Luận án Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam

lệ tăng so TH (%) WT 0.12 0.17 0.18 0.23 0.25 206.84 H33 0.24 0.79 0.81 1.04 1.11 451.77 H40 0.24 0.50 0.51 0.69 0.72 297.21 H15 0.29 0.65 0.73 0.79 0.83 286.10 H11 0.27 0.45 0.56 0.68 0.70 259.54 H21 0.23 0.42 0.63 0.72 0.72 315.55 H26 0.27 0.44 0.68 0.81 0.93 343.84 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 - + 1,5kb 1kb 83 Hình 3.26. Hàm lượng prolin tích lũy trong các thời gian gây hạn nhân tạo TH: trước hạn; S3, S5, S7, S9: thời gian gây hạn trong 3, 5, 7, 9 ngày Kết quả này hoàn toàn phù hợp với biểu hiện về hình thái cây về khả năng chống chịu khô hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen sau 9 ngày, 20 ngày gây hạn nhân tạo. Kết quả cho thấy, sau 9 ngày ở điều kiện không được tưới nước, các dòng cây thuốc lá chuyển gen vẫn sinh trưởng bình thường trong khi cây thuốc lá không chuyển gen bắt đầu hiện tượng héo lá. Xử lý hạn sau 20 ngày, hình thái và phát triển cây rõ nét nhất (hình 3.27A). Khả năng chịu hạn ở các dòng thuốc lá chuyển gen có thể được giải thích là do hoạt động của gen P5CS đột biến không bị ức chế bởi hàm lượng prolin trong tế bào. Các dòng thuốc lá chuyển gen có các mức độ chống chịu khác nhau, điều này có thể do khả năng biểu hiện của gen biến nạp và phụ thuộc vào vị trí chèn trong hệ gen vật chủ hoặc số lượng copy của gen biến nạp. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hong và đtg (2000) [42] khi nghiên cứu các dòng cây thuốc lá chuyển gen tăng cường biểu hiện gen mã hóa cho các dạng enzym P5CS đột biến thay thế Asp ở hai vị trí 126 và 129 thể hiện tính chống chịu mặn tốt hơn so với các dòng cây thuốc lá chuyển gen P5CS dạng chưa đột biến trên môi trường chứa 200mM NaCl. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 TH S3 S5 S7 S9 Thời gian (ngày) H àm lư ợ n g pr o lin e (µm o le /g ) WT H33 H40 H15 H11 H21 H26 84 Hình 3.27. Các dòng cây thuốc lá sau 20 ngày hạn nhân tạo (A) và sau phục hồi (B) WT: cây đối chứng không chuyển gen, H11, H15, H26, H33: các dòng cây chuyển gen Sau 20 ngày khô hạn, các dòng cây thí nghiệm được tưới nước phục hồi. Các dòng cây chuyển gen có khả năng phục hồi tốt và nhanh hơn các dòng cây không chuyển gen (hình 3.27B). Kết quả này rất có ý nghĩa trong sử dụng cấu trúc rd29A::P5CSM để biến nạp vào các loài cây trồng khác, nâng cao khả năng chống chịu điều kiện khô hạn và mất nước. 3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN 3.5.1. Kết quả tái sinh tạo đa chồi ở giống đậu tương DT84 3.5.1.1. Tối ưu thời gian khử trùng hạt Có rất nhiều nguyên liệu được sử dụng cho mục đích tái sinh cây đậu tương phục vụ chuyển gen như: lá mầm non, đỉnh sinh trưởng phôi hạt chín,…. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng nách lá mầm hạt chín làm nguyên liệu tái sinh cây thông qua đa chồi. Nách lá mầm hạt chín được xử lý sau khi hạt đậu tương được khử trùng bằng hai cách: Khử trùng bằng Javen và bằng khí clo và đặt lên môi trường nảy mầm sau 4 - 5 ngày. Thời gian khử trùng có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng nảy mầm cũng như tỉ lệ mẫu nhiễm trên môi trường nuôi cấy in vitro. Do vậy để thu được nguyên liệu tốt 85 nhất phục vụ cho công việc tái sinh cây đậu tương. Với phương pháp khử trùng bằng Javen, chúng tôi đã tiến hành tối ưu hóa thời gian khử trùng và nồng độ Javen cho hạt đậu tương chín với các khoảng thời gian là: 10; 20; 30 và 40 phút ở các nồng độ Javen 10;20;30 và 40%. Kết quả được đánh giá bằng các chỉ tiêu là tỉ lệ mẫu nảy mầm, tỉ lệ mẫu nhiễm trên môi trường nảy mầm của hạt. Kết quả nghiên cứu thu được trình bày trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng Javen đến khả năng nảy mầm của giống đậu tương DT84 Tỉ lệ mẫu nảy mầm (%) Thời gian khử trùng (phút) Nồng độ Javen (%) + - Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) 10 100 - 96,5 20 60 12 21 30 69 21 31 10 40 89 19 29 10 100 - 98 20 60 24 18 30 80 17 17 20 40 70 10 6 10 95 0,5 94 20 55 18 45 30 85,6 3,9 5% 30 40 83,7 15 4 10 89 10 95 20 65 15 55 30 66 8,4 4 40 40 62 33 2 Ghi chú: (+) Hạt nảy mầm có màu xanh, thân mầm dài và mập; (-) Hạt nảy mầm có màu vàng, thân mầm ngắn, không có khả năng kéo dài. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian khử trùng và nồng độ khử trùng khác nhau có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cũng như số lượng lá mầm thu được dùng cho tái sinh. Việc tăng thời gian và nồng độ khử trùng làm giảm số lượng mẫu bị nhiễm (mốc và khuẩn) trên môi trường nảy mầm. Tuy nhiên, trong thời gian 40 phút và nộng độ Javen 40% mặc dù tỷ lệ mẫu nhiễm là thấp (2%) nhưng khả năng kéo dài 86 chồi lại thấp. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian tối ưu của phương pháp khử trùng bằng Javen trong thời gian 30 phút ở nồng độ 30%. Phương pháp khử trùng bằng khí clo ở 4 thời gian khác nhau cho thấy 4 giờ có tỉ lệ mẫu nhiễm cao nhất (12,56%), tỉ lệ này giảm dần khi tăng thời gian khử trùng lên 8 giờ (8,1%), 16 giờ (2,4%). Và khi thời gian khử trùng tăng lên đến 24 giờ, tất cả các hạt mang khử trùng đã được làm sạch hoàn toàn (bảng 3.9). Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng khí Clo đến khả năng nảy mầm của giống đậu tương DT84 Tỉ lệ mẫu nảy mầm (%) Thời gian khử trùng (giờ) + - Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) 4 100 0,00 12,56 8 94,1 5,9 8,1 16 98,68 1,32 2,4 24 50,69 45,9 0,00 Ghi chú: (+) Hạt nảy mầm có màu xanh, thân mầm dài và mập; (-) Hạt nảy mầm có màu vàng, thân mầm ngắn, không có khả năng kéo dài. Như vậy, nếu chỉ căn cứ vào tỉ lệ mẫu nhiễm trên môi trường GM thì thời gian khử trùng thích hợp là 24 giờ. Tuy nhiên, chất lượng lá mầm thu được có tác động đến khả năng tạo đa chồi của mẫu cấy trong thí nghiệm tiếp theo, những lá mầm có màu xanh đậm, mập được xem là lựa chọn tối ưu. Vì vậy, trong thí nghiệm này, yếu tố thứ 2 được quan tâm là tỉ lệ hạt nảy mầm được, cũng như chất lượng mẫu sau nảy mầm. Từ kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy rằng: tỉ lệ hạt nảy mầm đạt 100% ở các thời gian thí nghiệm là 4; 8 và 16 giờ. Với thời gian thí nghiệm là 24 giờ đã xuất hiện một số hạt không có khả năng nảy mầm (3,41%) và