Luận văn Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl transferase)vào mô sẹo sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

nax, 2,4-D là chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng phổ biến vì có tác dụng tốt cho sự tăng sinh khối của mô sẹo. Ngoài ra, với việc bổ sung TDZ, mô sẹo tăng sinh nhanh, quá trình phát sinh và 58 hình thành phôi soma diễn ra mạnh hơn (Proctor J.T.A. và cs., 1996). Sự kết hợp giữa 2,4-D và TDZ có thể dẫn đến phát sinh cơ quan sau 6 ngày nuôi cấy (Yancheva và cs., 2003). Trong thí nghiệm này, tỷ lệ mô sẹo hình thành phôi soma khá cao (>70%). Trạng thái mô ở các nghiệm thức môi trường không khác nhau nhiều. Tuy nhiên, môi trường S2 là môi trường thích hợp nhất cho sự tăng sinh khối và hình thành phôi soma. 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo lá sâm Mỗi giai đoạn phát triển của tế bào sinh phôi cần sự kết hợp đặc biệt của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật ở các nồng độ thích hợp. Một môi trường thích hợp cho giai đoạn này có thể cản trở sự diễn tiến của các giai đoạn tiếp theo. Trong giai đoạn cảm ứng (giai đoạn tạo các tế bào sinh phôi trong mô sẹo, dịch treo) thì sự có mặt của auxin là cần thiết nhưng sự có mặt tiếp tục của nó lại trở nên bất lợi cho sự biệt hoá mô của phôi (giai đoạn tiến hoá phôi soma) và tái sinh chồi. Bảng 3.2. Kết quả tái sinh chồi sâm Ngọc Linh sau 12 tuần STT Môi trường Số lượng chồi TB/mẫu Trạng thái chồi 1 C1 7,4 ± 1,63Pab z - Chồi không xanh tốt. - Phát triển không đồng đều. 2 C2 12,7 ± 0,86Pc - Chồi xanh tốt. - Phát triển tương đối đồng đều ở các mẫu, lá chồi xanh, to. 3 C3 10,8 ± 1,93Pbc - Chồi xanh tốt. - Phát triển đồng đều. 4 C4 6,6 ± 0,68Pa - Chồi tương đối tốt. - Lá chồi yếu. 5 C5 5,2 ± 0,58Pa - Chồi không xanh, tốt. - Số chồi ít, phát triển không đều. 6 C6 6,0 ± 1,18Pa - Chồi không xanh tốt. - Số chồi ít, phát triển chậm. 59 Các số trung bình trong bảng với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có mức ý nghĩa p ≤ 0,05. z: các chữ cái a, b, c trong một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan (Duncan’s Multiple Range Test). Tỷ lệ và nồng độ kết hợp giữa cytokinin và auxin có ảnh hưởng quan trọng trong quá trình tái sinh chồi. Thông thường, trên môi trường có tỷ lệ auxin/cytokinin thấp, mẫu có xu hướng tạo chồi (Vanden và cộng sự, 1998). Trong 6 nghiệm thức khảo sát hiệu quả tác dụng của sự kết hợp giữa auxin (NAA) và cytokinin (BA) trong hình thành chồi, tỷ lệ chồi ở các nghiệm thức có sự khác biệt. Các mẫu ở môi trường C5 có số chồi thấp nhất (trung bình 5,2 chồi/mẫu). Cả 3 môi trường C4, C5 và C6 đều có tỷ lệ chồi thấp và trạng thái chồi cũng không tốt, chồi tăng trưởng chậm. Môi trường C1 có 7,4 chồi/mẫu, nhưng chồi tăng trưởng chậm và một số mẫu dường như không tạo được chồi. Ở môi trường C1, nồng độ BA thấp (0,5 mg/l) và các môi trường C4, C5, C6 có nồng độ NAA cao (2 mg/l) nên không phù hợp cho sự hình thành và tăng trưởng của chồi. Môi trường C2 và môi trường C3 cho kết quả tốt nhất. Số lượng chồi nhiều (môi trường C2: 12,7 chồi/mẫu; môi trường C3: 10,8 chồi/ mẫu) (hình 3.3, 3.4) và sự tăng trưởng của chồi trong 2 nghiệm thức này tốt hơn hẳn so với 4 nghiệm thức còn lại. Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu vì cả hai môi trường C2 và C3 có tỷ lệ auxin/cytokinin thấp hơn so với các môi trường C1, C4, C5 và C6. Trong đó, môi trường C2 tốt hơn cho sự tạo chồi nên sẽ được dùng để tái sinh sau chuyển gen. Nghiên cứu sự tạo chồi in vitro, nhiều loại chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng, đặc biệt có hiệu quả cao khi kết hợp hai hay nhiều hợp chất. Khi nghiên cứu ở loài Vicia faba, Mutasim và Kazumi (1999) đã chứng minh được rằng với sự kết hợp giữa BA và TDZ, chồi được hình thành và phát triển tốt hơn hẳn so với tác dụng riêng lẻ của TDZ. Hay ở sâm Mỹ (Panax quingquefolium L.), sự kết hợp giữa 2,4-D và NAA cũng cho kết quả tạo chồi rất tốt (Ananchanok Tirajoh, 1996). Đối với sâm Ngọc Linh, sự phối hợp giữa NAA (1mg/l) và BA (1mg/l) được xem là thích hợp cho sự hình thành và phát triển chồi. 60 Hình 3.3. Chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi trường C1, C2, C3, C4, C5 và C6 C1 C2 C3 C4 C5 C6 61 Hình 3.4. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần a, b. Môi trường C1 c, d. Môi trường C2 e, f. Môi trường C3 a f e d c b 62 Hình 3.5. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần g, h. Môi trường C4 i, j. Môi trường C5 k, l. Môi trường C6 k i h l j g 63 Nghiên cứu sâu hơn về bản chất của con đường tái sinh cây (plant regeneration pathway), nhận thấy ở sâm Ngọc Linh sự hình thành mô có khả năng sinh phôi (embryogenic) nhiều hay ít từ mô sẹo lá và cuống lá trên môi trường có 2,4-D và TDZ với các nồng độ khác nhau theo thời gian nuôi cấy – theo dõi sau khoảng 3 – 6 tháng. Sự hình thành mô có khả năng sinh phôi/mô phôi đã tạo điều kiện thích hợp cho sự tái sinh chồi khi mô sẹo được cây chuyển sang môi trường có NAA và BA. Hình 3.6 dưới đây minh họa cơ bản quá trình tái sinh chồi thông qua phôi soma từ mô sẹo lá. Hình 3.6. Sự hình thành và phát triển của phôi soma từ mô sẹo mảnh lá. a. Mô sẹo lá sau 2 tháng nuôi cấy trên môi trường có 1 mg/l 2,4-D (chưa tạo mô phôi). b. Mô phôi soma hình cầu ở dạng đơn và dạng cụm được nhân sinh khối trên môi trường thạch có 1 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ (để trong tối). c. Toàn cảnh một số giai đoạn phát triển của mô phôi soma. d. Cận cảnh cụm mô phôi soma ở các giai đoạn phát triển. e. Phôi soma đặc trưng với hai cực lá mầm và rễ mầm. f. Phôi soma có lá mầm phát triển. g. Sự hình thành lá thật ở phôi soma e 2 mm a d f g 2 mm b 2 mm c 64 Theo nghiên cứu của nhiều tác giả nước ngoài, ở đối tượng sâm Triều Tiên (họ Araliaceae), tuy cũng có hiện tượng tái sinh theo kiểu phát sinh cơ quan (organogenesis) (Gorpenchenko và cs., 2006) nhưng hiện tượng tái sinh theo con đường sinh phôi soma (somatic embrygenesis) được xem là rất đặc trưng (Chang, Hsing, 1980; Arya và cs., 1991; Ahn và cs., 1996; Choi và cs., 1998; Choi và cs., 2003). Ở luận văn này, sự tái sinh qua con đường sinh phôi soma trên đối tượng sâm Ngọc Linh, cây cùng họ Araliaceae, phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả nêu trên. Theo chúng tôi, tương tự phôi hợp tử, phôi soma cũng là nguồn vật liệu rất có giá trị dùng để biến nạp. Choi và cs. (2001, 2003) qua sử dụng trực tiếp lá mầm phôi hợp tử đã nghiên cứu biến nạp thành công gen gusA, gen nptII, gen bar (tạo enzyme phosphinothricin acetyltransferase) vào cây sâm Triều Tiên. Các chồi phát triển trên môi trường MS có 1 mg/l NAA + 1 mg/l BA được tách ra và tiếp tục nuôi trên môi trường 1/2 MS (20 g/l đường saccharose) có bổ sung 1 g/l than hoạt tính để phát triển thành cây hoàn chỉnh (số liệu cá nhân). Môi trường MS có 1 mg/l NAA + 1 mg/l BA thích hợp cho việc tái sinh chồi từ mô sẹo lá cũng được thử nghiệm đối với tái sinh mô sẹo có nguồn gốc cuống lá. Kết quả bước đầu cho thấy mô sẹo cuống lá cũng có đáp ứng tái sinh tốt tương tự mô sẹo lá. Dưới đây là hình minh họa các bước cơ bản của quá trình tạo mô sẹo và tái sinh chồi thông qua phôi soma từ mô sẹo cuống lá (hình 3.7). 65 Hình 3.7. Sự hình thành và phát triển của phôi soma từ mô sẹo cuống lá in vitro. a. Mô sẹo cuống lá sau 2 tháng nuôi cấy trên môi trường có 1 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ (để trong tối). b. Cụm mô tăng sinh với phôi ở các giai đoạn phát triển khác nhau trên môi trường thạch có 1 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ (để trong tối). c. Phôi soma đơn. d. Phôi soma điển hình với hai cực lá mầm và rễ mầm. e. Lá mầm phôi soma phát triển (để trong tối). f. Cụm cây với lá thật hình thành từ phôi soma a b 1 mm c d e f 66 3.2. THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN 3.2.1. Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen Hygromycin có tính độc đối với tế bào thực vật lẫn tế bào động vật. Gen hpt mã hóa enzyme hygromycin phosphotransferase có khả năng phosphoryl hóa hygromycin, làm mất hoạt tính của kháng sinh này. Do đó những tế bào được chuyển gen hpt sẽ phát triển bình thường trong môi trường có hygromycin với nồng độ thích hợp. Nồng độ kháng sinh hygromycin thích hợp sẽ được sử dụng để chọn lọc các dòng mô sẹo sau thí nghiệm xử lý chuyển gen. Tùy đối tượng mà hygromycin tác dụng chọn lọc với các nồng độ khác nhau, nếu nồng độ tác nhân này trong môi trường chọn lọc quá thấp thì kết quả chọn lọc không đáng tin cậy, nhưng nếu nồng độ quá cao sẽ làm chết cả các tế bào đã được chuyển gen. Tiến hành nuôi cấy các mẫu mô sẹo trên môi trường S2 bổ sung hygromycin ở các nồng độ khác nhau (0; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35 và 40 mg/l). Sau 2 tuần, các mẫu thí nghiệm có biểu hiện tăng trưởng chậm và bắt đầu chuyển sang nâu hơn so với mẫu đối chứng (0 mg/l), đặc biệt là các mẫu thí nghiệm với nồng độ hygromycin cao (> 20 mg/l). Tiếp tục cấy chuyển và theo dõi sau 8 tuần, kết quả cho thấy tất cả các mẫu thí nghiệm ở nồng độ hygromycin ≥ 25 mg/l trở nên nâu và chết; còn đối với các mẫu thí nghiệm ở nồng độ hygromycin thấp hơn 25 mg/l, sau thời gian đầu tăng trưởng chậm có sự hình thành các cụm tế bào mới bắt đầu tăng sinh lại. 67 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát nồng độ hygromycin Môi trường S2 có bổ sung hygromycin (mg/l) Số mẫu sống Sau 2 tuần Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần 0 mg/l hygromycin 15 15 15 15 5 mg/l hygromycin 15 14 14 14 10 mg/l hygromycin 13 11 9 9 15 mg/l hygromycin 12 10 8 7 20 mg/l hygromycin 11 7 5 4 25 mg/l hygromycin 8 6 3 0 30 mg/l hygromycin 5 3 1 0 35 mg/l hygromycin 5 2 0 0 40 mg/l hygromycin 3 1 0 0 Một số nghiên cứu môi trường chọn lọc sau chuyển gen đối với các loài thuộc chi Panax thường sử dụng chất kháng sinh kanamycin hoặc hygromycin. Nồng độ kanamycin được sử dụng ở các loài này là 50 mg/l (Ananchanok Tirajoh et al., 1996), hygromycin với nồng độ chọn lọc khoảng 20 mg/l hoặc cao hơn. Tuy nhiên trong thí nghiệm này, nhận thấy ở nồng độ hygromycin ở giới hạn 25 mg/l thì các mô sẹo đã ngừng tăng trưởng và chết dần. Như vậy, 25 mg/l được xem là nồng độ thích hợp cho sự chọn lọc mô sẹo sâm Ngọc Linh. 68 Hình 3.8. Kết quả thử hygromycin sau 8 tuần 3.2.2. Chuyển gen vào mô sẹo sâm nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3.2.2.1. Biến nạp plasmid vào E. coli; kiểm tra sự hiện diện của plasmid trong E. coli và tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dùng chuyển gen Mục đích của các thí nghiệm này là tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dùng để chuyển gen. Vật liệu ban đầu là plasmid pVDH396 mang gen ipt. Trước hết, plasmid này được biến nạp vào vi khuẩn E. coli. Sau biến nạp, vi khuẩn E. coli được nuôi nhân, tách chiết plasmid. Plasmid tách chiết được đem kiểm tra kích thước bằng cách 69 dùng enzyme NcoI để cắt và chạy điện di trên gel. Kết quả điện di cho thấy kích thước plasmid khoảng 15,9 kb (hình 3.9) - phù hợp với kích thước plasmid dùng biến nạp. Tiếp theo, plasmid (tách từ E. coli) được biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Sản phẩm Agrobacterium tumefaciens biến nạp được nuôi cấy nhân dòng, tách chiết plasmid và thực hiện phản ứng PCR đối với gen ipt. Kết quả cho thấy có sự hiện diện của băng DNA khuếch đại với kích thước 615 bp (hình 3.10). Như vậy, dòng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 tạo được đã chứa plasmid pVDH396 (mang gen đích ipt) và được sử dụng để chuyển gen vào mô sâm. Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pVDH396 Dãy 1: thang DNA chuẩn λ-HindIII Dãy 2: plasmid trong E. coli 1 1 2 15,9 kb 23,130 kb 9,416 kb 70 3.2.2.2. Gây nhiễm và nuôi chung mô với vi khuẩn; chọn lọc tế bào chuyển gen trên môi trường có hygromycin Do lần đầu tiên triển khai thí nghiệm chuyển gen dùng hygromycin để chọn lọc nên việc tìm hiểu, đánh giá tính chịu đựng tự nhiên của mô sẹo đối với kháng sinh này là rất quan trọng. Kết quả thử nghiệm cho thấy mô sẹo sâm Ngọc Linh khá mẫn cảm đối với hygromycin. Trên môi trường S2 có 5 mg/l, mô sẹo tăng sinh tương đối bình thường. Ở nồng độ 10 mg/l, nhận thấy phần lớn mô sẹo còn khả năng tăng sinh nhưng chậm; ở nồng độ cao hơn, 20 mg/l, tăng trưởng của mô sẹo bị ức chế mạnh, chết rất nhiều và chết hoàn toàn ở nồng độ từ 25 mg/l trở lên. Theo Choi (2006), qua sử dụng mô sẹo có khả năng sinh phôi (embryogenic) sâm Triều Tiên để nghiên cứu biến nạp gen, nồng độ hygromycin thích hợp dùng chọn lọc tế bào dao động từ 10 – 30 mg/l; tuy nhiên, Shim và cs. (2010) dùng nồng độ hygromycin rất cao, 100 mg/l, qua sử dụng lá mầm (cotyledon) để nghiên cứu. Theo chúng tôi, sự khác nhau về nồng độ hygromycin sử dụng giữa hai tác giả nêu trên có Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen ipt ở plasmid tách chiết từ vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 tạo được qua biến nạp Dãy 1: thang DNA chuẩn 1 kb Dãy 2: plasmid pVDH396 (đối chứng dương) Dãy 3: nước cất (đối chứng âm) Dãy 4: plasmid pVDH396 từ A. tumefaciens 500 bp 615 bp 4 3 2 1 71 thể do vật liệu dùng chuyển gen là khác nhau và môi trường nuôi cấy khác nhau. Kết quả thử nghiệm đánh giá tác động của hygromycin trên sâm Ngọc Linh cho thấy khá tương hợp với kết quả nghiên cứu của Choi (2006) trên sâm Triều Tiên. Thực tế cho thấy các cụm mô sẹo, sau nuôi chung với vi khuẩn, nếu được nuôi cấy chọn lọc ngay trên môi trường có 25 mg/l hygromycin thường không có khả năng sống; do vậy ở các bố trí thí nghiệm sau, nồng độ hygromycin sử dụng cho giai đoạn đầu là 15 mg/l. Sau đó tăng lên 25 mg/l ở các chu kỳ chọn lọc tiếp theo. Trong quá trình chọn lọc, mô sẹo sống sót trên môi trường có 15 mg/l hygromycin được tách ra và cấy chuyển trải nuôi trên môi trường có nồng độ hygromcin đạt mức chọn lọc hiệu quả - 25 mg/l. Theo Choi (2006), trong quá trình chọn lọc cần lưu ý sự tăng sinh của mô chuyển gen (transgenic) có thể bị ức chế bởi sự hóa nâu của mô chết. Thực tế ở nghiên cứu này cũng cho thấy hiện tượng tương tự; do vậy các mô sống sót nằm phía trên phần mô chết nâu đã được tách ra cẩn thận dưới kính hiển vi soi nổi và cấy chuyển sang môi trường mới. 72 Trên môi trường S2 có 25 mg/l hygromycin, có sự hình thành một số ít cụm mô trắng đục, có khả năng tăng sinh tiếp tục (hình 3.11c, 3.11d, 3.11e, 3.11f); chúng Hình 3.11. Chọn lọc mô chuyển gen. a. Mô sẹo dùng chuyển gen; b. Đĩa mô chọn lọc trên môi trường có hygromycin; c, d. Mô sẹo hóa phôi sống sót và tăng sinh trên môi trường chọn lọc chứa 25 mg/l hygromycin; e, f. Hai loại kết cấu mô cứng (hóa phôi) và xốp hình thành trên môi trường chọn lọc chứa 25 mg/l hygromycin; g, h. Mô sẹo sống sót (2 dòng) tiếp tục được trải nuôi trên môi trường có hygromycin có 25 mg/l hygromycin a 2 mm b 1 mm c d e f g h 73 được tách và cấy chuyển sang môi trường chọn lọc mới (cũng có 25 mg/l; hygromycin) để tiếp tục tăng sinh (hình 3.11g, 3.11h). Qua triển khai nghiên cứu, đến nay chúng tôi đã nhận được 04 dòng mô có khả năng tăng sinh trên môi trường có 25 mg/l hygromycin; tuy nhiên, kết cấu (texture) của mô khi chưa chuyển sang giai đoạn tái sinh có sự khác nhau về độ cứng (compact)/khả năng tạo cấu trúc phôi soma dạng cầu (hình 3.11e, 3.11f). Tần số chuyển gen đạt khoảng 0,5% (nhận được 04 dòng chuyển gen trên tổng số 800 cụm mô sẹo sử dụng để làm thí nghiệm). 3.2.3. Kiểm tra sự hiện diện/biểu hiện của các gen chuyển 3.2.3.1. Kiểm tra sự biểu hiện của gen chỉ thị gusA bằng kỹ thuật hóa mô Khả năng phát hiện DNA ngoại lai đã được xen vào DNA bộ gen thực vật và từ đó có thể xác định các dòng tế bào đã biến nạp là điều hết sức quan trọng. Trong thí nghiệm này, một số dòng mô có khả năng tăng trưởng tương đối tốt trên môi trường có hygromycin đã được kiểm tra sự biểu hiện GUS. Sau thời gian ngâm mẫu mô ở các giai đoạn nuôi cấy khác nhau trong dung dịch X-Gluc ở 37PoPC trong thời gian 12 giờ, thực hiện quan sát mô dưới kính hiển vi soi nổi. Kết quả cho thấy có sự biểu hiện GUS tạm thời (transient expression) của mô được ghi nhận ở giai đoạn 5 ngày sau khi nuôi chung - đang được nuôi trên môi trường chọn lọc có 15 mg/l hygromycin (Hình 3.12a). Biểu hiện GUS bền vững (stable expression) sau 1 tháng chọn lọc cũng đã được ghi nhận (Hình 3.12b). Sau nhiều tháng chọn lọc, mô các dòng sống sót trên môi trường có 25 mg/l hygromycin cũng được dùng để thử GUS; kết quả cho thấy có 02/05 dòng có biểu hiện GUS dương tính ổn định (Hình 3.12c, 3.12d). Việc ghi nhận biểu hiện GUS ở các giai đoạn hình thành phôi soma (phôi cầu, phôi trái tim, phôi có lá mầm) cũng đã được thực hiện với kết quả được trình bày ở hình 3.12e, 3.12f, 3.12g. Kết quả biểu hiện GUS dương tính chứng tỏ mô giả định chuyển gen có mang gen gusA. Các dòng này tiếp tục được chọn lọc và được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của gen hpt và gen ipt bằng phương pháp PCR. 74 3.2.3.2. Kiểm tra sự hiện diện của gen hpt và gen ipt bằng phương pháp PCR Các mẫu mô sâm sau quá trình nuôi chung được nuôi cấy nhiều chu kỳ trên môi trường chọn lọc (môi trường S2 có bổ sung hygromycin từ thấp đến cao, 15 – 25 mg/l và cefotaxime giảm dần, từ 500 mg/l xuống 250 mg/l) trong nhiều tháng (3 tháng trở lên). Trong quá trình chọn lọc, ở thời gian đầu đa số các mẫu chuyển sang màu nâu và không còn khả năng tăng trưởng. Bên cạnh đó, ở một số ít mẫu xuất hiện các cụm tế bào màu vàng tươi. Nếu các cụm mô này có khả năng tăng sinh, tiếp tục trên môi trường có nồng độ tác nhân chọn lọc cao hơn và đây là những dòng tế bào có thể được xem là giả định chuyển gen. Chúng được tiếp tục cấy Hình 3.12. Thử nghiệm hóa mô GUS mô chuyển gen. a. Biểu hiện GUS tạm thời sau 5 ngày (vị trí mũi tên); b. Biểu hiện GUS bền vững sau 1 tháng nuôi cấy; c, d. Biểu hiện GUS bền vững sau 3 tháng chọn lọc của hai dòng mô sẹo chuyển gen 1 và 2; e. Biểu hiện GUS ở phôi soma giai đoạn hình cầu (vị trí mũi tên); f. Biểu hiện GUS ở phôi soma giai đoạn hình trái tim (vị trí mũi tên); g. Biểu hiện GUS ở phôi soma giai đoạn có lá mầm (vị trí mũi tên) a b c d e f g 75 truyền đến khi mô tăng trưởng ổn định và đạt kích thước tương đối thì được cắt lấy một phần nhỏ (khoảng 100 mg) đem tách chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR để kiểm tra sự hiện diện của gen hpt và gen ipt. Như đã trình bày, phản ứng PCR gồm 01 ống đối chứng dương (chứa plasmid pVDH396), 01 ống đối chứng âm (chứa mẫu đối chứng không chuyển chuyển gen), còn lại là 2 ống chứa mẫu giả định chuyển gen (chọn hai dòng mô để kiểm tra). Kiểm tra bằng phản ứng PCR, điện di sản phẩm và chụp ảnh gel, kết quả được thể hiện ở hình 3.13 và hình 3.14. Hình 3.13. Ảnh chụp gel điện di sản phẩm PCR gen hpt (băng DNA 800 bp) Dãy 1: thang chuẩn 1kb; Dãy 2: plasmid pVDH396 (đối chứng dương); Dãy 3: DNA mẫu đối chứng; Dãy 4: DNA mẫu chuyển gen 1; Dãy 5: DNA mẫu chuyển gen 2. 