Luận văn Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú

rose 0,8% và đo nồng độ ADN bằng máy NanoDrop. 22 - Mẫu ADN sau khi được tách chiết được bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.2. Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR đa mồi phục vụ mục đích định lượng 2.2.2.1. Phân tích HPLC với các ADN chuẩn 100 bp, 200 bp và 400 bp - Phân tích HPLC với ADN chuẩn 100 bp, 200bp và 400 bp để lựa chọn kích thước sản phẩm cần thiết kế cho phản ứng PCR đa mồi. - Nước sử dụng trong phân tích HPLC là nước khử ion. - Thành phần các hóa chất sử dụng trong phân tích HPLC (bảng 2) Bảng 2: Thành phần hóa chất sử dụng trong phân tích HPLC Hóa chất Thành phần TEAA 1M Triethylamin 1M +acid acetic 1M Đệm A TEAA 0,1M + EDTA 0,1mM, pH 7,0 Đệm B TEAA 0,1M + acetonitrile 50% + EDTA 0,1mM, pH 7,8 Dung dịch bảo quản Acetonitrile 50% - Chương trình Phân tích HPLC được thực hiện theo các bước sau (Hình 3) Hình 3- Chương trình phân tích HPLC - Loại cột: HotSep PLRP-S: S-167-1010, 5µ- 1000Å, - Kích thước cột: đường kính 1.0 mm, dài 10 cm. - Tốc độ dòng 20 µl/ phút. - Nhiệt độ buồng cột: 50oC - Đo ở bước sóng 260nm. 23 2.2.2.2. Thiết kế các cặp primer Để định lượng số bản sao mtADN chúng tôi thiết kế hai cặp primer cho phản ứng PCR đa mồi để tạo sản phẩm cho các phương pháp định lượng sau đó. Với mục đích định lượng số bản sao của mtADN, chúng tôi chọn gen giữ nhà trong nhân là gen β-actin (ACTB) và đoạn gen đặc trưng cho tính bảo thủ của mtADN được lựa chọn là ở vùng gen ND1– mã hóa cho 1 tiểu phần của Ubiquinon trong phức hệ 1 của chuỗi hô hấp của ti thể. Ngoài ra, để quá trình phân tích và định lượng bằng HPLC được tiến hành thuận lợi, các đoạn ADN (sản phẩm PCR định lượng) phải được lựa chọn sao cho có sự khác biệt nhất định về kích thước. Các cặp primer được thiết kế dựa trên các trình tự gen được tham khảo trên cơ sở dữ liệu NCBI (gen β-actin: NG_007992.1; mtDNA: NC_012920.1) và phần mềm thiết kế Primer-BLAST (NCBI). Khuếch đại đoạn gen mt và gen ACTB bằng phương pháp PCR - Đoạn gen mt và ACTB được khuếch đại bằng phương pháp PCR với thể tích 12,5 µl nhằm kiểm tra cặp mồi có nhân sản phẩm đúng kích thước không. - Phản ứng PCR với từng cặp primer mt và ACTB gồm các thành phần trong bảng 3. Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích Nồng độ cuối cùng Phản ứng 12,5 µl Phản ứng 100 µl Master mix Maxima 2X 6,25µl 50 µl 1X Primer F (10-5M) 0,25µl 2 µl 0,2 µM Primer R (10-5M) 0,25 µl 2 µl 0,2 µM ADN khuôn Tùy nồng độ ADN tổng số của mẫu 1 ng H2O siêu sạch Bổ sung đủ 12,5 µl Bổ sung đủ 100 µl 24 Chu trình nhiệt được thiết lập như sau (Hình 2.2.2.3) Hình 4- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn gen mt và ACTB Khuếch đại đoạn gen ti thể mt và đoạn gen nhân ACTB bằng phương pháp PCR đa mồi - Khuếch đại bằng phản ứng PCR đoạn gen mt và ACTB với thể tích 15 µl gồm các thành phần như trong bảng 4. Bảng 4. Thành phần phản ứng PCR (thể tích 15 µl) Thành phần Thể tích Nồng độ cuối cùng Master mix Maxima 2X 7,5µl 1X Primer mt-F (10-5M) 0,3 µl 0,2 µM Primer mt-R (10-5M) 0,3 µl 0,2 µM Primer ACTB-F (10-5M) 0.3 µl 0,2 µM Primer ACTB-R (10-5M) 0.3 µl 0,2 µM ADN khuôn Tùy nồng độ ADN tổng số của mẫu 2 ng H2O siêu sạch Bổ sung đủ 15 µl Chu trình nhiệt được thiết lập như ở hình 4 ở trên. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di Trong đệm TBE (pH 7,5 - 8.3), các phân tử acid nucleic tích điện âm nên dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử này sẽ chuyển động từ cực âm sang cực dương. Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích 25 thước phân tử acid nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di. Gel điện di thường sử dụng là agarose và polyacrylamide. Tùy vào kích thước đoạn ADN muốn phân tách người ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ khác nhau. Kích thước sản phẩm PCR đoạn gen mt là 433 bp và đoạn gen ACTB là 107 bp, nên có thể phân tích bằng điện di trên gel agarose 1.7%. 2.2.2.3. Nhân dòng đoạn gen mt và ACTB và giải trình tự ADN Các đoạn ADN tinh sạch được nhân dòng để giải trình tự nhằm xác định trình tự của các đoạn gen. - Tiến hành tạo đầu bằng và biến nạp đoạn mt và ACTB bằng kit CloneJET PCR Cloning Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất (vectơ được sử dụng là pJET 1.2 có kích thước 2974bp. Vị trí đa điểm của vector được thiết kế nằm trong gen mã hóa cho một protein gây độc cho vi khuẩn). - Vectơ được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. - Các tế bào sau biến nạp thành công sẽ mọc trên môi trường LB đặc có chứa ampicillin. - Các khuẩn lạc sau khi được kiểm tra đúng bằng PCR sẽ được nuôi với thể tích lớn 5ml trong môi trường LB có chứa ampicillin ở 37oC trong 14-16h lắc 200 vòng /phút. - Sau đó các tế bào được thu và tách plasmid bằng QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). - Kiểm tra plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8% và đo nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ Nanodrop. - Plasmid thu được sẽ được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi mt, ACTB và pJET, nếu đúng sẽ cho đoạn gen có kích thước tương ứng với các cặp mồi và với mồi PJet sẽ cho đoạn gen lớn hơn 120bp so với kích thước của các đoạn gen tương ứng. - Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1,7%. - Mẫu plasmid sau khi tinh sạch sẽ được giải trình tự ADN. 26 2.2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR Plasmid sau khi dược khuếch đại với thể tích lớn 100 µl sẽ được tinh sạch bằng kit thôi gel QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN, Đức) - Kiểm tra ADN tinh sạch bằng điện di trên gel agarose 1.5 % và đo nồng độ ADN bằng máy NanoDrop. Mẫu ADN sau khi tinh sạch được bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.3. Định lượng ADN bằng HPLC và phần mềm ImageJ 2.2.3.1. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR đa mồi mt_ACTB để phục vụ mục đích định lượng: Theo lý thuyết PCR, số bản sao đoạn gen sẽ tăng theo chu kỳ, tuy nhiên với số chu kỳ lớn hơn 40 thì sản phẩm đạt đến tình trạng bão hòa. Điều này được giải thích với các nguyên nhân chủ yếu như: nồng độ bản sao DNA tăng khiến cho lượng dNTP không đủ cung cấp; hoạt tính enzyme polymerase giảm sau nhiều chu trình thay đổi nhiệt độ. Vì vậy, việc xác định các chu kỳ mà tại đó sản phẩm PCR vẫn đang thay đổi tuyến tính mang tính quyết định tới độ chính xác của kết quả định lượng sau này. Đặc biệt là đối với phản ứng PCR đa mồi còn có cả sự cạnh tranh dNTP, enzyme polymerase và không loại trừ khả năng bắt cặp giữa các cặp mồi. Chính vì vậy, dựa vào các kết quả PCR đơn và đa mồi phía trên, chúng tôi tiến hành tìm các chu kỳ cho PCR đa mồi mà ở đó lượng sản phẩm vẫn đang biến đổi tuyến tính. Tiến hành PCR ở các chu kì khác nhau 20, 25, 30, 35 chu kì để chọn được chu kì PCR phù hợp (nằm trong khoảng tuyến tính). 2.2.3.2 Kiểm tra sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB bằng điện di Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 10% (bảng 2.2.4.2). Điện di bằng đệm TBE 1X (pH 7,5 - 8,3) ở 175 V trong 40 phút. Sau đó được nhuộm bạc và quan sát dưới ánh sáng trắng. 27 Bảng 5. Công thức đổ gel polyacrylamide 10% bản 7cm 2.2.3.3 Kỹ thuật nhuộm bạc Bản gel sau điện di trên gel polyacrylamid được nhuộm bạc dựa trên phương pháp của Bassam (1991) [3] gồm các bước sau: - Cố định bản gel bằng dung dịch acid acetic 7,5% lắc bằng máy lắc trong 20 phút. - Rửa bằng nước cất ba lần, mỗi lần 5 phút. - Nhuộm bằng dung dịch bạc nitrat trong 20 - 30 phút, lắc đều, tránh ánh sáng. - Rửa nước khoảng 30 giây - 1 phút. - Hiện băng bằng dung dịch develop (30g/L Na2CO3, 0,056% formaldehyde, 400 µg/L natri thiosulfate) trong 3- 5 phút. - Dừng phản ứng bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 1 – 2 phút. - Bảo quản gel bằng nước cất, quan sát kết quả bằng ánh sáng trắng. 2.2.3.4. Định lượng số bản sao ADN ti thể bằng HPLC - Các mẫu sau khi PCR được li tâm với tốc độ 13000v/phút ở 5oC trong 15 phút để chuẩn bị phân tích bằng HPLC. - Nước sử dụng trong quá trình chạy HPLC là nước khử ion. - Thành phần các hóa chất chạy HPLC ở bảng 2 - Mẫu chạy HPLC gồm 9 µl sản phẩm PCR đã li tâm, bổ sung 1 µl TEAA 1M ph7. - Mỗi lần phân tích HPLC, cài chương trình cho bộ phận bơm mẫu tự động hút 3 µl mẫu. - Các mẫu được phân tích theo chương trình như Hình 3 Thành phần Gel 10% bản 7cm Monoacrylamide 20% 1,65ml TBE 1X 3.3ml APS 37,5µl TEMED 3µl 28 - Dựng đường chuẩn với các đoạn ACTB và mt tinh sạch. - Tiến hành phân tích HPLC các mẫu PCR. - Sau khi thực hiện xong ta sẽ có hình các đỉnh sắc ký, đựa vào phần phân tích của phần mềm LC solution kết nối với hệ thống HPLC ta sẽ tính được diện tích của các đỉnh sắc ký. - Số lượng bản sao ADN ti thể (giá trị tương đối) có thể tính toán dựa theo công thức: n= k. a/b Trong đó: k: tỉ số nồng độ các cặp mồi ACTB/mt a: diện tích đỉnh của sản phẩm mt b: diện tích đỉnh của sản phẩm ACTB 2.2.3.5. Định lượng số bản sao ADN ti thể bằng phần mềm phân tích hình ảnh gel điện di: - ImageJ là phần mềm miễn phí, mã nguồn mở được sử dụng cho phân tích hình ảnh gel điện di. Phần mềm cho phép phân tích lượng ADN của các băng điện di thông qua việc xác định mật độ điểm ảnh (densitometry) của các vùng được lựa chọn phân tích của các mẫu. - 2 µl các mẫu PCR được chạy điện di trên gel polyacrylamide 10%, 175V trong 40 phút và nhuộm bạc. - Bản gel sẽ được scan để lấy hình ảnh sử dụng phân tích. 2.2.4. Tính toán thống kê Số liệu xử lí và phân tích thống kê bằng Microsoft Excel và phần mềm SPSS. So sánh tỷ số mt/ACTB giữa các mẫu mô khác nhau và phân tích mối liên quan với các đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú bằng kiểm định test Mann-Whitney và test Kruskal-Wallis. 29 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MÔ Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết thành công ADN tổng số từ 46 mô u và lân cận u của bệnh nhân ung thư vú và 20 mẫu máu và mô của bệnh nhân u xơ vú. Kết quả tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 5). Hình 5- Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ các mẫu nghiên cứu (điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium bromide) Các giếng 1-6: ADN tách ở bệnh nhân u xơ; các giếng 7-12: ADN tách ở bệnh nhân ung thư vú. 2 giếng liên tiếp 1-2, 3-4, 5-6; theo thứ tự là mẫu máu và mô của bệnh nhân u xơ: 7-8, 9-10,11-12 theo thứ tự là mẫu mô lân cận u và mô u của cùng bệnh nhân. Kết quả điện di cho thấy ADN tổng số tách chiết thu được khá sạch, chất lượng tương đối tốt, các băng thu được khá sắc nét và ít bị đứt gẫy. Do đó, ADN tách chiết đảm bảo chất lượng để làm khuôn cho phản ứng tiếp theo. Độ sáng của các băng là khác nhau khá nhiều, có băng rất đậm như giếng 2, có băng mờ như giếng 3, chứng tỏ hàm lượng ADN có trong sản phẩm tách chiết của các mẫu khác nhau là khác nhau. Đối với mẫu máu và mẫu mô u xơ lấy từ cùng một bệnh nhân có thể thấy rằng lượng ADN tách từ mẫu mô u xơ nhiều hơn ADN tách từ mẫu máu. 30 Đối với mẫu mô lân cận u và mẫu mô u lấy từ cùng một bệnh nhân, có thể thấy rằng lượng ADN tách từ mẫu mô u nhiều hơn ADN tách từ mẫu mô lân cận u, dù lượng mẫu ban đầu dùng để tách là tương đương. Điều này có thể do ở mẫu bệnh, phần khối u có sự tăng sinh của tế bào nhiều hơn nên có lượng vật chất di truyền lớn hơn, do đó, cùng một khối lượng mô đem tách ADN lại thu được lượng ADN ở mẫu bệnh nhiều hơn. 3.2. THIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER CHO PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI 3.2.1. Kết quả phân tích HPLC với các ADN chuẩn 100 bp, 200 bp và 400 bp Chúng tôi tiến hành phân tích HPLC với các cặp ADN chuẩn 100_400bp và 200_400 bp để đánh giá sự phân tách của cột và thu được kết quả ở Hình 6 Hình 6 - Kết quả phân tích HPLC với ADN chuẩn 100_200bp và 200_400bp A- ADN chuẩn 100_400bp; B- ADN chuẩn 200_400bp Qua kết quả trên cho thấy ADN chuẩn 100_400bp phân tách đỉnh rõ ràng, ADN chuẩn 200_400bp có tách đỉnh nhưng bị chung nhau phần chân. Để dễ dàng cho việc phân tích định lượng thì phân tích ADN chuẩn 100bp_400bp sẽ cho kết quả chính xác hơn. Do đó chúng tôi thiết kế các cặp primer cho sản phẩm là các đoạn ADN có kích thước khoảng 100bp và 400bp. 31 3.2.2. Kết quả thiết kế các cặp primer Sử dụng phần mềm Primer-BLAST và các trình tự tham khảo NCBI, kết hợp với kết quả phân tích HPLC với các ADN chuẩn 100bp, 200bp và 400bp ở trên, chúng tôi đã thiết kế hai cặp primer cho sản phẩm đoạn gen mt là 433 bp và đoạn gen ACTB là 107 bp có các trình tự như sau: - Primer mt (kích thước sản phẩm 433 bp)  Mồi xuôi mt-F: 5’- GAC GCC ATA AAA CTC TTC AC - 3’  Mồi ngược mt-R: 5’- GGT TGG TCT CTG CTA GTG TG- 3’ - Primer ACTB (kích thước sản phẩm 107 bp)  Mồi xuôi ACTB-F: 5’- ACG GCA GAA GAG AGA ACC A - 3’  Mồi ngược ACTB-R: 5’- GAG AAG ATG ACC CAG GTG AGT - 3’ Bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi đã nhân thành công đoạn gen ti thể mt-ND1 kích thước tương đương 433bp (mt) và đoạn gen nhân β-actin 107bp (ACTB). Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,7% (Hình 7) Tiếp tục tiến hành PCR đa mồi hai đoạn mt và ACTB chúng tôi đã thu được sản phẩm PCR có hai băng tương ứng. Sản phẩm được kiểm tra trên gel 1.7% (giếng 4 Hình 7) Hình 7- Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn mt và ACTB trên gel agarose 1,7% Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp; giếng 2: sản phẩm PCR đoạn gen ACTB kích thước khoảng 107 bp Giếng 3: sản phẩm PCR đoạn gen mt kích thước khoảng 433bp; Giếng 4: sản phẩm PCR đa mồi gen ACTB và mt. 32 Từ kết quả PCR đa mồi, hai băng mt và ACTB thu được sáng và rõ ràng, chúng tôi quyết định sử dụng cặp băng trên để tiến hành quá trình định lượng mtADN. 3.2.3. Kết quả nhân dòng và giải trình tự Tế bào khả biến được biến nạp và cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có bổ sung ampicillin để qua đêm ở tủ ấm 37oC. Những tế bào biến nạp thành công (có chứa plasmid) sẽ phát triển và mọc thành khuẩn lạc, những tế bào không chứa plasmid sẽ chết và không phát triển. (Hình 10) Hình 10- Hình ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid được biến nạp vào tế bào E.coli DH5α. Đĩa 1 khuẩn lạc biến nạp đoạn gen mt, đĩa 2 khuẩn lạc biến nạp đoạn gen ACTB Các đĩa đều mọc khuẩn lạc, chứng tỏ biến nạp đã thành công, các khuẩn lạc tròn rõ ràng, không có dấu hiệu nhiễm. 3.2.3.1. Kết quả tách plasmid Sau khi kiểm tra khuẩn lạc có chứa đoạn gen mong muốn bằng phương pháp PCR với cặp mồi ACTB và mt, các tế bào khuẩn lạc đó được muôi cấy với thể tích 5ml để tách plasmid bằng kit QIA prep Miniprep kit. Plamid được điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 11) Qua hình ảnh điện di ta thấy các băng plasmid tương đối sáng, khá gọn chứng tỏ hàm lượng ADN trong mẫu khá cao và sạch, đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 33 Hình 11- Hình ảnh điện di sau khi tách plasmid. Giếng 1 ADN chuẩn 1kb, Giếng 2 plasmid mt, giếng 3 plasmid ACTB 3.2.3.2. Kết quả PCR kiểm tra plasmid tinh sạch Sau khi tinh sạch, các plasmid được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi ACTB, mt và PJet. Các cặp mồi ACTB và mt sẽ nhân được các đoạn gen tương ứng khoảng 107bp và 433bp, còn cặp mồi PJet ngoài nhân đoạn gen ACTB và mt mà plasmid đó chứa còn nhân thêm một đoạn 120bp của vectơ PJet 1.5, đo đó các plasmid chứa đoạn gen ACTB và mt sẽ có kích thước tương ứng khoảng 227bp và 553 bp. Sản phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel agrose 1.7% (Hình 12) Hình 12- Hình ảnh điện di sản phẩm PCR plasmid mt và ACTB. Giếng 1 ADN chuẩn 100 bp; giếng 2,3 lần lượt là sản phẩm PCR plasmid ACTB với cặp mồi ACTB và PJet; giếng 4, 5 lần lượt là sản phẩm PCR plasmid mt với cặp mồi ACTB và PJet. 34 Kết quả điện di cho các băng tương ứng với dự đoán, như vậy các plasmid tinh sạch chứa đúng đoạn gen mong muốn đã biến nạp. Plasmid tinh sạch được đo nồng độ ADN và chuẩn bị cho việc giải trình tự. 3.2.3.3. Kết quả giải trình tự Sử dụng phần mềm BioEdit, phần mềm Sequence Scanner 1.0 để phân tích kết quả giải trình tự. Sau đó sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự thu được với trình tự ADN chuẩn của ti thể (hình 13) và gen β_actin (hình 14) đã được công bố trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi đã xác định được kích thước và trình tự đoạn gen mt và ACTB đúng với đoạn trình tự tham khảo và có kích thước tương ứng là 433 và 107 bp. Hình 13- Kết quả giải trình tự plasmid có chứa đoạn mt 35 Hình 14- Kết quả giải trình tự plasmid có chứa đoạn ACTB Các trình tự trên phù hợp với trình tham khảo, như vậy chúng tôi đã thiết kế được đúng các cặp mồi và nhân được đoạn gen quan tâm nhằm phục vụ mục đích định lượng số lượng bản sao mtADN. 3.2.4. Tinh sạch ADN Sử dụng khuôn là các plasmid mang đoạn gen ACTB và mt đã được tinh sạch, các đoạn gen ACTB và mt được nhân lên bằng PCR với thể tích 100 µl. ADN được tinh sạch, đo nồng độ ADN bằng máy nanodrop, điều chỉnh để có nồng độ ADN 50 ng/µl phục vụ cho việc xây dựng đường chuẩn phân tích HPLC. 3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG SỐ BẢN SAO ADN TI THỂ 3.3.1. Kết quả tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR đa mồi Tiến hành PCR đa mồi ở các chu kì thứ 25, 28, 30, 35, kiểm tra sản phẩm bằng gel polyacrylamide 10%, nhuộm bạc (Hình 8). 36 Hình 8- Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi ở các chu kì khác nhau trên gel polyacrylamide 10%, nhuộm bạc. Giếng 1,2,3,4 và giếng 5,6,7,8:lần lượt là sản phẩm PCR đa mồi gen mt_ACTB ở các chu kì 20,25,30 và 35 chu kì của hai bệnh nhân ung thư khác nhau. Qua quan sát các sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB ở các chu kì trên ta thấy, ở 20 chu kì chỉ thấy sản phẩm của băng mt, băng ACTB gần như không xuất hiện. ở 30 và 35 chu kì thì sản phẩm gần như đã bão hòa tương đương nhau (không có sự cách biệt rõ ràng). Trong khoảng 25-30 chu kì, sự thay đổi lượng sản phẩm tăng rõ ràng, vì vậy, chu kì ở giữa là chu kì 28 được lựa chọn để tiến hành các phản ứng PCR đa mồi sử dụng trong định lượng. 3.3.2. Kết quả PCR đa mồi Các mẫu nghiên cứu được tiến hành PCR đa mồi ở chu kì thứ 28 để chuẩn bị cho các khâu định lượng bằng HPLC và phần mềm ImageJ, sản phẩm được điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc (Hình 9) 37 Hình 9- Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB ở 28 chu kì của các mẫu khác nhau. Giếng 1,2 và 3,4 lần lượt là sản phẩm của mẫu máu và mô bệnh nhân u xơ, giếng 5: thang chuẩn ADN 100bp; giếng 6, 7 và 8, 9 lần lượt là sản phẩm của mẫu mô lân cận u và mô u của bệnh nhân ung thư vú. Các mẫu đều có cả hai băng ở chu kì 28, phù hợp để tiến hành các phân tích tiếp theo định lượng bằng HPLC và ImageJ. 