Luận văn Nghiên cứu đa hình protein huyết thanh và trình tự vùng điều khiển D-Loop ty thể của ba giống gà: Ri, Mông và Đa cựa

ng thời họ đã xác định đƣợc trình tự của 400bp đầu tiên trên vùng điều khiển mtDNA. Kết quả nhận đƣợc đã chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60bp trên vùng điều khiển mtDNA là điểm đặc trƣng của giống Gallus. Randi và cộng sự (1997) [19]; Scott(1997) [24] phân tích trình tự của một phân đoạn điều khiển ty thể (đoạn D-Loop)của 2 loài gà lôi đặc hữu ở Việt Nam đã chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa 2 giống gà này. Năm 1999, Kimball và cộng sự [21] cũng dựa trên sự phân tích đầy đủ của gen cytochrom b (1143 bp) và đoạn siêu biến 1 (350 bp) của vùng điều khiển mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài Trĩ và gà Gô. Hai cây phân loại đƣợc xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận đƣợc trên một đoạn trình tự ngắn trên mtDNA cũng cho kết quả khá phù hợp với kết quả phân tích trên toàn bộ gen cytochrom b, điều này cho thấy trình tự vùng điều khiển có đủ cơ sở để phân tích quan hệ chủng loại. Năm 2001, D.Niu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nguồn gốc và đánh giá đa dạng di truyền 6 giống gà bản địa của trung Quốc. Họ giải trình tự 539 nucleotide vùng trình tự D-Loop của 6 giống gà, so sánh với trình tự nucleotide của các giống gà G. gallus, G.sonneratii, G.varius, G. lafayettei lƣu giữ trong GenBank và thiết lập cây chủng loại phát sinh giữa các giống. Đồng thời, dựa trên đoạn trình tự phân tích đƣợc họ cũng nhân thấy sự khác biệt đáng kể về mặt di truyền giữa các giống gà chuyên trứng và các giống nuôi với mục đích khác, chủ yếu là do sự khác biệt về dòng mẹ giữa các giống [31]. Năm 2002 Zang và đồng tác giả đã giải trình tự 539 nucleotide đầu tiên trong vùng D-Loop của 6 chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen quốc tế. Ông đã thiết lập đƣợc mối quan hệ nguồn gốc của chúng dựa trên trình tự vùng D-Loop. Kết quả cho thấy 4 loài thuộc giống Gallus có rất nhiều điểm khác nhau. G. g. domesticus có mối quan hệ thân thuộc nhất với G. gallus của Thái Lan và các vùng lân cận. Nhóm nghiên cứu đã giả thuyết rằng, gà nhà Trung Quốc có thể có nguồn gốc từ loài G.gallus ở các nơi này và hai loài phụ G. g. Gallus, G. g. spadiceus có thể thuộc một loài phụ do tính tƣơng đồng cao giữa chúng [36]. Năm 2003, S. Moulin và cộng sự đã sử dụng 800 bp của đoạn D-Loop và 400 bp của gen cyt b để nghiên cứu sự phát sinh chủng loại của 2 loài gà Lôi Lophura nycthemera và L. leucomelanos. Các kết quả thu đƣợc đã góp phần phân biệt 2 loài trên và đồng thời làm sáng tỏ nguồn gốc của một số loài thuộc 2 loài này [29]. Năm 2003, T. Komiyama và cộng sự cũng dựa trên trình tự đầy đủ của vùng D-Loop để nghiên cứu nguồn gốc tiến hóa và quá trình thuần hóa của 3 giống gà Naganakidori của Nhật Bản. Trên cơ sở cây chủng loại phát sinh xây dựng đƣợc các nhà nghiên cứu cho rằng tuy có nhiều điểm khác biệt đáng chú ý, 3 giống gà trên đều có nguồn gốc từ giống gà chọi Shamo. Kết quả này còn dẫn đến kết luận 3 giống gà đƣợc đƣa từ các vùng lân cận miền Nam trung Quốc hoặc Đông Dƣơng qua Okinawa vào Nhật Bản [22, 23]. Pereira và cộng sự (2004) đã tìm đƣợc ít nhất 13 gen giả (pseudogene hay Numt) trong genome của G.gallus với kích thƣớc dao động từ 131 đến 1733 nucleotide. Đây là các đoạn DNA ty thể đƣợc tìm thấy trong hệ gen nhân của sinh vật nhân thật. Một số trong chúng có nhiều điểm tƣơng đồng với các đoạn trong ty thể. Do đó, chúng có thể đƣợc dùng trong các nghiên cứu mối quan hệ chủng loại và di truyền quần thể sử dụng DNA ty thể làm đối tƣợng nghiên cứu. Tuy nhiên, ngƣời ta vẫn chƣa xác định đƣợc tần số bắt gặp của Numt cũng nhƣ đóng góp của nó đối với genome trong nhân [33]. Komiya T và đồng tác giả (2004) [23] đã tiến hành phân tích trình tự vùng D-Loop trong ty thể từ mẫu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc gà địa phƣơng của Nhật Bản đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà lông đỏ (Jungle Fowl) đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen Quốc Tế EMBL/Genbank/DDBJ, làm nhóm ngoại (outgroup). Trên cơ sở đó họ đã thiết lập cây phát sinh và kết quả cho thấy cả 3 chủng Naganakidori có nguồn gốc từ gà chọi Shamo. Các kết quả này đã gợi ý rằng 3 mẫu gà cảnh đuôi dài đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái bên ngoài rất khác nhau. Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ các con gà chọi Okinawa vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc và Đông Nam Á hơn so với Honshu/Kyushu Nhật Bản. Điều này dẫn đến giả thiết rằng gà đuôi dài Nhật Bản đầu tiên đƣợc đƣa đến Nhật Bản là gà chọi các vùng lân cận của vùng Nam Trung Quốc và Đông Nam Á. Nhƣ vậy có thể thấy trình tự nucleotide của vùng D-Loop là một công cụ hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể địa lý. 1.4.6. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam Năm 1999, Kim Thị Phƣơng Oanh và cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp đa hình các đoạn cắt giới hạn (RFLP) nghiên cứu vùng D-Loop của 3 loài gà lôi Việt Nam gồm: gà lôi đuôi trắng, trĩ bạc và gà lôi hông tía. Các kết quả thu đƣợc cho thấy sự sai khác về trình tự nhận biết các enzyme trong vùng trình tự nói trên [13]. Năm 2000 Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3] đã tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà lôi đặc hữu Việt Nam trong vector pBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide vùng D-Loop. Năm 2006 Địch Thị Kim Hƣơng và cộng sự [6] đã xác định đƣợc trình tự vùng D-Loop gồm 1277 nucleotide của 2 mẫu giống gà Ác Tiềm, Lƣơng Phƣợng, đã phát hiện đƣợc 22 vị trí khác biệt về nuclotide giữa hai đại diện. Năm 2007 Lê Đức long và cộng sự đã giải trình tự và so sánh trình tự nucleotide vùng D-Loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên, Hà Giang và Yên Bái đƣợc nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theo dự án gà sạch. Kết quả nghiên cứu đã xác định đƣợc trình tự vùng D-Loop gồm 1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định đƣợc 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này. Năm 2008 Nguyễn Trƣờng Huy và cộng sự [5] đã xác định đƣợc trình tự 300 nucleotide đầu tiên trong đoạn D-Loop của 4 mẫu thuộc 4 giống gà: Gà Ác, gà Mía, gà Hồ và gà Mông và so sánh với trình tự tƣơng ứng trên đoạn D-Loop 2 giống gà Leghorn và gà bản địa Lào. Dựa trên cây chủng loại phát sinh xây dựng đƣợc, có thể đƣa ra kết luận sơ bộ về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu thuộc 4 giống gà nghiên cứu so với 2 giống gà đƣợc chọn để so sánh. Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU Vật liệu nghiên cứu là mẫu máu của các giống gà: - Gà Ri Bắc Kạn (RI): Lông vàng, da vàng, chân vàng. - Gà Mông Bắc Kạn (Mo): Lông đỏ thẫm điểm đốm trắng nhỏ, da vàng, chân chì. - Gà Đa Cựa Bắc Kạn (Da): Lông màu đỏ thẫm, da vàng, chân vàng và có nhiều cựa. Các giống gà trên đƣợc lấy từ Bản Hậu - Xã Mỹ Phƣơng - Huyện Ba Bể - Tỉnh Bắc Kạn. 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.2.1. Hóa chất Protease K (20mg/l); phenol:chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1); Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1); Agarose 0.8%; Tris-HCl (0.1M; pH7.5); NaOH 1M; H2O khử ion vô trùng; Ethidium bromide. Bộ hóa chất dùng để tách DNA tổng số của hãng Biosciences, Sigma. Dung dịch đệm PBS (phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl 0.2g; Na2HPO4 1.44g; KH2PO4 0.24g. Dẫn nƣớc đến 100ml. Dung dịch đệm tách tế bào (Lysis buffer): Tris - HCl (10mM, pH8); EDTA (10mM, pH8); NaCl 0.1M; SDS 2.1%. Dung dịch đệm TAE dùng trong kĩ thuật điện di: Tris base; CH3COOH; EDTA (0.5mM, pH8). Bộ hóa chất dùng cho PCR (dNTPs, MgCl2, enzym chịu nhiệt...) Gel cô 5% : 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 ml 10% (w/v) SDS, 0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 ml 10% (w/v) APS, 2 ml TEMED Gel tách 12,6%: 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45ml 10% (w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O, 30 ml 10% (w/v) APS, 3 ml TEMED. Đệm hòa mẫu 5x: 25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8 Đệm điện di: 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3 2.2.2. Thiết bị Các thiết bị và hóa chất đƣợc sử dụng thuộc sở hữu của phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công Nghệ Sinh Học. Các thiết bị sử dụng trong đề tài - Bể ổn nhiệt hãng Tempette Junior Tech - Cân phân tích hãng metter Toledo, Thụy Sỹ - Máy li tâm hãng Sorvall - Máy điện di hãng PowerPac 300, Mỹ - Máy khuấy trộn hãng OSI, Rotolab - Máy làm khô chân không hãng Speed Vac Sc 110A- Savan, Mỹ - Máy PCR-PTC 100 hãng MJ Research, Mỹ - Máy chụp ảnh hãng Bio-Rad, Mỹ - Lò vi sóng hãng Samsung, Hàn Quốc - Pipetman các loại hãng Gilson, Pháp - Tủ lạnh sâu -20oC, -84oC do hãng Sanyo, Nhật Bản sản xuất. - Máy gene AmpPCR System 9700 do hãng Applied Biosystems, Mỹ sản xuất. - Máy xác định trình tự tự động ABI PRISMTM3100 Genetic Analyser do hãng Applied Biosystems, Mỹ sản xuất. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu của động vật • Nguyên tắc chung Màng tế bào đƣợc phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài nhân đƣợc giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA đƣợc tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform:isoamylalcohol. Cuối cùng, DNA đƣợc tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phƣơng pháp ly tâm. • Quy trình kĩ thuật Làm tan máu đông lạnh ở 37-39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia máu vào các ống eppendof 1,5 ml với thể tích 500µl/ống, tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp của Sambrook và Russell [35] các bƣớc nhƣ sau: Bƣớc 1: Hòa tan 500 µl PBS vortex và ly tâm ở 6000 v/p, 15 phút, 4 oC, đổ dịch, thu cặn. Bƣớc 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 µl proteinase K. Mẫu thu đƣợc ủ ở 65oC trong 1h, sau đó để ở nhiệt độ phòng, chia vào mỗi ống Epp 500 µl dịch. Bƣớc 3: Bổ sung một lƣợng tƣơng đƣơng Phenol: Chlroform: Isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4 oC. Hút pha trên vào ống mới. Bƣớc 4: Thêm một thể tích tƣơng đƣơng Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), vortex và ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4oC. Thu pha trên. Bƣớc 5: Thêm CH3COONa một lƣợng bằng 1/10 thể tích dung dịch trong ống. Thêm 3 thể tích cồn 100%, để ở tủ lạnh -20oC trong 15h (qua đêm). Bƣớc 6: Ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4oC để thu DNA. Tiếp đó, bổ sung 500µl cồn 70% để rửa, ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4oC, bỏ dịch và thu cặn. Bƣớc 7: Làm khô cặn trong máy sấy, hòa tan cặn trong 50 µl H2O, búng nhẹ. 2.3.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose • Nguyên tắc chung Điện di là kĩ thuật dùng để tách và định lƣợng axit nucleic với các kích thƣớc và hàm lƣợng khác nhau. Kĩ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của 3- axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm do sự có mặt của gốc PO4 trên bề mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trƣờng với cƣờng độ dòng điện và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dƣơng. Gel đƣợc sử dụng trong kĩ thuật điện di có thể là gel agarose hoặc polyacrylamid. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã dùng gel agarose 0,8 bởi nồng độ này phù hợp kích thƣớc trung bình của các đoạn DNA cần phân tích (1-20kb). • Quy trình kĩ thuật Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8g agrose vào 100ml dung dịch đệm TAE. Đun trong lò vi sóng cho đến khi thu đƣợc dung dịch trong suốt. Để nguội đến khoảng 50-60oC, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lƣợc. Sau 30 phút gel đông lại thì rút răng lƣợc ra và đặt bản gel vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE. Tra mẫu DNA: Trộn một lƣợng mẫu thích hợp (3 µl) với đệm tra mẫu (2,5 µl), tra vào các giếng trên bản gel. Điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100V, dòng 60-80mA trong khoảng 30 phút. Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 µl/ml. Lấy bản gel ra sau 10-15 phút và rửa trong nƣớc sạch. Quan sát và chụp ảnh bằng máy Bio-Rab. 2.3.3. Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE • Nguyên tắc SDS-PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi [26].Trong phƣơng pháp này, các phân tử protein đƣợc phân tách theo trọng lƣợng dƣới tác dụng của điện trƣờng không đổi. Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau. Dƣới tác dụng của dòng điện một chiều, các protein có kích thƣớc khác nhau sẽ di chuyển về điện cực trái dấu. Các phân tử protein gắn với SDS nên chúng sẽ tích điện âm, do đó sự khác biệt về điện tích đƣợc loại trừ. Khi protein đƣợc chạy trong điện trƣờng không đổi, phức hệ protein- SDS sẽ di chuyển xuyên qua các lỗ gel polyacrylamid với vận tốc phục thuộc vào hình dáng, kích thƣớc phân tử. Khi đó protein sẽ đƣợc phân tách thành các băng, vạch khác nhau. Gel thƣờng đƣợc sử dụng với nồng độ từ 5%-15% và có thể đƣợc chạy theo chiều nằm ngang hoặc chiều thẳng đứng. • Phƣơng pháp Máu ngoại vi đƣợc lấy khoảng 3ml -5ml từ ba đại diện của ba giống gà . Để mẫu máu tại nhiệt độ phòng trong 3h. Sau đó ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút. Hút chuyển phần huyết thanh sang eppendorf mới. Mẫu huyết thanh sau đó đƣợc giữ tại điều kiện -25oC hoặc -75oC. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE) Kỹ thuật SDS-PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi, 1970 .Các thiết bị, hóa chất đƣợc sử dụng trong kỹ thuật SDS-PAGE do hãng Bio-Rad cung cấp. Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau. Đối với các protein có trọng lƣợng phân tử từ 6 kDa-160 kDa, gel 10%, 12.6% và 15% (w/v) thƣờng đƣợc sử dụng. Trong nghiên cứu này, SDS- PAGE đƣợc tiến hành trên gel 12.6% với các thành phần cơ bản nhƣ sau cho 3 mẫu huyết thanh của 3 dòng gà thí nghiệm đã pha loãng 30 lần. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE Gel cô 5% : 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 ml 10% (w/v) SDS, 0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 ml 10% (w/v) APS, 2 ml TEMED Gel tách 12,6%: 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45ml 10% (w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O, 30 ml 10% (w/v) APS, 3 ml TEMED Đệm hòa mẫu 5x: 25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8 Đệm điện di: 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3 Quá trình điện di đƣợc thực hiện ở 2 vùng điện thế: (i) 75V trong 30 phút và (ii) 150V cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản gel. Kết thúc quá trình điện di, bản gel đƣợc nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250. Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0.1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản gel đƣợc tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi có thể quan sát thấy . 2.3.4. Nhân vùng điều khiển D-Loop bằng kĩ thuật PCR Kĩ thuật phản ứng chuỗi dùng enzyme polimerase (polimerase chain reaction = PCR hay PCR Technology) lần đầu tiên đƣợc Mullis và cộng sự mô tả năm 1986. • Nguyên tắc: Phản ứng chuỗi polimerase là một kĩ thuật đơn giản, cho phép khuếch đại invitro một trình tự DNA lên hàng triệu lần trong vài giờ. Điều này rất thuận lợi cho việc phát hiện những trình tự hiếm trong các bộ gene từ những đoạn DNA ngắn đƣợc phân lập hoặc từ một lƣợng rất nhỏ lấy ra đƣợc khuếch đại cho các thử nghiệm sinh học, y học và nông nghiệp. Đồng thời nó giúp cho các nhà sinh học phân tử nghiên cứu cấu trúc trình tự DNA trong bộ gene của các cơ thể sinh vật khác nhau. Phản ứng chuỗi polimerase đƣợc thực hiện khi có DNA mẫu, 2 đoạn mồi, Taq polimerase, bốn loại deoxyronucleotit triphotphat( dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dung dịch đệm và ion Mg2+. Phản ứng chuỗi PCR đƣợc thực hiện trên thiết bị nhân DNA. Một chu kì PCR gồm 3 giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau: - Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng kép sang sợi đơn ở nhiệt độ 94o- 95oC trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 1- 1.5 phút) - Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng đƣợc hạ thấp xuống 40- 65oC cho phép hai đoạn mồi gắn DNA mẫu ở vị trí tƣơng đồng theo nguyên tắc bổ sung ( A - T, G - X) ở hai đầu DNA cần nhân. - Giai đoạn kéo dài: Ở nhiệt độ 72oC DNA Taq polimerase hoạt động kéo dài DNA từ đoạn mồi và hai đoạn DNA mới đƣợc tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu đoạn DNA khuôn ban đầu. Sau một chu kì gồm 3 giai đoạn nhƣ trên, một đoạn DNA khuôn đƣợc nhân lên thành hai, các đoạn DNA đƣợc nhân bản trong mỗi chu kì lại đƣợc coi là DNA khuôn cho chu kì nhân bản tiếp theo. Chính vì vậy sau k chu kì nhân bản sẽ tạo ra 2k DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu. • Nguyên liệu - DNA khuôn (Teplate) - Cặp mồi H1255- L16725 chuyên biệt. Ở đây, H(Heavy) và L( Light) là kí hiệu chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, còn chữ số là vị trí nuclotide đầu 3' của primer trong trình tự đầy đủ của mtDNA ở gà [15]. + - Bộ hóa chất: Dung dịch đệm có chứa NH4 10mM, Taq DNA polymerase của hãng Fermentas. - Nƣớc khử ion vô trùng. , dNTPs 10mM, MgCl2 Thành phần của phản ứng khuếch đại gen cho một mẫu với tổng thể tích 25 µl nhƣ trong bảng 2.1. Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen Nƣớc 10,85 µl Buffer 2,5 µl MgCl2 4 µl dNTPs 2,5 µl Mồi H1255-F 0,5 µl Mồi L16725-R 0,5 µl Taq DNA polymerase 0,15 µl DNA temp 4 µl Tổng thể tích 25 µl Bảng 2.2. Chu trình nhiệt Các bƣớc Khởi động nóng Biến tính Gắn mồi Kéo dài Ổn định Giữ mẫu Nhiệt độ 94oC 94oC 50oC 72oC 72oC 4oC Thời gian 4' 1' 1' 1'20" 10' ∞ Số chu kì 1 30 1 Sau khi kết thúc phản ứng, điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%. 2.3.5. Tinh sạch sản phẩm DNA - Cân ống eppendoff (1,5ml) - Điện di toàn bộ sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%, sau đó tiến hành cắt gel trên máy soi DNA, thu lấy các vạch DNA đặc hiệu rồi cho vào ống eff đã cân. - Cân lại ống eff có chứa gel để biết đƣợc trọng lƣợng của băng gel ta vừa cắt. - Bổ sung dung dịch MBS (Membrane Binding Solution) với tỉ lệ 1mg gel: 1 µl dung dịch MBS và ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 50-60oC để gel tan hoàn toàn. - Hút dịch gel hòa tan vào các vi cột, giữ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 phút, sau đó ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC và đổ dịch thừa. - Bổ sung 700 µl dung dịch MBW (Membrane Wash Solution) và ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC, sau khi ly tâm cũng loại bỏ dịch. - Lặp lại bƣớc trên với 500 µl dung dịch MBW và ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Đổ dịch thừa và ly tâm lại trong 1 phút. - Chuyển vi cột sang 1 ống eff 1,5 ml mới, sau đó cho vào máy sấy khoảng 5 phút. - Bổ sung thêm khoảng 30-35 µl H2O 2x để ở nhiệt độ phòng 1 phút rồi ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC, cuối cùng bảo quản mẫu sau khi tinh sạch ở -20oC. 2.3.6. Phƣơng pháp xác định trình tự • Nguyên tắc chung Trình tự vùng D-Loop đƣợc xác định dựa trên nguyên tắc chung của phƣơng pháp Sanger: Tạo ra các đoạn Oligonuclotide hơn kém nhau 1 nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã đƣợc đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDya Terminator v3.1 Cycle Squencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự nhƣ dNTPs,ddNTPs, DNA polymerase... Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn và mồi phù hợp. Phản ứng đƣợc thực hiện trong 1 ống vì 4 loại ddNTP đx đƣợc đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2pM, 200ng DNA khuôn, BigDye và nƣớc với tổng thể tích là 15 µl. Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 Các bƣớc Khởi động nóng Biến tính Gắn mồi Kéo dài Giữ mẫu Nhiệt độ 94oC 96oC 50oC 60oC 4oC Thời gian 1' 10'' 5'' 4' ∞ Số chu kì 1 25 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ Để tìm hiểu sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các cá thể thuộc ba giống gà Ri, Mông, Đa cựa chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của chúng, dùng kỹ thuật PCR để nhân đoạn điều khiển trong ty thể, xác định trình tự của vùng D-Loop. Từ đó, so sánh các trình tự này để tìm ra sự khác biệt giữa chúng. 3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà Để tiến hành đánh giá đa dạng di truyền các giống gà, vấn đề quan trọng đầu tiên là phải thu nhận đƣợc DNA tổng số ở dạng tinh sạch và không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Có nhiều phƣơng pháp tách chiết DNA từ máu động vật nhƣng việc lựa chọn một phƣơng pháp tách chiết có nhiều ƣu điểm và phù hợp với đối tƣợng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm này là mẫu máu cho nên chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp có sử dụng protease K và SDS của Sambrook và Russel để tách chiết DNA. Trƣớc tiên, máu đông đƣợc làm tan trong bể ổn nhiệt ở 39oC trong 2 giờ. Trong điều kiện về nhiệt độ và thời gian nhƣ vậy, plasminogen trong huyết tƣơng sẽ đƣợc chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein nhƣ fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào đƣợc giải phóng. Sau khi rã đông đem ly tâm dung dịch máu đã đƣợc hòa tan trong dung dịch đệm PBS. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì dộ pH của máu. Các tế bào thu đƣợc đem hòa tantrong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA ra môi trƣờng. Thành phần EDTA sẽ liên kết với các Mg2+, nhờ vậy mà hoạt động của các nuclease bị ức chế. Nhƣ vậy, cả SDS và EDTA đều tham gia bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các nuclease. Ngoài ra, protease K có trong đệm chiết sẽ phân hủy các liên kết peptit trong protein. pH kiềm của dung dịch đệm chiết làm DNA trở nên ổn định. Để loại bỏ thành phần protein trong mẫu tách, chúng tôi tiến hành lắc mạnh mẫu với hỗn hợp phenol: chloroform: isoamy alcohol. Chloroform làm tăng cƣờng hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhƣng không làm ảnh hƣởng đến cấu trúc của DNA. Đồng thời, nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nƣớc với với pha hữu cơ. Isoamy alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp đƣợc phân làm ba pha: pha trên cùng là pha nƣớc có chứa DNA, pha giữa là protein đã bị biến tính, và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, chloroform và isoamy alcohol. Pha nƣớc đƣợc hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó đƣợc xử lý bằng hỗn hợp chloroform: isoamy alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bƣớc này có thể lặp lại 1-2 lần. Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50 µm CH3COONa 3M, pH 5,2 và 1ml EtOH 100%. EtOH có tác dụng hút lớp nƣớc bao quanh phân tử DNA, để lộ ra các gốc phosphat tích điện âm. Khi đó các ion Na+ sẽ kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa các chuỗi nucleitit giảm, do đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện -20oC trong 15 giờ thì DNA kết tủa gần nhƣ DNA kết tủa hoàn toàn. Tủa thu đƣợc đƣợc rửa bằng EtOH 70%, Làm khô và hòa tan trong nƣớc. Trong dung dịch này có lẫn nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã loại RNA bằng RNase, ủ ở 37oC trong 2-3 giờ. DNA tinh sạch đƣợc hòa tan trong nƣớc khử ion vô trùng và đem điện di kiểm tra trên gel agrose 0,8%. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.1. Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số 1: DNA tổng số gà Ri; 2: DNA tổng số gà Mông; 3: DNA tổng số gà Đa Cựa Trên ảnh điện di, các mẫu đều xuất hiện một vạch DNA sáng đậm ở vị trí cao nhất trên bản gel. Theo lý thuyết, DNA tổng số bao gồm các đoạn có kích thƣớc từ 10 kb đến 300 kb, khi điện di sẽ tập trung thành một vạch đậm. Nếu DNA tách chiết đƣợc có lẫn protein, các phân tử protein chƣa đƣợc loại hoàn toàn sẽ tạo thành vạch sáng kéo dài phía trên vạch DNA tổng số. Hình 1.3 cho thấy sản phẩm DNA tách chiết ít bị lẫn protein tạp và dựa vào độ sáng của vạch DNA tổng số, có thể thấy nồng độ DNA thu đƣợc khá cao. Chúng tôi kết luận DNA tổng số tách chiết từ các mẫu máu gà đảm bảo chất lƣợng để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể Tốc độ tích lũy đột biến trong vùng trình tự điều khiển cao gấp 5-10 lần so với các gen khác trong hệ gen ty thể, do đó nó rất có ý nghĩa rất quan trọng trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật. Nhằm mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của 3 giống gà Ri, Mông và Đa cựa, chúng tôi đã sử dụng vùng trình tự D-Loop trong hệ gen ty thể làm đối tƣợng nghiên cứu. Để nhân vùng D-Loop từ mẫu DNA tổng số đã thu đƣợc chúng tôi tiến hành PCR với việc sử dụng cặp mồi H1255 và L16725. L16725 (Tm = 60oC): 5'-AGGACTACGGCTTGAAAGC-3 '(19 nucleotit) H1255 (Tm = 55OC): 5'-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3 '(21nucleotit) Cặp mồi này đƣợc thiết kế dựa trên trình tự hai đầu đoạn D-Loop ở gà nhà và là cặp mồi bảo thủ, do đó có thể sử dụng cho nhiều đối tƣợ ng khác trong bộ gà. Theo lý thuyết, sản phẩm thu đƣợc khi nhân bản bằng cặp mồi trên có chiều dài khoảng 1,3 kb. PCR là loại phản ứng đòi hỏi sự chính xác về chu trình nhiệt của phản ứng cũng nhƣ thành phần và nồng độ các chất tham gia. • Chu trình nhiệt của PCR - Giai đoạn biến tính (Denaturation): Nhiệt độ biến tính thƣờng khoảng 94 - 95oC để đảm bảo sau khoảng 30 chu kỳ PCR, Taq vẫn giữ đƣợc hoạt tính. Thời gian biến tính tùy thuộc vào hàm lƣợng G - C và chiều dài của phân tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến tính là 94oC trong 1 phút. Trƣớc khi bƣớc vào chu kỳ thứ nhất, nhiệt độ đƣợc đặt 94oC trong 4 phút để đảm bảo phân tử DNA đƣợc biến tính hoàn toàn. - Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Vì Tm nhỏ nhất của cặp mồi trên là 55oC nên nhiệt độ gắn mồi có thể từ 50 - 52oC. Chúng tôi đã thử chạy phản ứng ở một số giá trị khác nhau trong khoảng nhiệt độ này và chọn đƣợc nhiệt độ gắn mồi tối ƣu trong thí nghiệm này là 50oC. - Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extension): Nhiệt độ lúc này đƣợc tăng đến 72oC để cho enzym Taq polymerase hoạt dộng tốt nhất. Tốc độ tổng hợp của phản ứng vào khoảng 1000 nucleotit/phút. Trình tự vùng D-Loop quan tâm có kích thƣớc khoảng 1,3 kb nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi đƣợc lựa chọn là 1 phút 20 giây. Sau khi kết thúc 30 chu kỳ, chúng tôi đặt nhiệt độ lên 72oC trong 10 phút để đảm bảo sự tổng hợp đƣợc kết thúc hoàn toàn. Sau đó sản phẩm PCR đƣợc giữ ở nhiệt độ 4oC. • Thành phần và nồng độ các chất tham gia: Tham gia vào phản ứng này là 7 thành phần thiết yếu, đó là: Taq DNA polymerse, dung dịch đệm, mồi, MgCl2, các dNTP, DNA khuôn và nƣớc. Trong đó có 3 thành phần thƣờng thay đổi trong từng phản ứng đó là: Mồi, MgCl2 và DNA khuôn. - Dung dịch đệm: PCR đƣợc thực hiện trong một môi trƣờng đệm phù hợp với hoạt động của enzym với giá trị pH là 7,2. Trong thí nghiệm này, sau + khi khảo sát, chúng tôi sử dụng loại đệm có chứa NH4 của hãng Fementas, nó phù hợp với hoạt động của enzym Taq polymerase và khoảng biến thiên rộng về nồng độ của MgCl2. Hơn nữa, loại đệm này cho chất lƣợng sản phẩm tốt + hơn so với loại đệm không có chứaNH4 . - Mồi: Đây là một yếu tố rất quan trọng trong PCR bởi việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi và nồng độ của mồi có ảnh hƣởng đến lƣợng sản phẩm thu đƣợc. Nồng độ mồi xuôi và ngƣợc đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này là 10pmol/µl. - MgCl2: Vai trò của ion Mg2+ là tạo phức với dNTP và gắn chúng với enzym, kích hoạt và tăng sự kết hợp giữa mồi và khuôn. Nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm hoạt tính của enzym. Tuy nhiên, nếu nồng độ này quá cao sẽ ức chế hoạt động của enzym. Sau khi khảo sát, chúng tôi thấy nồng độ Mg2+ là 10mM cho kết quả tốt nhất. - 4 loại dNTP: Nồng độ của mỗi loại dNTP đều phải bằng nhau và phụ thuộc nhiều vào kích thƣớc của đoạn DNA đích, nồng độ của mồi và MgCl2. Nồng độ của các dNTP lớn hơn 4mM sẽ ức chế phản ứng PCR do ion Mg2+ bị cô lập, dễ dẫn đến sự nhân lên của các đoạn không cần thiết. Qua thử nghiệm, chúng tôi thấy nồng độ của các dNTP 1mM là phù hợp. - Thành phần cuối cùng của PCR là DNA khuôn có chứa trình tự đích cần nhân lên, nó phải đảm bảo yêu cầu đƣợc tinh sạch và ít bị đứt gãy. Thông thƣờng, hàm lƣợng DNA khuôn trong mỗi hỗn hợp phản ứng là 10 - 100ng/ phản ứng. Sản phẩm PCR đƣợc bảo quản ở 4oC. Sau khi đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả thu đƣợc thể hiện trên hình 3.2. M 1 2 3 Kb 1,5  1,3 1,0 Hình 3.2. Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR M: Marker; 1: Mẫu gà RI; 2: Mẫu gà Mông; 3: Mẫu gà Đa Cựa Quan sát ảnh chụp kết quả điện di, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA nằm ở vị trí giữa vạch 1,5 kb và 1 kb trên thang kích thƣớc chuẩn (marker), cho thấy kích thƣớc phân tử của sản phẩm PCR vào khoảng 1,3 kb, tức là phù hợp với tính toán theo lý thuyết. Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung và chỉ nhìn thấy băng phụ rất mờ bên dƣới chứng tỏ sản phẩm PCR tƣơng đối đặc hiệu. Kết quả này cho thấy chúng tôi đã nhân đƣợc vùng D-loop. Sản phẩm PCR đặc hiệu chứng tỏ chƣơng trình đã lựa chọn và nồng độ các chất tham gia phản ứng là phù hợp. 3.1.3. Xác định trình tự vùng điều khiển của DNA ty thể Đoạn D-Loop đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Sanger. Do xác định trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR nên chúng tôi sử dụng cặp mồi H1255 và L16725 làm cặp mồi cho 2 chiều đọc. Sở dĩ phải dùng cả mồi xuôi và mồi ngƣợc vì đoạn DNA cần xác định trình tự dài 1,3 kb trong khi ở điều kiện thí nghiệm tối ƣu, chỉ có thể xác định trình tự tối đa 900 - 1000 nuclotitde. Kết quả đƣợc kết hợp và xử lý bằng phần mềm Seqscape và BioEdit giúp xác định đƣợc trình tự đầy đủ của vùng D-Loop của các mẫu gà. Do mẫu gà Mông đọc trình tự gặp phải khó khăn nên trình tự D-Loop của gà Mông chƣa đầy đủ. Vì vậy chúng tôi công bố và so sánh kết quả hai mẫu Da và RI. So sánh trình tự Da và RI với nhau và với trình tự D-Loop của gà đã đƣợc công bố Galuss galuss gốc Nhật lấy trình tự trong trên ngân hàng gen mang mã số AB114078 quốc tế EMBL (EBI)/Gen Bank/DDBJ, chúng tôi thu đƣợc kết quả hình 3.3. 10 20 30 40 50 60 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 aattttattt tttaacctaa ctcccctact aagtgtaccc cccctttccc ccccaggggg DA G.CG..T.A. ...T...... .......... .......... .......... .......... RI C......... .......... .......... .......... .......... .......... 70 80 90 100 110 120 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 ggtatactat gcataatcgt gcatacattt atataccaca tatattatgg taccggtaat DA .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 130 140 150 160 170 180 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 atatactata tatgtactaa acccattata tgtatacggg cattaaccta tattccacat DA .......... .......... .......... .......... ......T... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... 190 200 210 220 230 240 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 ttctcccaat gtccattcta tgcatgatcc aggacatact catttaccct ccccatagac DA .......... .......... .......... .A........ ....C..... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... 250 260 270 280 290 300 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 agttccaaac cactatcaag ccacctaact atgaatggtt acaggacata aatctcactc DA .....T.... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... 310 320 330 340 350 360 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 tcatgttctc cccccaacaa gtcacctaac tatgaatggt tacaggacat acatctaact DA .......... ....T..... .......... .......... .......... ....T..... RI .......... .......... .......... .......... .......... ....T..... 370 380 390 400 410 420 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 accatgttct aacccatttg gttatgctcg ccgtatcaga tggatttatt gatcgtccac DA .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... 430 440 450 460 470 480 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 ctcacgagag atcagcaacc cctgcctgta atgtacttca tgaccagtct caggcccatt DA .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... 490 500 510 520 530 540 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 ctttccccct acacccctcg cccaacttgc cttccaccgt acctctggtt cctcggtcag DA .......... .......... ...T...... .......... .......... .......... RI .......... .......... ...T...... .......... .......... .......... 550 560 570 580 590 600 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 gcacatccca tgcataactc ctgaactttc tcacttttca cgaagtcatc tgtggattat DA .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... 610 620 630 640 650 660 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 cttcccctct ttagtccgtg atcgcggcat cttctctctt ctattgctgt tggttccttc DA .