800 bp 1 2 3 4 5 1kb 750bp 76 Như vậy có sự tạo các băng DNA kích thước 800 bp và 615 bp qua sự khuếch đại đoạn gen hpt và gen ipt. Các dòng sau kiểm tra dương tính sự có mặt của gen ipt và gen hpt tiếp tục được cấy chuyển sang môi trường tạo chồi C2 có bổ sung hygromycin và cefotaxime với nồng độ thấp, lần lượt là 10 mg/l và 250 mg/l, nhằm tạo điều kiện thúc đẩy sự tái sinh. Qua quá trình cấy chuyển liên tục 2 tuần/lần trong thời gian sau khoảng 6 tuần, ở các cụm mô sẹo này có sự hình thành chồi (Hình 3.15). Số lượng chồi tuy ít nhưng xét về hình thái, các chồi này to và có lá màu xanh đậm. Đồng thời với quá trình cấy chuyển tái sinh các cụm mô sẹo chuyển gen, các mẫu mô sẹo sâm đối chứng (không qua chuyển gen) cũng được tiến hành thử nghiệm nuôi cấy tái sinh trên môi trường tạo chồi C2 có bổ sung hygromycin (10 mg/l); kết quả cho thấy ở các cụm mô đối chứng không có hiện tượng phát sinh hình thái chồi. Kết quả này tương tự kết quả thí nghiệm của Franklin và cs. (2009). 615 bp 1 2 3 4 5 1kb 750bp Hình 3.14. Ảnh chụp gel điện di sản phẩm PCR gen ipt (băng DNA 650 bp) Dãy 1: thang chuẩn 1kb; Dãy 2: plasmid pVDH396 (đối chứng dương); Dãy 3: DNA mẫu đối chứng; Dãy 4: DNA mẫu chuyển gen 1; Dãy 5: DNA mẫu chuyển gen 2. 77 Như vậy, kết quả cho thấy có sự khác biệt về khả năng tái sinh (với sản phẩm lá tái sinh to khỏe, xanh và có sức sống) giữa mô chuyển gen và mô không chuyển gen; điều này theo chúng tôi là do mô chuyển gen sản sinh enzyme HPT làm bất hoạt hygromycin, ngoài ra có thể do có hàm lượng cytokinin nội sinh cao hơn bình thường. Kết quả này tương tự như kết quả ở nhiều nghiên cứu khác của các tác giả Sakakibara (2006), Haberer và Kieber (2002), Howell và cs. (2003), Kakimoto (2003), Geng và cs. (2001). Chuyển gen ở các loài Panax đã được thực hiện vào khoảng thập niên 80; trong đó, hai loài được chú ý nghiên cứu nhiều nhất là Nhân sâm (Panax ginseng C.A. Mey.) và sâm Mỹ (Panax quinquefolium L.). Mục đích của việc nghiên cứu các đối tượng này chủ yếu là nhằm gia tăng mức ginsengnoside hoặc tăng khả năng kháng bệnh hại của các loài này qua các nghiên cứu của Yoskikawa và Furuya (1987), Hwang và cs. (1991), Inomata và cs. (1993), Ananchanok Tirajoh (1996). Điều đáng chú ý là sau chuyển gen, các tác giả đều nhận thấy khả tái sinh của mô bị giảm. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh có thể là do mẫu cấy, quá trình gây nhiễm, điều kiện nuôi chung với vi khuẩn hay do môi trường chọn lọc, tái sinh sau chuyển gen chưa thực sự thích hợp (Garcia và cs., 1986; Perkins và cs., 1987; Mathew và cs., 1990). Trong nghiên cứu đề tài này, qua sự hình thành các chồi từ mẫu chuyển gen cho thấy các xử lý trong nuôi cấy, chọn lọc và tái sinh đã tương đối thích hợp. Chồi có màu xanh đẹp có thể do gen ipt sau khi được biến nạp vào tế bào đã hoạt động, kích thích việc sản sinh cytokinin. Ở kết quả thí nghiệm trên cây Thanh hao (Artemisia annua L.) của Geng và cs. (2001) thì mức cytokinin nội sinh trong tế bào tỷ lệ thuận với hàm lượng diệp lục tố và hợp chất thứ cấp artemisinin. Đối với kết quả chuyển gen ở sâm Ngọc Linh, hy vọng rằng hàm lượng saponin cũng có thể được gia tăng qua tác động của gen ipt hiện diện trong tế bào – làm thay đổi theo chiều hướng tích cực trạng thái sinh lý hóa sinh của cây. \ 78 Hình 3.15. Chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh chuyển gen a, b. Sau 4 tuần; c. Sau 5 tuần; d. Sau 6 tuần; e. Sau 8 tuần d e c a 1 cm 1 cm b 79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN Từ kết quả nhận được, chúng tôi rút ra những kết luận sau: 1. Tạo được mô sẹo từ vật liệu lá và cuống lá sâm Ngọc Linh dung môi trường MS bổ sung 1 mg/l 2,4-D. 2. Môi trường thích hợp cho sự tăng sinh khối mô sẹo lá sâm Ngọc Linh là môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ. 3. Môi trường thích hợp cho sự tái sinh chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh là môi trường môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA và 1 mg/l BA. 4. Nồng độ hygromycin 25 mg/l thích hợp cho việc chọn lọc tế bào chuyển gen sâm Ngọc Linh. 5. Đã nhận được 04 dòng mô sẹo sâm Ngọc Linh chuyển gen đang trong quá trình tái sinh nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens; các dòng mô này đã được kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen gusA, gen hpt và gen ipt bằng thử nghiệm hóa mô GUS và bằng phương pháp PCR. Tần số chuyển gen đạt khoảng 0,5%. 2. ĐỀ NGHỊ Cũng từ kết quả nhận được, chúng tôi có các đề nghị sau: + Khảo sát các điều kiện tối ưu nhằm tăng tần số chuyển gen (thời gian nuôi chung mô với vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, nồng độ acetosyringone,). + Tiếp tục thực hiện các bước thí nghiệm nhằm tạo cây sâm Ngọc Linh chuyển gen hoàn chỉnh từ mô phôi và đưa ra trồng ở vườn ươm. + Kiểm tra, phân tích một số chỉ tiêu sinh lý hóa sinh cơ bản như hàm lượng cytokinin, hàm lượng diệp lục tố, đặc biệt là hàm lượng hợp chất thứ cấp trong mô/cây sâm chuyển gen. 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Đái Duy Ban (2008), Bộ sách chuyên khảo ứng dụng và phát triển công nghệ cao - Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học phòng chống một số bệnh cho người và vật nuôi, Viện KH&CN VN, NXB KHTN và Công Nghệ, 2. Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. 3. Nguyễn Văn Bình (2008), Xây dựng hệ thống tái sinh rễ và bước đầu nghiên cứu chuyển gen vào mô sẹo cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grush.), Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Đà Lạt, Lâm Đồng. 4. Lê Thanh Bình, Phùng Văn Vui, Dương Thanh An và cs. (2009), Kiến thức cơ bản về sinh vật biến đổi gen và an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen, Tài liệu tham khảo. 5. PGS. TS. Nguyễn Thượng Dong (Chủ biên), TS. Trần Công Luận, TS. Nguyễn Thi Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật Hà Nội. 6. Hà Thị Dung, Grushvitzky I. V. (1985), “Một loài sâm mới thuộc chi sâm (Panax L.), họ Nhân sâm (Araliaceae) ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, tập 7(3), 45-48. 