trong số các hạt nảy mầm thì tỉ lệ mẫu có chất lượng tốt, sử dụng được cho tái sinh tạo đa chồi là rất thấp, chỉ đạt 50,69%, trong khi ở các công thức khác là 100% (4 giờ) và 94,1% (8 giờ) và 98,68% (16 giờ). Như vậy việc tăng thời gian khử trùng đã có ảnh hưởng ức chế khả năng nảy mầm của hạt cũng như chất lượng mẫu thu được sau nảy mầm. Vậy căn cứ vào tỉ lệ mẫu nhiễm và chất lượng mẫu sau nảy mầm cho thấy, thời gian khử trùng thích hợp cho hạt đậu tương DT84 là 16 giờ, ngắn hơn so với nghiên 87 cứu của một số tác giả khác là 24 giờ (Olhoft và đtg, 2001) [69], Olhoft và đtg, 2007) [70], Olhoft và đtg, 2001) [71], (Pazl và đtg, 2004) [75] và trùng với thời gian nghiên cứu trên ĐT12. A B Hình 3.28. Hạt nảy mầm ở các phương pháp khử trùng khác nhau A: Khử trùng bằng Javen 30% trong 30 phút B: Khử trùng bằng khí clo trong 16 giờ So sánh hai phương pháp khử trùng trên, chúng tôi nhận thấy phương pháp khử trùng bằng khí clo đã tỏ ra ưu thế hơn, vì vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp khử trùng này trong thời gian 16 giờ để thu nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.5.1.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi từ lá mầm hạt chín Đa số các công trình tái sinh đậu tương sử dụng hai phương pháp chủ yếu là tái sinh qua đa chồi và tái sinh qua phôi soma. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh từ phương pháp tái sinh qua phôi soma đã được nghiên cứu trên nhiều giống đậu tương khác nhau. Tuy nhiên, quy trình này gặp một số hạn chế đó là: nguồn nguyên liệu khó thu thập, thời gian tái sinh kéo dài (tối thiểu 8 tháng), quy trình tương đối phức tạp (Hong và đtg, 2007) [41], (Sairam và đtg, 2003) [79], (Samoylov và đtg, 1998) [82], (Tae-Seok và đtg, 2004) [91]. Phương pháp tái sinh tạo đa chồi có nhiều ưu điểm: chủ động được nguồn nguyên liệu, ít lệ thuộc vào thời vụ, rút ngắn thời gian tạo cây (3 tháng), đồng thời việc khử trùng nguyên liệu cũng được tiến hành khá đơn giản. Có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen công bố gần đây đã thành công bằng việc sử dụng phương pháp này (Olhoft và đtg, 2001) [69], (Olhoft 88 và đtg, 2007) [70], Olhoft và đtg, 2001) [71], (Pazl và đtg, 2004) [72], (Ren-Gao và đtg, 2006) [76]. Trong phương pháp tái sinh cây thông qua đa chồi, hàm lượng hoocmon sinh trưởng trong môi trường là yếu tố rất quan trọng. Mỗi giống cây đều có một ngưỡng nồng độ thích hợp để có được hiệu quả tạo đa chồi cao nhất. Với giống DT84, hạt chín sau khi khử trùng được tách thành 2 mẫu giống nhau, mỗi mẫu có 1 lá mầm liên kết với nách lá mầm và một nửa trụ mầm. Các mẫu này sau khi gây tổn thương và cắt bỏ đỉnh sinh trưởng, chúng được tạo đa chồi trên 8 loại môi trường (SIM0-SIM7) chứa nồng độ BAP từ 0mg/l đến 2,5 mg/l . Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.10. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của BAP tới khả năng tạo đa chồi Công thức BAP (mg/l) Tỉ lệ mẫu tạo đa chồi (%) Số chồi trung bình/cụm SIM0 0,0 0,00 0,0 SIM1 1 68,1 4,8 SIM2 1,25 72,57 5,1 SIM3 1,5 74,15 5,4 SIM4 1,75 78,8 5,7 SIM5 2 81,3 6 SIM6 2,25 60,2 5,5 SIM7 2,5 55,68 5,0 Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy, sự có mặt của BAP trong môi trường nuôi cấy đã có vai trò kích thích hình thành các cụm chồi trên mẫu cấy, song tỷ lệ mẫu tạo đa chồi không tỷ lệ thuận với nồng độ BAP có trong môi trường. Khi môi trường không có BAP, 100% mẫu cấy không tạo được chồi phụ, rễ xuất hiện ở các lá mầm. Trong khi, với việc bổ sung 2mg/l BAP vào môi trường SIM5, tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi và số chồi trung bình/cụm thu được là cao nhất (81,3% và 6 chồi/cụm), tỷ lệ này là thấp nhất (68,1% và 4,8 chồi/cụm) trên môi trường SIM1 với nồng độ BAP là 1mg/l. Khi nồng độ BAP được tăng lên 2,5mg/l ở môi trường SIM7 thì tỷ lệ mẫu tạo đa chồi lại giảm xuống (55,68%), trên môi trường xuất hiện những mảnh lá mầm mà phần nách lá mầm bị hóa đen, chồi phụ không được hình thành. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với lý 89 thuyết là các chất kích thích sinh trưởng chỉ có tác dụng ở nồng độ nhất định và sẽ ức chế các hoạt động thậm chí là gây chết nếu ở nồng độ quá cao. SIM0 SIM5 SIM7 Hình 3.29. Cụm chồi hình thành trên môi trường có nồng độ BAP khác nhau So sánh với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác trên thế giới nhận thấy nồng độ phù hợp chúng tôi thu được trong nghiên cứu này là 2mg/l BAP cho môi trường tạo đa chồi, trong khi nồng độ mà các tác giả khác sử dụng là 1,67mg/l (Olhoft và đtg, 2007) [70], (Trần Thị Cúc Hòa, 2007) [9]. Điều này cho thấy, mỗi giống đậu tương phù hợp với một nồng độ BAP nhất định. Như vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ BAP là 2mg/l để bổ sung vào môi trường tạo đa chồi và sử dụng kết quả này cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.5.1.3. Ảnh hưởng của hoocmon sinh trưởng GA3, tới khả năng kéo dài chồi Các cụm chồi hình thành trên môi trường SIM sẽ được chuyển sang môi trường kéo dài chồi. Trong các nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật thì gibberellin được biết đến với vai trò chủ yếu trong việc kích thích sự sinh trưởng dãn dài của thân thông qua việc kích thích sự sinh trưởng dãn dài của tế bào, kích thích sự phân bào của mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh lóng. GA3 là một trong hai đại diện của nhóm gibberellin có hoạt tính sinh học và được sử dụng rất phổ biến trong nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Như Khanh, 2008) [10], (Nguyễn Như Khanh và đtg, 2008) [11]. Trong nghiên cứu này, để rút ngắn thời gian tạo cây hoàn chỉnh từ các cụm chồi, chúng tôi tiến hành bổ sung vào môi trường chất kích thích sinh trưởng GA3. Các cụm chồi tạo trên môi trường SIM4 được chuyển sang 4 môi trường (SEM0-SEM3) có bổ 90 sung GA3 với các nồng độ tương ứng là 0,5mg/l, 1mg/l và 1,5mg/l. Hiệu quả kéo dài chồi được đánh giá thông qua tỷ lệ mẫu kéo dài chồi, số chồi kéo dài/cụm và chất lượng chồi sau kéo dài. Số liệu được tổng hợp trong bảng 3.11. Bảng 3.11. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi Công thức GA3 (mg/l) Tỷ lệ mẫu kéo dài chồi (%) Số chồi kéo dài/cụm Chất lượng chồi SEM0 0,0 31,21 2,1 +++ SEM1 0,5 83,15 4,0 +++ SEM2 1,0 86,68 4,5 ++ SEM3 1,5 88,45 4,7 + Ghi chú: (+++): thân chồi khỏe, phiến lá dày và có màu xanh; (++): thân chồi mảnh, lá mỏng và có màu lục nhạt; (+): thân chồi nhỏ và yếu có màu vàng, lá mỏng và có màu lục nhạt hơi vàng. Kết quả của bảng 3.11 cho thấy, trong môi trường không có GA3 vẫn xuất hiện các cụm chồi kéo dài, tỷ lệ này là 30,7% nhưng tốc độ kéo dài chồi chậm, số chồi kéo dài/cụm thu được là thấp nhất (2,5). Khi môi trường có mặt của GA3, tỷ lệ mẫu kéo dài chồi cũng như số chồi kéo dài/cụm tăng lên. Tỷ lệ mẫu kéo dài chồi dao động từ 83,33% đến 88,33%, trong đó cao nhất ở môi trường SEM3 có bổ sung 1,5mg/l GA3 và thấp nhất ở môi trường SEM1 với 0,5mg/l GA3, song mức độ thay đổi về tỷ lệ này giữa các công thức thí nghiệm là không nhiều. Đối với chỉ tiêu về số chồi kéo dài/cụm cũng có sự tăng lên nhưng không lớn giữa việc bổ sung 0,5mg/l với việc bổ sung 1,5mg/l GA3, cụ thể thu được 4 chồi kéo dài/cụm trong môi trường SEM1 và 4,5 chồi kéo dài/cụm trong môi trường SEM2 và SEM3. Như vậy, so sánh với công thức đối chứng, có thể nhận thấy GA3 có vai trò quan trọng trong việc kích thích khả năng kéo dài chồi. Các chồi sau khi kéo dài được cho ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, chất lượng của chúng sẽ ảnh hưởng đến khả năng sống sót của cây khi đưa ra giá thể. Chất lượng của chồi được đánh giá dựa vào việc quan sát hình thái của chồi và màu sắc của thân và lá. Nhận thấy rằng chất lượng chồi giảm theo sự tăng nồng độ GA3 được bổ sung vào môi trường. Khi nồng độ GA3 là 0,5mg/l thì chất lượng chồi thu được là tốt nhất (+++) 91 tương đương với sự phát triển bình thường của chồi trên môi trường không bổ sung GA3, chồi kéo dài có thân to, phiến lá dày và có màu xanh. Còn khi tăng nồng độ GA3 lên 1,5mg/l thì tốc độ kéo dài của chồi nhanh nhưng kèm theo nó là sự giảm chất lượng của các chồi được kéo dài (+), chồi lớn vóng lên, thân nhỏ và yếu, phiến lá mỏng và có màu lục nhạt hơi vàng . Hình 3.30. Chồi kéo dài trên môi trường có nồng độ GA3 khác nhau Như vậy, căn cứ vào kết quả thu được, với những nồng độ GA3 nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn nồng độ GA3 bổ sung vào môi trường là 0,5mg/l Như vậy với những kết quả thu được ở trên nhận thấy sự phối hợp giữa GA3 (0,5mg/l) là thích hợp cho quá trình kéo dài chồi. Kết quả này cũng phù hợp với một số kết quả nghiên cứu của các tác giả khác đã công bố (Olhoft và đtg, 2001) [69], Olhoft và đtg, 2007) [70] 3.5.1.4. Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả tạo rễ IBA được sử dụng để kích thích sự ra rễ của cây in vitro trong nhiều nghiên cứu về cây đậu tương. Trong thí nhiệm này, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát khả năng tạo rễ của cây đậu tương với các nồng độ IBA khác nhau. Các chồi sau khi đạt chiều cao từ 4-5 cm trên môi trường kéo dài được cắt và chuyển sang môi trường ra rễ với nồng độ IBA được bổ sung lần lượt là: 0,1mg/l; 0,5mg/l; 1 mg/l IBA và gây sốc bằng cách nhúng chồi vào IBA có nồng độ 1mg/ml. Có bốn chỉ tiêu được theo dõi trong thí nghiệm này là: tỉ lệ mẫu tạo rễ, ngày bắt đầu ra rễ, số rễ trung bình, và chất lượng rễ. Các kết quả được trình bày trong bảng 3.12. 0mg/l 0,5mg/l 1mg/l 1,5mg/l 92 Bảng 3.12 . Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ Công thức IBA (mg/l) Tỉ lệ mẫu tạo rễ (%) Ngày bắt đầu ra rễ Số rễ trung bình Chất lượng rễ RM0 0 100 5 3,5 + RM1 0,1 100 4 5,5 +++ RM2 0,5 100 3 6,0 ++ RM3 1 100 3 7,0 ++ Ghi chú: (+++): rễ trắng, to và có nhiều rễ thứ cấp; (++): rễ có màu vàng, ít rễ thứ cấp; (+): rễ mảnh, có màu nâu, rất ít rễ thứ cấp. Căn cứ vào kết quả ở bảng 3.12 nhận thấy, khác với một số cây nuôi cấy in vitro như thông, cam, quýt,…khả năng tạo rễ của chồi cây đậu tương tốt hơn, tỉ lệ chồi tạo rễ thu được trong tất cả các môi trường đều đạt 100% ngay cả trong công thức đối chứng. Thời gian bắt đầu xuất hiện rễ của cây đậu tương sớm hơn: 3 ngày trong công thức RM2 (0,5mg/l IBA) và RM3 (1mg/l IBA), dài nhất là 5 ngày trong công thức RM0. Số rễ trung bình thu được trong các công thức dao động từ 3,5 đến 7 rễ trên một chồi. Số lượng rễ thu được cao nhất là khi tăng nồng độ IBA lên 1mg/l trong công thức RM4, quan sát thấy rễ ra thành chùm xung quanh phần gốc thân. Còn ở công thức RM0, số lượng rễ thu được là thấp nhất với 3,5 rễ/chồi. Bên cạnh số lượng rễ thì chất lượng rễ được coi là yếu tố quyết định đến khả năng sống của cây khi đưa ra trồng trong môi trường tự nhiên. Với kết quả thu được trong bảng 1.5 cho thấy, chất lượng rễ tốt nhất quan sát được ở công thức có bổ sung 0,1mg/l IBA, rễ có màu trắng, to, dài, nhiều rễ thứ cấp và xuất hiện đều xung quanh gốc cấy. Rễ sinh trưởng kém nhất ở hai công thức RM0 và RM4, hình thái rễ quan sát được trong 2 môi trường này khá giống nhau: rễ mảnh, có màu nâu sậm, rất ít rễ thứ cấp (Hình 3.31). 93 ĐC RM1 RM2 RM3 Hình 3.31. Ảnh hưởng của IBA tới việc hình thành rễ cây in vitro Như vậy, trong những nồng độ IBA đã nghiên cứu thì nồng độ 0,1mg/l là thích hợp nhất cho việc ra rễ của cây đậu tương in vitro giống DT84. 3.5.1.5. Xác định giá thể thích hợp cho ra cây in vitro Để cây nuôi cấy in vtro sinh trưởng được một cách bình thường trong điều kiện tự nhiên, chúng cần có thời gian thích ứng và phục hồi thông qua giai đoạn phát triển trên giá thể trong điều kiện nhà lưới hay vườn ươm. Đây là khâu cuối cùng và cũng là bước để đánh giá mức độ hiệu quả của một quy trình tái sinh. Vì vậy việc lựa chọn một giá thể ra cây phù hợp có ý nghĩa đặc biệt quan trọng, giá thể thích hợp sẽ giúp rễ cây nhanh chóng phục hồi và phát triển, làm tăng tỉ lệ sống khi ra cây. Thông thường, với ưu điểm là xốp nhẹ, giữ ẩm tốt, trấu hun được sử dụng khá phổ biến để làm giá thể ra cây. Đồng thời việc kết hợp trấu hun với một số thành phần khác như cát, đất phù sa,… với tỉ lệ nhất định tạo ra giá thể thích hợp cho nhiều loại cây in vitro khác nhau. 94 Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng thử nghiệm 3 loại giá thể khác nhau là: trấu hun, 1 trấu hun :1 cát vàng và hỗn hợp trồng cây có bán sẵn. Hai yếu tố được đánh giá trong thí nghiệm này là tỉ lệ sống của