3.3.3. Kết quả phân tích HPLC 3.3.3.1. Xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn với ADN chuẩn 100bp và 400bp Các mẫu ADN chuẩn 100bp và 400bp được sử dụng để dựng đường chuẩn. Các mẫu được phân tích với tỉ số ADN chuẩn 400bp/100bp theo hàm lượng ADN khác nhau. Các mẫu được chạy 2 lần và thu được kết quả phân tích HPLC theo tỷ số diện tích đỉnh trung bình (Bảng 6) 38 Bảng 6- Số liệu phân tích HPLC với các mẫu có tỉ số hàm lượng ADN chuẩn 400bp/100bp khác nhau Tỉ số hàm lượng ADN 400bp/100bp 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1 Tỷ số diện tích đỉnh ADN 400bp/100bp 0,096 0,302 0,488 0,683 0,891 0.985 Tỉ số hàm lượng ADN 400bp/100bp 2 3 4 5 6 Tỷ số diện tích đỉnh ADN 400bp/100bp 2,037 3,062 4,153 5,113 6,102 A B Hình 15- Hình ảnh phân tích HPLC và biểu đồ đường chuẩn tỉ số hàm lượng ADN chuẩn 400bp/100bp A- Hình ảnh phân tích HPLC với tỉ số hàm lượng ADN 400bp/100bp 0.1; 0,3; 0,7; 1; 3; 6 B- Biểu đồ đường chuẩn tỉ số hàm lượng ADN mt/ACTB Từ kết quả xây dựng đường chuẩn với ADN chuẩn 100bp và 400 bp cho thấy đã thu được 1 đường thẳng tuyến tính về sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích đỉnh 400b/100bp vào tỷ số hàm lượng ADN chuẩn tương ứng. Hệ số tương quan tuyến tính cao (R2 = 0,9998). Như vậy, với tỷ số hàm lượng ADN 400bp/100bp biến đổi 39 từ 0,1 đến 6,0 là phù hợp cho phân tích định lượng ADN ti thể. Điều này chứng tỏ, phương pháp HPLC đủ nhạy để sử dụng định lượng ADN với lượng mẫu nhỏ và nồng độ ADN tương đối thấp, thu được kết quả có độ chính xác cao. Đường chuẩn với băng mt/ACTB tinh sạch Các mẫu ADN tinh sạch ACTB và mt được sử dụng để dựng đường chuẩn. Các mẫu được phân tích với tỉ số mt/ACTB theo hàm lượng ADN lần lượt là 1; 0,5; 0,25; 0,125 và 0,0625. Các mẫu được phân tích 3 lần và thu được kết quả phân tích HPLC theo tỷ số diện tích đỉnh trung bình (Bảng 7) Bảng 7 - Số liệu phân tích HPLC với các mẫu có tỉ số hàm lượng mt/ACTB khác nhau Tỉ số hàm lượng mt/ACTB 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 Tỷ số diện tích đỉnh mt/ACTB 0.99 0.497 0.246 0.124 0 A B Hình 16 - Hình ảnh phân tích HPLC và biểu đồ tỉ số mt/ACTB. A- Hình ảnh phân tích HPLC với các tỉ số hàm lượng mt/ACTB khác nhau B- Biểu đồ đường chuẩn tỉ số mt/ACTB Dựa trên hình ảnh thu được sau khi phân tích HPLC ta có thể thấy được hai đỉnh của ADN chuẩn được rửa giải khỏi cột với thời gian lưu khoảng giữa 35,5 - 37 40 phút. Mặt khác, khi phân tích với các tỉ số mt/ACTB khác nhau, diện tích các đỉnh thu được khác nhau, ta thấy đỉnh thứ hai giảm rõ ràng về diện tích, như vậy có thể khẳng định được đỉnh 1 có thời gian lưu sớm hơn là đỉnh của băng ACTB và đỉnh thứ hai có thời gian lưu muộn hơn là đỉnh của băng mt. Qua biểu đồ trên ta thấy với các mẫu có tỉ số băng mt/ACTB về lượng khác nhau cho các kết quả rất tương ứng sau khi phân tích HPLC. Với tỉ số mt/ACTB là 1/16 tương ứng mẫu lên cột có 3,125 ng mt/50ng ACTB thì không phân biệt được đỉnh của băng mt so với đường nền. Với tỉ số 1/8 tương ứng mẫu lên cột có chứa 6,25 ng mt/50ng ACTB thì tỉ số về lượng ADN và tỉ số diện tích đỉnh của mt/ACTB đã tương ứng với nhau. Như vậy với lượng ADN tối thiểu của mỗi băng chứa trong mẫu khi lên cột là 6,25 ng đã cho phép phân biệt được với đường nền và cho kết quả tốt để định lượng. Đường chuẩn thu được dạng tuyến tính với hệ số tương quan cao (R2 = 0,9961). 3.3.3.2. Phân tích mối liên quan giữa biến đổi số lượng bản sao mtADN và đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú Chúng tôi đã tiến hành phân tích HPLC với các mẫu của 46 bệnh nhân nhân ung thư vú và 20 mẫu bệnh nhân u xơ vú. Trong đó có 46 mẫu mô u và lân cận u của bệnh nhân ung thư vú, 20 mẫu mô và 19 mẫu máu của bệnh nhân u xơ vú. Các biến đổi số lượng bản sao mtADN (giá trị tương đối) được xem xét dựa trên tỉ số mt/ACTB của các mẫu và phân tích mối liên quan với các đặc điểm bệnh học. Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo loại mẫu Xem xét trên hai đối tượng bệnh nhân ung thư vú và bệnh nhân u xơ vú, về phương diện loại mẫu chúng tôi thu được kết quả ở bảng 8. 41 Bảng 8. Biến đổi tỉ số mt/ACTB trong các loại mẫu ở bệnh nhân ung thư vú và bệnh nhân u xơ vú Loại mẫu Số lượng Trung bình tỉ số mt/ACTB P Mô lân cận u Mô u 46 46 3,6 2,6 0,0096 Mô u Mô u xơ 46 20 2,6 2,5 0,245 Mô u xơ Máu 20 19 2,5 3,1 0,11621 Chú thích: Kiểm định thống kê bằng test Mann-Whitney (giá trị P). Hình 17- Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB trung bình ở các loại mẫu. Bằng cách sử dụng phương pháp kiểm định phi tham số Mann-Whitney cho từng cặp nhóm mẫu ở bệnh nhân ung thư và bệnh nhân u xơ vú. Chúng tôi thấy ở bệnh nhân ung thư vú, ở mẫu mô u có hiện tượng số lượng bản sao mtADN giảm (tỉ số mt/ACTB) so với các mẫu lân cận u, sự sai khác này có ý nghĩa thống kê với với p = 0,0096 < 0,05. Như vậy, hiện tượng giảm số lượng bản sao mtADN có thể liên quan đến sự hình thành khối u ở bệnh nhân ung thư, có thể sự suy giảm số lượng bản sao này đã ảnh hưởng đến chức năng điều hòa quá trình apoptosis, giúp các tế bào đột biến gây ung thư thoát khỏi chết theo chương trình để trở thành tế bào bất tử. 42 Ở bệnh nhân u xơ vú, số lượng bản sao mtADN ở các mẫu mô u xơ có xu hướng giảm so với máu, tuy nhiên sai khác này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Giữa mẫu mô u ung thư và mẫu mô u xơ, số lượng bản sao mtADN không có sự sai khác rõ rệt với giá trị trung bình tỉ số mt/ACTB tương đương nhau (p > 0,05). Biến đổi số lượng bản sao mtADN ở bệnh nhân ung thư vú Tiến hành phân tích mối liên quan giữa biến đổi số lượng bản sao mtADN với các đặc điểm bệnh học của các bệnh nhân ung thư vú, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 9. Bảng 9. Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thư vú Đặc điểm Số lượng Trung bình tỉ số mt/ACTB P Tuổi <50 ≥50 21 25 3,0 2,4 0,028 Độ biệt hóa Rõ Vừa Kém 2 25 10 1,81 3,42 3,34 0,108* Kích thước khối u < 5cm ≥ 5cm 24 22 2,0 3,3 0,000125 Mức độ xâm lấn của khối u (T) T1,2 T3,4 35 10 2,66 2,65 0,361 Hạch di căn (N) N0 N1,2 21 24 2,45 2,83 0,1225 Giai đoạn bệnh I II III 18 3 24 2,45 2,31 2,85 0,507* Chú thích: Giai đoạn I: T1,2N0M0; giai đoạn II: T3,4N0M0; giai đoạn III: T2-4N1,2M0; kiểm định thống kê bằng test Mann-Whitney và test Kruskal-Wallis (*) (giá trị P). 