7. PTS. Nguyễn Ngọc Dung (1995), Nhân giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) bằng con đường công nghệ sinh học và kinh nghiệm trồng Nhân sâm (Panax ginseng), NXB Nông Nghiệp TPHCM. 8. Trần Quốc Dung, Trần Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen (Động vât, Thực vật), Đại học Huế. 9. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục. 10. Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Phan Tường Lộc, Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh (2007), “Nghiên cứu tái sinh in vitro và bước đầu phân tích cây cúc 81 Dendranthema grandiflorum L. mang gen ipt tạo cytokinin”, Hội nghị Khoa học và Công nghệ, 358-366. 11. Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, NXB Đại học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. 12. Nguyễn Thị Lang (2002), Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học, NXB Nông Nghiệp TPHCM 13. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Viết Dũng, Trần Quốc Dung (2008), Công nghệ AND tái tổ hợp, NXB Đại học Quốc gia TPHCM. 14. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Viết Dũng, Trần Quốc Dung (2008), Kỹ thuật chuyển gen thực vật và ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia TPHCM. 15. Phan Tường Lộc (2007), Biến nạp gen tạo cytokinin vào cây hoa cúc (Chrysanthemum morifolium L) và khảo sát một số chỉ tiêu sinh hóa và sinh học phân tử cây chuyển gen, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TPHCM. 16. Trần Công Luận (2003), “Kết quả nghiên cứu về hóa học sâm Việt Nam”, Hội thảo bảo tồn và phát triển sâm Ngọc Linh tại tỉnh Quảng Nam, 62-75. 17. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học. 18. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Cao Cường (2002), Công nghệ gen, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM. 402 trang. 19. Nguyễn Thới Nhâm, Phan Văn Đệ, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (1993), “Sâm Việt Nam- Kết quả nghiên cứu từ năm 1978-1992, Báo cáo nghiệm thu đề tài khoa học cấp Nhà nước thuộc chương trình 64C”, Chủ biên: Trung tâm Sâm Việt Nam, Bộ Y tế, 1-97. 20. Nguyễn Cửu Thành Nhân (2010), Nghiên cứu khả năng nhân nhanh sinh khối rễ cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) trong một số hệ thống nuôi cấy in vitro, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TPHCM. 21. Dương Tấn Nhựt (2006), Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong nghiên cứu 82 tái sinh, nhân giống và chuyển gen thực vật, NXB Nông Nghiệp TPHCM. 22. Lê Thanh Sơn, Nguyễn Tập (2006), Những đặc điểm sinh thái cơ bản của sâm Ngọc Linh, Tạp chí dược liệu, tập 11, số 4, 145-147. 8T23. Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen: Nguyên lý và ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật. 24. Nguyễn Trung Thành, Lê Văn Cần, Paek Kee Youep (2007) Nuôi cấy rễ bất định của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Tuyển tập báo cáo khoa học HN toàn quốc về Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 828-831. 25. Bùi Đình Thạch (2007), Xây dựng hệ thống tái sinh và ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen ipt tạo cytokinin ở cây bắp cải (Brassica oleracea var. Capitata), Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TPHCM. 26. Nguyễn Quang Thạch (Chủ biên), Nguyễn Thị Ly Anh, Phạm Kim Ngọc, Trần Văn Minh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2009), Cơ sở công nghệ sinh học, Tập III- Công nghệ sinh học tế bào, NXB Giáo Dục Việt Nam. 27. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – nghiên cứu và ứng dụng, NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật Hà Nội. 28. Nguyễn Trung Thành, Paek Kee Yoeup (2008), “Nhân nhanh rễ bất định Nhân sâm Panax ginseng C.A Meyer: ảnh hưởng của một số nhân tố lý hóa lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm trao đổi chất ginsenosides”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 24: 318-323. 29. Nguyễn Văn Uyển (1995), Những phương pháp của công nghệ sinh học thực vật, tập 1 và tập 2, NXB Nông Nghiệp. 30. Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, Phần II- Phát triển, NXB Đại học Quốc Gia TPHCM. 31. Oanh Vũ (2009), “Nuôi cấy tế bào để sản xuất hợp chất thứ cấp”, Không gian công nghệ (Technology Space). 83 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 32. Ahn I. O., B.V. Le, Gendy C. and Van K.T.T. (1996), "Direct somatic embryogenesis through thin cell layer culture in Panax ginseng", Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 237-243. 33. Ahn I.O, Le B.V., Gendy C., Van K.T.T. (1996) Direct somatic embryogenesis through thin cell layer culture in Panax ginseng. Plant Cell Tiss Org Cult 45: 237-243. 34. Akalezi C.O., Uu S., U Q.S., Yu J.T., Zhong J.J. (1999), "Combined effects of initial sucrose concentration and inoculum size on cell growth and ginseng saponin production by suspension cultures of Panax ginseng", Pro Biochem, 34:639-642. 35. Akiyoshi D.E., Klee H., Amasino R.M., Nester E.W., Gordon M.P. (1984) "T- DNA of Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis", Proc Natl Acad Sci USA, 81:5994-5998. 36. Arya S., Liu J.R., Eriksson T. (1991) Plant regeneration from protoplasts of Panax ginseng (C. A. Meyer) through somatic embryogenesis. Plant Cell Rep 10: 227-291. 37. Attele A.S., Wu J.A., Yuan C.S. (1999), “Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple action”, Biochem. Pharmacol., 58 (11): 1685- 1893. 38. Baisong L., Harold N., Renping Z. (2002), “Neuroprotective effects of ginseng total saponin and ginsengnoside Rb1 and Rg1 on spinal cord neurons in vitro”, Experimental Neurology, 173: 224-234. 39. Baldarin M.F., Kloccke J.A., Wurtele E.S., Bollinger W.H. (1985), Natural plant chemical, Ber Dtsch Bot Ges., 94: 1-26. 40. Bernard R.G., Jack J.P. (2003), Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, USA, 760 pages. 84 41. Bourgaud F., Gravot A., Milesi S., Gontier (2001), "Production of plant secondary metabolites: a historical perspective", Plant Science, Vol 161, 13: 839-851. 