cây con và chất lượng cây con. Tỷ lệ cây sống là tiêu chí quan trọng để đánh giá mức độ phù hợp của giá thể. Khi bộ rễ cây in vitro có khả năng thích ứng với môi trường bên ngoài để sống sót và bắt đầu hình thành rễ mới thì cây sẽ được phục hồi và xuất hiện lá mới. Điều này được thể hiện ở chất lượng cây con trên giá thể ra cây. Căn cứ vào chất lượng cây con kết quả nhận thấy với tỷ lệ giá thể là 1 trấu hun: 1 cát vàng là phù hợp. Cây con trên giá thể này có thời gian xuất hiện lá mới sớm, thân kéo dài nhanh. Điều này có thể giải thích giá thể xốp và thoáng khí bởi việc bổ sung cát vàng vào trấu hun trong khi vẫn giữ được độ ẩm cần thiết. Đây chính là cơ sở để chúng tôi lựa chọn giá thể (1 trấu hun : 1 cát vàng) làm nguyên liệu để đưa cây đậu tương in vitro ra môi trường tự nhiên. Sau hai tuần chúng tôi chuyển ra đất. Hình 3.32. Huấn luyện cây, trồng ở nhà lưới và thu hoạch quả 3.5.2. Kết quả bước đầu chuyển gen GUS vào cây đậu tương DT84 Gen mã hóa enzym β- glucuronidase (GUS) được phân lập từ chủng E.coli RA201. Enzym β- glucuronidase có khả năng phân hủy cơ chất glucuronidase thành sản phẩm có khả năng tạo màu xanh lam dễ nhận biết. Chính những đặc điểm này mà các nhà khoa học đã thiết kế gen GUS vào các vector chuyển gen để làm chỉ thị dễ nhận biết ở mô, tế bào thực vật mang gen chuyển (Jefferson và đtg, 1987) [51]. Hiện nay có rất nhiều vector chuyển gen vào thực vật thông dụng được thiết kế có mang gen gus như pBI 121, pCAM 301,… hiệu suất của quá trình chuyển gen không chỉ phụ thuộc vào hệ thống tái sinh mà còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó có đặc 95 điểm di truyền của giống. Nhiều nghiên cứu chuyển gen thành công vào cây đậu tương thông qua nách lá mầm đã được công bố, tuy nhiên để xác định DT84 có phải là giống thích hợp cho việc chuyển gen theo phương pháp này hay không, chúng tôi đã khảo sát khả năng chuyển gen thông qua việc sử dụng gen chỉ thị GUS intron. Theo quy trình chuyển gen tham khảo từ một số nghiên cứu đã công bố, chúng tôi tiến hành nhiễm khuẩn trong thời gian 30 phút và sau thời gian đồng nuôi cấy là 5 ngày các mẫu được kiểm tra biểu hiện gen GUS tạm thời bằng phương pháp nhuộm màu với cơ chất X-Gluc (Hình 3.33). Tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen GUS chúng tôi thu được là 67,5%. Sau 2 tuần trên môi trường tạo đa chồi không chứa chất chọn lọc, các cụm chồi được chuyển sang môi trường chứa ppt với nồng độ 3mg/l (Olhoft và đtg, 2001) [69]. Trên môi trường này, đa số các cụm chồi bị hóa vàng, khô và chết dần. Tỷ lệ mẫu sống sót sau 2 tuần trên môi trường chứa chất chọn lọc thống kê được là 15,21%. Những cụm chồi sống sót sẽ được chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM và tiếp tục được chọn lọc. Như vậy, dựa trên tỷ lệ mẫu biểu hiện gen gus tạm thời, cũng như tỷ lệ mẫu sống trên môi trường chọn lọc, bước đầu nhận thấy rằng DT84 là giống đậu tương thích hợp với phương pháp chuyển gen qua nách lá mầm hạt chín. A B Hình 3.33. Biểu hiện của gen GUS A: Biểu hiện của gen GUS sau 5 ngày đồng nuôi cấy; B: Mẫu biến nạp sống trên môi trường chọn lọc Từ các kết quả trên, chúng tôi trình bày quy trình hoàn chỉnh cho việc tái sinh phục vụ chuyển gen đối với cây đậu tương thông qua phương pháp nách lá mầm như sau: 96 Hình 3.34. Sơ đồ hoàn chỉnh chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm 3.5.3. Kết quả chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào đậu tương Từ các kết quả nghiên cứu chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào cây thuốc lá chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc này vào nách lá mầm giống đậu tương DT84 bằng vi khuẩn A. tumefaciens theo quy trình đã được tối ưu. 1. Chuẩn bị vật liệu chuyển gen - Khử trùng hạt bằng khí clo, 16 giờ - Nảy mầm hạt trên GM (4–5 ngày) 2. Chuẩn bị vi khuẩn A.tumefaciens mang cấu trúc gen chuyển - Nuôi đặc tạo khuẩn lạc - Nuôi lỏng tạo dịch huyền phù - Ly tâm thu cặn khuẩn, hòa cặn trong CCM (OD600 0,6-1) 3. Chuyển gen - Gây tổn thương nách lá mầm trong dịch khuẩn - Lây nhiễm 30 – 40 phút - Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối (5 ngày) 4. Rửa khuẩn và chọn lọc trên môi trường cảm ứng tạo đa chồi - Rửa mẫu trong SIM lỏng + 500 mg/l cefotaxime - Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 1 (2 tuần) - Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 2 (2 tuần) 5. Chọn lọc trên môi trường kéo dài chồi - Cắt bỏ lá mầm - Chuyển mẫu sang SEM (2 tuần/lần) 6. Ra rễ và ra cây hoàn chỉnh - Ra rễ trên RM (14-20 ngày) - Ra cây trên giá thể 1 trấu hun : 1 cát vàng 97 Bảng 3.13. Tỷ lệ tái sinh/sống sót của các mẫu qua các giai đoạn Lô thí nghiệm Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo chồi Số chồi kéo dài Số chồi ra rễ Số cây sống trên giá thể Số cây dương tính với PCR 1 410 189 30 16 9 2 2 480 200 33 23 11 - 3 425 175 38 14 8 1 Tổng 1262 564 101 53 28 3 Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như nguồn vật liệu ban đầu, môi trường nuôi cấy, thời gian nhiễm khuẩn, vector chuyển gen,... Trong nghiên cứu này, cây mầm 4 - 5 ngày tuổi được sử dụng làm vật liệu chuyển gen ở giai đoạn này, việc tách đôi hai lá mầm được thực hiện dễ dàng, đồng thời chồi ngọn và chồi bên có thể được phát hiện và loại bỏ nhằm tránh hiện tượng ưu thế ngọn ảnh hưởng đến sự phát triển của các mô phân sinh phụ nằm ở vùng nách lá mầm. Việc sử dụng dao gây tổn thương nách lá mầm giúp cho mẫu vật sản sinh ra các hợp chất phenolic có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn, làm tăng cường khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn. Ngoài ra, tổ hợp các hợp chất có chứa thiol (L-cysteine, dithiothreitol và sodium thiosulfate) được bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy CCM giúp làm tăng khả năng gắn T-DNA vào bộ gen thực vật và do đó tăng hiệu quả chuyển gen (Olhoft và đtg, 2001) [69]. Thí nghiệm được tiến hành trên 3 lô thí nghiệm với tổng số 1262 mẫu được sử dụng cho chuyển gen, có 564 số mẫu tạo chồi, 101 số mẫu kéo dài chồi, trong quá trình chọn lọc kháng sinh có 28 cây sống sót ra rễ và trồng ở nhà lưới. Hình 3.35. Hình ảnh minh họa quá trình chuyển gen GM SIM SEM SIM BN 98 Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển, sau khi ra cây khoảng 1 tháng, mẫu lá của các dòng cây T0 được tiến hành thu để tách chiết DNA tổng số. Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số cho thấy các băng vạch thu được đều rõ, chứng tỏ DNA có chất lượng tốt, có thể dùng làm mẫu cho phản ứng PCR nhân gen. Sử dụng 1µl sản phẩm DNA đã được tách chiết, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu của promoter rd29A. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy đã thu nhận được 3 cây dương tính với phản ứng PCR chiếm tỷ lệ 0,23% tổng mẫu biến nạp. Trong số 3 dòng cây thu được có một dòng không ra hoa. Các dòng cây được tiếp tục trồng để thu hạt và đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển ở các thế hệ sau. Hình 3.36. Kiểm tra cây đậu tương T0 chuyển gen bằng PCR M: Thang DNA chuẩn 1kb; (-): Đối chứng âm; WT: Cây không chuyển gen; 1 -5: Các dòng T0 được phân tích; (+): Đối chứng dương (plasmid) Dòng 11 Dòng 23 Dòng 17 Hình 3.37. Cây đậu tương T0 chuyển gen M 1 2 3 4 5 WT - + 1,5kb 1kb 1,3kb 99 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1.1. 16 giống đậu tương địa phương sưu tập được có sự đa dạng và phong phú về hình thái, kích thước và khối lượng hạt. Phân tích về chỉ tiêu hóa sinh cho thấy các giống đậu tương địa phương có chất lượng và khả năng chịu hạn cao hơn so với giống đối chứng. Đã xác định được mối liên quan giữa tỷ lệ tăng hàm lượng prolin và khả năng chịu hạn của các giống đậu tương trong phạm vi nghiên cứu. 1.2. Trình tự gen P5CS của hai giống đậu tương DT84 và SL5 đã được phân lập gồm có 2148 nucleotid, mã hóa 715 axit amin. 1.3. Đã tạo đột biến ở bộ ba có vị trí thứ 125 của gen P5CS của giống SL5, thay thế Asp bằng Ala trong trình tự protein. 1.4. Promoter rd29A đã được phân lập thành công từ cây A.thaliana. Promotor rd29A có chiều dài 1298bp mang các trình tự đặc trưng gồm các nhân tố cis thuộc nhóm MYB, DRE, AMY box nhân tố đặc trưng của promoter và nhân tố cảm ứng điều kiện khô hạn. 1.5. Khả năng hoạt động của promtor rd29A đã được đánh giá trong cây thuốc lá chuyển gen. Trong điều kiện thiếu nước, promoter rd29A đã điều khiển gen chỉ thị GUS biểu hiện khá mạnh và rõ ràng ở các dòng thuốc lá chuyển gen được xử lý bởi hạn nhân tạo so với các dòng cây chuyển gen không xử lý và cây đối chứng. 1.6. Đối với các dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM, có hiện tượng tăng cao hàm lượng prolin sau khi gây hạn nhân tạo, dẫn đến khả năng sống sót cao hơn các cây đối chứng (không chuyển gen). Khả năng phục hồi của các dòng cây chuyển gen nhanh hơn các cây đối chứng. 100 1.7. Tối ưu được quy trình tái sinh và chuyển gen thông qua mô nách lá mầm ở đậu tương. Bước đầu chuyển thành công cấu trúc gen rd29A::P5CSM vào giống đậu tương DT84, và thu được một số dòng dương tính PCR đối với gen chuyển. 2. Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu, phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen chịu hạn phục vụ cho chọn tạo giống. - Mở rộng sử dụng cấu trúc promoter rd29A::GUS và rd29A::P5CSM vào các đối tượng cây trồng khác. 101 CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Hà Tấn Thụ, Đinh Thị Kim Phương, Trần Thị Trường (2006), “Sưu tập, phân loại và đánh giá chất lượng hạt của một số giống đậu tương địa phương tại tỉnh Sơn La” Tạp chí Nông nghiệp và phát triển Nông thôn số 11 kỳ I tháng 6/2006. 28-32 2. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thuý Hường (2006), “Thành phần axit amin và khả năng chịu hạn của một số giống đậu tương địa phương của tỉnh Sơn La” Tạp chí Nông nghiệp và phát triển Nông thôn số 20 kì II tháng 10/2006. 22-26. 3. Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2008) Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen P5CS của một số giống đậu tương (Glycine max L.Merrili) Tạp chí Công nghệ sinh học 6(4): 459-466 4. Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009) Phát triển hệ thống tái sinh invitro ở cây đậu tương (Glycine max L.Merrili) phục vụ chuyển gen. Tạp chí Khoa học và Công nghệ . Đại học Thái Nguyên 52(4): 82-88. 5. Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2009) Tạo gen mã hóa enzym P5CS (Pyroline - 5 - carboxylate synthase) mang đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi bằng kỹ thuật PCR . Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2009: 191 - 193. 6. Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hoàng Hà (2010) Tách dòng và đánh giá hoạt động của promoter cảm ứng khô hạn RD29A từ Arabidopsis thaliana. Tạp chí Công nghệ sinh học. 8(4): 1805-1810. 7. Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hoàng Hà (2010) Tạo cây thuốc lá chuyển gen P5CS đột biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngược, làm tăng hàm lượng protein và khả năng chống chịu khô hạn. Hội nghị toàn quốc về khoa học sự sống Bio-Hà Nội 2010. Tạp chí Công nghệ sinh học 8 (3A): 539-544. 8. Chu Hoang Mau, Nguyen thi Thuy Huong, Nguyen Tuan Anh, Chu Hoang Lan, Le van Son, Chu Hoang Ha ( 2010) Characteristic of the gene encoding pyrroline – 5 – carboxylate synthase (P5CS) in Vietnamese sobean cultivar ( Glycine max L.Merrill) 2010 International Conference on Biology, Environment and Chemistry (ICBEC 2010): 319-323 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt 1. Lê Trần Bình, Hỗ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp. 2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa. NXB Đại học quốc gia Hà Nội. 3. Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), “Mối tương quan giữa hàm lượng prolin và tính chống chịu ở cây lúa′′ Tạp chí công nghệ sinh học, 1(1): 85-95. 4. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành hóa sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội 5. Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi, Nguyễn Thị Tỵ (1998), “Xác định thành phần axit amin bằng phương pháp dẫn xuất hoá với 0-phthalđialehyd và 9-fluorenlmthyl chlorofomat trên hệ HP aminoquan series II”, kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học 1997. NXB khoa học kỹ thuật H, 454-461 6. Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương. NXB Nông Nghiệp. 7. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005). Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục.101-112 8. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây đậu tương. NXB Nông Nghiệp. 9. Trần Thị Cúc Hòa (2007), “Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các giống đậu tương trồng ở Việt Nam“ Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn. 18: 11-16. 10. Nguyễn Như Khanh(2008), Sinh học phát triển thực vật. NXB Giáo dục. 11. Nguyễn Như Khanh, Cao Phi Bằng (2008), Sinh lý học thực vật. 2008, NXB Giáo dục. 103 12. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học. Viện Công nghệ sinh học: Hà Nội 13. Trần Thị Phương Liên (2010) Protein và tính chống chịu ở thực vật, NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ :82-140 14. Trần Đình Long, Đoàn Thị Thanh Nhàn (1995). Kết quả nghiên cứu giống đỗ tương M103, Kết quả nghiên cứu khoa học cây đậu đỗ 1991-1995:52-56 15. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo các dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học. Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội 16. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật. Luận án tiến sỹ sinh học, Hà Nội. 17. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên cứu thực nghiệm trong nông lâm ngư nghiệp trên máy vi tính, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 18. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu và ứng dụng. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 19. Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2009) “Cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời hai loại virus gây bệnh khảm”. Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(2): 193- 201 Tài liệu tham khảo tiếng Anh 20. Armengaud P, Thiery L, Buhot N, Grenier-de March G, Savouré A (2004) “Transcriptional regulation of prolin biosynthesis in Medicago truncatula reveals developmental and environmental specific features“. Physiologia plantarum 120(3), 442-450 21. Bates LS (1973), Rapid determination of free prolin for water stress studies. Plant Soil. 39: 205-207 104 22. Baucher M, Andree BVM , Chabbert B, Michel BJ, Opsomer C, Van MM. and Botterman J. (1999). “Down-regulation of cinnamyl alcohol dehydrogenase in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.) and the effect on lignin composition and digestibility”. Plant Molecular Biology. 39: 437-447 23. Boggess SF and Stewart CR (1976), “Effect of water stress on prolin synthesis from radioactive precursors”. Plant Physiol. 58(3): 398-401. 24. Borsani O, Zhu J, Verslues PE, Sunkar R, and Zhu JK. (2005). “Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis”. Cell 123: 1279–1291. 25. Close T.J.(1997), “Dehydrin: Emergence biochemical role family plant dehydrin proteins’’, Physiol.Plant , 795-803. 26. Csonka LN, Gelvin SB, Goodner BW, Orser CS, Siemieniak D, and Slightom JL (1988), “Nucleotid sequence of a mutation in the proB gene of Escherichia coli that confers prolin overproduction and enhanced tolerance to osmotic stress”. Gene. 64(2): 199-205. 27. Curtis J, Shearer G, and Kohj DH (2004), “Bacteroid prolin catabolism affects N(2) fixation rateof drought- stressed soybeans”. Plant Physiol. 136(92): 3313-3318. 28. Chen JB, Wang SM, Jing RL, and Mao XG (2009), “Cloning the PvP5CS gene from common bean (Phaseolus vulgaris) and its expression patterns under abiotic stresses”. J Plant Physiol, 166(1): 12- 19 29. Choudhary NL, Sairam RK, and Tyagi A (2005), “Expression of ∆1 - Pyrroline - 5 - carboxylate synthetase gene during droght in rice (Oryzasativa L)”. Indian J Biochem Bio, 42: 366-370 30. Delauney AJ, Hu CAA, and Kishor PB, Verma, D. P. S (1993). “Cloning of ornithine δ- aminotransferase cDNA from Vigna aconitifolia by trans- complementation in Escherichia coli and regulation of prolin biosynthesis”. J Biol Chem, 268: 18673-18678. 31. Dix PJ, (1986) “Plant cell culture technology”. Yeoman M.M. (eds), Oxford, Blackwell Scientific Publications. 143-201. 105 32. Do TH, Jacob M, Angenon G, Hermans C, Tran TT, Le VS, and Roosens NH (2003), “Prolin accumulation and ∆1 - Pyrroline - 5 - carboxylate synthetase gene properties in three rice cultivars differing in salinity and drought tolerance”. Plant Sci. 165: 1059-1068 33. Fior S, Vianelli A, and Gerola PD (2009), “A novel method for fluorometric continuous measurement of β-glucuronidase (GUS) activity using 4-methyl- umbelliferyl-β-d-glucuronide (MUG) as substrate”. Plant Sci. 176(1): 130- 135. 34. Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau A., Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J. (2005). “EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem, regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis”. The Plant Journal. 43(4): 553-567 35. Hai L, Qingyin Z, Yan LZ, Shasheng W, Xiangning J (2003), “Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco”. Plant Growth Regulation. 41: p. 279-286 36. HamiltonIIIEW,HeckathornSA(2001)MitochondrialadaptationstoNaCl.Com plexIisprotectedoxidantsandsmallheatshockproteins,whereascomplexIIisprot ectedby prolineandbetaine.PlantPhysiol126:1266–1274 37. Hawkins S, Samaj J, Lauvergeat V, Boudet A, Grima-Pettenati J(1997), Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase: Identification of New Sites of Promoter Activity in Transgenic Poplar. Plant Physiol, 113(2): p. 321-325. 38. Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumasho T (1994) “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries the T-DNA”, The Plant J (271-282) 39. Hirasawa, T Tanaka K., Miyamoto D., Takei, M. and Ishihara K. (1994) “Effects of preflowering moisture deficits on dry matter production and ecophysiological characteristics in soybean plants under drought conditions during grain filling”. Jpn. J. Crop Sci. 63: 721-730. 106 40. Hiroaki Fujii and Jian-Kang Zhu (2009) An Autophosphorylation Site of the Protein Kinase SOS2 Is Important for Salt Tolerance in Arabidopsis. Molecular Plant, doi:10.1093/mp/ssn087 41. Hong HP, Zhang H, Olhoft P, Hill S, Wiley H, Toren E, Hillebrand H, Jones T, Cheng M (2007),“Organogenic callus as the target for plant regeneration and transformation via Agrobacterium in soybean (Glycine max (L.) Merriill”. In vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 43: 558-568. 