Luận văn Công nghệ tổng hợp Lysine

sự sai biệt thì thu nhận được trong gen phe A nhưng không có trong operon HD-HK của C. glutamicum. Amino acid cuối cùng của DDH được tìm thấy là threonine chứ không phải là methionine. Amino acid methionine thì bị mất đi sau khi sự dịch mã bắt đầu. Mặc dù không có sự hoạt động nhưng aminopeptidase methionine có thể hiện diện trong C. glutamicum như trong E. coli. Trong bài thí nghiệm tạo dòng này, gen dapA của C. glutamicum không được biểu hiện là do sự gián đoạn của khu vực thay thế cho biểu hiện gen bằng EcoRI và đang có những cố gắng để tạo dòng gen dapA của C. glutamicum. Lysine được cung cấp một cách rộng rãi trong quy mô công nghiệp bằng lên men sử dụng những thể đột biến của vi khuẩn acid glutamic đại diện là C. glutamicum. Trong con đường tổng hợp lysine ở C. glutamicum DDh cung cấp meso-DAP để tổng hợp lysine. Một sự gia tăng 14 lần trong hoạt tính đặc biệt của DDH được thu nhận sau khi giới thiệu gen tạo dòng trong một đối tượng không phải đối tượng sản xuất. 2.1.3.4. Khuếch đại biểu hiện của Fructose 1,6-biphosphatase trong tế bào Corynebacterium glutamicum thông qua con đường pentose phosphate và sản xuất lysine từ các nguồn carbon khác nhau:[18] Sự tác động quá mức của fructose 1,6 – biphosphatase (FBPase) trong Corynebacterium glutamicum có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện sản xuất lysine từ các nguồn đường khác nhau. Sự khuếch đại biểu hiện của FBPase qua promoter của gen mã hóa yếu tố kéo dài TU (EFTU) làm tăng sản lượng lysine trong sản xuất không tuân theo những qui tắc của lên men feedback từ chủng C. glutamicum lysCfbr có 40% glucose và 30% fructose hay sucrose. Hơn nữa, sự hình thành các sản phẩm glycerol và dihydroxyacrtone được giảm đáng Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 73 kể trong đột biến PEFTUfbp. Theo tiết lộ, sự trao đổi chất ở carbon thứ 13 của glucose tác động quá mức của FBPase là lí do chuyển hướng trao đổi carbon từ chu trình glycosis về phía chu trình pentose phosphate (PPP) và do đó dẫn đến tăng cung cấp NADPH. Bình thường với một lượng glucose hấp thụ là 100%, lượng tương đối vào PPP là 56% C. glutamicum lysCfbr PEFTU và 46% C. glutamicum lysCfbr. Cơ chất cung cấp cho NADPH là 180% đối với chủng PEFTUfbp và chỉ 146% cho chủng gốc ban đầu của chúng. Khuếch đại cùa FBPase làm tăng sản lượng lysine thông qua việc tăng sự cung cấp NADPH. So sánh nghiên cứu này với các chủng đột biến khác duy trì the sod promoter upstream của gen biểu thị fbp rằng mức độ biểu hiện của FBPase liên quan đến mức độ hiệu quả trao đổi chất. Sự biểu hiện quá mức của FBPase xem như hữu ích cho sản xuất lysine trong công nghiệp từ tinh bột và mật mía từ C. glutamicum. Việc chuyển hướng trao đổi chất vể phía PPP cũng thú vị để sản xuất khác NADPH – yêu cầu các hợp chất cũn như sản phẩm trực tiếp bắt nguồn từ PPP. Vi sinh vật được sử dụng trong bài nghiên cứu này là các giống đột biến từ chủng hoang dại C. glutamicum ACTT 13032. Bảng 2. 5 Giống C. glutamicum dùng trong bài nghiên cứu này [18]. Chủng Sự thay đổi Chủng Sự sửa đổi Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 74 Bảng 2. 6 Vị trí chuỗi primer đặc biệt được sử dụng phổ biến để thay thế trong G. glutamicum bằng phương pháp PCR và chuỗi DNA tiếp theo sau [18]. Corynebacterium glutamicum sản xuất thành công lysine trong công nghiệp hơn 40 năm, sản xuất hàng ngàn tấn lysine mỗi năm trên thị trường thế giới. Chủng sản xuất cổ điển vẫn được sử dụng đến ngày nay, tuy nhiên hiện nay sử dụng chủng đột biến từ chủng gốc ban đầu và nhờ đó làm giảm lượng đường sử dụng, tăng sản lượng và chịu được điều kiện khắc nghiệt. Để đạt được những mục tiêu như vậy, so sánh không ngừng chủng C. glutamicum hoang dại và các chủng sản xuất gần đây là một chiến lược mạnh mẽ. Bằng cách làm này, các đột biến được xem là chìa khóa phản ứng để giải quyểt việc sinh tổng hợp trong sản xuất hay cung cấp trao đổi chất được xác định và sau đó giới thiệu chủng hoang dại. Trong bài nghiên cứu này, phân tích quá trình trao đổi chất đóng vai trò quan trọng trong trung tâm trao đổi chất của C. glutamicum để sản xuất lysine. Quá trình sinh tổng hợp lysine đòi hỏi nhiều NADPH. Phương pháp chính cho sự hình thành NADPH trong C. glutamicum là con đường pentose phosphate (PPP) với hai loại enzyme tạo ra NADPH là glucose 6-phosphate dehydrogenase và 6-phosphpgluconate dehydrogenase. Enzyme fructose 1,6 – biphosphate (FBPase) được xem là mục tiêu tiềm năng để sản xuất lysine. Enzyme này là một phần của chu trình gluconeogenetic và giúp C. glutamicum phát triển mà noncarbohydrate như là acetate, citrate, Gen mục tiêu Đoạn mồi Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 75 glutamate. Trong suốt giai đoạn phát triển trên đường, không cần fructose 1,6 – biphosphate và bị ức chế hay đàn áp bởi các cơ chế khác. C. glutamicum phát triển trên đường glucose hay fructose mà hoàn toàn thiếu hoạt động của fructose 1,6 – biphosphatase. Chính vì thiếu enzyme này đã làm giảm hiệu suất sản xuất lysine mặc dù con đường PPP có tác dụng nâng cao sự hình thành sản phẩm. Vi vậy, kết luận rằng enzyme fructose 1,6 – biphosphatase có ảnh hưởng đến sản lượng là hiệu suất sản xuất lysine từ những nguồn carbon khác nhau. Kết quả: Hoạt động của fructose 1,6-biphosphatase trong tế bào ở những chủng C. glutamicum khác nhau: Fructose 1,6-biphosphatase biểu hiện hoạt tính trong tế bào của chủng bố mẹ C. glutamicum lysCfbr là tương đối thấp. Đồ thị 2. 2 Hoạt động invivo của fructose 1,6-biphosphatase trong các chủng C. glutamicum khác nhau [18]. Ảnh hưởng của fructose 1,6-biphosphatase vào sự sản xuất lysine: C. glutamicum lysCfbr có vi trò quan trọng trong việc sản xuất lysine trên nhiều nguồn carbon khác nhau. Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 76 Bảng 2. 7 Sản lượng và những đặc trưng của sự sản xuất lysine của C. glutamicum ACTT 13032 [18]. Đây là kết quả của quá trình lên men feedback – chịu được sự có mặt của aspartikinase chứa trong chủng này, mà là lý do để sinh tổng hợp lysine. Sản lượng lysine đạt khoảng C-mmol C-mol-1 (1C-mol = 1 mol C) từ nguồn cơ chất là glucose hay sucrose, còn đối với fructose thì năng suất thấp hơn khoảng 20%.. Hơn nữa, việc ứng dụng fructose 1,6-biphosphatase trong C. glutamicum lysCfbr PEFTUfbp làm tăng mạnh sản lượng lysine thu được trên cả ba nguồn carbon. Sự gia tăng cao nhất là ở cơ chất glucose (40%), nhưng cải thiện đáng kể là trên cơ chất sucrose (30%) và fructose (30%). Đối với chủng C. glutamicum lysCfbr PSODfbp cũng cải thiện sản lượng lysine thu được, tuy nhiên không tăng mạnh đối với cả ba nguồn carbon sử dụng. Ảnh hưởng của fructose 1,6-biphosphatase lên sự phát triển: Thêm vào sự gia tăng sản lượng lysine, chủng C. glutamicum lysCfbr PEFTUfbp cũng như các chủng khác đều có ảnh hưởng đến sự phát triển. Trên cơ chất glucose, tỉ lệ phát triển µ (0,31 h-1) của C. glutamicum lysCfbr PEFTUfbp thì thấp hơn so với lysCfbr (µ = 0,39 h-1). Nhưng kết quả này không phải do cơ chất khác nhau, bởi vì cả hai chủng đểu thu được giá trị tương tự là 4.9 mmol/g.h cho C. glutamicum lysCfbr và 4.8 mmol/g.h cho C. glutamicum lysCfbr PEFTUfbp. Kết luận là sự giảm ở đây là do sinh khối giảm. Mặc dù FBPase không phụ thuộc vào nguồn cơ chất khác nhau nhưng khá là ảnh hưởng đến sự phân phối nguồn carbon nội bào. Chủng C.glutamicum Nguồn C Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 77 Sự thú vị là khào sát sự phát triển của tế bào trên nguồn đường fructose, C. glutamicum lysCfbr PEFTUfbp phát triển nhanh (µ=0,35 h-1) hơn chủng bố mẹ của chúng (µ = 0,27 h-1) và sản lượng sinh khối thu được cũng cao hơn. Kết quả sử dụng nguồn fructose đạt hiệu quả cao hơn ở C. glutamicum lysCfbr PEFTUfbp (qs = 4.7 mmol/g.h) trong khi ở C. glutamicum lysCfbr chỉ đạt qs = 4.4 mmol/g.h. Ảnh hưởng sự biểu hiện của fructose 1,6-biphosphatase lên quá trình hình thành sản phẩm: Dựa vào nghiên cứu về enzyme FBPase thấy rằng chúng hoạt động mạnh trong tế bào của C. glutamicum và đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện sự sản xuất lysine. Bảng 2. 8 Sinh khối và các chất chuyển hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr và C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp từ 99% [1-13C] glucose [18]. Dựa vào bảng 2.8, lượng lysine từ 2 chủng đột biến thu được đều cao nhưng ở chủn C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp là cao hơn hẳn so với C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr. Thông số Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 78 Bảng 2. 9 Nhu cầu đồng hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp và C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr trên nguồn glucose [18]. Tóm lại, tăng sự biểu hiện của fructose 1,6-biphosphatase có vai trò quan trọng trong cải thiện sự sản xuất lysine. Vì vậy, sự biến đổi gen hứa hẹn sẽ được ứng dụng trong sản xuất theo quy mô công nghiệp dựa trên nguồn cơ chất là tinh bột, mật mía, đường nguyên chất. Khảo sát giữa 2 giống đột biến là C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp là cao hơn hẳn so với C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr để làm rõ vai trò biểu iện của FBPase. Hơn nữa, gen tham gia vào sự hình thành glycerol và dihydroxyacetone trong C. glutamicum không được xác định. Nhưng hàm lượng glycerol và dihydroxyacetone thì có liên quan đến sự hoạt động của FBPase trong tế bào. Sự hình thành glycerol và dihydroxyacetone sẽ giảm khi tăng biểu hiện của FBPase. Do đó, kết luận rằng sự tổng hợp các chất này là hiện tượng tràn ra trong C. glutamicum bị giới hạn bởi enzyme FBPase. 2.2. Công nghệ lên men L-lysine: 2.2.1. Nghiên cứu công nghệ sản xuất acid amin L-lysine : Năm 2007, Nguyễn Thuỳ Châu và cs. đã tiến hành phân lập các chủng Corynebacterium glutamicum có khả năng tổng hợp L-lysine cao từ các mẫu đất ở Việt Nam, sau đó gây đột biến bằng nitrosoguanidine để thu được các thể đột biến dị dưỡng với homoserin kí hiệu là CM24 có khả năng tổng hợp L-lysine cao nhất. Đồng thời, nhóm nghiên cứu đã thực hiện khảo sát quá trình lên men thu nhận L- Nhu cầu tiền chất [mmol (mol glucose)-1] Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 79 lysine bằng thể đột biến CM24 ở qui mô 50 lít, 150 lít. Từ đó đưa ra qui trình lên men L-lysine theo mẻ với qui mô 1500lít, thu hồi và tạo chế phẩm L-lysine. 4 môi trường được nghiên cứu có nguồn Carbon thay đổi lần lượt là : 30g/l glucose, 100g/l glucose, 130g/l mật rỉ đường , 80g/l mật rỉ đường. Trong đó môi trường chứa 130 g/l mật rỉ đường cho sản lượng L-lysine cao nhất là 30g/l, và được lựa chọn để lên men trong các thí nghiệm sau. Bảng 2. 10 Khả năng lên men của chủng CM24 trên 4 loại môi trường [6]. Môi trường 30g/l glucose 100g/l glucose 130g/l mật rỉ đường 80g/l mật rỉ đường Sản lượng L- lysine (g/l) 22 25 30 18 Khi lên men ở quy mô 50 lít, thời gian tối ưu để lên men L-lysine là 72 h. Từ đồ thị 2.2, sinh khối phát triển cực đại ở 24 giờ, pha cân bằng bắt đầu từ 24 giờ đến 78 giờ. Hàm lượng L-lysine tăng mạnh từ 18 giờ đến 72 giờ. Hàm lượng L- lysine đạt cao nhất là 30g/lít. Đồ thị 2. 3 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít [6]. Khoảng nhiệt độ lên men khảo sát là từ 20 đến 35oC. Kết quả ở đồ thị 2.3 cho thấy đột biến thể CM24 khi lên men ở nhiệt độ 30oC cho sản lượng L-lysine Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 80 đạt cao nhất là 31g/l. Vì vậy có thể nói rằng nhiệt độ 30oC là thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp L-lysine. Đồ thị 2. 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít [6]. Khoảng pH khảo sát từ 6- 7.5, trong đó pH tối ưu cho quá trình sự sinh tổng hợp lysine của đột biến thể CM24 là 7,0 cho sản lượng L-lysine cao nhất, đạt 31g/l (bảng 2.6). Bảng 2. 11 Ảnh hưởng của pH lên sản lượng L-lysine qui mô 50 lít [6]. pH môi trường 6.0 6.5 7.0 7.5 Sản lượng L-lysine (g/l) 18 23 31 25.5 Hàm lượng Oxy hòa tan được thay đổi trong quá trình lên men tại những thời gian điểm nhất định, để khảo sát ảnh hưởng của oxy lên hoạt động sinh tổng hợp L-lysine. Kết quả ở bảng 2.7 cho thấy khi điều khiển độ oxy hoà tan trong suốt quá trình lên men là 100% sản lượng L-lysine là 32,2 g/l tại thời điểm 72 giờ. Khi độ oxy hòa tan thay đổi trong quá trình lên men, giảm từ 100% từ giờ thứ 12 đến giờ 24 xuống còn 90% ở thời gian còn lại của quá trình lên men, sản lượng L- lysine giảm xuống còn 28,2 g/l. Như vậy có thể nói rằng đột biến thể CM 24 là chủng hiếu khí cao, cần oxy trong quá trình sinh tổng hợp L-lysine . Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 81 Bảng 2. 12 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít [6]. Thời gian lên men (h) Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Độ oxy hòa tan (%) Sản lượng L- lysine (g/l) Độ oxy hòa tan (%) Sản lượng L-lysine (g/l) 0 100 - 100 - 12 100 - 100 - 24 100 3.8 90 3.1 36 100 8.1 90 6.8 48 100 16 90 14 60 100 24.2 90 21.5 72 100 32.2 90 28.2 84 100 30 90 25.2 Dựa trên những kết quả thu được khi khảo sát quá trình lên men ở qui mô 50 lít, nhóm nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ lên men L- lysine trên hệ thống lên men 150 lít. Dựa vào kết quả ở đồ thị 2.4 và bảng 2.8, ta thấy động thái sinh tổng hợp L-lysine ở quy mô 150 lít không khác gì so với qui mô 50 lít đã trình bày ở trên. Đồ thị 2. 5 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng L-lysine ở qui mô 150 lít [6] . Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 82 Bảng 2. 13 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 150 lít [6]. Thời gian lên men (h) Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Độ oxy hòa tan (%) Sản lượng L-lysine (g/l) Độ oxy hòa tan (%) Sản lượng L-lysine (g/l) 0 100 - 100 - 12 100 - 100 - 24 100 3.8 90 3.1 36 100 8.1 90 6.8 48 100 16 90 14 60 100 24.2 90 21.5 72 100 30.2 90 28.2 84 100 30.2 90 25.2 Tuy nhiên, khi nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ lên men L-lysine trên hệ thống lên men 1500 lít, một vài thông số có sự thay đổi. Dựa vào đồ thị 2.5 và bảng 2.9, sản lượng L-lysine ở 72 giờ là 28,5g/l. Sản lượng này giảm hơn so với sản lượng ở hệ thống 150l/mẻ. Có thể lý giải rằng hiệu quả khuấy của hệ thống 1500l/mẻ có kém hơn so với hệ thống 150l/mẻ đó dẫn đến kết quả trên . Đồ thị 2. 6 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng L-lysine ở qui mô 1500 lít [6]. Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 83 Bảng 2. 14 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 1500 lít [6]. Thời gian lên men (h) Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Độ oxy hòa tan (%) Sản lượng L-lysine (g/l) Độ oxy hòa tan (%) Sản lượng L- lysine (g/l) 0 100 - 100 - 12 100 - 100 - 24 100 3.8 90 3.1 36 100 8.1 90 6.8 48 100 16 90 14 60 100 24.2 90 21.5 72 100 28.5 90 25.5 84 100 28.5 90 25.5 Công nghệ thu hồi và tạo chế phẩm L-lysine cũng được nghiên cứu. Dịch sau khi lên men được li tâm trên hệ thống li tâm liên tục với vận tốc 16000v/phút để loại bỏ tế bào vi khuẩn, thu dịch nổi. Tiến hành sắc ký trao đổi cation bằng nhựa Dowex 50. Dịch chiết rút của quá trình sắc ký trao đổi ion được cô đặc bằng thiết bị cô chân không RP2 của Anh quốc. Sau khi thu hồi bằng sắc ký trao đổi ion và cô đặc bằng cô chân không được phối trộn với bột sắn tinh theo tỷ lệ L-lysine /bột sắn là 7:3. Tiến hành sấy phụ hỗn hợp ở nhiệt độ 50-55oC thu được thành phẩm chứa 70% L-lysine.Kết quả được chỉ ra ở bảng 2.15 Bảng 2. 15 Hiệu suất thu hồi L-lysine [6]. Lượng L-lysine (g/1000 lít) Trước thu hồi 30200 Thu hồi bằng sắc kí và cô chân không 27180 Hiệu suất thu hồi 90% Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 84 Từ các khảo sát trên , nhóm nghiên cứu đã đưa ra qui trình công nghệ lên men L-lysine qui mô 1500 lít/mẻ như sau: Chủng Corynebacterium glutamicum đột biến dị dưỡng homoserin giữ ở ống thạch nghiêng ở 4oC trên môi trường L3 (Giống gốc giữ bằng phương pháp đông khô và bảo quản trong tủ lạnh -200C). Nhân giống trong bình tam giác 500ml có chứa 150ml môi trường L3 (thành phần gồm: mật rỉ đường 130 g/l, NH4Cl 20 g/l, Ure 5 g/l, KH2PO4 1 g/l, MgSO4.7H2O 0,4 g/l; FeSO4.7H2O 10mg; MnSO4.4H2O 8mg; đậu tương thủy phân 10 g/l; thiamin 0,1mg; biotin 0,3mg; pH = 7) tỷ lệ tiếp giống là 10%. Nuôi cấy lắc ở vận tốc 200v/phút trong 24h. Nhân giống trên hệ thống lên men 150 lít /mẻ trong 24h trên môi trường L3 tỷ lệ tiếp giống là 10%. Lên men L-lysine trên hệ thống lên men 1500 lít /mẻ trong 72h trên môi trường L3, tỷ lệ tiếp giống là 10%. Ly tâm ở vận tốc 16.000v/phút, loại bỏ xác tế bào, thu dịch nổi. Tiến hành sắc ký trao đổi cation bằng nhựa Dowex 50 có nhóm acid và rửa giải bằng dung dịch amonium hydroxide. Dịch chiết rút chứa L- lysine được cô đặc bằng cô chân không đến thể tích 1/10 sau đó được acid hóa bằng HCl và kết tinh bằng hạ nhiệt độ, dịch L-lysine cô đặc được phối trộn với bột sắn theo tỷ lệ 7:3. Tiến hành sấy khô hỗn hợp ở nhiệt độ 500C – 550C, thu được thành phẩm dạng bột chứa 70% L-lysine, với hàm ẩm 12%. Theo tính toán sơ bộ, giá thành sản xuất thử cho 30 kg L-lysine cho 1 mẻ sản xuất ở hệ thống lên men chìm sục khí 1500 l/ mẻ như sau: Tiền môi trường cho lên men: 50 000 đ/ kg Tiền hóa chất cho thu hồi acid amin: 15 000 đ/ kg Tiền năng lượng và khấu hao thiết bị : 27 000đ/kg Tiền nhân công : 15 000 đ/ kg Tổng : 107 000 đ/kg Nghiên cứu trên tuy còn một số hạn chế khi mà hàm lượng L-lysine thu được khá thấp 28.5 g/l. Nhưng đã bước đầu đưa ra được một qui trình công nghệ hoàn thiện từ khâu nhân giống, lên men, và tạo ra chế phẩm cuối cùng, có thể chuyển giao vào sản xuất. Thực tế cho thấy mật rỉ đường ở nước ta hiện nay chủ yếu mới chỉ được sử dụng để sản xuất cồn. Trong khi đó, có rất nhiều sản phẩm có thể sản xuất được từ rỉ đường để đáp ứng nhu cầu cuộc sống , song vẫn chưa triển khai được. Đặc biệt Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 85 các acid amin như L- lysine, là những chất có thể sản xuất từ rỉ đường nhưng ta vẫn phải nhập ngoại với số lượng vài trăm tấn/năm trị giá nhiều chục tỉ đồng. Vì vậy, việc nghiên cứu công nghệ sản xuất các acid amin L-lysine là rất cần thiết để đa dạng hoá các sản phẩm sau đường và phát triển chăn nuôi, dược phẩm. 2.2.2. Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine: Năm 2009, Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị Minh Tâm đã nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Corynebacterium sp. cố định trong lên men thu nhận L-lysine. 