Luận án Nghiên cứu và sử dụng chế phẩm vi sinh vật bản địa đối kháng với một số nấm gây hại rễ cây hồ tiêu tại Đăk Lắk

C GAAGGCGGAT CTCTGGGCCG ATACTGACGC TGAGGAGCGA AAGTGTGGGG AGCGAACAGG ATTAGATACC CTGGTAGTCC ACGCCGTAAA CGTTGGGAAC TAGGTGTGGG CGACATTCTA CGTTGTCCGT GCCGCAGCTA ACGCATTAAG TTCCCCGCCT GGGGAGTACG GCCGCAAGGC TAAAACTCAA AGGTATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCGGCG GAGCATGTGG CTTAATTCGA CGCAACGCGA AGAACCTTAC CAAGGCTTTA CATACACCGG AAACATCCAG AGATGGGTGC CCCCTTGTGG TCGGTGTACA GGTGGTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTC GTGAGATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT GTTCTGTGTT GCCAGCATGC CCTTCGGGTT GATGGGGACT CACAGGAGAC TGCCGGGGTC AACTCGGAGG AAGGTGGGGA CGACGTCAAG TCATCATGCC CCTTATGTCT TGGGCTGCAC ACGTGCTACA ATGGCCGGTA CAATGAGCTG CGATACCGCG AGGTGGAGCG AATCTCAATA AGCCGGTCTC AGTTCGGATT GGGGTCTGCA ACTCGACCCC ATGAAGTCGG AGTCGCTAGT AATCGCAGAT CAGTATTGCT GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTC ACGTCACGAA AGTCGGTAAC ACCCGAAGTC GGTGGCCCAA CCCCTTGTGG GAGGGAGTCG TCGAAGGTGG GACTGGCGAT TGGGACGAAG TCGTAACAAG GTATCCGTAC GGAAGGA Trình tự gen 16S RNA riboxom của chủng xạ khuẩn CS2.6trk (1469 bp): CATTCACGGA GAGTTTGATC CTGGCTCAGG ACGAACGCTG GCGGCGTGCT TAACACATGC AAGTCGAACG ATGAACCACT TCGGTGGGGA TTAGTGGCGA ACGGGTGAGT AACACGTGGG CAATCTGCCC TTCACTCTGG GACAAGCCCT GGAAACGGGG TCTAATACCG GATACAACCA CTAGGGGCAT CTCTTGGTGG TGGAAAGCTC CGGCGGTGAA GGATGAGCCC GCGGCCTATC AGCTTGTTGG TGAGGTAACG GCTCACCAAG GCGACGACGG GTAGCCGGCC TGAGAGGGCA 15 CCGGCCACAC TGGGACTGAG ACACGGCCCA GACTCCTACG GGAGGCAGCA GTGGGGAATA TTGCACAATG GGCGAAAGCC TGATGCAGCG ACGCCGCGTG AGGGATGACG GCCTTCGGGT TGTAAACCTC TTTCAGCAGG GAAGAAGCGA AAGTGACGGT ACCTGCAGAA GAAGCGCCGG CTAACTACGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GTAGGGCGCG AGCGTTGTCC GGAATTATTG GGCGTAAAGA GCTCGTAGGC GGTCTGTCGC GTCGGATGTG AAAGCCCGGG GCTTAACCCC GGGTCTGCAT TCGATACGGG CAGACTAGAG TGTGGTAGGG GAGATCGGAA TTCCTGGTGT AGCGGTGAAA TGCGCAGATA TCAGGAGGAA CACCGGTGGC GAAGGCGGAT CTCTGGGCCA TTACTGACGC TGAGGAGCGA AAGCGTGGGG AGCGAACAGG ATTAGATACC CTGGTAGTCC ACGCCGTAAA CGGTGGGAAC TAGGTGTTGG CGACATTCCA CGTCGTCGGT GCCGCAGCTA ACGCATTAAG TTCCCCGCCT GGGGAGTACG GCCGCAAGGC TAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCAGCG GAGCATGTGG CTTAATTCGA CGCAACGCGA AGAACCTTAC CAAGGCTTGA CATACACCGG AAACGGCCAG AGATGGTCGC CCCCTTGTGG TCGGTGTACA GGTGGTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTC GTGAGATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT GTTCTGTGTT GCCAGCATGC CCTTCGGGGT GATGGGGACT CACAGGAGAC TGCCGGGGTC AACTCGGAGG AAGGTGGGGA CGACGTCAAG TCATCATGCC CCTTATGTCT TGGGCTGCAC ACGTGCTACA ATGGCAGGTA CAATGAGCTG CGAAGCCGTG AGGCGGAGCG AATCTCAAAA AGCCTGTCTC AGTTCGGATT GGGGTCTGCA ACTCGACCCC ATGAAGTCGG AGTTGCTAGT AATCGCAGAT CAGCAGTGCT GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTC ACGTCACGAA AGTCGGTAAC ACCCGAAGCC GGTGGCCCAA CCCCTTGTGG GAGGGAGCTG TCGAAGGTGG GACTGGCGA Trình tự gen 16S RNA riboxom của chủng vi khuẩn CM5.5 crk (1260 bp): TCGCTGGGGG CGCCTAACCA TGCAAGTCGA GCGGCAGCGG AAAGTAGCTT GCTACTTTGC CGGCGAGCGG CGGACGGGTG AGTAATGTCT GGGAAACTGC CTGATGGAGG GGGATAACTA CTGGAAACGG TAGCTAATAC CGCATAACGT CGCAAGACCA AAGAGGGGGA CCTTCGGGCC TCTTGCCATC AGATGTGCCC AGATGGGATT AGCTAGTAGG TGGGGTAACG GCTCACCTAG GCGACGATCC CTAGCTGGTC TGAGAGGATG ACCAGCCACA CTGGAACTGA GACACGGTCC AGACTCCTAC GGGAGGCAGC AGTGGGGAAT ATTGCACAAT GGGCGCAAGC CTGATGCAGC CATGCCGCGT GTATGAAGAA GGCCTTCGGG TTGTAAAGTA CTTTCAGCGG GGAGGAAGGC GGTGAGGTTA ATAACCTCAT CGATTGACGT TACCCGCAGA AGAAGCACCG GCTAACTCCG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA CGGAGGGTGC AAGCGTTAAT CGGAATTACT GGGCGTAAAG CGCACGCAGG CGGTCTGTCA AGTCGGATGT GAAATCCCCG GGCTCAACCT GGGAACTGCA 16 TTCGAAACTG GCAGGCTAGA GTCTTGTAGA GGGGGGTAGA ATTCCAGGTG TAGCGGTGAA ATGCGTAGAG ATCTGGAGGA ATACCGGTGG CGAAGGCGGC CCCCTGGACA AAGACTGACG CTCAGGTGCG AAAGCGTGGG GAGCAAACAG GATTAGATAC CCTGGTAGTC CACGCCGTAA ACGATGTCGA CTTGGAGGTT GTGCCCTTGA GGCGTGGCTT CCGGAGCTAA CGCGTTAAGT CGACCGCCTG GGGAGTACGG CCGCAAGGTT AAAACTCAAA TGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG AGCATGTGGT TTAATTCGAT GCAACGCGAA GAACCTTACC TACTCTTGAC ATCCAGAGAA CTTTCCAGAG ATGGATTGGT GCCTTCGGGA ACTCTGAGAC AGGTGCTGCA TGGCTGTCGT CAGCTCGTGT TGTGAAATGT TGGGTTAAGT CCCGCAACGA GCGCAACCCT TATCCTTTGT TGCCAGCGGT TCGGCCGGGA ACTCAAAGGA GACTGCCAGT GATAAACTGG AGGAAGGTGG GGATGACGTC AAGTCATCAT GGCCCTTACG AGTAGGGCTA CACACGTGCT ACAATGGCGC ATACAAAGAG AAGCGACCTC GCGAGAGCAA GCGGACCTCA TAAAGTGCGT Trình tự gen 16S ARN riboxom của chủng vi khuẩn CS1.5 trk (948 bp): ATGACTTGAC GTCATCCCCC ACACCTTCCT CCCAGTTTAT CAACTGGCAG TCTCCTTTGA GTTCCCCGGC CTAAACCGCT GGCAACAAAG GATAAGGGTT GCGCTCGTTG CGGGACTTAA CCCAACATTT CACAACACGA GCTGACGACA GCCATGCAGC ACCTGTCTCA CAGTTCCCCG AAGGCACCAA TCCATCTCTG GAAAGTTCTG TGGATGTCAA GACCAGGGTA AGGTTCTTCG CGTTGCATCG AATTAAACCA CATGCTCCAC CGCTTGTGCG GGCCCCCGTC AATTCATTTG AGTTTTAACC TTGCGGCCGT ACTCCCCAGG CGGTCGACTT AACGCGTTAG CTCCGGAAGC CACGCCTCAA GGGCACAACC TCCAAGTCGA CATCGTTTAC GGCGTGGACT ACCAGGGTAT CTAATCCTGT TTGCTCCCCA CGCTTTCGCA CCTGAGCGTC AGTCTTCGTC CAGGGGGCCG CCTTCGCCAC CGGTATTCCT CCAGATCTCT ACGCATTTCA CCGCTACACC TGGAATTCTA CCCCCCTCTA CGAGACTCAA GCCTGCCAGT TTCGGATGCA GTTCCCAGGT TGAGCCCGGG GATTTCACAT CCGACTTGAC AGACCGCCTG CGTGCGCTTT ACGCCCAGTA ATTCCGATTA ACGCTTGCAC CCTCCGTATT ACCGCGGCTG CTGGCACGGA GTTAGCCGGT GCTTCTTCTG CGGGTAACGT CAATCGACGC GGTTATTAAC CGCATCGCCT TCCTCCCCGC TGAAAGTACT TTACAACCCG AAGGCCTTCT TCATACACGC GGCATGGCTG CATCAGGCTT GCGCCCATTG TGCAATATTC CCCACTGCTG CCTCCCGTAG GAGTCTGGAC CGTGTCTCAG TTCCAGTGTG GCTGGTCATC CTCTCAGAAT CGTATCGTAC GTACCGTAGT CAATGGCA Trình tự gen 16S ARN riboxom của chủng vi khuẩn CM5 crk (1444 bp): AGCATGTATC ATGCAGTCGA GCGGAAGTTG GGAGCTTGCT CCCTGATGTT AGCGGCGGAC GGGTGAGTAA CACGTGGGTA ACCTGCCTGT AAGACTGGGA 17 TATCTCCGGG AAACCGGGGC TAATACCGGA TGGTTGTTTG AACCGCATGG TTCAAACATA AAAGGTGGCT TCGGCTATCA CTTACAGATG GACCCGCGGC GCATTAGCTA GTTGGTGAGG TAACGGCTCA CCAAGGCAAC GATGCGTTAG CCTGACCCTA AGAGAGGGTG ATTCGGCCAC CACTGGGACT GAGACACCGG CCCAGACTCC TACCGGGAGG CAGCAGTTGG GAATCTTCCG CAATGGACGA AAGTCTGACG GAGCAACGCC