., A One‐ pot Approach to Ethyl 1, 4, 5‐Triaryl‐1H‐pyrazole‐3‐carboxylates via an Improved Claisen Condensation‐Knorr Reaction Sequence. Chinese Journal of Chemistry, 2013, 31, (12), 1526-1538. 120. Monks, A.; Scudiero, D.; Skehan, P.; Shoemaker, R.; Paull, K.; Vistica, D.; Hose, C.; Langley, J.; Cronise, P.; Vaigro-Wolff, A., Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines. JNCI: Journal of the National Cancer Institute, 1991, 83, (11), 757-766. 121. Waskewich, C.; Blumenthal, R. D.; Li, H.; Stein, R.; Goldenberg, D. M.; Burton, J., Celecoxib exhibits the greatest potency amongst cyclooxygenase (COX) inhibitors for growth inhibition of COX-2-negative hematopoietic and epithelial cell lines. Cancer research, 2002, 62, (7), 2029-2033. 122. Li, Y.; Niu, Y.; Wu, H.; Zhang, B.; Sun, Y.; Huang, H.; Li, Q.; Fan, L.; Liu, L.; Mei, Q., PC‐407, a celecoxib derivative, inhibited the growth of colorectal tumor in vitro and in vivo. Cancer science, 2009, 100, (12), 2451-2458. 123. Roy, K. R.; Reddy, G. V.; Maitreyi, L.; Agarwal, S.; Achari, C.; Vali, S.; Reddanna, P., Celecoxib inhibits MDR1 expression through COX-2-dependent 113 mechanism in human hepatocellular carcinoma (HepG2) cell line. Cancer chemotherapy and pharmacology, 2010, 65, (5), 903-911. 124. Cheenpracha, S.; Park, E.-J.; Rostama, B.; Pezzuto, J. M.; Chang, L. C., Inhibition of nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-activated murine macrophage RAW 264.7 cells by the norsesterterpene peroxide, epimuqubilin A. Marine drugs, 2010, 8, (3), 429-437. 125. Tarade, D.; Ma, D.; Pignanelli, C.; Mansour, F.; Simard, D.; van den Berg, S.; Gauld, J.; McNulty, J.; Pandey, S., Structurally simplified biphenyl combretastatin A4 derivatives retain in vitro anti-cancer activity dependent on mitotic arrest. Plos one, 2017, 12, (3), e0171806. 126. Belloc, F.; Dumain, P.; Boisseau, M. R.; Jalloustre, C.; Reiffers, J.; Bernard, P.; Lacombe, F., A flow cytometric method using Hoechst 33342 and propidium iodide for simultaneous cell cycle analysis and apoptosis determination in unfixed cells. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology, 1994, 17, (1), 59-65. 127. Porter, A., Jaenicke RU. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differ, 1999, 6, 99-104. 128. Van Engeland, M.; Nieland, L. J.; Ramaekers, F. C.; Schutte, B.; Reutelingsperger, C. P., Annexin V‐affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology, 1998, 31, (1), 1-9. 129. Pérez, D. J.; Díaz-Reval, M. I.; Obledo-Benicio, F.; Zakai, U. I.; Gómez- Sandoval, Z.; Razo-Hernández, R. S.; West, R.; Sumaya-Martínez, M. T.; Pineda- Urbina, K.; Ramos-Organillo, Á., Silicon containing ibuprofen derivatives with antioxidant and anti-inflammatory activities: An in vivo and in silico study. European Journal of Pharmacology, 2017, 814, 18-27. 130. Pérez, D. J.; Sarabia, O.; Villanueva-García, M.; Pineda-Urbina, K.; Ramos- Organillo, Á.; Gonzalez-Gonzalez, J.; Gómez-Sandoval, Z.; Razo-Hernández, R. S., In silico receptor-based drug design of X, Y-benzenesulfonamide derivatives as selective COX-2 inhibitors. Comptes Rendus Chimie, 2017, 20, (2), 169-180. 114