43 Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo nhóm tuổi bệnh nhân Ung thư vú có liên quan đến sự thay đổi hormon trong cơ thể phụ nữ, vì vậy, chúng tôi chia bệnh nhân theo 2 nhóm tuổi: dưới 50 tuổi và từ 50 tuổi trở lên (giai đoạn mãn kinh). Trong đó có 21 bệnh nhân <50 và 25 bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên, Kết quả phân tích thu được trong bảng 9, Hình 18 Hình 18- Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB trung bình theo nhóm tuổi ở bệnh nhân ung thư vú Kết quả ở bảng và hình trên cho thấy số lượng bản sao mtADN ở nhóm bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên giảm so với nhóm dưới 50 tuổi, sự sai khác này có ý nghĩa thống kê với p = 0,028 <0,05. Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo kích thước khối u Chúng tôi chia bệnh nhân thành hai nhóm tương ứng với cách chia của nhiều nghiên cứu trước đây ở bệnh nhân ung thư vú, nhóm có kích thước khối u < 5cm và nhóm có kích thước khối u ≥ 5 cm và thu được kết quả như bảng 3.6.6.2 (Hình 19). Ở các mẫu của các bệnh nhân có kích thươc khối u lớn hơn, có tỉ số mt/ACTB lớn hơn so với các bệnh nhân có khối u < 5cm, như vậy có sự biến đổi số lượng bản sao mtADN tăng ở các bệnh nhân có khối u ≥ 5cm, đây là biến đổi có ý nghĩa thống kê với p = 0,000125 <0,05. 44 Hình 19- Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB trung bình theo kích thước khối u ở bệnh nhân ung thư vú. Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di căn và giai đoạn bệnh Chúng tôi đã xem xét sự biến đổi số lượng bản sao mtADN trên nhiều khía cạnh như theo mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di căn và theo giai đoạn bệnh và thu được kết quả trong bảng 9. Về mức độ biệt hóa, tuy có sự sai khác lớn giữa nhóm biệt hóa rõ và hai nhóm biệt hóa vừa và kém, số lượng bản sao mtADN có xu hướng giảm ở nhóm biệt hóa rõ, tuy nhiên sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê (p >0,05). Với mức độ xâm lấn của khối u, các nhóm có sự sai khác không đáng kể, với tỉ số mt/ACTB trung bình là 2,66 và 2,65, sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Về số hạch di căn, nhóm có hạch di căn (nhóm N1,2) có xu hướng biến đổi số lương bản sao mtADN tăng so với nhóm không có hạch di căn, tuy nhiên sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Xét chung giai đoạn bệnh, giai đoạn I, II của bệnh có số lượng bản sao mtADN tương đương nhau, giai đoạn III có xu hướng biến đổi tăng so với hai giai đoạn đầu, tuy nhiên sự sai khác này cũng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). 45 Qua kết quả phân tích sự biến đổi số lượng bản sao mtADN ở bệnh nhân ung thư vú và bệnh nhân u xơ vú bằng phương pháp HPLC, chúng tôi nhận thấy không có sự sai khác đáng kể nào ở mẫu máu và mô u xơ ở bệnh nhân u xơ vú, cũng như ở mẫu u xơ vú và u ung thư, tuy nhiên ở bệnh nhân ung thư vú, có hiện tượng số lượng bản sao mtADN giảm ở nhóm mẫu u ung thư so với mẫu lân cận u, ở nhóm tuổi ≥ 50 so với nhóm tuổi < 50, và có hiện tượng tăng số lượng bản sao mtADN ở nhóm có kích thước khối u lớn ≥ 5cm so với nhóm có kích thước < 5cm, các sai khác này đều có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Xét trên mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di căn và theo giai đoạn bệnh, không có sự khác biệt đáng kể nào. Như vậy sự biến đổi số lượng bản sao mtADN có liên quan đến sự hình thành khối u, sự phát tiển của khối u và tuổi của bệnh nhân. 3.3.4. Kết quả phân tích phần mềm IMAGEJ Sau khi điện di, nhuộm bạc và scan các bản gel, ta sử dụng hình ảnh để phân tích bằng phần mềm Image J. (Hình 20) Hình 20- Hình ảnh bản gel khi phân tích bằng phầm mềm ImageJ Khi sử dụng phầm mềm ImageJ khoanh các vùng cần phân tích, phần mềm sẽ cho ta hình ảnh của các băng biểu diễn qua các đỉnh, dựa vào độ đậm và rộng của các băng. Đánh dấu vùng cần tính diện tích ta có thể dễ dàng tính diện tích các đỉnh. Từ đó có thể thu được số liệu để đánh giá biến đổi số lượng bản sao ở mỗi mẫu. 46 Đối chiếu kết quả tỉ số mt/ACTB của các mẫu khi phân tích bằng HPLC và phân tích bằng phần mềm ImageJ không sai lệch nhiều, các mẫu tăng giảm đều cho kết quả tương ứng (số liệu được cung cấp đầy đủ ở phần phụ lục). 3.3.4.1. Phân tích mối liên quan giữa biến đổi số lượng bản sao mtADN và đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú và u xơ vú từ các kết quả phân tích bằng phần mềm ImageJ Tương ứng với các mẫu phân tích HPLC, chúng tôi tiến hành phân tích song song bằng phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ với 46 bệnh nhân nhân ung thư vú và 20 mẫu bệnh nhân u xơ vú. Trong đó có 46 mẫu mô u và lân cận u của bệnh nhân ung thư vú, 20 mẫu mô và 19 mẫu máu của bệnh nhân u xơ vú. Các biến đổi số lượng bản sao mtADN được xem xét dựa trên tỉ số mt/ACTB của các mẫu và so sánh với nhiều đặc điểm bệnh học. Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo loại mẫu Xem xét trên hai đối tượng bệnh nhân ung thư vú và bệnh nhân u xơ vú, về phương diện loại mẫu chúng tôi thu được kết quả ở bảng 10. Bảng 10. Biến đổi tỉ số mt/ACTB trong các loại mẫu ở bệnh nhân ung thư vú và bệnh nhân u xơ vú bằng phương pháp ImageJ Loại mẫu Số lượng Trung bình tỉ số mt/ACTB P Mô lân cận u Mô u 46 46 3,4 2,7 0,058 Mô u Mô u xơ 46 20 2,7 2,48 0,131 Mô u xơ Máu 20 19 2,48 3,1 0,595 Chú thích: Kiểm định thống kê bằng test Mann-Whitney (giá trị P). Bằng cách sử dụng phương pháp kiểm định phi tham số Mann-Whitney cho từng cặp nhóm mẫu ở bệnh nhân ung thư và bệnh nhân u xơ vú. Ở kết quả phân tích bằng phần mềm ImageJ, các số liệu cho thấy xu hướng tương ứng với phân tích bằng phương pháp HPLC (tương ứng về hiện tượng tăng giảm) (Hình 17 và Hình 47 21). Ở bệnh nhân u xơ vú, số lượng mtADN ở các mẫu mô u có xu hướng giảm so với máu, tuy nhiên sai khác này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Giữa mẫu mô u ung thư và mẫu mô u xơ, số lượng bản sao mtADN không có sự sai khác rõ rệt với giá trị trung bình tỉ số mt/ACTB tương đương nhau (p > 0,05). Ở bệnh nhân ung thư vú, mẫu mô u có xu hướng số lượng bản sao mtADN giảm so với các mẫu lân cận u, tuy nhiên, sự sai khác này mặc dù không có ý nghĩa thống kê với p<0.05 nhưng giá trị p cũng nhỏ (p=0,058). Kết quả này sai khác một chút so với kết quả phân tích bằng phương pháp HPLC. Như vậy, phương pháp ImageJ có thể sử dụng để nhận biết xu hướng biến đổi số lượng bản sao ở các mẫu nhưng không cho độ chính xác cao như phương pháp HPLC. Hình 21- Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB trung bình theo loại mẫu phân tích bằng phương pháp ImageJ. Biến đổi số lượng bản sao mtADN ở bệnh nhân ung thư vú Tiến hành phân tích mối liên quan giữa biến đổi số lượng bản sao mtADN với các đặc điểm bệnh học của các bệnh nhân ung thư vú đựa trên các số liệu thu được bằng phương pháp phân tích ImageJ, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 11. Bảng 11. Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thư vú phân tích bằng phương pháp ImageJ Đặc điểm Số lượng Trung bình tỉ số mt/ACTB P 48 Tuổi <50 ≥50 21 25 2,9 2,4 0.0427 Độ biệt hóa Rõ Vừa Kém 2 25 10 1,85 2,98 2,81 0.336* Kích thước khối u < 5cm ≥ 5cm 24 22 2,18 3,24 0.000246 Mức độ xâm lấn của khối u (T) T1,2 T3,4 35 10 2,74 2,6 0,341 Hạch di căn (N) N0 N1,2 21 24 2,67 2,75 0,468 Giai đoạn bệnh I II III 18 3 24 2,73 2,3 2,75 0,677* Chú thích: Giai đoạn I: T2N0M0; giai đoạn II: T3,4N0M0; giai đoạn III: T2-4N1,2M0; kiểm định thống kê bằng test Mann-Whitney và test Kruskal-Wallis (*) (giá trị P). Tương ứng với các kết quả phân tích bằng phương pháp HPLC, chúng tôi thu được kết quả phân tích bằng ImageJ ở bệnh nhân ung thư vú. Biến đổi số lượng bản sao có liên quan đến nhóm tuổi và kích thước khối u. Cụ thể là có hiện tượng giảm số lượng bản sao mtADN ở nhóm tuổi từ 50 trở lên so với nhóm dưới 50 tuổi (p < 0,05) và hiện tượng tăng số lượng bản sao ở nhóm có kích thước khối u lớn hơn 5cm so với nhóm có kích thước khối u nhỏ hơn 5cm (p < 0,05). Ở các khía cạnh khác như theo mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di căn và theo giai đoạn bệnh, kết quả thu được cũng theo chiều hướng tương tự với kết quả phân tích HPLC. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm theo đặc điểm bệnh học (p > 0,05). Qua so sánh giữa 2 phương pháp phân tích bằng HPLC và ImageJ, kết quả phân tích mặc dù có sai khác nhưng vẫn tuân theo cùng xu hướng biến đổi (ví dụ, tỉ số mt/ACTB của mẫu mô lân cận u cao hơn so với mẫu mô u, của máu cao hơn mô u xơ , của nhóm tuổi trên 50 thấp hơn nhóm dưới 50, ). 49 Như vậy có thể thấy, mặc dù phương pháp phân tích ImageJ không cho kết quả chính xác bằng HPLC, tuy nhiên, phương pháp này có ưu điểm là phương pháp đơn giản, cho kết quả nhanh, chi phí rất thấp. Vì vậy, có thể kết hợp phương pháp sử dụng ImageJ với HPLC hoặc PCR định lượng để đánh giá số bản sao mtADN. Phương pháp này thích hợp để áp dụng ở các cơ sở không được trang bị các thiết bị đắt tiền như HPLC hoặc thiết bị PCR định lượng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân tích trên 46 bệnh nhân ung thư vú và 20 bệnh nhân u xơ vú để nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN. Kết quả của chúng tôi cho thấy ở bệnh nhân ung thư vú, số lượng bản sao mtDNA trong mô u thấp hơn đáng kể so với mô lân cận u tương ứng. Chứng tỏ rằng biến đổi số lượng bản sao mtADN có thể dẫn đến một khiếm khuyết chức năng ti thể dẫn đến hình thành khối u ác tính. Số bản sao mtADN giảm trong mô u so với mô lân cận u cũng được tìm thấy trong bệnh ung thư biểu mô gan [38], bệnh ung thư dạ dày [33]. Bên cạnh đó, giảm số lượng bản sao mtADN có liên quan với nhóm tuổi của các bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên. Kết quả này phù hợp với các quan sát trước đây trên thế giới như trong nghiên cứu năm 2007 của Yu và cs, trong 59 trường hợp bệnh nhân ung thư vú có 46 (78%) mẫu có hiện tượng giảm số lượng bản sao mtADN trong mô u so mô lân cận u tương ứng, hiện tượng này cũng thấy xuất hiện thường xuyên hơn ở nhóm cao tuổi ≥ 50 tuổi (63%) so với nhóm tuổi < 50 (33%) [39]. Tuy nhiên, nghiên cứu trên các bệnh nhân ung thư vú người Trung Quốc, Xia và cs (2009) lại không tìm thấy mối liên quan giữa số bản sao ADN ti thể với nhóm tuối của bệnh nhân [35]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi còn tìm thấy số lượng bản sao mtADN tăng ở nhóm có kích thước khối u từ 5cm trở lên so với nhóm có kích thước khối u nhỏ hơn 5cm. Như vậy, ngược với quá trình hình thành khối u, sự giảm số lượng bản sao ADN có thể dẫn đến khiếm khuyết chức năng trong quá trình trao đổi năng lượng, ảnh hưởng đến hoạt động hô hấp của tế bào, hay thay đổi chức năng trong quá trình apoptosis...dẫn đến việc hình thành các tế bào đột biến và cho chúng khả năng bất tử trở thành các khối u ác tính thì việc tiến triển của các khối u có thể đòi hỏi nhiều năng lượng hơn để đáp ứng nhu cầu của những tế bào tăng sinh vô hạn, dẫn đến việc tăng số lượng bản sao mtADN. 50 Dựa trên mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di căn và giai đoạn bệnh chúng tôi không tìm thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm. Điều này không tương đồng với kết quả mà Xia và cs (2009) đã chỉ ra rằng có hiện tượng biến đổi số lượng bản sao mtADN giữa các giai đoạn bệnh với p < 0,05 [35]. Ở bệnh nhân u xơ vú, chúng tôi không tìm thấy sự khác biệt đáng kể nào về số lượng bản sao mtADN giữa mẫu máu và mẫu mô của các bệnh nhân. Cũng không có sự sai khác giữa mẫu mô u xơ và mẫu mô ung thư. Hiện nay, ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể trong ung thư vú nói riêng và các loại ung thư khác nói chung, đây sẽ là hướng đi có tiềm năng cho việc tìm chỉ thị sinh học của bệnh ung thư. Bên cạnh đó, cần tăng số lượng mẫu nghiên cứu và kết hợp với các phương pháp định lượng khác như PCR định lượng, kết hợp điều tra với các mẫu mô khác như mẫu máu để khẳng định kết quả nghiên cứu và tăng khả năng ứng dụng thực tiễn. 51 KẾT LUẬN Qua các kết quả thu được từ phân tích biến đổi số bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú nguyên phát, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Đã tách chiết thành công 132 mẫu ADN tổng số của 46 bệnh nhân ung thư vú (gồm mẫu u và mẫu lân cận u) và 20 bệnh nhân u xơ vú (mẫu mô và máu). 