GCGTGAGTGA TGAAGGTTTT CGGATCGTAA AGTTCTGTTG TTAGGGAAGA ACAAGTACCG TTCGAATAGG GCGGTACCTT GACGGTACCT AACCAGAAAG CCACGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAG GTGGCAAGCG TTGTCCGGGA ATTATTGGGC GTAAAGGGCT CGTAGGCGGT TTCTTAAGTC TGATGTGAAA GCCCCCGGCT CAACCGGGGA GGGTCATTGG AAACTGGGGA ACTTGAGTGC AGAAGAGGAG AGTGGAATTC CACGTGTAGC GGTGAAATGC GTAGAGATGT GGAGGAACAC CAGTGGCGAA GGTGACTCTC TGGTCTGTAA CTGACGCTGA GGAGCGAAAG CGTGGGGAGC GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCTCG CCGTAAACGA TGAGTGCTAA GTGTTAGGGG GTTTCCGCCC CTTAGTGCTG CAGCTAACGC ATTAAGCACT CCTCCTGGGG AGTACGGTCG CAAGACTGAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG TCTTGACATC CTCTGACAAT CCTAGAGATA GGACGTCCCC TTCGGGGGCA GAGTGACAGG TGGTGCATGG TTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTTGA TCTTAGTTGC CAGCATTCAG TTGGGCACTC TAAGGTGACT GCCGGTGACA AACCGGAGAG AAGGTGGGGA TGACGTCAAA TCATCATGCC CCTTATGACC TGGGCTACAC ACGTGCTACA ATGGACAGAA CAAAGGGCAG CGAAACCGCG AGGTTAAGAC CAATCCCACA AATCTGTTCT CAGTTCGGAT CGCAGTCTGC AACTCGACTG CGTGAAGCTG GAATCGCTAG TAATCGCGGA TCAGCATGCC GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTC ACACCACGAG AGTTTGTAAC ACCCGAAGTC GGTGAGGTAA CCTTTAGAGC AGCCGCCAAA AAAG CGGTCGCAAG ACTGAAACTC AAAGGAATTG ACGGGGGCCC GCACAAGCGG TGGAGCATGT GGTTTAATTC GAAGCAACGC GAAGAACCTT ACCAGGTCTT GACATCCTCT G 18 CÂY PHẢ HỆ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT Cây phả hệ dựa trên trình tự 16SrRNA của các chủng đối kháng F.oxysporum và Rhizoctonia solani 19 PHỤ LỤC III. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VÀ THÔNG SỐ KỸ THUẬT LÊN MEN CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ĐƢỢC TUYỂN CHỌN Bảng 3.1. Một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn tuyển chọn Chủng Đặc tính CM5crk Bacillus subtilis Gram + Hình dạng tế bào Rod Sử dụng citrate - Phản ứng VP + Hoạt tính calataza + Hoạt tính oxidase - Tạo acid từ glucose + Thủy phân: Casein Tinh bột Gelatin Urea + + + - Tạo indole - Endospore + Sinh trƣởng ở NaCl7% + Khả năng khử nitrat - Bảng 3.2. Một số đặc điểm hình thái và sinh hóa của chủng xạ khuẩn Đặc điểm hình thái & sinh hóa CM5.11cđk (Streptomyces diastatomonogenes ) Khả năng đồng hóa: Glucose +++ 20 Đặc điểm hình thái & sinh hóa CM5.11cđk (Streptomyces diastatomonogenes ) Saccharose ++ Fructose +++ Lactose + Manitol ++ Xylose + Cellulose Rhamnose + - Khả năng chịu muối 10 % Khuẩn ti khì sinh Xám Cuống sinh bào tử Xoắn, bề mặt bào tử nhẵn Melanin (môi trƣờng ISP6) + Thủy phân: Casein + Tinh bột + CMC + Bảng 3.3. Một số đặc điểm hình thái và sinh hóa của 2 chủng nấm tuyển chọn Đặc điểm hình thái, sinh hóa P.oxalicum (N1CS1trk) Trên môi trƣờng Czapek Phía trên màu trắng nhẹ, phìa dƣới màu vàng nâu Trên môi trƣờng PDA Phìa trên có màu xanh oliu, phìa dƣới có màu vàng kem Sợi nấm Có vách, có nhiều cấu trúc bào tử vô tính Bào tử Hình oval, mịn Khả năng đồng hóa: 21 Đặc điểm hình thái, sinh hóa P.oxalicum (N1CS1trk) Glucose + Fructose + Sucrose Lactose Manitol Galactose + + + + Sinh enzyme: Protease + Cellulase + Amylase + Thủy phân gelatin + Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng lên sinh trƣởng của Bacillus CM5crk(CFU/mL) Thời gian (giờ) Bacillus CM5crk MTBS2 MTBS3 MTBS5 MTBM4.3 0 0,7x10 5 0,7x10 5 0,7x10 5 0,7x10 5 20 1,8x10 6 5,0x10 5 3,6x10 5 1,9x10 6 30 2,3x10 6 1,7x10 6 1,8x10 6 2,0x10 8 35 4,9x10 7 1,9x10 7 1,3x10 7 4,8x10 8 40 1,7x10 8 5,4x10 8 1,7x10 8 2,5x10 9 48 1,3x10 8 2,0x10 8 4,7x10 8 1,7x10 9 22 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sinh trƣởng của chủng BacillusCM5crk Thời gian nuôi cấy (giờ) Mật độ vi khuẩn (CFU/mL) 25 o C 30 o C 35 o C 37 o C 40 o C 45 o C 0 1,1x10 5 1,1x10 5 1,1x10 5 1,1x10 5 1,1x10 5 1,1x10 5 24 4,1x10 6 2,5x10 7 1,0x10 7 3,4x10 7 1,4x10 5 2,1x10 5 30 1,1x10 7 3,4x10 8 1,6x10 8 2,9x10 8 2,1x10 5 3,6x10 5 35 2,4x10 8 2,3x10 9 3,9x10 9 4,0x10 9 2,3x10 5 4,1x10 5 40 5,7x10 8 3,6x10 9 4,3x10 9 4,6x10 9 3,2x10 5 1,2x10 5 48 4,6x10 8 3,2x10 9 3,8x10 8 3,9x10 8 1,9x10 5 2,0x10 4 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của pH lên sinh trƣởng của chủng BacillusCM5crk Thời gian nuôi cấy (giờ) Mật độ vi khuẩn (CFU/mL) pH 6,0 pH 6,5 pH 7,0 pH 7,5 pH 8,0 0 1,0x10 5 1,0x10 5 1,0x10 5 1,0x10 5 1,0x10 5 24 4,8x10 6 3,1x10 7 3,4x10 7 1,6x10 7 1,3x10 5 30 2,0x10 7 4,8x10 8 5,1x10 8 2,7x10 8 2,1x10 5 35 1,4x10 8 2,3x10 9 3,7x10 9 1,0x10 9 4,5x10 5 40 3,8x10 8 4,1x10 9 5,3x10 9 1,8x10 9 5,3x10 5 48 2,9x10 8 3,8x10 9 4,8x10 9 1,2x10 9 2,9x10 5 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng tốc độ lắc lên sinh trƣởng của chủng BacillusCM5crk Thời gian (giờ) Mật độ vi khuẩn (CFU/mL) 100v/p 125v/p 150v/p 175v/p 200v/p 225v/p 0 0,9x10 5 0,9x10 5 0,9x10 5 0,9x10 5 0,9x10 5 0,9x10 5 24 5,1x10 6 1,0x10 7 2,1x10 7 3,4x10 7 4,0x10 7 2,4x10 7 30 3,1x10 7 2,4x10 8 3,1x10 8 3,4x10 8 3,6x10 8 2,9x10 8 35 5,4x10 8 1,3x10 9 3,3x10 9 3,9x10 9 4,3x10 9 3,7x10 9 23 Thời gian (giờ) Mật độ vi khuẩn (CFU/mL) 100v/p 125v/p 150v/p 175v/p 200v/p 225v/p 40 4,7x10 8 1,6x10 9 3,6x10 9 5,1x10 9 5,4x10 9 4,8x10 9 48 2,6x10 8 3,2x10 8 2,5x10 9 3,2x10 9 3,9x10 9 3,4x10 9 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên sinh trƣởng của vi nấm P.oxalicum Thời gian nuôi cấy (giờ) Trọng lƣợng khô của vi nấm (g/L) MTNp1 MTNp2 MTNp3 MTNp4 24 1,92 1,22 1,78 1,57 48 2,53 1,94 2,33 2,13 72 3,45 2,77 3,16 2,96 96 5,11 4,13 4,82 4,42 120 5,06 4,01 4,73 4,39 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sinh trƣởng của P.oxalicum Thời gian nuôi cấy (giờ) Trọng lƣợng khô của vi nấm (g/L) 15 0 C 20 0 C 25 0 C 30 0 C 35 0 C 40 0 C 24 1,12 1,32 1,96 1,87 1,02 0,32 48 2,03 1,94 3,53 3,67 1,73 0,84 72 3,01 2,77 5,11 4,99 2,41 1,47 96 3,11 4,13 5,23 5,14 3,15 2,13 120 3,05 4,01 4,73 4,39 2,95 2,01 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng lên sinh trƣởng của P. oxalicum Thời gian nuôi cấy (giờ) Trọng lƣợng khô của vi nấm (g/L) pH 5,0 pH 5,5 pH 6,0 pH 6,5 pH 7,0 pH 7,5 24 1,12 1,32 1,91 1,89 1,96 1,11 48 2,03 2,64 3,55 3,62 1,58 2,58 24 Thời gian nuôi cấy (giờ) Trọng lƣợng khô của vi nấm (g/L) pH 5,0 pH 5,5 pH 6,0 pH 6,5 pH 7,0 pH 7,5 72 3,91 4,17 5,18 5,24 5,11 4,47 96 4,01 4,33 5,33 5,34 5,25 4,73 120 3,87 4,01 5,13 5,19 5,01 4,31 Bảng 3.11. Ảnh hƣởng tốc độ lắc lên sinh trƣởng của vi nấm P.oxalicum Thời gian nuôi cấy (giờ) Trọng lƣợng khô của vi nấm (g/L) 100v/p 125v/p 150v/p 175v/p 200v/p 225v/p 24 1,11 1,35 1,71 1,96 1,88 1,41 48 2,09 2,67 3,45 3,61 3,48 2,78 72 3,98 4,14 5,08 5,25 5,11 4,37 96 4,05 4,38 5,11 5,45 5,33 4,94 120 3,97 4,45 5,03 5,31 5,19 4,81 Bảng 3.12. Ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng lên sinh trƣởng của xạ khuẩn Thời gian nuôi cấy (giờ) Mật độ xạ khuẩn (CFU/mL) MTXs1 MTXs2 MTXs3 MTXs4 0 0,8x10 4 0,8x10 4 0,8x10 4 0,8x10 4 30 1,8x10 6 1,1x10 6 1,6x10 6 1,3x10 6 35 2,9x10 7 2,4x10 7 2,6x10 7 2,1x10 7 40 4,2x10 8 3,1x10 8 3,9x10 8 3,2x10 8 45 3,7x10 9 2,6x10 9 3,3x10 9 2,2x10 9 48 5,4x10 9 4,8x10 9 5,1x10 9 4,7x10 9 50 4,8x10 9 4,5x10 9 4,7x1`0 9 4,3x10 9 25 Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sinh trƣởng của S. diastatochromogenes Thời gian nuôi cấy (giờ) Mật độ tế bào (CFU/mL) 15 o C 20 o C 25 o C 30 o C 35 o C 40 o C 0 0,7x10 4 0,7x10 4 0,7x10 4 0,7x10 4 0,7x10 4 0,7x10 4 30 1,3x10 4 1,1x10 5 1,9x10 6 2,1x10 6 1,8x10 6 1,0x10 4 35 2,9x10 5 2,3x10 6 2,6x10 7 2,9x10 7 2,7x10 7 1,4x10 5 40 4,2x10 6 3,1x10 7 3,9x10 8 3,7x10 8 4,1x10 8 2,1x10 6 45 3,7x10 7 2,1x10 8 3,1x10 9 4,8x10 9 3,7x10 9 2,6x10 7 48 4,4x10 7 4,3x10 8 4,9x10 9 5,3x10 9 5,0x10 9 3,3x10 7 50 4,1x10 7 4,1x10 8 4,5x10 9 5,1x10 9 4,6x10 9 3,0x10 7 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của pH lên sinh trƣởng của S. diastatochromogenes Thời gian nuôi cấy (giờ) Mật độ tế bào xạ khuẩn (CFU/mL) pH 5,0 pH 5,5 pH 6,0 pH 6,5 pH 7,0 pH 7,5 0 0,9x10 4 0,9x10 4 0,9x10 4 0,9x10 4 0,9x10 4 0,9x10 4 30 3,9x10 4 1,0x10 5 1,2x10 6 2,1x10 6 2,3x10 6 1,5x10 6 35 2,8x10 5 2,3x10 6 2,1x10 7 2,5x10 7 2,9x10 7 2,4x10 7 40 4,5x10 6 4,1x10 7 4,6x10 8 3,9x10 8 4,3x10 8 4,1x10 8 45 3,2x10 7 3,1x10 8 3,3x10 9 4,2x10 9 3,9x10 9 3,6x10 9 48 3,4x10 7 3,7x10 8 4,1x10 9 5,3x10 9 5,5x10 9 4,9x10 9 50 3,1x10 7 3,1x10 8 4,0x10 9 5,2x10 9 5,1x10 9 4,6x10 9 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của tốc độ khuấy lên sinh trƣởngcủa S. diastatochromogenes Thời gian nuôi cấy (giờ) Mật độ tế bào (CFU/mL) 100v/p 125v/p 150v/p 175v/p 200v/p 225v/p 0 1,0x10 4 1,0x10 4 1,0x10 4 1,0x10 4 1,0x10 4 1,0x10 4 30 1,0x10 5 1,2x10 5 1,8x10 6 2,2x10 6 1,9x10 6 1,6x10 6 26 Thời gian nuôi cấy (giờ) Mật độ tế bào (CFU/mL) 100v/p 125v/p 150v/p 175v/p 200v/p 225v/p 35 2,1x10 6 2,4x10 6 2,5x10 7 2,9x10 7 2,7x10 7 2,3x10 7 40 2,9x10 7 3,2x10 7 3,3x10 8 3,8x10 8 3,5x10 8 3,1x10 8 45 1,7x10 8 2,3x10 8 3,0x10 9 4,7x10 9 3,8x10 9 2,0x10 9 48 3,4x10 8 4,1x10 8 4,3x10 9 5,4x10 9 5,0x10 9 4,6x10 9 50 2,1x10 8 3,8x10 8 4,1x10 9 5,1x10 9 4,7x10 9 4,2x10 9 Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng lên sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn nghiên cứu (pilot) Thời gian lên men (giờ) Mật độ vi khuẩn (CFU/mL) Bacillus subtilisCM5crk MTBS3 MTBM4.3 0 1,5x10 5 1,5x10 5 24 3,2x10 8 1,5x10 8 30 1,3x10 9 2,5x10 9 35 5,3x10 9 4,6x10 9 40 2,5x10 9 1,3x10 9 Bảng 3.17. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng lên sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn nghiên cứu (pilot) Mật độ vi sinh vật (CFU/mL) Streptomyces diastatochromogenes CM5.11cđk Thời gian lên men (giờ) 0 35 40 45 48 50 MTXs3 1,4x10 4 2,4x10 6 1,5x10 8 1,0x10 9 1,5x10 9 3,8x10 8 MTXs1 1,4x10 4 1,5x10 6 4,5x10 7 6,3x10 8 2,0x10 9 1,0x10 9 27 Bảng 3.18. Trọng lƣợng khô của P.oxalicum N1CS1trk trong các loại môi trƣờng nuôi khác nhau (g/L) (pilot) Môi trƣờng Thời gian lên men (giờ) 24 48 72 96 120 MTNp1 1,5 2,17 4,01 5,05 4,6 MTNp3 1,47 2,10 3,93 4,89 4,17 Bảng 3.19. Tốc độ tăng trƣởng của chủng vi khuẩn Bacillus CM5crkdƣới các giá trị pH môi trƣờng ban đầu khác nhau (CFU/mL) (pilot) pH ban đầu Thời gian lên men (giờ) 0 24 30 40 44 48 6,0-6,5 1,2x10 4 1,2x10 5 2,1x10 5 2,8x10 6 1,3x10 6 1,5x10 5 6,5-7,0 1,2x10 4 1,5x10 6 1,1x10 7 1,1x10 9 6,5x10 8 1,3x10 8 7,0-7,5 1,2x10 4 3,4 x10 7 2,6x10 8 3,5x10 9 5,4x10 8 2,9x10 8 7,5-8,0 1,2x10 4 1,1x10 5 1,7x10 5 2,6x10 5 1,6x10 5 2,0x10 4 7,5-8,0 1,3x10 4 2,4x10 4 1,5x10 5 2,0x10 6 3,1x10 5 1,7x10 5 Bảng 3.20. Sinh trƣởng của chủng vi khuẩn Bacillus CM5crktheo lƣu lƣợng khí (CFU/mL) (pilot) Lƣu lƣợng khí (lít/phúth) Thời gian lên men (giờ) 0 24 30 40 44 48 45 1,5x10 4 2,7x10 5 3,2x10 6 5,5x10 6 6,2x10 5 3,7x10 5 55 1,5x10 4 1,9x10 7 1,5x10 8 3,8x10 8 3,4x10 8 6,6x10 7 60 1,5x10 4 2,5x10 8 3,1x10 8 1,6x10 9 3,0x10 9 4,2x10 8 65 1,5x10 4 1,5x10 6 2,3x10 7 1,0x10 8 5,7x10 7 1,5x10 6 70 1,5x10 4 2,4x10 5 4,3x10 7 4,3x10 8 2,1x10 5 3,4x10 4 28 Bảng 3.21. Sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn nghiên cứu dƣới các giá trị pH khác nhau (CFU/mL) (pilot) Giá trị pH ban đầu Thời gian nuôi (giờ) 0 35 40 48 55 60 6,0-6,5 1,2x10 4 2,1x10 5 1,5x10 6 1,7x10 7 4,3x10 6 1,3x10 6 6,5-7,0 1,2x10 4 2,5x10 7 1,5x10 8 3,2x10 9 2,5x10 8 1,3x10 7 7,0-7,5 1,2x10 4 1,6x10 6 1,4x10 7 2,0x10 8 1,5x10 7 2,0x10 6 Bảng 3.22. Sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn S. diastatochromogenestheo lƣu lƣợng khí (CFU/mL) (pilot) Lƣu lƣợng khí (lít/phúth) Thời gian nuôi (giờ) 0 35 40 48 55 60 50 1,3x10 4 5,8x10 5 1,9x10 7 3,8x10 7 2,0x10 7 2,4x10 6 55 1,3x10 4 2,0x10 6 1,5x10 7 3,3x10 8 3,4x10 7 2,1x10 7 60 1,3x10 4 3,5x10 6 2,3x10 7 6,2x10 9 5,6x10 8 2,3x10 8 65 1,3x10 4 1,3x10 6 1,9x10 7 1,8x10 8 1,0x10 8 5,4x10 7 70 1,3x10 4 3,1x10 6 1,5x10 7 6,0x10 8 2,4x10 8 1,5x10 8 Bảng 3.23. Sinh khối của vi nấm Penicilium oxalicum N1CS1trk dƣới các giá trị pH môi trƣờng ban đầu khác nhau (g/L) (pilot) Giá trị pH ban đầu Thời gian nuôi (giờ) 24 48 72 96 120 144 5,0-5,5 0,8 0,87 0,94 0,91 0,88 0,7 5,5-6,0 1,11 1,56 2,63 2,72 1,80 1,34 6,0-6,5 3,60 4,09 5,02 4,91 4,45 4,10 6,5- 7,0 3,53 4,41 5,38 4,94 4,45 4,12 7,0-7,5 2,18 2,23 3,01 3,24 2,87 2,17 29 Bảng 3.24. Sinh khối của vi nấm N1CS1trk theo lƣu lƣợng khí (g/L) (pilot) Lƣu lƣợng khí (lít/phúth) Thời gian nuôi (giờ) 24 48 72 