3 loại chất mang khảo sát là Alginate, Bacterial Cellulose (BC) và phức Alginate – Bacterial Cellulose (BC-A) tương ứng với 3 phương pháp cố định là: nhốt, bẫy- hấp phụ, kết hợp nhốt và bẫy – hấp phụ. Điều kiện tối ưu thu nhận L-lysine là: môi trường lên men chứa 8,35 % glucose ,điều kiện lên men: giống bổ sung 3%, pH 7.0, nhiệt độ 30oC, thời gian lên men 72 giờ. Quá trình lên men được thực hiện trong fermentor với tốc độ khuấy đảo 300 vòng/phút, dO2 = 100%. Sử dụng 3 chế phẩm Corynebacterium sp (được cố định bằng 3 chất mang alginate, BC và phức BC-A) để lên men thu nhận lysine nhằm so sánh hiệu quả của các chế phẩm cố định đó. Tiêu chí đánh giá đánh giá để xác định số lần tái sử dụng là sản lượng L-lysine của các lần tái sử dụng lên men bằng các chế phẩm cố định trong cùng một thời gian lên men là 72h. Một số kết quả thu được như sau: Các chế phẩm vi khuẩn Corynebacterium sp cố định trên alginate dưới tác động khuấy đảo trong lên men, đã bị trương và vỡ ra sau 5 lần tái sử dụng. Trong môi trường lên men có một lượng Na+ và gốc phosphate là những tác nhân phá vỡ cấu trúc hệ gel của alginate. Trong khi đó, màng BC giữ nguyên cấu trúc rất chắc sau 10 lần theo dõi tái sử dụng (đồ thị 2.7). Dựa vào các yêu cầu của chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào, ưu điểm nổi bậc của chất mang BC thể hiện qua 4 điểm: tính chất cơ lý bền vững, dễ phù hợp với hình dạng thiết bị lên men, giá thành thấp và số lần tái sử dụng cao. Nhưng kiểu cố định tế bào bằng phương pháp bẫy-hấp phụ dẫn đến hiện tượng rửa trôi tế bào sau mỗi lần tái sử dụng. Vì vậy, khi cố định tế bào bằng phương pháp bẫy-hấp phụ trên BC chỉ có khả năng tái sử dụng khoảng 9 lần (đồ thị 2.6). Khi kết hợp với nhốt tế bào bằng alginate trên phức BC-A đã khắc phục được hiện Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 86 tượng rửa trôi tế bào. Sau 10 lần tái sử dụng chế phẩm vi khuẩn cố định trên BC, tỷ lệ rửa trôi lên đến 32%, tương ứng là sản lượng lysine giảm 40% so với đối chứng. Đối với chất mang BC-A, sau 13 lần tái sử dụng tỷ lệ rửa trôi là 27%, tương ứng sản lượng lysine giảm 25% so với đối chứng. Kết quả khảo sát tỷ lệ rửa trôi tế bào thể hiện qua bảng 2.16. Đánh giá hiệu quả cố định của chế phẩm Corynebacterium sp cố định trên các chất mang thông qua sản lượng lysine trong quá trình lên men và xử lý số liệu, cho kết quả như sau: Đối với chất mang alginate: có thể tái sử dụng 3 lần cho hiệu quả lên men không khác biệt so với đối chứng. Lần lên men tái sử dụng thứ 4, sản lượng lysine giảm khoảng 24%. Lần tái sử dụng thứ 5, sản lượng giảm 32%. Dưới tác động khuấy đảo trong quá trình lên men, chế phẩm Corynebacterium sp cố định trên alginate bị trương và vỡ ra sau 5 lần tái sử dụng. Đối với chất mang BC: có thể tái sử dụng 8 lần cho hiệu quả lên men không khác biệt so với đối chứng. Lần lên men tái sử dụng thứ 9, sản lượng lysine giảm khoảng 24%. Lần tái sử dụng thứ 10, sản lượng lysine giảm 40%. Chính sự khác biệt của sản lượng lysine qua các lần lên men tái sử dụng, nên đối với chất mang BC, số lần tái sử dụng được xác định là 8 lần. Đối với phức chất mang BC-A: có thể tái sử dụng 12 lần cho hiệu quả lên men không khác biệt so với đối chứng. Lần lên men tái sử dụng thứ 13, sản lượng lysine giảm khoảng 25%. Lần tái sử dụng thứ 14, sản lượng lysine giảm 38%. Do sự khác biệt của sản lượng lysine qua các lần lên men tái sử dụng nên đối với phức chất mang BC-A, số lần tái sử dụng được xác định là 12 lần. Chất mang BC và phức BC-A, sau số lần theo dõi tái sử dụng để lên men vẫn giữ được nguyên trạng thái cấu trúc ban đầu. Đây cũng là một ưu điểm, thể hiện qua tính chất vật lý của BC và củng là một yêu cầu quan trọng của chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật. Với phức BC-A, các tế bào được nhốt bởi gel alginate trong mạng lưới BC, giúp giảm tỷ lệ rửa trôi tế bào trong quá trình tái sử dụng để lên men (bảng 2.15), vì vậy số lần tái sử dụng gia tăng (đồ thị 2.7). Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 87 Alginate BC BC-A Đồ thị 2. 7 Sản lượng L-lysine của các lần tái sử dụng lên men bằng các chế phẩm vi khuẩn cố định. [8] Bảng 2. 16 Tỷ lệ rửa trôi tế bào sau tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%) [8]. Chất mang Lần tái sử dụng 2 4 6 8 10 12 13 Alginate 8 35 x x x x x BC 12 15 19 25 32 x x BC-A 9 12 17 19 22 23 27 (x): không có khả năng tái sử dụng. Chất mang BC có nhiều ưu thế hơn các chất mang truyền thống alginate trong kỹ thuật cố định tế bào vi khuẩn Corynebacterium sp. BC hoàn toàn phù hợp với các yêu cầu của chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi khuẩn. Phức chất mang BC-A phát huy được những ưu thế của chất mang Bacterial cellulose và Alginate. Hiệu quả sử dụng chế phẩm Corynebacterium sp cố định trên phức chất mang BC-A trong lên men thu nhận lysine khá cao: có thể tái sử dụng chế phẩm 12 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men và sản lượng lysine so với đối chứng sản lượng lysine trung bình là 30g/l. Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 88 2.2.3. Nghiên cứu quá trình lên men thu nhận L-lysine ở các chế độ lên men khác nhau: Nakamura et al [25] đã nghiên cứu quá trình lên men thu nhận L-lysine bằng Brevibacterium lactofermentumATCC 21800, Brevibacterium flavum ATCC 21475 và Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 21491 ở các chế độ lên men khác nhau: lên men batch, lên men fed batch chỉ bổ sung glucose, fed batch bổ sung glucose và các thành phần khác, repeat fed batch, lên men liên tục. Môi trường lên men ban đầu chứa 80g/l mật rỉ đường, hàm lượng glucose trong môi trường bổ sung là 40g/l, Dịch đậu nành thủy phân 100mg/l, Thiamine HCL 0,1 mg/l, biotin 0,3 mg/l. Trong quá trình lên men fed batch, 100ml môi trường bổ sung được thêm vào sao cho nồng độ đường trong canh trường nuôi cấy duy trì ở các mức dưới 5g/l và từ 5-15 g/l, quá trình lên men kết thúc vào thời điểm hàm lượng đường trong canh trường nuôi cấy được sử dụng hết. Trong repeat fed batch, sau khi 100 ml môi trường bổ sung được thêm vào, 100ml canh trường được rút ra từ fermentor tại thời điểm đường trong canh trường nuôi cấy cạn kiệt, tiếp tục bổ sung thêm môi trường bổ sung, quá trình nuôi cấy được tiếp tục. Trong trường hợp này, nồng độ đường trong canh trường nuôi cấy cũng được giữ ở