2. Sự giảm số lượng bản sao ADN ti thể có liên quan tới sự hình thành khối u và có liên quan đến tuổi của bệnh nhân ung thư vú. Ngược lại, số lượng bản sao ADN ti thể tăng theo kích thước khối u. 3. Bằng kỹ thuật HPLC và ImageJ đã phân tích được biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể của các mẫu, trong đó HPLC là kỹ thuật định lượng chính xác, còn ImageJ là kỹ thuật định lượng nhanh, hiệu quả và ít tốn kém. 52 KIẾN NGHỊ Từ quá trình nghiên cứu thực tế chúng tôi đưa ra một số kiến nghị sau: 1. Tiếp tục phân tích hiện tượng biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể với mẫu ADN tách từ mô của bệnh nhân ung thư vú với số lượng mẫu lớn hơn. 2. Tiến hành phân tích hiện tượng biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể với mẫu ADN tách từ máu và mô vú của bệnh nhân ung thư vú nhằm tìm ra mối tương quan giữa chúng, phục vụ cho chẩn đoán bệnh dựa vào mẫu ADN máu. 3. Kết hợp với các phương pháp định lượng khác để khẳng định kết quả, góp phần tìm các chỉ thị sinh học cho chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư vú. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Anh: 1. Alonso A, Martin P, Albarran C, Aquilera B, Garcia O, Guzman A, Oliva H, Sancho M. (1997), “Detection of somatic mutations in the mitochondrial DNA control region of colorectal and gastric tumors by heteroduplex and single-strand conformation analysis”, Electrophoresis, 18, pp.682-685. 2. Anderson S., Bankier A. T., Barrell B. G., de Bruijn M. H. L., Coulson A. R., Drouin J., Eperon I. C., Nierlich D. P., Roe B. A., Sanger F., Schreier P. H., Smith A. J. H., Staden R. & Young I. G. (1981), “Sequence and organization of the human mitochondrial genome”, Nature, 290, pp.457-465. 3. Bassam B. J., Caetano-Anollés G. and Gresshoff P. M. (1991), “Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels”, Anal. Biochem, 196 (1), pp.80-83. 4. Bianchi M., Bianchi N. and Bailliet G. (1995), “Mitochondrial DNA mutations in normal and tumor tissues from breast cancer patients”, Cytogenet Cell Genet, 71, pp.99-103. 5. Carew J. and Huang P. (2002), “Mitochondrial defects in cancer”, Mol. Cancer, 12, pp.1-12. 6. Chester K.A., Robson L., Begent R.H., Pringle H., Primrose L., Talbot I.C., Macpherson A.J., Owen S.L., Boxer G., Malcolm A.D. (1990), “In situ and slot hybridization analysis of RNA in colorectal tumours and normal colon shows distinct distributions of mitochondrial sequences”, J Pathol, 162, pp.309-315. 7. Dimauro S. (2007), “Mitochondrial DNA medicin”, Biosci. Rep, 27 (1–3), pp.5-9. 8. DiMauro S. and Schon E. (2001), “Mitochondrial DNA mutations in human disease”, Am J Med Genet, 106, pp.18-26. 9. Hileman E.O., Achanta G., Huang P. (2001), “Superoxide dismutase: an emerging target for cancer therapeutics”, Expert Opin Ther Targets, 5, pp.697-710. 54 10. Hockenbery D. (2002), “A mitochondrial achilles heel in cancer?”, Cancer Cell, 2, pp.1-2. 11. Jerónimo C., Nomoto S., Caballero O.L., Usadel H., Henrique R., VarzimG., OliveiraJ., Lopes C., Fliss MS. Sidransky D. (2001), “Mitochondrialmutations in earlystageprostatecancer and bodily fluids”, Oncogene, 20, pp.5195-5198. 12. King MP., Attardi G. (1989), “Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation”, Science , 246, pp.500-503. 13. Kornburg H. (1987), "Tricarboxylic acid cycles," Bioessays , 7, pp. 236-238. 14. Lightowlers R.N., Chinnery P.F., Turnbull D.M. & Howell N. (1997), “Mammalian mitochondrial genetics, heredity, heteroplasmy and disease”, Trends Genet, 13, pp.450–455. 15. Lin C.S., Wang L.S., Tsai C.M., and Wei Y.H. (2008), “Low copy number and low oxidative damage of mitochondrial DNA are associated with tumor progression in lung cancer tissues after neoadjuvant chemotherapy” Interact. Cardiovasc. Thorac. Surg., 7 (6), pp.954-958. 16. Liu V.W., Shi H.H., Cheung A.N., Chiu P.M., Leung T.W., Nagley P., Wong L.C., Ngan H.Y. (2001), “ High incidence of somatic mitochondrial DNA mutations in human ovarian carcinomas”, Cancer Res, 61, pp.5998-6001. 17. Liu X., Kim C., Yang J., Jemmerson R. and Wang X. (1996) , "Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c", Cell , 86, pp.147-157. 18. Marchington D.R., Macaulay V., Hartshorne G.M., Barlow D. & Poulton J. (1998), “Evidence from human oocytes for a genetic bottleneck in an mtDNA disease”, Am J Hum Genet, 63, pp.769–775. 19. Modica-Napolitano J.S., Singh K.K. (2002), “Mitochondria as targets for detection and treatment of cancer”, Exp Rev Mol Med, 4 (9), pp. 1-19. 20. Montoya J., Ojala D., Attardi G. (1981), “Distinctive features of the 5'- terminal sequences of the human mitochondrial mRNAs”, Nature, 290 (5806), pp.465-70. 55 21. Parrella P., Xiao Y., Fliss M., Sanchez-Cespedes M., Mazzarelli P., Rinaldi M., Nicol T., Gabrielson E., Cuomo C., Cohen D., Pandit S., Spencer M., C Rabitti., Fazio VM., Sidransky D. (2001), “Detection of mitochondrial DNA mutations in primary breast cancer and fine-needle aspirates”, Cancer Res, 61, pp.7623-7626. 22. Pinz KG. & Bogenhagen DF. (1998) “Efficient repair of abasic sites in DNA by mitochondrial enzymes”, Mol Cell Biol, 18, pp.1257–1265. 23. Polyak K., Li Y., Zhu H., Lengauer C., Willson J.K., Markowitz S.D., Trush M.A., Kinzler K.W., Vogelstein B. (1998), “Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours”, Nat Genet, 20, pp.291-293. 24. Sharp M.G., Adams S.M, Walker R.A., Brammar W.J., Varley J.M. (1992) “Differential expression of the mitochondrial gene cytochrome oxidase II in benign and malignant breast tissue” J Pathol, 168, pp.163-168. 25. Shuster R.C., Rubenstein A.J. & Wallace D.C. (1988), “Mitochondrial DNA in anucleate human blood cells” Biochem Biophys Res, 155, pp.1360-1365. 26. Susin S.A., Lorenzo H.K., Zamzami N., Marzo I., Snow B.E., Brothers G.M., Mangion J., Jacotot E. Costantini P., Loeffler M., Larochette N., Goodlett D.R., Aebersold R., Siderovski D.P., Penninger J.M., Kroemer G. (1999), “Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor” Nature, 397, pp.441-446. 27. Staniek K., Gille L., Kozlov A.V., Nohl H. (2002), “Mitochondrial superoxide radical formation is controlled by electron bifurcation to the high and low potential pathways” Free Radic Res, 36, pp.381- 387. 