96 120 144 50 1,63 2,38 2,74 3,33 2,47 2,34 55 1,98 2,17 2,67 3,40 3,06 2,87 60 2,31 3,14 3,51 4,01 3,48 3,20 65 2,39 2,74 3,20 4,18 4,21 3,89 70 3,21 3,87 4,84 4,42 4,34 4,11 75 3,01 3,13 4,00 3,78 3,43 3,12 Bảng 3.25. Ảnh hƣởng của thời gian lên sinh trƣởng của chủng vi khuẩn Bacillus CM5crk(CFU/mL) (pilot) Thời gian nuôi (giờ) 0 24 30 37 40 48 1,5x10 6 3,3x10 8 1,5x10 9 3,5x10 9 5,7x10 9 4,7x10 8 Bảng 3.26. Ảnh hƣởng của tốc độ khuấy lên sinh trƣởng của chủng vi khuẩn Bacillus CM5crk(CFU/mL) (pilot) Tốc độ khuấy (v/ph) Thời gian lên men (giờ) 0 24 30 37 40 48 50 1,5x10 4 1,3x10 6 2,3x10 6 3,2x10 7 1,5x10 7 3,1x10 6 100 1,5x10 4 4,5x10 6 2,5x10 7 3,3x10 8 1,4x10 8 5,3x10 7 150 1,5x10 4 1,0x10 8 1,5x10 9 4,7x10 9 5,2x10 8 1,3x10 8 200 1,5x10 4 1,6x10 7 1,5x10 8 2,1x10 8 1,3x10 8 2,5x10 7 250 1,5x10 4 2,4x10 6 1,3x10 7 1,2x10 8 7,6x10 7 3,5x10 6 30 Bảng 3.27. Ảnh hƣởng của thời gian lên men lên sinh trƣởng của xạ khuẩn S. diastatochromogenes (CFU/mL) (pilot) Thời gian lên men (giờ) 0 35 40 48 55 60 1,5x10 5 6,7x10 7 3,5x10 8 4,2x10 9 4,7x10 9 1,4x10 9 Bảng 3.28. Ảnh hƣởng của tốc độ vòng quay lên sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn nghiên cứu (CFU/mL) (pilot) Tốc độ khuấy (v/p) Thời gian (giờ) 0 24 40 48 72 96 50 1,3x10 5 1,5x10 6 3,4x10 7 5,2x10 7 1,8x10 7 1,0x10 6 100 1,3x10 5 3,5x10 6 1,5x10 8 1,2x10 9 3,0x10 8 7,3x10 6 150 1,3x10 5 1,5x10 7 3,5x10 9 3,7x10 9 5,3x10 8 1,5x10 7 200 1,3x10 5 3,6x10 6 2,0x10 7 1,0x10 8 3,3x10 7 1,5x10 6 250 1,3x10 5 3,0x10 6 1,1x10 7 1,0x10 8 2,5x10 7 5,4x10 5 Bảng 3.29.: Ảnh hƣởng của thời gian lên sinh trƣởng của chủng P.oxalicum N1CS1trk (g/L) (pilot) Thời gian (giờ) 24 48 72 96 120 144 N1CS1trk 4,33 5,14 5,43 5,87 5,30 4,86 Bảng 3.30. Ảnh hƣởng của tốc độ vòng quay lên sinh trƣởng của chủng P.oxalicumN1CS1trk (g/L) (pilot) Tốc độ khuấy (v/p) Thời gian (giờ) 48 72 96 120 144 100 3,71 4,52 4,43 4,24 4,00 150 4,06 4,72 5,06 5,00 4,67 200 4,85 5,26 5,40 5,33 4,76 250 4,22 4,72 4,56 4,24 4,12 300 4,10 4,65 4,32 4,03 3,85 31 Bảng 3.31. Điều kiện lên men qui mô pilot thích hợp cho các chủng vi sinh vật tuyển chọn Thông số N1CS1trk CM5.11cđk CM5crk Môi trƣờng MTNp1 MTXs1 MTBM 4.3 Tốc độ khuấy (v/ph) 200 150 150 Tốc độ sục khí (lít/phúth) 70 60 60 Nhiệt độ lên men (oC) 30±1 30±1 37±1 pH môi trƣờng 6-7 Trung tính Trung tính Thời gian thu hồi (giờ) 72 37 48 Bảng 3.32. Ảnh hƣởng của thành phần cơ chất lên sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn nghiên cứu (CFU/g) Môi trƣờng Bacillus CM5crk S.diastatochromogenes CM5.11cđk CTvk1 5,6x10 8 7,0x10 8 CTvk2 6,2x10 8 1,3x10 9 CTvk3 7,4x10 9 3,8x10 9 CTvk4 4,5x10 8 5,3x10 8 CTvk5 5,3x10 8 4,7x10 8 Bảng 3.33. Ảnh hƣởng của thành phần cơ chất lên sinh trƣởng của P.oxalicum N1CS1trk STT Công thức Mật độ P. oxalicum N1CS1trk (CFU/g) 1 CTnp1 2,3x10 9 2 CTnp2 1,5x10 9 3 CTnp3 6,3x10 9 4 CTnp4 3,5x10 9 32 Bảng 3.34. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sinh trƣởng của vi khuẩn nghiên cứu(CFU/g) Nhiệt độ ( o C) Thời gian lên men (giờ) 0 24 35 40 48 52 30 1,4x10 5 5,4x10 6 1,5x10 7 2,3x10 8 3,0x10 7 4,0x10 6 35 1,4x10 5 2,6x10 7 2,5x10 8 3,7x10 9 2,0x10 8 1,0x10 7 40 1,4x10 5 2,2x10 6 3,5x10 6 1,5x10 7 8,0x10 6 3,3x10 5 Bảng 3.35. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sinh trƣởng của chủng vi nấm nghiên cứu (CFU/g) Nhiệt độ ( o C) Thời gian nuôi (giờ) 0 72 96 120 144 168 25 1,3x10 5 2,8x10 8 4,7x10 8 2,3x10 8 1,3x10 7 3,1x10 5 30 1,3x10 5 2,4x10 9 1,0x10 10 1,3x10 10 1,2x10 9 3,5x10 7 35 1,3x10 5 1,2x10 8 4,5x10 8 3,0x10 8 2,2x10 7 4,3x10 5 Bảng 3.36. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn nghiên cứu (CFU/g) Nhiệt độ ( o C) Thời gian nuôi (giờ) 0 35 40 48 52 72 25 1,2x10 5 2,3x10 6 1,0x10 7 3,5x10 8 1,5x10 8 2,0x10 7 30 1,2x10 5 1,8x10 6 2,1x10 7 3,5x10 9 4,2x10 9 5,1x10 7 35 1,2x10 5 3,5x10 6 5,2x10 7 2,1x10 8 1,7x10 9 1,3x10 7 40 1,2x10 5 2,8x10 6 1,4x10 7 4,8x10 7 2,1x10 6 3,1x10 5 33 Bảng 3.37. Ảnh hƣởng của pH lên sinh trƣởng của chủng vi khuẩn CM5crk khi lên men xốp (CFU/g) pH ban đầu Thời gian lên men (giờ) 0 24 30 40 44 48 5,0 –5,5 1,6x105 1,2x106 5,5x106 1,1x107 2,2x106 4,8x105 6,0 - 6,5 1,6x10 5 6,3x10 6 1,2x10 7 3,6x10 8 1,4x10 8 5,3x10 7 6,8 – 7,2 1,6x10 5 3,0x10 7 1,3x10 8 6,6x10 9 3,2x10 9 3,6x10 8 7,5 - 8,0 1,6x10 5 1,1x10 6 4,8x10 6 1,0x10 7 5,3x10 5 1,4x10 5 Bảng 3.38. Ảnh hƣởng của pH lên sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn CM5.11cđk khi lên men xốp (CFU/g) pH ban đầu Thời gian nuôi (giờ) 0 35 40 48 55 60 5,0-5,5 1,1x10 5 7,5x10 5 2,1x10 6 8,2x10 6 5,3x10 5 1,5x10 5 6,0-6,5 1,1x10 5 2,7x10 7 3,1x10 8 1,2x10 9 7,5x10 8 1,8x10 7 6,8 – 7,2 1,1x10 5 1,2x10 7 3,3x10 8 5,9x10 9 8,7x10 8 5,3x10 7 7,5-8,0 1,1x10 5 6,1x10 5 2,5x10 6 6,7x10 7 1,1x10 6 2,1x10 5 Bảng 3.39. Ảnh hƣởng của pH lên sinh trƣởng của chủng N1CS1trk khi lên men xốp (CFU/g) pH ban đầu Thời gian nuôi (giờ) 0 72 96 120 144 168 5,0-5,5 2,4x10 4 1,7x10 5 4,2x10 5 3,0x10 6 3,4x10 5 1,3x10 5 5,5-6,0 2,4x10 4 5,8x10 7 2,3x10 8 3,5x10 9 2,1x10 8 4,3x10 7 6,0-6,5 2,4x10 4 8,3x10 8 6,4x10 9 1,7x10 9 3,0x10 7 5,7x10 7 6,5- 7,2 2,4x10 4 1,1x10 9 1,2x10 10 3,5x10 9 1,5x10 9 4,3x10 8 7,5-8,0 2,4x10 4 1,2x10 6 1,6x10 7 7,7x10 6 1,2x10 6 6,3x10 5 34 Bảng 3.40. Mật độ chủng vi khuẩn CM5crk sau các khoảng thời gian lên men xốp khác nhau (CFU/g) Thời gian lên men (giờ) 0 24 35 40 48 52 60 2,2x10 5 3,0x10 7 4,1x10 8 1,2x10 9 5,2x10 9 1,8x10 9 4,2x10 8 Bảng 3.41. Ảnh hƣởng của thời gian lên sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn CM5.11cđk trong lên men xốp (CFU/g) Thời gian lên men (giờ) 0 37 47 52 60 72 1,5x10 5 6,1x10 7 7,3x10 8 4,6x10 9 1,8x10 9 3,5x10 8 Bảng 3.42. Ảnh hƣởng của thời gian lên sinh trƣởng của chủng N1CS1trk trong lên men xốp (CFU/g) Thời gian lên men (giờ) 0 96 120 144 168 240 1,7x10 5 5,1x10 9 1,0x10 10 2,2x10 8 5,8x10 9 2,1x10 9 Xác định độ ẩm cho quá trình lên men xốp các chủng vi sinh vật Hình 3.1. Ảnh hƣởng của độ ẩm lên sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn nghiên cứu sản xuất chế phẩm (CFU/g) 35 Bảng 3.43. Mật