42. Hong Z, Lakkineni K, Zhang Z, Verma DPS (2000) Removal of feedback inhibition of -pyrroline -5- carboxylate synthetase results in increased proline accumulation and protection of plants from osmotic stress”. Plant Physiol,. 122: p. 1129-1136. 43. Hoogenboom G.Peterson, CM, Huck, MG (1987) “Shoot growth rate of soybeans as affected by drought stress”. Agron. J. 79: 598-607. 44. Hu CA, Delauney AJ, Verma DPS (1992) “A bifunctional D1-enzyme- pyrroline-5-carboxylate synthetase catalyzes the first two steps in prolin biosynthesis in plants”. Proc Natl Acad Sci USA 89:9354– 9358 45. Hua X, Van De Cotte B, Van Montagu, M., Verbruggen N (1999) “A 69 bp fragment in the pyrroline-5-carboxylate reductase promoter of Arabidopsis thaliana activates minimal CaMV 35S promoter in a tissue-specific manner”. FEBS Lett. 458:193–196. 46. Hua X-J, Van De Cotte B, Van Montagu M, Verbruggen N (1997) Developmental regulation of pyrroline-5-carboxylate reductase gene expression in Arabidopsis. Plant Physiol 114: 1215–1224 47. Huck MG, Ishihara K, Peterson C.M. and Ushijima T (1983) “Soybean adaptation to water stress at selected stages of growth”. Plant Physiol. 73: 422-427. 48. Hufstetler EV, Boerma, HR, Carter TE, Earl HG (2007) “Genotypic variation for three physiological traits affecting drought tolerance in soybean”. Crop Sci. 47: 25-35. 107 49. James AT, Lawn RJ, Cooper M (2008a) “Genotypic variation for drought stress response traits in soybean. I. Variation in soybean and wild Glycine spp. for epidermal conductance, osmotic potential, and relative water content”. Aus. J. Agri. Res. 59: 656-669 50. James AT, Lawn RJ, Cooper M (2008b) “Genotypic variation for drought stress response traits in soybean. II. Inter-relations between epidermal conductance, osmotic potential, relative water content, and plant survival”. Aus. J. Agri. Res. 59: 670-678. 51. Jefferson RA, Kavanagh TA, and Bevan MW (1987), “GUS fusion: β- glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants”. EMBO. 6: 3901-3907. 52. Jovanovi Z, Proki L, Stiki R, Peki S (1996) “Cuticular characteristics in maize lines differing in drought resistance and maturity grouping”. J. Exp. Bot. 47: 59-60. 53. Jun SS, Choi HJ, Yang JY, Hong YN (2001), “Photosynthetic response to dehydration and high temperature in trehalose-producing transgenic tobacco In PS2001 Proceedings, 12th International Congress on Photosynthesis”. CSIRO Publishing, Canberra, S35-017. 54. Kaspar TC, Taylor HM, Shibles RC. (1984) “Taproot elongation rates of soybean cultivars in the glasshouse and their relation to filed rooting depth”. Crop Sci. 24: 916-920. 55. Kavi Kishor PB, Hong Z, Miao G, Hu C, Verma DPS (1995) Overexpression of D1-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline overproduction and confers osmoto lerance intransgenic plants. Plant Physiol 108: 1387–1394 56. King CA, Purcell LC (2005) “Inhibition of N2 fixation in soybean is associated with elevated ureides and aminoacids”. Plant Physiol. 137: 1389- 1396 108 57. Kishor PBK, Sangam S, Amrutha RN, Sri Laxmi P, Naidu KR, Rao K R S S, Sreenath Rao, Reddy K J, Theriappan P, Sreenivasulu N (2005) “Regulation of prolin biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: Its implications in plant growth and abiotic stress tolerance”. Current Science 88:3 424 – 438. 58. Kodym A, Afza R (2003) “Physical and chemical mutagenesis, plant functional genomics. Erich Grotewold (Ed.)”, Humana Press. 189-204. 59. Kohl DH, Schubert KR, Carter MB, Hagedorn CH, Shearer G (1988) Proline metabolism in N2-fixing root nodules: energy transfer and regulation of purine synthesis. Proc Natl Acad Sci USA 85: 2036–2040 60. Lambert N, Yarwood JN (1992), Engineering legume seed storage protein, in Plant Protein Engineering. Cambridge University press, 167-187. 61. Liu F, Andersen MN, Jensen CR. (2003) “Loss of pod set caused by drought stress is associated with water status and ABA content of reproductive structures in soybean”. Funct. Plant Biol. 30: 271-280 62. Liu Y, Gai JY, Lu HN, Wang Y J, Chen SY (2005) “Identification of drought tolerant germplasm and inheritance and QTL mapping of related root traits in soybean [Glycine max (L.) Merr.]” Yi Chuan Xue Bao 32: 855- 863. 63. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (November 1951). "Protein measurement with the Folin phenol reagent". J. Biol. Chem. 193 (1): 265–75. 64. Marino D, Frendo P, Ladrera R, Zabalza A, Puppo A, Arrese-Igor C (2007) “Nitrogen fixation control under drought stress. Localized or systemic?” Plant Physiol. 143: 1968–1974. 65. Mattioli R, Falasca G, Sabatini S, Altamura MM, Costantino P, and Trovato M (2009). “The prolin biosynthetic genes P5CS1 and P5CS2 play 109 overlapping roles in Arabidopsis flower transition but not in embryo development”. Physiologia Plantarum 137: 72–85. 66. Matysik J, Ali Bhalu,B, Mohanty P (2002) “Molecular mechanism of quenching of reactive oxygen species by prolin under water stress in plants”. - Curr. Sci. 82: 525-532 67. Murakeozy EP, Nagy Z, Duhaz C, Buchereau A, Tuba Z (2003) “Seasonal changes in the levels of compatible osmolytes in three halophytic species of inland saline vegetation in Hungary”. J Plant Physiol 160:395–401 68. Nguyen HT, Babu RCBlum, A. (1997) “Breeding for drought resistance in rice: physiology and molecular genetics considerations”. Crop Sci. 37: 1426-1434 69. Olhoft PM, Lin K, Galbraith J, Nielsen NC, Somers DA (2001), “The role of thiol compound in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells”. Plant Cell Rep. 20: 731-737. 70. Olhoft PM (2007), “A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary- node explants from seedlings”. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 43: 536-549. 71. Olhoft PM, Somers DA (2001), “L-Cysteine increases Agrobacterium- mediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-node cells”. Plant Cell Rep, 20: 706-711. 