28. Taanman J.W., Street R. H., and L. Nw (1999), “The mitochondrial genome : structure, transcription, translation and replication”, Biochim Biophys Acta, 1410 (2), pp.103-123. 29. Tan D.J., Bai R.K., Wong L.J. (2002), “Comprehensive scanning of somatic mitochondrial DNA mutations in breast cancer”, Cancer Res, 62, pp.972-976. 56 30. Thyagarajan B., Wang R., Nelson H., Barcelo H., Koh W. and Yuan J. (2013), "Mitochondrial DNA copy number is associated with breast cancer risk" PLoS One, 8(6), e65968. 31. Wang Y, Liu V.W., Xue W.C., Cheung A.N., Ngan H.Y. (2006), “Association of decreased mitochondrial DNA content with ovarian cancer progression”, Br J Cancer, 95, pp.1087-91. 32. William L.D., John S.S. (2002) “Cancer of the breast”, Elsevier Health Sciences, pp.169-179. 33. Wu C.W., Yin P.H., Hung W.Y., Li A.F., Li S.H., Chi C.W., et al (2005), “Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial DNA depletion in gastric cancer”, Genes Chromosomes Cancer, 44, pp.19–28. 34. Warburg O. (1956), “On the origin of cancer cells”, Science, 123, pp.309-314. 35. Xia P., An H., Dang C., Radpour R., Kohler C., Fokas E., Engenhart-Cabilic R., Holzgreve W. and Zhong X. (2009), “Decreased mitochondrial DNA content in blood samples of patients with stage I breast cancer”, BMC Cancer, 9, pp.454. 36. Yamada S., Nomoto S., Fujii T., Kaneko T., Takeda S., Inoue S., et al (2006), "Correlation between copy number of mitochondrial DNA and clinico-pathologic parameters of hepatocellular carcinoma", Eur J Surg Oncol, 32, pp.303–7. 37. Ye C., Shu X., Wen W., Pierce L., Courtney R., Gao Y., Zheng W. and Cai Q. (2008), "Quantitative analysis of mitochondrial DNA 4977-bp deletion in sporadic breast cancer and benign breast diseases", Breast Cancer Res. Treat, 108 (3), pp.427–34. 38. Yin P.H., Lee H.C., Chau G.Y., Wu Y.T., Li S.H., Lui W.Y., Wei Y.H., Liu T.Y., and Chi C.W. (2004), “Alteration of the copy number and deletion of mitochondrial DNA in human hepatocellular carcinoma”, Br. J. Cancer, 90 (12), pp.2390–6. 39. Yu M., Zhou Y., Shi Y., Ning L., Yang Y., Wei X., N. Zhang, X. Hao, and Niu R. (2007), “Reduced mitochondrial DNA copy number is correlated with 57 tumor progression and prognosis in Chinese breast cancer patients”, IUBMB Life, 59 (7), pp. 450–457. Tài liệu trang web 40. (20.05.2014) 41. (30/1/2015) 42. (12.05.2014) 43. factors. 44. 58 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân u xơ và số liệu phân tích ImageJ, HPLC LOẠI MẪU MẪU MÁU MẪU MÔ PHƯƠNG PHÁP ImageJ HPLC ImageJ HPLC STT Mã BN Tên Tỉ số mt/ACTB Tỉ số mt/ACTB 1 13477 Nguyễn Hải M. 1.3 1.3 2.1 1.9 2 27215 Trần Thị T. 3.8 3.6 5.5 5.1 3 27222 Trương Nguyệt M. 2.7 2.5 3.7 3.4 4 27236 Lê Hương T. 4.5 5.1 3.3 3.0 5 27237 Nông Thị Thùy L. 2.2 2.1 6 27241 Đoàn Bích H. 2.7 2.6 0.8 0.8 7 27253 Nguyễn Thùy C. 2.0 2.0 1.3 1.5 8 27257 Nguyễn Hoàng Như N. 4.7 4.4 2.9 2.5 9 27263 Trương Hoàng L. 2.4 2.1 2.6 2.5 10 27269 Nguyễn Thị Tuyết M. 1.7 1.2 2.5 2.0 11 27896 Trần Phương T. 2.8 3.1 6.4 6.7 12 27901 Trần Thị Thu H. 3.8 3.8 2.4 2.0 13 27905 Phạm Thị T. 5.5 5.1 2.1 2.2 14 27907 Vương Thị C. 5.0 6.0 2.3 3.6 15 27908 Đặng Thị H. 0.9 0.9 2.8 3.9 16 27913 Nguyễn Thị T. 2.8 3.2 0.7 0.6 17 27921 Trần Thị R. 2.1 1.9 0.7 0.9 18 27927 Phạm Thị H. 3.9 4.4 1.2 1.4 19 27931 Trương Thị T. 3.3 3.6 2.9 2.9 20 27936 Phạm Thị Đ. 2.5 2.0 1.2 1.3 Phụ lục 2. Danh sách bệnh nhân ung thư vú và số liệu phân tích ImageJ, HPLC LOẠI MẪU MÔ LÂN CẬN U MÔ U PHƯƠNG PHÁP ImageJ HPLC ImageJ HPLC STT Mã BN Tên Tuổi Kích thước u(cm) Số hạch Phân loại TNM Mức độ biệt hóa Tỉ số mt/ACTB Tỉ số mt/ACTB 1 8239 Phạm Thị X. 51 6 17 T2N0M0 - 2.3 3.2 0.9 1.1 2 8304 Nguyễn Thị H. 42 2 4 T2N0M0 - 3.1 3.0 2.8 3.0 3 8625 Nguyễn Thị Ư. 74 4 15 T2N1M0 - 1.7 2.3 1.7 2.2 4 10073 Nguyễn Thị P. 56 4 6 T2N0M0 - 1.9 1.0 1.9 1.1 5 10106 Đoàn Thị B. 63 4 7 T2N0M0 - 1.3 2.1 1.4 1.3 6 10193 Ngô Ngọc O. 54 3 7 T2N0M0 - 2.1 1.4 1.3 1.0 7 25366 Chu Thị T. 50 1 7 T2N1M0 rõ 0.5 0.5 1.5 1.5 8 25766 Lê Thị N. 43 1,2 4 T1N2M0 vừa 0.9 1.0 1.3 0.9 9 26136 Ngô Thị C. 59 6 7 T4N1M0 vừa 1.4 1.3 2.1 1.7 10 26137 Đào Thị L. 55 5,5 22 T3N1M0 kém 3.7 4.0 1.4 2.8 11 26300 Bùi Thị C. 45 2 9 T2N2M0 kém 1.8 1.8 2.2 2.7 12 26301 Vũ Thị L. 51 1 6 T2N1M0 vừa 2.6 2.7 2.5 2.5 13 26452 Nguyễn Thị T. 51 2,5 6 T2N1M0 vừa 1.3 1.6 1.9 1.9 14 26454 Trương Hồng T. 40 4,5 6 T3N0M0 vừa 2.0 1.9 2.1 1.9 15 26661 Nguyễn Thị Kim A. 41 2,5 6 T2N0M0 vừa 1.4 1.2 3.1 1.8 16 26671 Vũ Thi X. 50 2,5 5 T2N0M0 vừa 2.8 2.2 3.8 1.6 17 26708 Nguyễn Thị S. 64 2,8 5 T2N1M0 vừa 2.4 3.3 1.1 1.1 18 27054 Nguyễn Thị T. 75 7 2 T4N1M0 kém 6.9 7.8 2.9 3.2 19 27136 Vũ Thị L. 54 3,5 5 T3N0M0 kém 4.9 4.5 2.7 2.8 20 27398 Nguyễn Thị L. 61 1,5 13 T1N0M0 vừa 4.1 5.2 2.4 2.1 21 27400 Phạm Thị L. 60 1 4 T1N1M0 vừa 5.9 5.4 3.9 4.7 22 31249 Hoàng Thị L. 54 3,5 9 T4N1M0 rõ 3.6 3.8 2.2 2.2 23 31250 Vũ Thị D. 47 6,5 9 T3N0M0 vừa 7.1 6.8 2.1 2.2 24 31371 Nguyễn Thị B. 59 15 6 T2N0M0 - 4.3 4.2 3.2 1.9 25 31403 Nguyễn Thị H. 34 14 28 T3N1M0 vừa 7.2 6.0 3.0 2.4 26 31404 Vũ Thị L. 50 15 8 T2N0M0 vừa 1.4 1.7 3.2 2.1 27 31420 Nguyễn Thị N. 50 20 10 T2N2M0 kém 3.0 3.2 2.7 2.6 28 31646 Phạm Thị T. 60 20 19 T4N1M0 kém 3.1 3.2 3.0 3.1 29 31654 Hoàng Thị M. 67 15 4 T3N1M0 vừa 2.7 6.1 4.5 4.1 30 31716 Ngô Thị Diệp H. 30 14 8 T2N0M0 vừa 5.6 5.4 2.7 3.7 31 31720 Hà Thị C. 47 16 3 T2N0M0 vừa 4.8 4.1 2.7 2.9 32 31755 Nguyễn Thị T. 46 1,5 8 T1N2M0 vừa 5.5 4.3 2.0 2.1 33 32009 Dương Thị N. 60 16 11 T3N2M0 kém 3.5 6.2 3.2 5.2 34 32427 Vũ Thị P. 64 14 6 T2N0M0 vừa 6.3 6.5 4.3 5.2 35 33190 Nguyễn Thị N. 24 7 7 T2N0M0 kém 4.0 3.3 3.7 4.7 36 33286 Lê Thị T. 49 7 2 T1N0M0 vừa 4.0 4.3 3.8 3.6 37 33354 Trần Thị Ánh H. 40 14 2 T2N1M0 vừa 4.4 4.4 4.1 3.7 38 33538 Phan Thị V. 46 14 15 T2N1M0 vừa 5.2 5.4 4.9 3.1 39 33696 Trương Thị T. 41 15 4 T2N0M0 vừa 5.5 5.5 3.7 3.1 40 34115 Vũ Thị T. 43 2.5 8 T2N1M0 vừa 4.7 4.5 3.5 3.6 41 34695 Ngô Thị Thanh T. 32 16 7 T2N0M0 kém 6.0 7.8 3.5 3.6 42 35670 Phạm Thị Bích L. 36 18 7 T1N1M0 vừa 1.7 1.5 5.0 6.0 43 36235 Nghiêm Thị L. 47 16 6 T2N1M0 kém 2.5 3.0 2.7 2.6 44 19320 Nguyễn Tố H. 55 3,3 6 T2N0M0 vừa 1.4 1.1 0.8 0.5 45 - Thái Thị Hồng L. 40 3 11 T2N1M0 - 1.3 1.3 2.4 2.5 46 9956 Đoàn Thị M. 48 4,5 13 - - 2.8 4.3 1.6 1.7