độ vi sinh vật trong chế phẩm (CFU/g) Môi trƣờng Bacillus spp. S. diastatochromogenes P. oxalicum MPA 5,4 x 10 9 ISP4 2,1 x 10 9 Czapek-Dox 2,2 x 10 9 Bảng 3.44. Hoạt tính của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm (CFU/g) Hoạt tính Bacillus spp. Streptomyces diastatochromogenes Penicilium oxalicum Kết tụ sinh học > 70 % Phân giải phốt phát 11-13 mm Sinh tổng hợp IAA 93-100 mm Đối kháng F. oxysporium 45-50 mm > 15 % > 75% Đối kháng R. solani 53-60 mm MICFe (mM Fe) * +++ +++ +++ MICAl (mM Al) * +++ +++ +++ Bảng 3.13. Trọng lƣợng của chuột sau 7 ngày sử dụng chế phẩm Số TT Nhóm chứng Số TT Mức liều 1 Trƣớc thí nghiệm Sau thí nghiệm Trƣớc thí nghiệm Sau thí nghiệm 1 18,3 25,4 21 18,0 26,1 2 18,2 24,7 22 18,5 24,5 3 18,0 23,1 23 18,5 25,0 4 18,4 25,4 24 18,4 25,6 5 18,8 24,6 25 18,2 25,9 6 19,1 26,2 26 18,9 27,5 7 18,4 27,2 27 18,5 23,3 36 Số TT Nhóm chứng Số TT Mức liều 1 Trƣớc thí nghiệm Sau thí nghiệm Trƣớc thí nghiệm Sau thí nghiệm 8 18,2 25,7 28 18,3 24,1 9 18,5 26,3 29 18,6 25,7 10 18,9 24,5 30 18,8 26,4 11 18,3 25,9 31 18,7 26,2 12 18,6 24,7 32 18,5 24,1 13 18,0 23,9 33 18,4 25,4 14 18,4 25,3 34 18,5 25,3 15 18,3 24,3 35 18,1 25,5 16 19,1 26,6 36 18,0 27,2 17 18,3 27,4 37 18,1 23,9 18 18,1 25,5 38 18,3 24,7 19 18,6 26,5 39 18,5 25,4 20 18,4 24,8 40 19,3 26,3 Trung bình 18,45±0,32 25,40 ± 1,11 Trung bình 18,46 ± 0,32 25,41 ± 1,09 Số TT Mức liều 2 Số TT Mức liều 3 Trƣớc thí nghiệm Sau thí nghiệm Trƣớc thí nghiệm Sau thí nghiệm 41 18,4 25,5 61 18,7 24,5 42 18,2 24,0 62 18,1 23,9 43 18,4 27,6 63 18,4 24,7 44 18,0 26,2 64 18,5 25,5 45 18,7 26,5 65 18,7 26,3 37 Số TT Mức liều 2 Số TT Mức liều 3 Trƣớc thí nghiệm Sau thí nghiệm Trƣớc thí nghiệm Sau thí nghiệm 46 18,1 25,6 66 18,2 25,7 47 18,2 27,0 67 18,6 25,4 48 18,5 23,4 68 18,1 24,5 49 18,9 26,5 69 18,4 26,4 50 18,0 24,6 70 18,2 27,2 51 18,6 25,1 71 18,4 24,4 52 18,3 24,8 72 18,7 23,9 53 18,9 27,1 73 18,9 24,6 54 18,7 26,0 74 18,5 25,5 55 18,3 26,5 75 18,7 26,6 56 18,4 25,3 76 18,5 25,3 57 18,5 27,4 77 18,1 25,8 58 18,6 23,9 78 18,4 24,2 59 18,0 26,2 79 18,2 26,7 60 18,1 24,4 80 18,4 27,1 Trung bình 18,39±0,28 25,68 ± 1,22 Trung bình 18,44 ± 0,23 25,41 ± 1,05 38 PHỤ LỤC IV: CÁC LOẠI MÔI TRƢỜNG SỬ DỤNG - Môi trƣờng MPA (g/L): Cao thịt - 5, Cao men - 10, NaCl- l 5, agar- 18, pH 7.4 - Môi trƣờng Pikokaya (g/L): Ca3(PO4)2-10; MgSO4.7H2O - 0,1; KCl- 0,2; (NH4)2SO4- 0,5; MgCl2.6 H2O- 5; glucose- 10; MnSO4- 0,001; Cao nấm men - 0,1; agar- 2%. - Môi trƣờng Czapek-Dox (g/L): NaNO3- 2; K2HPO4- 1; MgSO4- 0,5; KCl - 0,5; FeSO4- 0,1; Saccharose - 30; Agar - 15; pH 7,3 - Môi trƣờng tinh bột agar (g/ L): trypton - 10; cao men - 10; K2HPO4- 5; tinh bột tan - 3; agar - 18; pH 7. - Môi trƣờng cazein agar (g/ L): Cao thịt- 3, trypton - 5; cazein - 10; agar - 18. pH 7 - Môi trƣờng gelatin (g/ L): Cao thịt - 3, trypton - 5, gelatin - 40; pH 7. - Môi trƣờng tối thiểu (g/ L): (NH4)2SO4 -2; K2HPO4 -14; KH2PO4 - 6; natri xitrat - 1; MgSO4.7H2O - 0,2; 10 ml MnCl2- 0,001 M (Khử trùng riêng); agar - 18; pH 7. - ISP-1 (g/ L): Trypton - 5, cao nấm men - 3; agar - 18, pH 7 - 7,2. - ISP4 (g/L): tinh bột tan- 10; K2HPO4- 1; MgSO4.7H2O- 1; NaCl - 1; (NH4)2SO4- 2; CaCO3 - 2; 1 ml vi lƣợng (MnCl2.4H2O -1g/L; FeSO4.7H2O-1 g/L; ZnSO4.7 H2O -1 g/L); agar - 20; pH 7-7,2. - ISP-6 (g/L): Peptone - 10; cao nấm men - 1; xitrat sắt - 0,5; agar - 18; pH 7 - 7,2. - ISP-9 (g/L): (NH4)2SO4- 2,64; KH2PO4- 2,38; K2HPO4- 5,65; MgSO4- 1; dung dịch khoáng 1ml (CuSO4- 0,64%; FeSO4- 0,11%; MgCl2 - 0,79%); nguồn cacbon - 10; agar - 20; pH 6,8 - 7. - Môi trƣờng Czapek-Dox cải tiến (g/L): glucose– 20; NaNO3- 3,5; K2HPO4- 1,5; MgSO4.7H2O - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4.7H2O - 0,1; Agar – 20; pH= 6,5 39 - Môi trƣờng thử hoạt tính cellulase(g/L): CMC– 10; NaNO3- 3,5; K2HPO4- 1,5; MgSO4.7H2O - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4.7H2O - 0,1; Agar – 20; pH 6,5 - Môi trƣờng thử hoạt tính protease (g/L): cazein- 15; NaNO3- 3,5; K2HPO4- 1,5; MgSO4.7H2O -0,5; KCl - 0,5; FeSO4.7H2O - 0,1; Agar - 20, pH 6,5 - Môi trƣờng thử hoạt tính amylaza (g/L): tinh bột tan– 15; NaNO3- 3,5; K2HPO4- 1,5; MgSO4.7H2O - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4.7H2O - 0,1; Agar - 20; pH 6,5 - Môi trƣờng PDA (g/L): dextrose - 20, khoai tây - 200, agar - 20, pH 6,5 - 7 - Hansen(g/L): pepton - 10; glucoza - 5%; KH2PO4- 0,3; MgSO4.7H2O - 0,3. * Các môi trƣờng lên men chìm vi khuẩn Bacillus subtilis Môi trƣờng Thành phần(g/L) MTBS2 Glucose 10; pepton 4,979; MgSO4.7H2O 0,48 MTBS3 Tinh bột 1,5; peptone 0,5; cao men 0,1; MgSO4.7H2O 0,05; NaCl 0,05; CaCl2 0,0002 MTBS5 Glucose 10; peptone 5; NaCl 0,05 MTBM4.3 Urê 10; pepton 4,41; NaCl 6,08; glucose 5 * Các môi trƣờng lên men vi nấm Penicilium oxalicum Môi trƣờng Thành phần (g/L) MTNp1 K2O: 1,0; P2O5: 0,5; MgSO4 .7H2O: 0,2; NaCl: 0,2; CaCl2: 0,1; FeSO4:0,001; Urea: 5; glucoza: 5 MTNp2 K2O: 1,0; P2O5: 0,5; MgSO4 .7H2O: 0,2; NaCl: 0,2; CaCl2: 0,1; FeSO4:0,001; Urea: 10; glucoza: 10 MTNp3 K2O: 1,0; P2O5: 0,5; MgSO4 .7H2O: 0,2; NaCl: 0,2; CaCl2: 0,1; FeSO4:0,001; Urea: 10; saccarose: 10 MTNp4 K2O: 1,0; P2O5: 0,5; MgSO4 .7H2O: 0,2; NaCl: 0,2; CaCl2: 0,1; FeSO4:0,001; Urea: 10; saccarose: 5 40 * Các môi trƣờng lên men chìm Streptomyces diastatochromogenes Môi trƣờng Thành phần (g/L) MTXs1 Tinh bột khoai tây: 2,0; KNO3: 0,1; NaCl: 0,05; KH2PO4: 0,05; MgSO4.7H2O: 0,05 MTXs2 Tinh bột: 2,0; cao ngô: 0,5; NH4SO4: 0,4; KH2PO4: 0,2; MgSO4.7H2O: 0,025; CaCO3: 0,1 MTXs3 Pepton: 5; cao thịt: 5; glucoza: 10; NaCl: 5 MTXs4 Tinh bột tan: 2,0; KNO3: 0,1;NaCl: 0,05; KH2PO4: 0,05; MgSO4.7H2O: 0,05 41 PHỤ LỤC V QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT GỐC POLYFA-TN3 42 Mở đầu Quá trình lên men là quá trình sinh học (bioprocess) bắt nguồn từ việc sử dụng vi khuẩn để sản xuất các thực phẩm nhƣ phomat, sữa chua, các loại rau củ lên men, xúc xìch, nƣớc tƣơng, các loại đồ uống lên men nhƣ bia, rƣợu vang, cũng nhƣ các loại chế phẩm sinh học đƣợc sử dụng trong nông nghiệp nhƣ phân bón sinh học, thuốc trừ sâu sinh học Các vi sinh vật