72. Paz1 MM, Shou H, Guo Z, Zhang Z, Banerjee AK, Wang K (2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”. Euphytica 136: 167- 179. 73. Peng Z, Lu Q, Verma DPS (1996) Reciprocal regulation of D1- pyrroline- 5-carboxylate synthetase and proline dehydrogenase genes control levels during and after osmotic stress in plants.Mol Gen Genet 253: 334–341 74. Porcel R, azconR,Ruiz- Lozano JM (2005), “Evaluation of the role of genes encoding for dehydrin proteins (LEA D-11) during drought stress in 110 arbuscular mycorrhizal Glycine max and Lactuca sativaplants”. J Exp Bot.,56(417):1933-42. 75. Purcell LC, King CA (1996) “Drought and nitrogen source effects on nitrogen nutrition, seed growth, and yield in soybean”. J. Plant Nutr. 19: 969-993 76. Ren-Gao X, Hong-Feng X, Zhang B (2006), “A multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells”. Biotechnol Lett, 28: 1551-1557. 77. Riederer M, Schreiber L (2001) “Protecting against water loss: Analysis of the barrier properties of plant cuticles”. J. Exp. Bot. 52: 2023-2032 78. SabehatA,LurieS,WeissD(1998)Expressionofsmallheatshockproteinsatlowte mperatures.PlantPhysiol117:651–658 79. Sairam RV, Franklin G, Hassel R, Smith B, Meeker K N K, Parani M, Abed DA, Ismail S, Berry K, Goldman SL (2003),” A study on the effect of genotypes, plant growth regulators and sugars in promoting plant regeneration via organogenesis from soybean cotyledonary nodal callus”. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 75: 79-85. 80. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 81. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Vol. 1, 2, and 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 82. Samoylov VM, Tucker DM, Thibaud-Nissen F, Parrott WA (1998), “A liquid-medium-based protocol for rapid regeneration from embryogenic soybean cultures”. Plant Cell Reports, 18: 49-54. 83. Satoh R, Nakashima K, Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2002) “ACTCAT, a novel cis-acting element for prolin-and hypoosmolarity-responsive expression of the ProDH gene encoding prolin dehydrogenase in Arabidopsis”. Plant Physiol. 130, 709–719 111 84. Shinozaki K, Yamamguchi-Shinozaki K (2007), “Gene expression and signal transduction in water-stress response”. Plant Physiol 115: 327-334. 85. Sinclair TR, Ludlow. MM (1986) “Influence of soil water supply on the plant water balance of four tropical grain legumes”. J. Plant Physiol. 13: 329-341 86. Sinclair TR., Purcell L.C, King CA., Sneller CH., Chen P, Vadez V (2007) “Drought tolerance and yield increase of soybean resulting from improved symbiotic N fixation”. Field Crops Res. 101: 68-71 87. Specht JE, Williams JH (1985) Breeding for drought and heat resistance: Prerequisites and examples. In: World Soybean Research Conference III. Proceedings. Edited by Shibles, R. pp.468–475. Westview Press, Boulder, Colarado 88. Sun XH, Chen MJ (2002) “A brief account of promoter cloning”. Acta Edulis Fungi. 9(3): 57-62. 89. Szabados L, AouldSavoure (2009) “ Prolin: amultifunctionalaminoacid ”Trends in PlantScience 15 (2): 89-97 90. Szekely G, Abraham E, Cseplo A, Rigo G, Zsigmond L, Csiszar J, Ayaydin F, Strizhov N, Jasik J, Schmelzer E (2008): “Duplicated P5CS genes of Arabidopsis play distinct roles in stress regulation and developmental control of prolin biosynthesis”. Plant Journal , 53(1):11-28. 91. Tae-Seok K and Korban SS (2004), “Enhancing the frequency of somatic embryogenesis following Agrobacterium-mediated transformation of immature cotyledons of soybean [ Glycine max(L.) Merrill.]”. In Vitro Cell. Dev. Biol-Plant. 40: p. 552-558. 92. Taji T, Seki M, Satou M, Sakurai T, Kobayashi M, Ishiyama K, Narusaka Y, Narusaka M, Zhu JK, Shinozaki K (2004) “Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-related halophyte salt cress using Arabidopsis microarray”. Plant Physiol 135:1697–1709 93. Taylor HM Burnett E, Booth GD (1978) “Taproot elongation rates of soybeans”. Z. Acker-und Pflanzenbau Bd. 146 112 94. ThomashowMF(1998)Roleofcoldresponsivegenesinplantfreezingtolerance.P lantPhysiol118:1–7 95. Topping JF (1988), Tobacco transformation. Methods Mol Biol, 81: 365 96. Turner NC, Wright GC, Siddique KHM (2001) “Adaptation of grain legumes (pulses) to water limited environments”. Adv. Agron. 71: 193-23. 97. Umezawa T, Yoshida R, Maruyama K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K and Thomashow MF (2004) SRK2C, a SNF1-Related protein kinase 2, improves drought tolerance by controlling stress-responsive gene expression in Arabidopsis thaliana. PNAS 101 (49):17306-17311 98. Valliyodan B and Nguyen HT. (2006) “Understanding regulatory networks and engineering for enhanced drought tolerance in plants”. Curr. Opin. Plant Biol. 9: 189 99. VierlingE,KimpelJA(1992)Plantresponsestoenvironmentalstress.CurrOpinB iotech3:164–170 100. Wu Y ZH, Que YX, Chen RK, Zhang MQ (2008) “Cloning and identification of promoter Prd29A and its application in sugarcane drought resistance”. Sugar Tech.10(1): 36-41 101. Xu Q , Wen XP and Deng XX (2004). “A simple protocol for isolating genomic DNA from chestnut rose (Rosa roxburghii Tratt ) for RFLP and PCR Analyses”. Plant Molecular Biology Reporter. 22: 301a-301g 102. Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1993) “The plant hormone abscisic acid mediates the drought-induced expression but not the seed-specific expression of rd22, a gene responsive to dehydration stress in Arabidopsis thaliana”. Mol.Gen.Genet. 2: p. 17-25 103. Zhang CS, Lu Q, Verma DPS (1995) “Removal of feedback inhibition of D1 -pyrroline-5-carboxylate synthetase, a bifunctional enzyme catalyzing the first two steps of prolin biosynthesis in plants”. J Biol Chem 270:20491– 20496 113 104. Zhang C-S, Lu Q, Verma DPS (1997) “Characterization of ∆1 – pyrroline - 5-carboxylate synthetase gene promoter in trangsgenic Arabidopsis thailana subjected to water stress” Plant Scicnce 129 : 81-89 105. Zhang N, Si HJ, and Wang D (2005), “Cloning of rd29A gene promoter from Arabidopsis thaliana and its application in stress-resistance transgenic potato”. Acta Agronomica Sinica. 31(2): 159-164. Tài liệu trang Web 106. . 107 108.