mức 5 g/l hoặc thấp hơn. Sau khi 100 ml môi trường bổ sung được thêm vào, quá trình nuôi cấy kết thúc tại thời điểm đường trong canh trường nuôi cấy cạn kiệt. Canh trường trong fermentor và canh trường lấy ra trước đó được trộn với nhau và đem đi định lượng L-lysine. Trong lên men liên tục, môi trường bổ sung cho quá trình nuôi cấy liên tục được bổ sung sau 25h kể từ khi quá trình lên men bắt đầu, môi trường bổ sung sử dụng là môi trường trường lên men ban đầu đem đi pha loãng 4 lần, khoảng 1 lít môi trường được đưa vào với độ pha loãng 0.05/h để thực hiện quá trình nuôi cấy liên tục, khi đạt được trạng thái ổn định, đem đi định lượng hàm lượng L-lysine trong môi trường nuôi cấy. Tất cả các quá trình nuôi cấy được thực hiện với tỉ lệ giống bổ sung là 5%, ở pH=7, nhiệt độ 31,5oC, tốc độ sục khí là ½ vvm, tốc độ khuấy 700 rpm. Trong đó, các kết quả ở thí nghiệm trước là tiến đề các thí nghiệm sau. Ở thí nghiệm 1, so sánh các chế độ lên men: lên men batch, lên men fed batch chỉ bổ sung glucose, fed batch bổ sung glucose và các thành phần khác, Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 89 giống sử dụng là Brevibacterium lactofermentum ATCC 21800. Kết quả thu được như sau: Bảng 2. 17 Sản lượng L-lysine thu được bằng các phương pháp lên men khác nhau.[25] Phương pháp lên men Năng suất L-lysine (g/l.h) Sản lượng L-lysine (%) Lên men batch 2,2 32 Fed batch chỉ bổ sung glucose 2,3 33 Fed batch bổ sung glucose và các thành phần khác 2,8 35 Ở thí nghiệm 2, tiến hành lên men fed batch, nồng độ đường trong canh trường nuôi cấy duy trì ở các mức dưới 5g/l và từ 5-15 g/l. Giống sử dụng là Brevibacterium flavum ATCC 21475. Kết quả thu được như sau: Bảng 2. 18 Ảnh hưởng của hàm lượng đường giới hạn lên năng suất và sản lượng L-lysine [25]. Hàm lượng đường Năng suất L-lysine (g/l.h) Sản lượng L-lysine (%) Thấp hơn 5 g/l 2,9 34 Từ 5-15 g/l 2,5 32 Ở thí nghiệm 3, khảo sát quá trình lên men repeat fed batch, sử dụng giống Brevibacterium flavum ATCC 21475, kết quả thu được: năng suất đạt được là 3,8 g/l.h, sản lượng là 42 %. Ở thí nghiệm 4, khảo sát quá trình lên men repeat fed batch và liên tục, sử dụng giống Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 21491. Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 90 Bảng 2. 19 Năng suất và sản lượng L-lysine trong lên men repeat fed batch và liên tục [25]. Phương pháp lên men Năng suất L-lysine (g/l.h) Sản lượng L-lysine (%) Repeat fed batch 3,9 41 Liên tục 3,5 35 Các kết quả trên cho thấy: So với quá trình lên men batch, quá trình lên men fed batch ở mức 5g/l hoặc ít hơn được năng suất và sản lượng cao hơn hẳn. Nguyên nhân là do nồng độ đường cao trong môi trường đôi khi làm ức chế sự phát triển của vi sinh vật hoặc giảm sản lượng sản phẩm, cùng với đó là sự tạo thành các sản phẩm phụ như acetate và lactate. Bằng cách hạ thấp nồng độ đường ban đầu thấp và bổ sung sau đó, tổng thời gian nuôi cấy, đặc biệt là phage lag, có thể được rút ngắn và sản lượng có thể được tăng lên [22]. Bên cạnh đó, quá trình lên men liên tục cũng thu được năng suất cao, và giá thành có thể giảm trong sản xuất công nghiệp. So với quá trình fed batch và lên men liên tục, quá trình repeat fed batch thu được năng suất và sản lượng cao hơn hẳn. Nguyên nhân có thể là do trong fed batch, nồng độ sản phẩm tăng làm tăng áp suất thẩm thấu, tác động xấu lên sự sinh trưởng, sự chuyển hóa và năng suất thu L-lysine. Bằng kĩ thuật repeat fed batch có thể khắc phục được hiện tượng trên bằng cách rút ra một lượng canh trường nhất định, do đó năng suất và sản lượng được cải thiện [25]. 2.2.4. Nghiên cứu quá trình lên men liên tục L-lysine: Năm 1989, Toshihiko Hirao và cs đã khảo sát quá trình nuôi cấy liên tục bằng chủng Corynebacterium gutamicum đột biến. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát quá trình lên men liên tục một cấp bằng chủng B-6, được tạo ra từ Corynebacterium gutamicum ATCC13032 bằng cách lựa chọn các chủng kháng S- (2-aminoethyl)-L-cysteine, rifampicin, streptomycin và 6-azauracil sau khi gây đột biến bằng N-nitro-N'-nitro-N-nitrosoguanidine. Môi trường lên men ban đầu chứa 3% mật rỉ đường. Môi trường bổ sung có hàm lượng mật rỉ đường thay đổi từ 12% đến 18%. Quá trình nuôi cấy được thực hiện trong fermentor 5lít chứa 1.3 lít môi trường ban đầu. Khi lượng đường ban đầu đã được tiêu thụ, môi trường bổ sung Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 91 được cung cấp với một tỉ lệ nhất định. Sau khi thể tích canh trường nuôi cấy là 2.51ít, quá trình nuôi cấy liên tục được bắt đầu bằng cách bổ sung liên tục môi trường bổ sung và đồng thời lấy ra canh trường chứa tế bào và sản phẩm. Thể tích làm việc được duy trì ở mức 2.5 1ít. Quá trình nuôi cấy được thực hiện ở tốc độ khuấy 600 rpm, thổi khí 3 1ít/ phút ở 32°C. pH 7 được chỉnh tự động bằng NH4OH 10 N. Các kết quả thu được như sau: Đồ thị 2.8 thể hiện thời gian nuôi cấy liên tục chủng B-6 và ảnh hưởng của tỉ lệ bổ sung đến năng suất (g/1.h) ở nồng độ đường bổ sung là 20%. Mặc dù nuôi cấy liên tục có thể trên 500h, nhưng không thực hiện quá 400 h để tránh hiện tượng giống bị đột biến gây ảnh hưởng đến năng suất. Với việc tăng tỉ lệ bổ sung vượt hơn 90 ml/h, nồng độ L-lysine giảm. Mặc khác, năng suất tăng dần dần và sinh khối không thay đổi rõ ràng. Đồ thị 2. 8 Thời gian nuôi cấy liên tục [16] Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng đến các thông số trạng thái ổn định được khảo sát ở nhiều nồng độ đường bổ sung khác nhau được thể hiện ở đồ thị 2.8. Với việc tăng tỉ lệ pha loãng, năng suất tăng và thể hiện một giá trị lớn nhất ở mỗi nồng độ đường bổ sung. Tuy nhiên, hiệu suất của L-lysine tính trên mỗi khối lượng đường (%), Yp/s, giảm dần ở các tỉ lệ pha loãng cao hơn. Sinh khối giảm mạnh ở tỉ Thời gian nuôi cấy (h) Thời gian nuôi cấy (h) Si nh k hố i N ăn g su ất (g /l. h) Tỉ lệ bổ sung sung Tỉ lệ bổ sung sung Đ ườ ng só t (% ) Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 92 lệ pha loãng cao nhất. Nồng độ L-lysine lớn nhất đạt được là105 g/l với Yp/s là 38.5%, đạt được ở nồng độ đường bổ sung là 28%. Năng suất và sinh khối lớn nhất tính trên mỗi khối lượng đường (%), Yx/s, lần lượt là 5.6 g/1.h và 14.7%, ở nồng độ đường bổ sung là 12%. Đồ thị 2. 