khác nhau cần có các điều kiện sinh học và lý học thích hợp khác nhau để phát triển tốt, vì vậy để quá trình lên men hiệu quả đòi hỏi phải lựa chọn các điều kiện lên men thích hợp nhằm tối ƣu hóa việc tạo sinh khối cũng nhƣ tối ƣu hóa hoạt tính mong muốn, từ đó có thể tối ƣu hóa đƣợc hiệu quả của quá trính lên men. Để có thể sản xuất đƣợc chế phẩm hiệu quả, các quá trình lên men chím cũng nhƣ lên men bề mặt phải đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng nhằm tiết kiệm đƣợc thời gian lên men, chi phì lên men cũng nhƣ nâng cao hiệu quả của quá trình lên men (sinh khối lớn, lƣợng lớn enzyme cần thiết, hoạt tính cao). Vật liệu Các chủng vi sinh vật hữu ích: các chủng vi khuẩn Bacillus CM5crk/TiVP18 (phân giải phốt phát khó tan, đối kháng P. Splendens, F. oxysporum), vi khuẩn Bacillus BX-F9/CFB3/CF-vp17 (sinh tổng hợp IAA, cố định đạm, phân giải phốt phát khó tan, kết tụ sinh học), Bacillus Ti6 (kháng R. solani và F. oxysporium), xạ khuẩn Streptomyces diastatochromogenes CM5.11cđk (kháng P. Splendens, F. oxysporum), vi nấm Penicillium oxalicum N1CS1crk/TiN1 (kháng R. solani và F. oxysporium). Môi trường nhân giống và lên men cấp 1, 2 và cấp 3 cho các chủng vi sinh vật: - Các chủng vi khuẩn Bacillus CM5crk/TIVP18, Bacillus BX-F9/CFB3/CF- vp17, Bacillus Ti6 đƣợc hoạt hoá và nhân giống cấp 1 trên môi trƣờng MPA và MPB, tƣơng ứng: Cao thịt 5 g/l, NaCl 5 g/l, Pepton 5 g/l, agar 20 g/l, pH:7-7,2. MPB không có thạch. - Hoạt hoá và nhân giống cấp 1 (trong môi trƣờng lỏng) chủng xạ khuẩn Streptomyces diastatochromogenes CM5.11cđk trên môi trƣờng ISP4: tinh bột tan 10 43 g/l; K2HPO4 1 g/l; MgSO4.7H2O 1 g/l; NaCl 1 g/l; (NH4)2SO4 2 g/l; CaCO3 2 g/l; 1 ml vi lƣợng (MnCl2.4H2O 1g/l; FeSO4.7H2O 1 g/l; ZnSO4.7H2O 1 g/l); agar 20 g/l; pH 7-7,2. - Hoạt hoá và nhân giống cấp 1(trong môi trƣờng lỏng) hai chủng vi nấm Penicilium oxalicum N1CS1crk/TiN1 trong môi trƣờng Czapek-Dox: NaNO3 2 g/l; K2HPO4 1 g/l; MgSO4 0,5 g/l; KCl 0,5 g/l; FeSO4.7H2O 0,1 g/l; saccharose 30 g/l; agar 15-20 g/l; pH 7,3. - Môi trƣờng lên men cấp 2 và cấp 3 các chủng Bacillus CM5crk/TIVP18, Bacillus BX-F9/CFB3/CF-vp17, Bacillus Ti6 (MTBM4.3): Urê 10 g/l; pepton 4,41 g/l; NaCl 6,08 g/l; casein 10,75 g/l; glucose 5 g/l. - Môi trƣờng lên men cấp 2 và cấp 3 Streptomyces diastatochromogenes CM5.11cđk (MTXs1): tinh bột khoai tây 2,0 g/l; KNO3 0,1 g/l; NaCl 0,05 g/l; KH2PO4 0,05 g/l; MgSO4.7H2O 0,05 g/l. - Môi trƣờng lên men cấp 2 và cấp 3 Penicilium oxalicum N1CS1crk/TiN1 (MTNp1): K2O 1,0 g/l; P2O5 0,5 g/l; MgSO4 .7H2O 0,2 g/l; NaCl 0,2 g/l; CaCl2 0,1 g/l; FeSO4 0,001 g/l; urê 5 g/l; glucoza 5 g/l. Phƣơng pháp - Xác định độ ẩm: bằng phƣơng pháp sấy ở 102oC -105oC đến trọng lƣợng không đổi. - Xác định hoạt tính kết tụ sinh học: theo phƣơng pháp của Kurane và cs (1996) đƣợc cải tiến bởi Zhang và cs (2005). - Xác định hoạt tính phân giải photphat khó tan: các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi trên môi trƣờng thạch có chứa 5% photphat canxi và đo đƣờng kình của vòng phân giải sau 24 giờ nuôi cấy. Định lƣợng hoạt tình phân giải photphat khó tan của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng lỏng dựa vào nồng độ PO4 có trong dịch nuôi cấy bằng phƣơng pháp xanh molipdate (TCVN 2322-78). - Đánh giá định lượng IAA: bằng phƣơng pháp Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995). - Xác định hoạt tính đối kháng nấm bệnh của vi khuẩn và xạ khuẩn: nghiên 44 cứu bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch - Xác định hoạt tính đối kháng nấm bệnh của vi nấm: nghiên cứu bằng phƣơng pháp cấy đối kháng trực tiếp (Srinivasan, 1991) - Đánh giá độ sống sót của vi khuẩn theo thời gian bảo quản: độ sống sót của vi khuẩn đƣợc xác định bằng cách pha loãng chế phẩm trong nƣớc cất vô trùng, sau đó cấy trải trên môi trƣờng MPA đối với các chủng vi khuẩn, môi trƣờng ISP4 đối với chủng xạ khuẩn và Czapek-Dox đối với các chủng vi nâm. Sau các khoảng thời gian nuôi cấy thìch hợp (24 giờ cho vi khuẩn, 48 giờ cho xạ khuẩn và 72 giờ cho nấm) ở điều kiện nhiệt độ thìch hợp (37oC ± 1 cho vi khuẩn, 30oC cho xạ khuẩn và 25-30oC cho vi nấm), đếm số khuẩn lạc tạo thành. 45 QUY SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT GỐC QUY MÔ 900kg Hình 5.1. Sơ đồ tổng quát quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật gốc POLYFA-TN3 Chuẩn bị môi trƣờng Chuẩn bị môi trƣờng xạ khuẩn Chuẩn bị môi trƣờng vi nấm Hoạt hoá các chủng vi khuẩn Bacillus spp. Hoạt hoá chủng xạ khuẩn S. diastatochromogenes CM5.11cdk Hoạt hoá các chủng vi nấm Penicillium oxalicum N1CS1crk/TiN1 Lên men cấp 1, cấp 2 và cấp 3 Lên men cấp 1, cấp 2 và cấp 3 Lên men cấp 1, cấp 2 và cấp 3 Lên men xốp Lên men xốp Lên men xốp Sấy Sấy Sấy Kiểm tra mật độ, hoạt tính Kiểm tra mật độ, hoạt tính Kiểm tra mật độ, hoạt tính Phối trộn các chủng vi sinh vật, đóng gói 46 Quy trình lên men tạo chế phẩm từ các chủng thuộc chi Bacillus (Bacillus BX- F9/CFB3/CF-vp17, Bacillus CM5crk; Bacillus Ti6) Hình 5.2. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm từ các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus Mô tả quy trình Bƣớc 1: Chuẩn bị môi trƣờng Các loại môi trƣờng hoạt hoá và lên men cấp 1, cấp 2, cấp 3 đƣợc cân chính xác các thành phần nhƣ đã đƣợc nêu ở trên, hòa tan và khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Môi trƣờng đặc sau khử trùng để nguội đến khoảng 50oC, đổ ra đĩa Petri vô trùng, để nguội. Bƣớc 2: Hoạt hóa giống Kiểm tra mật độ Trộn với sản phẩm VSV hữu ích khác. Đóng gói Hoạt hóa Kiểm tra Giống VSV (- 80 0 C) 9 8 7 6 4, 5 3 1 Chuẩn bị môi trƣờng 2 Lên men cấp 1 Lên men cấp 2, cấp 3 Lên men xốp Sấy 47 Các chủng thuộc chi Bacillus từ tủ lạnh sâu (hoặc tủ lạnh) đƣợc hoạt hóa trên môi trƣờng đặc MPA. Bƣớc 3: Nhân giống cấp 1 Dùng que cấy lấy một số khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào bình tam giác 25 ml chứa 10 ml môi trƣờng MPB. Mỗi chủng vi khuẩn cần 5 bính, đƣợc 50 ml giống mỗi chủng. Nuôi lắc (170-200 rpm/phút) trong 24 giờ ở 35-37oC và pH 7. Bƣớc 4: Nhân giống cấp 2 Chuyển canh trƣờng nuôi