42. Calderini O., Bovone T., Scotti C., Pupilli F., Piano E. and Arcioni S. (2006), “Delay of leaf senescence in Medicago sativa transformed with the ipt gene controlled by the senescence-specific promoter SAG12”, Plant cell report, Vol 26 (5), 611-615. 43. Chang H., Michelle L. J., Gary M. B. and David G. C. (2003), “Overproduction of Cytokinins in Petunia Flowers Transformed with PSAG12-IPT Delays Corolla Senescence and Decreases Sensitivity to Ethylene”, Plant Physiology, 132: 2174-2183. 44. Chang W.C., Hsing Y.I. (1980) Plant regeneration through somatic embryogenesis in root-derived callus of ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer). Theor. Appl. Genet. 57: 133-136. 45. Chen C. (1997), “Cytokinin biosynthesis and interconvertion”, Physiol Plant, 101: 665-673. 46. Choi K.T., Lee C.H., Ahn I.O., Lee J.H., Park J.C. (1994), "Characteristics of the growth and ginsenosides in the suspension - culture cells of Korean ginseng (Panax ginseng C. A. Mayer)", Proc Intl Ginseng Conf, 259-268. 47. Choi Y.E. (2006) Ginseng (Panax ginseng). In: Wang K, ed. Agrobacterium Protocols, 2/e, vol. 2. Humana Press Inc., Totowa, NJ. 48. Choi Y.E., Jeong J.H., In J.K., Yang D.C. (2003), “Production of herbicide- resistant transgenic Panax ginseng through the introduction of the phosphinothricin acetyl transferase gene and successful soil transfer”, Plant Cell Rep, 21: 563-568. 49. Choi Y.E., Yang D.C., Choi K.T. (1998), “Induction of somatic embryos by macrosalt stress from mature zygotic embryos of Panax ginseng”, Plant Cell Tiss Org Cult, 52: 177-181. 85 50. Choi Y.E., Yang D.C., Kusano T., Sano H. (2001), “Rapid and efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation by plasmolyzing pretreatment of cotyledons in Panax ginseng”, Plant Cell Rep, 20: 616-621. 51. Chopra V.L., Anwan N. (1990), Genetic Engineering and Biotechnology, Oxford and IBH Publishing CO.PVT. 52. Clive W. (Indianapolis, IN) (2002), "Hygromycin-resistant transgenic plants", United States Patent, 6365799. 53. Coleman C.I., Herbert J.H., Reddy P. (2003), “The effects of Panax ginseng on quality of life”, J.Clin. Pharm. Ther., 28 (1): 5-15. 54. Dornenburg H., Knorr D. (1995), "Strategies for the improvement of secondary metabolite production in plant cell cultures", Enzyme Microb Technol, 17: 674-684. 55. Ebinuma H., Sugita K., Matsunaga E. and Yamakado M. (1997), "Selection of marker-free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene (plant genetic engineering DNA transformation selectable marker ipt gene transposon Ac)", Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94: 2117-2121. 56. Engels H.J., Said J.M., Wirth J.C. (1996), "Failure of chronic ginseng supplementation to affect work performance and energy metabolism in healthy adult females", Nutr. Res, 16: 1295-1305. 57. Florence C., Lee (1992), Facts about ginseng – The elixir of life, Hollym Ltd.Co. 58. Franklin G., Oliveira M.M., Dias A.C. (2009), “Transgenic Hypericum perforatum”, Methods Mol Biol, 547: 217-34. 59. Furuya T., Yoshikawa T. (1987), "Saponin production by cultures of Panax ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes", Plant Cell Rep, 6: 449-453. 60. Garcia J.E. (1986) “Conceptus transfer In Jones H.W., Jones G.S., Hodgen G.D. and Rosenwaks, Z. (eds), In Vitro Fertilisation Williams & Williams”, Baltimore, 215–220. 86 61. Geng S., Ma M., Ye H.C., Liu B.Y., Li G.F., Chong K. (2001), "Effects of ipt gene expression on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L.", Plant Sci, 160: 691-698. 62. Glick B.R.., Jackj P. (1994), Molecular Biotechnology, ASM Press. Washington D.C. USA. 63. Gorpenchenko T.Y., Kiselev K.V., Bulgakov V.P., Tchernoded G.K., Bragina E.A., Khodakovskaya M.V., Koren O.G., Batygina T.B., Zhuravlev Y.N. (2006), “The Agrobacterium rhizogenes rolC-gene-induced somatic embryogenesis and shoot organogenesis in Panax ginseng transformed calluses”, Planta, 223(3): 457-467. 64. Guo B., Abbasi B.H., Zeb A., Xu L.L. and Wei Y. H. (2011), “Thidiazuron: A multi-dimensional plant growth Regulator (Review)”, African Journal of Biotechnology, Vol. 10(45), 8984-9000. 65. 8THaberer G., and Kiebers J.J.8T (2001), “Cytokinins: New insights into a classic phytohormone”, Plant Physiol, 8T128,8T 354–362. 66. Han J.L., Wang H., Ye H.C., Liu Y., Li Z.Q., Zhang Y.S., Li G.F. (2005) "High efficiency of genetic transformation and regeneration of Artemisia annua L. via Agrobacterium tumefaciens-mediated Procedure", Plant Sci, 16: 73-80. 67. Han J.Y., Choi Y.E. (2009), "Rapid induction of Agrobacterium tumefaciens- mediated transgenic roots directly from adventitious roots in Panax ginseng", Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 96:143-149. 68. Hiai S., Yokoyama H., Oura H. (1979), "Features of ginseng saponin induced corticosterone release", Endocrinol. Jpn., 26: 737-40. 69. Huang K.C. (1993), "The Pharmacology of Chinese Herbs", CRC Press, Boca Raton, FL, USA, 21-45. 70. 8THwang I. and Sheen J.8T (2001), “Two-component circuitry in 1TArabidopsis1T signal transduction”, Nature, 8T413,8T 383–389. 87 71. Hyo-Won B. (1978), Korean ginseng, Samhwa Printing Co., Ltd., Seoul, Korean. 72. Inomata N. (1993), “Crossability and cytology of hybrid progenies in the cross between Brassica campestris and three wild relatives of B. oleracea, B. bourgeaui, B. cretica and B. Montana”, 5TEuphytica5T, 69: 7–17. 73. Jefferson R.A., Burgess S.M. and Hirsh D. (1986), “ß-Glucuronidase from E. coli as a Gene Fusion Marker”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8447-8451. 74. Jeong G.T. and Park D.H. (2005), "Comparative Evaluation of Modified Bioreactors for Enhancement of Growth and Secondary Metabolite Biosynthesis Using Panax ginseng Hairy Root", Biotechnology and Bioprocess Engineering, 10: 528-534. 75. Jeong G.T. and Park D.H. (2006), "Characteristic of Transformed Panax ginseng C.A. Meyer Hairy Root: Growth and Nutrient Profile", Biotechnology and Bioprocess Engineering, 11: 43-47. 76. Jeong G.T. and Park D.H. (2005), "Enhancement of Growth and Secondary Metabolite Biosynthesis: Effect of Elicitors Derived from Plants and Insects", Biotechnology and Bioprocess Engineering, 10: 73-77. 