9 Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng lên các thông số trạng thái ổn định [16]. Nồng độ đường bổ sung: , 12%; , 20%; ,28% Yx/s= hiệu suất của sinh khối tính trên khối lượng đường Yp/s=hiệu suất thu sản phẩm tính trên khối lượng đường Quá trình nuôi cấy được thực hiện ở tốc độ khuấy 600 rpm, sục khí 3lít/phút Trong đồ thị 2.9, các thông số trạng thái ổn định được vẽ dựa vào tỉ lệ pha loãng. Tuy nhiên, nó khó để phân tích tỉ lệ - các yếu tố giới hạn ảnh hưởng đến năng suất trong trường hợp các nồng độ đường khác nhau. Do đó, năng suất được vẽ lại dựa theo tỉ lệ đường bổ sung, song song với các thông số trạng thái ổn định N ăn g su ất (g /l. h) Tỉ lệ pha loãng (h -1) Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 93 khác, bao gồm ORP và lượng L-lactic acid (lactate) tích tụ, nó có thể là một dấu hiệu của lượng oxy cung cấp. Kết quả thể hiện ở đồ thị 2.10. Điểm lớn nhất của năng suất trùng khớp với điểm mà lactate bắt đầu tích tụ ở mỗi nồng độ đường bổ sung. Bởi vì sự tích tụ đường cụ thể không phát hiện ở mỗi điểm, ngoại trừ điểm ở tỉ lệ đường bổ sung cao nhất, điều đó có vẻ như tỉ lệ đường bổ sung bằng với tỉ lệ đường tiêu thụ và do đó sự tích tụ lactate chủ yếu là do thiếu oxy. ORP tới hạn thay đổi nằm trong khoảng từ -100 mV ở nồng độ đường bổ sung là 28% đến -140 mV ở 12%. Những kết quả đó cho thấy sự thiếu oxy đã ảnh hưởng đến năng suất ở các tỉ lệ bổ sung đường cao. Đồ thị 2. 10 Ảnh hưởng của tỉ lệ đường bổ sung lên năng suất, thế oxy hóa ban đầu, lactate sinh ra [16]. Nồng độ đường bổ sung: , 12%; , 20%; ,28% ORP = thế oxy hóa ban đầu Bên cạnh đó, ảnh hưởng của lượng oxy cung cấp giới hạn lên các thông số khác nhau cũng được nghiên cứu. Oxy cung cấp được thay đổi bởi các tốc độ khuấy từ 450 rpm đến 700 rpm ở nồng độ đường bổ sung 25% và thổi khí 3 lít/phút. Trong đồ thị 2.10, năng suất lớn nhất tăng với việc tăng tốc độ khuấy. Mặc N ăn g su ất (g /l. h) Tỉ lệ đường bổ sung (g/l/h) Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 94 khác, cả nồng độ L-lysine và Yp/s giảm với việc tăng tỉ lệ pha loãng, ở những tốc độ khuấy thấp hơn, cả 2 đều giảm ở với tỉ lệ pha loãng thấp. Đồ thị 2. 11 Ảnh hưởng của khuấy đảo lên các thông số trạng thái ổn định [16]. Tốc độ khuấy: ∆, 450 rpm, 500 rpm; , 600 rpm; , 700 rpm. Nhằm xác định yếu tố giới hạn quá trình sản xuất L-lysine bằng phương pháp liên tục là do oxy cung cấp hay không, không khí giàu oxy được sử dụng trong quá trình sục khí. Việc sử dụng không khí chứa 29% oxy được so sánh với không khí chứa 21% oxy (không khí tự nhiên) ở nồng độ đường bổ sung là 25% và tốc độ khuấy là 500 rpm. Kết quả thể hiện ở đồ thị 2.11. Việc sử dụng không khí giàu oxy, ORP cho thấy giá trị cao hơn ở mỗi tỉ lệ pha loãng và năng suất cải thiện rõ rệt. Điều đó cũng cho thấy việc cung cấp đủ oxy là cần thiết để duy trì năng suất cao. N ăn g su ất (g /l. h) Tỉ lệ pha loãng (h -1) Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 95 . Đồ thị 2. 12 Ảnh hưởng của khí giàu oxy lên các thông số trạng thái ổn định [16]. Hàm lượng oxy trong không khí : , 29%; , 21% Nghiên cứu này cho thấy, chúng ta có thể thực hiện quá trình nuôi cấy liên tục một cấp ổn định và thành công. Nghiên cứu này cũng thu được năng suất và nồng độ L-lysine cao hơn, lần lượt là 5.6 g/l.h và 105 g/l. Chủng B-6 tích tụ 100 g/1 L-lysine-HCI sau 48 h bằng nuôi cấy fed-batch. Tuy nhiên, năng suất của nuôi cấy fed-batch không vượt quá 2.1 g/1.h (dữ liệu không thể hiện). Điều đó có nghĩa là năng suất của nuôi cấy liên tục cao hơn gấp 2.5 lần so với nuôi cấy fed-batch. Nuôi cấy liên tục mô tả trong nghiên cứu này cũng tạo điều kiện phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men liên tục L-lysine. Trong nuôi cấy liên tục, một vấn đề quan trọng chính là sự không ổn định của giống. Trong nghiên cứu này, sự không ổn định của giống B-6 có thể đã không xảy ra trong quá trình lên men L- N ăn g su ất (g /l. h) Tỉ lệ pha loãng (h -1) Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 96 lysine trong 400 h. Điều đó cho thấy sự ổn định của giống chủ yếu phụ thuộc vào đặc tính vốn có của nó. Một lý do cho sự ổn định của giống B-6 là sự sản xuất L- lysine hầu như giải phóng ra hoàn toàn từ sự điều hòa trao đổi chất bởi L-lysine (dữ liệu không thể hiện). Kết quả của nghiên cứu này cho thấy nuôi cấy liên tục không chỉ là một quá trình hiệu quả cho phân tích ở trạng thái ổn định trong phòng thí nghiệm, mà còn là một quá trình thực tiễn trong các nhà máy bởi năng suất cao và sự đơn giản của quá trình nuôi cấy [16]. 2.2.5. Nghiên cứu tổng hợp lysine bằng tế bào cố định: Năm 1989, Moncef Nari và cs đã nghiên cứu về sự sản xuất lysine bởi chủng C.glutamicum cố định. Giống Corynebacterium sp được thử nghiệm sản xuất Lysine bằng nuôi cấy theo mẻ với tế bào tự do và cố định với lượng vi sinh vật ban đầu 5x107 tế bào /ml, trong môi trường chứa 200 g/lít glucose. Một số kết quả thu được như sau: Khi giống nuôi cấy cấy ở dạng tự do, sự tích tụ lysine đạt được lần lượt là 42 và 46 g/lít L-lysine sau 72 và 96h. Trái lại, khi giống được nuôi cấy ở dạng cố định tạo ra được 60g/lít L-lysine sau 120h nuôi cấy. Hiệu suất sản xuất lysine, khi glucose thêm vào môi trường được tiêu thụ hoàn toàn, lần lượt là 23 và 30% khi nuôi cấy ở dạng tự do và cố định. Kết quả trên cho thấy quá trình cố định đã cải thiện quá trình sản xuất lysine. Số lượng tế bào trong gel tương ứng với số tế bào tự do. Nguyên nhân cho sự sinh trưởng chậm của Corynebacterium sp trong gel alginate là sự hạn chế oxy. Đối với các tế bào cố định, môi trường nuôi cấy cần bổ sung sung CaC12 để đảm bảo sự ổn định cơ học của các hạt gel. CaC12 có thể ảnh hưởng đến sự phát triển. Các kết quả thể hiện trong bảng 2.15, cho thấy rằng giống đã tích tụ 45 g/lít lysine khi không có CaC12, trong môi trường chứa 140 g/lít glucose, nhưng sự tích tụ giảm nhẹ bởi việc thêm vào CaC12. Trong hầu hết các trường hợp, sinh khối cuối cùng trong môi trường là giống nhau. Như vậy nồng độ CaC12 nằm trong khoảng từ 50 đến 200 mM có thể được bổ sung vào chế độ cố định mà không ảnh hưởng đến năng suất và sự phát triển của các tế bào cố định. Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 97 Bảng 2. 20 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 lên sinh khối và nồng độ L-lysine [24]. CaCl2 (mM) Glucose tiêu thụ Sinh khối (108) t=72h L-lysine HCl(g/l) Hiệu suất (%) 0 62.5 125 187.5 250 133 134 135 135 132 99 93 95 97 60 45 43 43 43 41 33.83 32.08 31.85 31.85 31.06 Lượng vi sinh vật ban đầu cũng ảnh hưởng đến năng suất tạo L-lysine. Các lần nuôi cấy được thực hiện với nhiều nồng độ khác nhau từ 107 đến 20.107 tế bào/ml trong môi trường chứa 200 g/1 glucose. Các kết quả thể hiện ở đồ thị 2.12 cho thấy, sau 72h nuôi cấy, sự tổng hợp L-lysine tăng theo lượng vi sinh vật cho vào ban đầu. Sau 120h, khi glucose thêm vào môi trường được tiêu thụ hoàn toàn, sự tổng hợp L-lysine duy trì không đổi khi tăng lượng tế bào. Hiệu suất sản xuất L- lysine (khoảng 33%) là giống nhau khi lượng tế bào sống từ 2,5 đến 20x107 tế bào bào/ml (Bảng 2.20 ). Bảng 2. 21 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu và thời gian lên men lên sự tổng hợp L-lysine bằng các tế bào C. glutamicum cố định [24]. Mật độ tế bào x 107/ml Glucose tiêu thụ (g/l) L- lysine (g/l) Hiệu suất (%) Glucose tiêu thụ (g/l) L- lysine (g/l) Hiệu suất (%) Glucose tiêu thụ (g/l) L- lysine (g/l) Hiệu suất (%) 72h 96h 120h 1 2.5 5 20 111 115 148 147 17 25 32.5 35 15.3 21.75 21.95 23.8 138 167 183 190 33 43 49.5 49.5 23.3 25.75 27 26 187 200 200 200 38 58.5 60 59.5 20.3 29.25 30 29.75 Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 98 Đồ thị 2. 13 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu lên sự tổng hợp L-lysine bằng các tế bào C.Glutamicum cố định [24]. Các kết quả thể hiện trong bảng 2.16 và đồ thị 2.12 cho thấy rằng sự tổng hợp L-lysine và hiệu suất tăng khi tăng thời gian nuôi cấy. Chẳng hạn như, với mật độ ban đầu là 2,5x107 tế bào/ml, khoảng 25 g/lít L-lysine được tạo ra (hiệu suất 21,73%). Sau 96h đạt tới 43 g/lít, và sau 120h là 58,5 g/lít L-lysine ( hiệu suất 29,25% ) khi glucose thêm vào môi trường được tiêu thụ hoàn toàn.Với các tế bào tự do, glucose được tiêu thụ hoàn toàn sau 96h, trong khi các tế bào bòa cố định là 120h. Hai điều lý giải cho việc tăng thời gian nuôi cấy có thể là: bởi vì sự khuếch tán hạn chế của oxy và các chất dinh dưỡng vào bên trong các hạt gel [29]; và gradient của tốc độ phát triển (gradient số lượng tế bào sống cố định) gây ra những hạn chế về khuếch tán. Thật sự, việc cung cấp đầy đủ oxy để thỏa mãn nhu cầu oxy của các tế bào là cần thiết để quá trình sản xuất L-lysine [14]. Sau khi kéo dài thời gian nuôi cấy hạt gel mất sự bền cơ học và do đó hình dạng và đường kính các hạt gel bị biến đổi. Sự ổn định của các hạt gel có thể được cải thiện bằng cách tăng nồng độ gel và ion canxi [12]. Nồng độ ion canxi được duy trì ở 100 mM, sự tăng nồng độ alginate làm giảm hàm lượng L-lysine và sự thất thoát tế bào. Những kết quả này có thể được giải thích là những nồng độ gel thấp sẽ làm giảm tối thiểu sự giới hạn trong vận chuyển vật chất và tối đa cho sự tạo thành sinh khối. Tốc độ tiêu thụ oxy của các vi sinh vật cố định giảm khi tăng nồng độ gel alginate [14]. Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan 99 Những kết quả đạt được ở đây cho thấy L-lysine có thể sản xuất hiệu quả bằng các tế bào Corynebacterium sp cố định. Bằng cách so sánh với những kết quả đạt được với tế bào tự do cho thấy có sự cải thiện nhỏ về sự tạo thành L-lysine bằng các tế bào cố định. Những ưu điểm đạt được khi sử dụng phương pháp cố định tế bào là: sử dụng lượng tế bào ban đầu nhỏ (so sánh với các tế bào tự do); giảm sự tạp nhiễm. Tế bào cố định phát triển gần bề mặt các hạt gel, nơi chúng tạo các khuẩn lạc [14,31]. Bởi vì tính chất cơ học của các hạt gel, nó cho phép một lượng giới hạn sự phân chia tế bào trong các lỗ trống [26], các tế bào Corynebacterium có thể được bảo vệ một phần khỏi sự cạnh tranh với các tế bào tạp nhiễm khi sự rửa trôi tế bào do các tế bào được bẫy không quá thừa. Hơn nữa, phương pháp này cho thấy để tăng tính ổn định plasmid một cách đáng kể cho khoảng thời gian nuôi cấy dài hơn [26, 27], và hiện tượng đó như là những sự biến động hoặc sự thay đổi di truyền, nó xảy ra sau quá trình nuôi cấy kéo dài của vi khuẩn trong nuôi cấy liên tục sử dụng tế bào tự do có thể tránh được thông việc cố định tế bào. Tuy nhiên, bởi vì sự giới hạn truyền khối, việc cung cấp oxy cũng như các chất dinh dưỡng cho các tế bào hiếu khí cố định (như là Brevibacterium flavum) và với các tế bào bào hiếu khí không bắt buộc (Corynebacterium glutamicum) thường trở thành một hạn chế trong việc sử dụng hiệu suất quả các tế bào này. Để giải quyết vấn đề này, cần thiết để xác định ảnh hưởng của kích thước hạt và sự cung cấp oxy lên tốc độ phản ứng. Việc làm các hạt nhỏ hơn, sẽ làm giảm đến mức thấp nhất các hạn chế truyền khối [24]. Chương 3:Kết luận 100 CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN Trên thế giới, với tốc độ tăng trưởng trên thị trường đã được dự báo rằng nhu cầu sử dụng L-lysine sẽ tiếp tục tăng, do đó sự cạnh tranh ngày càng mạnh mẽ để chia sẽ thị trường. Sự phát triển các giống sản xuất công nghiệp, bao gồm kĩ thuật quá trình chuyển hóa, kĩ thuật gen sẽ tiếp tục là chìa khóa để phát triển cạnh tranh, trong đó kĩ thuật về đột biến gen sẽ phát triển từ các đột biến ngẫu nhiên sang các đột biến xác định. Hiện nay, các nghiên cứu về cải thiện giống đã đạt được những kết quả như mong muốn, tạo ra được giống siêu sản xuất L-lysine. Bên cạnh đó các nghiên cứu theo hướng phát triển và tối ưu hóa qui trình công nghệ vẫn được tiếp tục thực hiện do sự tác động chặt chẽ giữa việc cải thiện giống và kĩ thuật nuôi cấy trong việc nâng cao quy mô sản xuất. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có cơ sở sản xuất L-lysine mà vẫn phải nhập L- lysine từ nước ngòai dưới dạng thuốc uống hoặc các dạng tồn tại của lysine. Đây có thể nói là một sự bỏ phí rất tiếc và sự kém phát triển của Việt Nam trên con đường ứng dụng thành tựu khoa học vào sản xuất. Ta có thể mua giống đã cải tạo để ứng dụng lên men thu nhận lysine hoặc có thể tự xây dựng giống Corynebacterium glutamicum siêu tổng hợp lysine từ chủng hoang dại hay cải tạo giống khác trên cơ sở kiến thức đã được công bố và được tìm hiểu rất sâu sắc. Bên cạnh những nghiên cứu nâng cao hiệu quả thu nhận lysine cần tập trung nghiên cứu và hoàn thiện quy trình sản xuất L-lysine, để triển khai xây dựng các nhà máy sản xuất L-lysine với chất lượng cao, giá thành hạ. Mặc dù đã có nhiều cố gắng trong việc thực hiện Đề tài này nhưng do thời gian có hạn và sự hiểu biết còn hạn chế nên nội dung Đồ án còn một số thiếu sót. Với ý nghĩa khoa học và kinh tế của Đề tài hy vọng rằng Đề tài này sẽ được tiếp tục tìm hiểu và phân tích sâu hơn trong Luận Văn Tốt Nghiệp. 101 Tài liệu tham khảo Tài liệu trong nước 1. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005). Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. 2. Nguyễn Đức Lượng (2006). Công nghệ vi sinh, Tập 2-Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP.Hồ Chí Minh. 3. Nguyễn Đức Lượng và cs.( 2006). Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Đức Lượng (2007). Công nghệ gen. Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 5. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên (1998). Giáo trình sinh hóa hiện đại. Nhà xuất bản giáo dục. 6. Nguyễn Thùy Châu, Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh hiện đại để sản xuất chế phẩm acid amin và enzyme từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp và hải sản ở quy mô bán công nghiệp, Đề tài KHCN cấp nhà nước, Hà nội, (2006): 154 -165. 7. Nguyễn Thuý Hương (2008), Một số ứng dụng của cellulose vi khuẩn trong lĩnh vực thực phẩm, Tạp chí sinh học, 30 (1): 62 -69. 8. Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị Minh Tâm (2009), “Ứng dụng vi khuẩn Corynebacterium sp. cố định trong lên men thu nhận L-lysine”, Tạp chí khoa học và công nghệ các trường đại học kỹ thuật, Số 70, trang 96 -100. 9. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006). Công nghệ chuyển gen (Động vật và Thực vật). Nhà xuất bản Huế. Tài liệu nước ngoài 10. A.A.de Graaf, L.Eggeling, H.Sahm (2001). Metabolic Engineering for Llysine Production by Corynebacterium glutamicum. Biotechnology, vol.73, 10-29 11. Akashi, K., Shibai, H. and Hirose, Y. (1979), Agric. Biol. Chem., 43, 2087- 2092. 12. Cheetham, P.S.J., Blunt, K.W. and Bucke, C. (1979), Biotechnoi. Bioeng., 21, 2155-2168. 102 13. De Hollander JJ, Eswilder R, and Noordover JAC. (1998) Amino Acid Fermentation Process. U.S. Patent No. 5,763,230 . 14. Eikmeier H., Westmeier F. and Rehm H.J. (1984), Appl. Microbiol. Biotechnol., 19, 53-57. 15. Gordon F. Bickertaff, (1997). Immobilization of enzymes and cells, Humana Press Inc, New Jersey. 16. Hirao T, Nakano T, Azuma T, Sugimoto M, and Nakanishi T. (1989) L- lysine production in continuous culture of an L-lysine hyperproducing mutant of Corynebacterium glutamicum. Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:269–273. 17. Junko Ohnishi and Masato Ikeda (2006). Comparisons of Potential for L- Lysine Production among Different Corynebacterium glutamicum strains. Biosci.Biotechnol. Biochem.,70 (4), 1017-1020. 18. Judith Becker, Corinna Klopprogge, Oskar Zelder, Elmar Heimzle and Christoph Wittmann (2005). Amplified Expression of Fructose 1,6- Biophosphatase in Corynebacterium Glutamicum Increase In Vivo Flux through the Pentose phosphate Pathway and Lysine Production on Different Carbon Sources. American Society for Microbiology. 71:8587-8596. 19. Kawahara Y, Yoshihara Y, Ikeda S, Yoshii H, and Hirose Y. (1990) Stimulatory effect of glycine betaine on L-lysine fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 34:87–90. 20. Liaw, H.J., Eddington, J., Yang, Y., Dancey, R., Swisher, S., Mao,W.: (2006). US20066984512. 21. Lothar Eggeling and Michael Bott (2005). Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, the United States of America. 22. Masato Ikeda (2003) ,amino acid production process . Advances in Biochemical Engineering, Biotechnology,Vol. 79. 23. Mikiro Hayashi, et al (2006). Transcription anlysis Reveals Global Expression Changes in an Industrial L-lysine Producer of Corynebacterium glutamicum. Biosci. Biotechnol. Biochem.,70 (2), 546-550. 24. Moncef nasri, Abdelhafidh dhouib, Fathi zorguani, Habib kriaa,Radouan ellouz.( 1989) Production of lysine by using immobilized living Corynebacterium sp cells . Biotechnology Letters . 11: 865-870. 103 25. Nakamura T, Nakayama T, Koyama Y, Shimazaki K, Miwa H, Tsuruta M, TamuraY, and Tosaka O. (2000) Process for production of lysine by fermentation. U.S. Patent No. 6,025,169. 26. Nasri, M., Sayadi, S., Barbotin, J.N. and Thomas, D. (1987b). J Biotechnol. 6, 147-157. 27. Nasri, M., Sayadi, S., Barbotin, J.N., Dhulster, P. and Thomas, D. (1987a). Appl. Environ. Microbiol. 53,740-744. 28. Oh, J. W., Kim, S.J., Cho, Y.J., Park, N. H., Lee, J.H.: US5268293(1993). 29. Rodovich, J.M. (1985). Biotech. Advs. 3, 1-12 . 30. Savas Anastassiadis (2007). L-Lysine Fermentation. Biotechnology, 1, 11- 24. 31. Shinmyo, A., Kimura, H. and Okada, H. (1982). Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 14, 7-12. 32. Shuichi Ishino, et al (1984). Involvement of meso-a,e- Diaminopimelate D- Dehydrogenase in Lysine Biosynthesis in Corynebacterium glutamicum. Agric. Biol. Chem, 48 (10), 2557-2560. 33. Shuichi Ishino, et al (1988). Cloningand Sequencing of the meso- Diaminopimelate-D-dehydrogenase (ddh) Gene of Corynebacterium glutamicum. Agric. Biol. Chem, 52 (11), 2903-2909. 34. Walter Pfefferle, et al (2003). Biotechnological Manufacture of Lysine. Biotechnology, Vol. 79, 60-112. 35. Yoshiya Gunji, et al (2004). Characterization of the L-lysine Biosynthetic Pathway in the Obligate Methylotroph Methylophilus methylotrophus. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68 (7), 1449-1460. 36. Yoshiya Gunji, et al (2006). Characterization of a Unique Murant lysE Genne, Originating from Corynebacterium glutamicum, Encoding a Product That Induces L-lysine Production in Methylophilus methylotrophus. Biosci. Biotechnol. Biochem.,70 (12), 2927-2934. Địa chỉ trang web 37. www.anabol.com. 38. www.baigiang.bachkim.vn. 104 39. www.lakewoodconferences.com. 40. www.wellbasics.com. 41. www.wikipatents.com/US-Patent-4123329