giống cấp 1 vào bình tam giác 500 ml chứa 250 ml môi trƣờng MTBM4.3 với tỉ lệ bổ sung giống 5%. Mỗi chủng cần 4 bính, đƣợc 1 lít giống cấp 2. Nuôi 24 giờ với chế độ nuôi nhƣ bƣớc 3. Bƣớc 5: Nhân giống cấp 3 Chuyển canh trƣờng nuôi giống cấp 2 vào bình tam giác 5000 ml chứa 2500 ml môi trƣờng MTBM4.3 với tỉ lệ bổ sung giống 5%. Mỗi chủng cần 4 bính, đƣợc 10 lít giống cấp 3. Nuôi 40 giờ với chế độ nuôi nhƣ bƣớc 4. Bƣớc 6: Lên men xốp Bổ sung canh trƣờng nhân giống cấp 3 của các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus vào cơ chất (Trấu 10%; cám gạo 65%; bột ngô 15%; bột đậu tƣơng 10%; (NH4)2SO4 0,1%; MgSO4.7H2O 0,25%; MnSO4,7H2O 0,25%; lân 0,5%). Tỉ lệ tiếp giống 10% (1 lìt canh trƣờng cho 10 kg cơ chất). Nhƣ vậy 6 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus (2 chủng Bacillus CM5crk, TIVP18; chủng Bacillus Ti6 và 3 chủng Bacillus BX-F9, CFB3, CF-vp17) sẽ cho 600 kg chế phẩm. Chỉnh độ ẩm với nƣớc máy vô trùng đến 40% - 50%. Nuôi trong tủ lên men có dung tích 5m x1m x1,5m; sử dụng khay inox với độ dày của cơ chất lên men từ 4 - 6 cm. Nhiệt độ lên men 37 0 C ± 1, pH 6,8-7,0. Sau 48 giờ, thu hồi sản phẩm. Bƣớc 7: Sản phẩm đƣợc sấy trong tủ sấy Ketong (Trung Quốc) ở nhiệt độ 40 oC cho đến khi ẩm độ còn lại 13-15%. Bƣớc 8: Kiểm tra mật độ vi khuẩn bằng cách cấy trải trên môi trƣờng MPA đặc và kiểm tra hoạt tính của các chủng sau khi lên men xốp. Mật độ vi khuẩn đạt 10 9 CFU/g và các hoạt tính của các chủng đƣợc đảm bảo theo yêu cầu. 48 Bƣớc 9: Trộn đều sản phẩm lên men xốp các chủng thuộc chi Bacillus với các sản phẩm lên men xốp có chứa các chủng vi sinh vật hữu ìch khác. Đóng gói trong túi kẽm và bảo quản. Quy trình sản xuất chế phẩm từ chủng xạ khuẩn Streptomyces diastatochromogenes (CM5.11cđk) Hình 5.3. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm từ chủng xạ khuẩn Streptomyces diastatochromogenes (CM5.11cđk) Mô tả quy trình Bƣớc 1: Chuẩn bị môi trƣờng Các loại môi trƣờng hoạt hoá và lên men cấp 1, cấp 2, cấp 3 đƣợc cân chính xác các thành phần, hòa tan và khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Môi trƣờng đặc sau khử trùng để nguội đến khoảng 50oC, đổ ra đĩa Petri vô trùng, để nguội. Kiểm tra mật độ Trộn với sản phẩm VSV hữu ích khác. Đóng gói Hoạt hóa Kiểm tra Giống VSV (-80 0 C) 9 8 7 6 4, 5 3 1 Chuẩn bị môi trƣờng 2 Lên men cấp 1 Lên men cấp 2, cấp 3 Lên men xốp Sấy 49 Bƣớc 2: Hoạt hóa giống Chủng S.diastatochromogenes CM5.11cđk từ tủ lạnh sâu (hoặc tủ lạnh) đƣợc hoạt hóa trên môi trƣờng đặc ISP4. Bƣớc 3: Nhân giống cấp 1 Dùng que cấy lấy một số khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào bình tam giác 25 ml chứa 10 ml môi trƣờng lỏng ISP4. Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi trong 5 bính, đƣợc 50ml giống cấp 1. Nuôi lắc (175-200 rpm/phút) trong 24 giờ ở 300C và pH 6.5-7. Bƣớc 4: Nhân giống cấp 2 Chuyển canh trƣờng nuôi giống cấp 1 vào bình tam giác 500 ml chứa 250 ml môi MTXs1 với tỉ lệ bổ sung giống 5%. Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi trong 4 bình, đƣợc 1 lít giống cấp 2. Nuôi 24 giờ với chế độ nuôi nhƣ bƣớc 3. Bƣớc 5: Nhân giống cấp 3 Chuyển canh trƣờng nuôi giống cấp 2 vào bình tam giác 5000 ml chứa 2500 ml môi MTXs1 với tỉ lệ bổ sung giống 5%. Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi trong 4 bình, đƣợc 10 lít giống cấp 3. Nuôi 40 giờ với chế độ nuôi nhƣ bƣớc 3. Bƣớc 6: Lên men xốp Bổ sung canh trƣờng nhân giống cấp 2 của chủng xạ khuẩn S. diastatochromogenes CM5.11cđk vào cơ chất (trấu 10%; cám gạo 65%; bột ngô 15%; bột đậu tƣơng 10%; (NH4)2SO4 0,1%; MgSO4.7H2O 0,25%; MnSO4,7H2O 0,25%; lân 0,5%). Tỉ lệ tiếp giống 10% (1 lìt canh trƣờng cho 10 kg cơ chất). Nhƣ vậy chủng xạ khuẩn S. diastatochromogenes CM5.11cđk sẽ cho 100 kg chế phẩm. Chỉnh độ ẩm với nƣớc máy vô trùng đến 40% - 50%. Nuôi trong tủ lên men có dung tích 5m x1m x1,5m; sử dụng khay inox với độ dày của cơ chất lên men từ 4 - 6 cm. Nhiệt độ lên men 300C ± 1, pH 6,8-7,0. Sau 52-60 giờ, thu hồi sản phẩm. Bƣớc 7: Sản phẩm đƣợc sấy trong tủ sấy Ketong (Trung Quốc) ở nhiệt độ 40 oC cho đến khi ẩm độ còn lại 13-15%. Bƣớc 8: Kiểm tra mật độ xạ khuẩn bằng cách cấy trải trên môi trƣờng ISP4 đặc và kiểm tra hoạt tính của chủng xạ khuẩn. Mật độ vi khuẩn đạt 109 CFU/g và vẫn còn giữ đƣợc hoạt tính tốt 50 Bƣớc 9: Trộn đều sản phẩm lên men xốp chủng S. diastatochromogenes CM5.11cđk với các sản phẩm lên men xốp khác có chứa các chủng vi sinh vật hữu ìch khác. Đóng gói trong túi kẽm và bảo quản. Quy trình sản xuất chế phẩm hai chủng vi nấm Penicilium oxalicum (N1CS1trk/TiN1) Hình 5.4. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm từ hai chủng vi nấm Penicilium oxalicum (N1CS1trk/TiN1) Mô tả quy trình Bƣớc 1: Chuẩn bị môi trƣờng Các loại môi trƣờng hoạt hoá và lên men cấp 1, cấp 2, cấp 3 đƣợc cân chính xác các thành phần, hòa tan và khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Môi trƣờng đặc sau khử trùng để nguội đến khoảng 50oC, đổ ra đĩa Petri vô trùng, để nguội. Kiểm tra mật độ Trộn với sản phẩm VSV hữu ích khác. Đóng gói Hoạt hóa Kiểm tra Giống VSV (- 80 0 C) 9 8 7 6 4, 5 3 1 Chuẩn bị môi trƣờng 2 Lên men cấp 1 Lên men cấp 2, cấp 3 Lên men xốp Sấy 51 Bƣớc 2: Hoạt hóa giống Hai chủng Penicilium oxalicum N1CS1trk/TiN1 từ tủ lạnh sâu (hoặc tủ lạnh) đƣợc hoạt hóa trên môi trƣờng đặc Czapex-Dox. Bƣớc 3: Nhân giống cấp 1 Dùng que cấy lấy một số khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào bình tam giác 25 ml chứa 10 ml môi trƣờng thích hợp của hai chủng Penicilium oxalicum N1CS1trk/TiN1. Nuôi lắc 175-200 vòng/phút trong 72 giờ ở 25-30 0 C và pH 6.5. Mỗi chủng cần 5 bính, đƣợc 1 lít giống cấp 1. Bƣớc 4: Nhân giống cấp 2 Chuyển canh trƣờng nuôi giống cấp 1 vào bình tam giác 500 ml chứa 250 ml môi trƣờng mới thích hợp đối với hai chủng Penicilium oxalicum N1CS1trk/TiN1 (nhƣ bƣớc 3) với tỉ lệ bổ sung giống 5%. Mỗi chủng cần 4 bính, đƣợc 1 lít giống cấp 2. Chế độ nuôi nhƣ bƣớc 3. Bƣớc 5: Nhân giống cấp 3 Chuyển canh trƣờng nuôi giống cấp 2 vào bình tam giác 5000 ml chứa 2500 ml môi trƣờng mới thích hợp đối với hai chủng Penicilium oxalicum N1CS1trk/TiN1(nhƣ bƣớc 4) với tỉ lệ bổ sung giống 5%. Mỗi chủng cần 4 bình, đƣợc 10 lít giống cấp 2. Chế độ nuôi nhƣ bƣớc 4. Bƣớc 6: Lên men xốp Bổ sung canh trƣờng nhân giống cấp 2 của hai chủng vi nấm Penicilium oxalicum N1CS1trk/TiN1 vào cơ chất lên men xốp thích hợp (cám gạo 50%, cám ngô 49%, lactose 1%). Tỉ lệ tiếp giống 10% (1 lìt canh trƣờng cho 10 kg cơ chất). Nhƣ vậy 2 chủng vi vi nấm sẽ cho 200 kg chế phẩm. Chỉnh độ ẩm với nƣớc máy vô trùng đến 40% - 50%. Nuôi trong tủ lên men có dung tích 5m x1m x1,5m; sử dụng khay inox với độ dày của cơ chất lên men từ 4 - 6 cm. Các điều kiện lên men xốp đối với Penicilium oxalicum N1CS1trk/TiN1 là 30 0 C ± 1, pH 6,5-7,0 và thời gian lên men xốp là 144 giờ. Bƣớc 7: Sản phẩm đƣợc sấy trong tủ sấy Ketong (Trung Quốc) ở nhiệt độ 40 oC cho đến khi ẩm độ còn lại 13-15%. 