77. John M.C. and Amasino R.M. (1988), "Expression of an Agrobacterium Ti Plasmid Gene Involved in Cytokinin Biosynthesis Is Regulated by Virulence Loci and Induced by Plant Phenolic Compounds", Journal of bacteriology, 6: 790-795. 78. 8TKakimoto T.8T (2001), “Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate:ATP/ADP isopentenyltransferases”, Plant Cell Physiol, 8T42,8T 677–685. 88 79. Khalafalla M.M. and Hattori K. (1999), “A combination of thidiazuron and benzyladenine promotes multiple shoot production from cotyledonary node explants of faba bean (Vicia faba L.)”, Plant Regulation, Vol 72, 145-148. 80. Kim Y.S., Han J.Y., Lim S. and Choi Y.E. (2009), “Ginseng metabolic engineering: Regulation of genes related to ginsenoside biosynthesis”, Journal of Medicinal Plants Research, Vol. 3(13), 1270-1276. 81. Kitts D.D. and Hu C. (2000), "Efficacy and safety of ginseng", Public Health Nutrition, 3(4A): 473-485. 82. Lee B.H., Lee S.J., Hui J.H., Lee S., Huh J.D., Moon C.K. (1998), "In vitro antigenotoxic activity of novel ginseng saponin metabolites formed by intestinal bacteria", Planta Med, 64: 500-3. 83. Lee H.S., Kim S.W., Lee K.W., Eriksson T. and Liu J.R. (1995), "Agrobacterium-mediated transformation of ginseng (Panax ginseng) and mitotic stability of the inserted beta-glucuronidase gene in regenerates from isolated protoplasts", Plant Cell Rep, 14: 545- 549. 84. Li T.S.C, Mazza G., Cottrell A.C., Gao L. (1996), "Ginsenosides in roots and leaves of American ginseng", J. Agric. Food Chem, 44: 717-20. 85. Lian M.L., Chakrabarty D. and Paek K.Y. (2002), "Effect of Plant Growth Regulators and Medium Composition on Cell Growth and Saponin Production during Cell- Suspension Culture of Mountain Ginseng (Panax ginseng C. A. Mayer)", Joumal of Plant Biology, 45 (4): 201-206. 86. Lim H.T., et al. (1997), "Regeneration of Panax ginseng C.A. Meyer by organogenesis and nuclear AND analysis of regenerants", Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 49: 179-187. 87. Liou C.J., Huang W.C., Tseng J. (2005), Long-term oral administration of ginseng extract modulates humoral immune response and spleen cell functions, Am. J. Chin, Med, 33(4): 651-661. 88. Lisa V., et al. (2003), "Agrobacterium tumefaciens and the Plant: The David and Goliath of Modern Genetics”, Plant Physiology, 133: 948-955. 89 89. Liu B., Wang H., Du Z., Li G., Ye H. (2010), "Metabolic engineering of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L.", Plant Cell Rep, Review. 90. Liu C.X., Xiao P.G. (1992), "Recent advances on ginseng research in China", J. Ethnopharmacol, 36: 27-38. 91. Lu L., Zhu Y., Liu Y., Zhao D. (2010), "Ethanol inducible isopentenyl transferase as a high efficiency marker for tobacco transformation", African Journal of Biotechnology, Vol. 9(48): 8139-8145. 92. Ma Q.H., Liu Y.C. (2009), "Expression of isopentenyl transferase gene (ipt) in leaf and stem delayed leaf senescence without affecting root growth", Plant Cell Rep, 28: 1759-1765. 93. Ma Y.C., Zhu J., Luo L. (1995), "A comparative evaluation of ginsenosides in commercial ginseng products and tissue culture samples using HPLC", J. Herb Spices Med. Plants, 3: 41-50. 94. Matsunaga H., Katano M., Yamamoto H., Fujito H., Mori M., Tanaka K. (1990), “Cytotoxic activity of polyacetylene compounds in Panax ginseng C.A. Meyer”, Chem. Pharm. Bull. Tokyo, 38 (12): 3480-3482. 95. Matthew S.M., Lee C.G., Frank S., Wilco J.R.M.J., Geert M.S., Evert D., J. Hans A.V.R, Power J.B. and Davey M.R. (2001), "Effects of PSAG12-IPT Gene Expression on Development and Senescence in Transgenic Lettuce", American Society of Plant Biologists, Vol. 127, 505-516. 96. McKenzie M.J., Mett V., Reynolds P.H.S., Jameson P.E. (1998), "Controlled cytokinin induction in transgenic tobacco using a copper inducible promoter", Plant Physiol, 116: 969-977. 97. Misawa M. (1985), “Production of useful plant metabolites”, Adv Bilchem Eng, 31: 59-88. 98. Mizuno M., Yamada J., Terai H, Kozukue N., Lee Y.S., Tsuchida H. (1994), "Differences in immunomodulating effects between wild and cultured Panax ginseng", Biochem. Biophys. Res. Commun, 200: 1672-8. 90 99. Murashige T., Skoog F. (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture”, Physiol. Plant, 15: 473-497. 100. Murthy H.N, Hahn E.J. and Paek K.Y. (2008), "Adventitious Roots and Secondary Metabolism", Chinese J. Biotechnology, Vol 24, 711. 101. Nhut D.T., Huy B.N, Phong P.T., Hai N.T. and Luan T.C. (2006), "Primary Study on Multiplication of Advaentitious Roots of Panax vietnamensis - A Valuable Source for Saponin Isolation", Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture, 118-121. 102. Pant D.R., Bhattarai T., Beck E. and Fettig S. (2009), "Genetic Transformation of Nepalese Spring Wheat (Triticum aestivum L.) Cultivars with ipt Gene under the Regulation of a Senescence Enhanced Promoter from Maize", Pakistan Journal of Biological Sciences 12, (2): 101-109. 103. Perkins D. and Buckley K.W. (1987), “Transformative change In Donald L. Kirkpatrick, How to manage change effectively”, San Francisco: Jossey- Bass Publishers, 45-63. 104. Proctor J.T.A., Slimmon T. and Saxena P.K. (1996), “Modulation of root growth and organogenesis in thidiazuron-treated ginseng (Panax quinquefolium L.)”, Plant Growth Regulation, 20: 201-208. 105. Ramachandra R.S. and Ravishankar G.A. (2002), "Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites", Biotechnol. Adv, 20: 101- 153. 106. Robak J., and Gryglewski I. (1988), “Flavonoides are scavengers of superoxide anions”, Biochemical Pharmacology, 37, 837 – 841. 107. Sa G., Mi M., He-chun Y., Ben-ye L., Guo-feng L., Kang C. (2001), "Effects of ipt gene expression on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L.", Plant Sci., 160(4): 691-698. 108. Sakakibara H. (2006), “Cytokinins: Activity, Biosynthesis, and Translocation”, Plant Biology, Vol. 57: 431-449. 91 109. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1999), Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press. 110. Schenk R.U. and Hildebrandt A.C. (1972), "Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonuous plant cell cultures", Can. J. Bot, 50: 199-204. 