52 Bƣớc 8: Kiểm tra mật độ xạ khuẩn bằng cách cấy trải trên môi trƣờng Czapek-Dox đặc và kiểm tra hoạt tính của các chủng vi nấm. Mật độ vi khuẩn đạt 10 9 CFU/g và vẫn giữ đƣợc hoạt tính Bƣớc 9: Trộn đều sản phẩm lên men xốp hai chủng Penicilium oxalicum N1CS1trk/TiN1 với các sản phẩm lên men xốp khác có chứa các chủng vi sinh vật hữu ìch khác. Đóng gói trong túi kẽm và bảo quản. Phối trộn chế phẩm gốc của 9 chủng vi sinh vật, chúng tôi đã sản xuất đƣợc 900kg chế phẩm vi sinh vật gốc. 53 PHỤ LỤC VI BỘ CHỦNG VI SINH VẬT HỮU ÍCH VÙNG TÂY NGUYÊN 6.1. Bộ sƣu tập các chủng đối kháng nấm P. splendens, F.oxysporum và R. solani STT KH chủng Vòng đối kháng P.splendens (D-d, mm) Vòng đối kháng F.oxysporum (D-d, mm) Vòng đối kháng R.solani (D-d, mm) Vùng phân lập 1 VK5 CM2.1crk 10 - Cƣ M’gar – ĐăkLăk 2 Ti-VP10 CS3trk 13 23 Chƣ Sê – Gia Lai 3 VK9 CM2.1cr 15 - Cƣ M’gar – ĐăkLăk 4 VK7 CM5cđk 19 - Cƣ M’gar – ĐăkLăk 5 VK2 CM5cđk 20 - Cƣ M’gar – ĐăkLăk 6 VK6 CM2cđ 20 - Cƣ M’gar – ĐăkLăk 7 VK19 CM5cđk 21 14 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 8 VK10 CM5cđk 21 - Cƣ M’gar – ĐăkLăk 9 VK3 CM6cđk 23 19 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 10 VK6 CM5crk 23 13 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 11 VK2 CM6crk 24 - Cƣ M’gar – ĐăkLăk 54 STT KH chủng Vòng đối kháng P.splendens (D-d, mm) Vòng đối kháng F.oxysporum (D-d, mm) Vòng đối kháng R.solani (D-d, mm) Vùng phân lập 12 VK4 CM6crk 15 24 - Cƣ M’gar – ĐăkLăk 13 VK5 CM5cđk 26 25 35 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 14 VK6 CM6crk 12 25 - Cƣ M’gar – ĐăkLăk 15 Vk5CS5trk 14 16 13 Chƣ Sê – Gia Lai 16 VK1 CS1tđk 17 25 - Chƣ Sê – Gia Lai 17 VK5 CS1trk 17 28 - Chƣ Sê – Gia Lai 18 VK5 CM5crk 29 32 33 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 19 VK10 CM4crk 22 33 24 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 20 CF B3 EH2cđ 9 37 - Ea H’Leo, ĐăkLăk 21 CF III EH2cđ - 4,7 8,0 Ea H’Leo, ĐăkLăk 22 Ti-VP18 CM6crk 19 5,2 - Cƣ M’gar – ĐăkLăk 23 BX 101 CS1trk 16 6,2 8,2 Chƣ Sê – Gia Lai 24 Ti-B6 CM6crk 14 6,2 - Cƣ M’gar – ĐăkLăk 25 BX9 CS1trk 15 8,2 - Chƣ Sê – Gia Lai 26 Ti-VP24 CM6crk 10 8,2 - Cƣ M’gar – ĐăkLăk 27 XK3 CS3.2tr - 16 - Chƣ Sê – Gia Lai 28 XK7 CS3.2tđ - 16 - Chƣ Sê – Gia Lai 55 STT KH chủng Vòng đối kháng P.splendens (D-d, mm) Vòng đối kháng F.oxysporum (D-d, mm) Vòng đối kháng R.solani (D-d, mm) Vùng phân lập 29 XK6 CS2.6trk 19 16 15 Chƣ Sê – Gia Lai 30 XK5 CS2trk - 17 - Chƣ Sê – Gia Lai 31 VK14 CM3.1cr - - 12 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 32 Ti-VP24 CM6crk 15 - 12 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 33 VK1 CM5cđk 17 - 13 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 34 VK10 CM6cđk 15 - 15 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 35 VK1 EH2cđ - - 16 Ea H’Leo, ĐăkLăk 36 VK15 CM3.1cr - - 17 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 37 VK2 CM6cđk 12 - 18 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 38 VK1 EH1tđ - - 21 Ea H’Leo, ĐăkLăk 39 VK14 CM3.1cr - - 22 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 40 VK2 EH2cđ 7,2 - 23 Ea H’Leo, ĐăkLăk 41 VK6 CM5cđk 16 - 25 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 42 VK4 CM1tl 10 - 25 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 43 VK1 CM5cđk 15 - 28 Cƣ M’gar – 56 STT KH chủng Vòng đối kháng P.splendens (D-d, mm) Vòng đối kháng F.oxysporum (D-d, mm) Vòng đối kháng R.solani (D-d, mm) Vùng phân lập ĐăkLăk 44 VK5 CM4cđk 13 - 30 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 45 VK3 CM5crk 25,5 - 33 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 46 VK5 CS1trk 15,9 - 33 Chƣ Sê – Gia Lai 47 CF B3 EH2cđ 14 - 42 Ea H’Leo, ĐăkLăk 48 Ti-VP18 CM6crk 18,6 - 44 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 49 BX9 CS1trk 15,7 - 6,2 Chƣ Sê – Gia Lai 50 CF-VP17 EH2cđ 14 - 7,0 Ea H’Leo, ĐăkLăk 51 VK5 CM5crk 25,3 - 7,2 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 52 Ti-B6 CM6crk 15,5 - 8,5 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 53 VK4 CM5crk 26,9 - 32,5 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 54 Ti-XK28 CM6crk 10 - 10 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 55 XK11 CM5cđk 19 - 16 Cƣ M’gar – ĐăkLăk 6.2. Các chủng nấm phân lập đối kháng với nấm bệnh P. splendens, F.oxysporum và R. solani 57 STT KH chủng Hoạt tính đ/kháng P. splendens (%) Hoạt tính đ/kháng F.oxysporum (%) Hoạt tính đ/kháng R. solani (%) Vùng phân lập 1 N1 EH3tđ 16,1 11,1 18,1 Ea H’Leo - ĐăkLăk 2 N1 CS1trk 77,2 87,2 19,6 Chƣ Sê – Gia Lai 58 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Chùm quả (gié tiêu) nếu bón phân chuồng có gié ngắn, hạt không đầy (có khoảng trống) Bón phân chuồng tuy có số chùm quả/cành khá nhiều nhưng chùm quả ngắn, ít hạt Phân POLYFA-TN3 đã cho gié quả dài hơn, hạt dày hơn, ít hạt lép Bón phân POLYFA-TN3 cho các trụ tiêu đầy đủ các cành, đồng đều hơn, số gié quả nhiều hơn và màu sắc lá xanh thẫm hơn 59 Vườn tiêu bón phân chuồng ít và không phân POLYFA-TN3 biểu hiện bệnh vàng lá chết chậm Rễ tiêu được bón phân POLYFA-TN3 không xuất hiện nốt sần do tuyến trùng Rễ tiêu không được bón phân POLYFA-TN3, bị tuyến trùng và Fusarium 60 61 62 63