111. Shahla S.N., Donald W.P. (1987), "Acetosyringone promotes high frequency transformation of Arabidopsis thaliana explants by Agrobacterium tumefaciens", Plant Molecular Biology, 8: 291-298. 112. Shim J.S., Lee O.R., Kim Y.J., Lee J.H., Kim J.H., Jung D.Y., In J.G., Lee B.S., Yang D.C. (2010), “Overexpression of PgSQS1 increases ginsenoside production and negatively affects ginseng growth rate in Panax ginseng”, J. Ginseng Res, 34(2): 98-103. 113. Song J.Y., Akhalaia M., Platonov A., Kim H.D., Jung I.S., Hang Y.S., Yun Y.S. (2004), “Effects of polysaccharide ginsan from Panax ginseng on liver function”, Arch. Pharm. Res, 27 (5): 531-538. 114. Sotaniemi E.A., Haapakoski E., Rautio A. (1995), "Ginseng therapy in non- insulin dependent diabetic patients", Diabetes Care, 18: 1373-5. 115. Tang W., Eisenbrand G. (1992) "Panax ginseng C. A. Mayer, Chinese Drugs of Plant Origin", Springer-Verlag, Berlin, 710-737. 116. Thanh N.T., Ket N.V, Yoeup P.K. (2007), "Effecting of medium composition on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Panax vietnamensis Ha et Grushv.", VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 23: 269-274. 117. Thanh N.T., Murthy H.N., Y K.W., Jeong C.S., Hahn E.J., Paek K.Y. (2006) “Effect of oxygen supply on cell growth and saponin production in bioreactor cultures of Panax ginseng”, J. Plant Physiology, 163(12): 1337- 1341. 92 118. Thanh N.T., Son L.T. and Paek K.Y. (2007), "Induction and proliferation of callus of Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.): Effects of plant growth regulators", J. of Science, 167. 119. Tirajoh A., et al (1996), "Tissue culture and Agrobacterium - mediated transformation of most American ginseng (Panax quinquefolium L.)", Biological Sciences, 3. 120. Tirajoh A., Kyung T. S. and Punja Z. K. (1998), "Somatic Embryogenesis and Plantlet Regeneration in American Ginseng (Panax quinquefolium L.)", In Vitro Cellular and Developmental Biology, 203-211. 121. Vergauwe A., Cammaert R., Vandenberghe D., Genetello C., Inze D, VanMontagu M., VandenEeckhout E. (1996), "Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of Artemisia annua and regeneration of transgenic plants", Plant Cell Rep, 15: 929-933. 122. Vergauwe A., Van Geldre E., Inze D., Van Montagu M., Van den Eeckhout E. (1998), "Factors influencing Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of Artemisia annua L.", Plant Cell Rep, 18:105-110. 123. Verpoorte R., Memelink J. (2002), "Engineering secondary metabolite production in plants", Curr Opin Biotechnol, 13:181-187. 124. Wang J., Letham D. S., Cornish E., Stevenson K. R. (1997), “Studies on cytokinins action and metabolism using tobacco p lants expressing either the ipt or the gus gene controlled by a chalcone synthase promoter”, Aus. J. Plant Physiol, 24: 661-672. 125. Yancheva S.D., Golubowicz S., Fisher E., Lev-Yadun S., Flaishman M.A. (2003), “Auxin type and timing of application determine the activation of the developmental program during in vitro organogenesis in apple”, Plant Science, Vol 165, 11: 299-309. 126. Yoder J.I, Golgsbrough A.P. (1994), "Transformation system for generating marker- free transgenic plants", Biotechnology, 12: 263-267. 93 127. Yuan C.S., Wu J.A., Lowell T., Gu M. (1998), "Gut and brain effects of American ginseng root on brainstem neuronal activities in rats", Am. J. Chin. Med., 26: 47-55. 128. Zhong J., Wang S.J. (1998), "Effects of nitrogen source on the production of ginseng saponin and polysaccharide by cell cultures of Panax quinquefolium", Pro Biochem 33: 671-675. 129. Zhong J.J., Bai Y., Wang S.J. (1996), "Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium", J Biotech, 45: 227-234. TÀI LIỆU INTERNET 130. 131. hppt://www.answers.com/topic/agrobacterium-tumefaciens-2 132. 5T PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các polyacetylen tìm thấy trong một số loài sâm Loài Hợp chất Panax ginseng C.A. Meyer Panaxynol (falcarinol) Panaxytriol Panaxydol Heptadeca-1-en-4,6-diyn-3,9-diol Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol Heptadeca-1,4-dien-6,8-diyn-3,10-diol Panaxycol 9,10-epoxy-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3-ol 10-cloro-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3,9,10-triol 9,10-epoxy-4,6-heptadecadiyn-3-on 9,10-epoxy-1-heptadecen-4,6-diyn-3-on 3-acetoxy-9,10-epoxy-1,16-heptadecadien-4,6-diyn 3-acetoxy-9,10-epoxy-4,6-heptadecadiyn 3-acetoxy-9,10-epoxy-16-heptadecen-4,6-diyn Panax quinquefolium Falcarinol Panaxytriol Panaxydol Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol Heptadeca-1-en-9,10-epoxy-4,6-diyn-3,8-diol 3-oxo-9,10-epoxy-heptadeca-1-en-4,6-diyn 6,7-epoxy-13-tetradecen-1,3-diyn 1,2,9,10-diepoxy-4,6-heptadecadiyn-3-on Panax notoginseng 8-acetoxy-9,10-epoxy-1-heptadecen 4,6-diyn-3-ol 10-metoxyheptadeca-1-en-4,6-diyn 3,9-diol Panaxytriol Panax Vietnamensis Ha et Grushv. Heptadeca-1,9(Z)-dien-4,6-diyn-3-ol (Panaxynol, Falcarinol) 10-acetoxy-hetadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol Heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol Heptadeca-1,8(Z)-dien-4,6-diyn-3,10-diol Heptadeca-1,8(E),10 (E)-trien-4,6-diyn-3,12-diol Phụ lục 2. Thành phần môi trường AB (Chilton và cs., 1974) Phụ lục 3. Thành phần môi trường LB (Luria Bertoni) Thành phần Khối lượng (g/l) Cao nấm men Bactotrypton NaCl 5 10 10 Thành phần Khối lượng (g/l) Dung dịch đệm AB 20X KR2RHPOR4 NaHR2RPOR4 30 4 Dung dịch muối khoáng 20X NHR4RCl MgSOR4 KCl CaClR2R.2HR2RO FeSOR4R.7HR2RO 20 6 3 3 0,005 Phụ lục 4. Thành phần môi trường MS (Murashige Skoop, 1962) (pH = 5,8) Thành phần Khối lượng (mg/l) Khoáng đa lượng NHR4RNOR3R KNOR3R CaClR2R.2HR2RO MgSOR4R.7HR2RO FeSOR4R.7HR2RO NaR2REDTA 1650 1900 440 370 27,3 37,3 Khoáng vi lượng HR3RBOR3R MnSOR4R.4HR2RO ZnSOR4R.4HR2RO KI NaR2RMoOR4R.2HR2RO CuSOR4R.5HR2RO CoClR2R.6HR2RO 6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 Vitamin Glycine B1 B6 Acid nicotinic Inositol 2 0,1 0,5 0,5 100 Phụ lục 5. Hình tăng sinh mô sẹo sau 8 tuần nuôi cấy (a., b., c., d., e., f.: Nuôi cấy trên môi trường S1, S2, S3, S4, S5, S6) a f c e d b Phụ lục 6. Hình tái sinh chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường C1, C2, C3, C4, C5 và C6. C1 C5 C6 C4 C3 C2