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... 670 680 690 700 710 720 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 tctttttggg gcttcttcac aggttgccct tcacagtgcg ggtgcggagt gctattcaag DA .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... 730 740 750 760 770 780 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 tgaagcctgg actacacctg cgttgcgtcc tatcctagtc ctctcgtgtc cctcgatgag DA .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... 790 800 810 820 830 840 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 acggtttgcg tgtatgggga atcatcttga cactgatgca ctttggatcg catttggtta DA .......... .A........ .......... .......... .......... .......... RI1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... 850 860 870 880 890 900 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 tggttcttcc accccccc-g gtaaatggtg ctatttagtg aatgcttgtc ggacatattt DA .......... ........-. .......... .......... .......... .......... RI .......... ........-. .......... .......... .......... .......... 910 920 930 940 950 960 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 ttatcaattt tcacttcctc tattttcttc acaaaactag gaaattcacc acaatttttt DA .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... 970 980 990 1000 1010 1020 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 c-tttgttat tttttaattt tttttttatt tattaaaaac attttttaaa aaactaaatt DA .-........ .......... .......... .T........ .......... .......... RI .-........ .......... .......... .T........ .......... .......... 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 acatacaaac taccgcataa aatccctcaa actatacaaa cgtttatcgt ataatatata DA .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1090 1100 1110 1120 1130 1140 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 tacattattg tttattctat cattattaga gaaactccac taccaaaacc atcattaaaa DA .......... .......... .......... .......... .......... .......... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AB114078 caaaaattta catgccactt aactcccctc acaaacaatc gttatttata ttgttaatta DA .......... .......... .......... .......... .......... ..A....... RI .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1210 1220 ....|....| ....|....| AB114078 gcaaacacaa aacccgcctt DA .......... .....A.... RI .......... .......... Hình 3.3. So sánh trình tự D-Loop của hai mẫu gà nghiên cứu Ri (RI) và Đa cựa (Da) với trình tự tham khảo mã số AB114078 So sánh hai mẫu Ri (RI) và Đa cựa (Da) với trình tự chuẩn chúng tôi thấy có 16 điểm đa hình/ đột biến (khác biệt nucleotide). Mẫu gà Da có 15 điểm (chiếm 1,23%) và RI có 4 điểm (chiếm 0.33%) khác với trình tự chuẩn. Cả hai giống thuộc mẫu gà Da và RI đều có cùng sự khác biệt nucleotide so với trình tự chuẩn AB114078 đó là các đột biến: Thay thế C bằng T ở vị trí 355, thay thế A bằng T ở vị trí 504 và vị trí 992. Ngoài ra giữa hai giống thuộc mẫu gà Da và RI còn có sự khác biệt với nhau ở 14 điểm đa hình ở các vị trí: Mẫu Da đột biến thay A thành G ở vị trí 1; đột biến thay G thành A ở vị trí 212, 792, 1193,1216; đột biến thay A thành T ở vị trí 7, 14; đột biến thay T thành A ở vị trí 9; đột biến thay T thành C ở vị trí 3, 225; đột biến C thành T ở vị trí 246, 315; Mẫu RI đột biến thay A thành C ở vị trí 1. Các sai khác giữa các mẫu là đột biến kiểu đồng hoán, và dị hoán đƣợc thống kê ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Thống kê các điểm đa hình ở hai mẫu nghiên cứu so với trình tự chuẩn STT Mẫu Thay đổi nucleotide Vị trí trên ty thể Kiểu biến dị 1 Da, RI C thành T 335 Đồng hoán 2 Da, RI A thành T 504 Dị hoán 3 Da, RI A thànhT 992 Dị hoán 4 Da A thành G 1 Đồng hoán 5 Da G thành A 212 Đồng hoán 6 Da G thành A 792 Đồng hoán 7 Da G thành A 1193 Đồng hoán 8 Da G thành A 1216 Đồng hoán 9 Da A thành T 7 Dị hoán 10 Da A thành T 14 Dị hoán 11 Da T thành A 9 Dị hoán 12 Da T thành C 3 Đồng hoán 13 Da T thành C 225 Đồng hoán 14 Da C thành T 246 Đồng hoán 15 Da C thành T 315 Đồng hoán 16 RI A thành C 1 Dị hoán Chúng tôi so sánh trình tự vùng D-Loop của 2 mẫu gà nghiên cứu với một số trình tự của các chủng gà đã đƣợc công bố: Giống Galuss galuss Murghi gốc Ấn Độ lấy trình tự trong ngân hàng gen mã số GQ293096, giống gốc Mỹ lấy trình tự trong ngân hàng gen mã số AY235570 và AY235571 để so sánh mức độ sai khác về trình tự nucleotide và xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng kết quả so sánh bảng 3.2. Bảng 3.2. So sánh mức độ sai khác về trình tự nucleotide AB114078 RI DA GQ293096 AY235570 AY235571 AB114078 0.0000 0.0033 0.0123 0.8156 0.1844 0.1329 RI 0.0033 0.0000 0.0115 0.8156 0.1819 0.1312 DA 0.0123 0.0115 0.0000 0.8164 0.1803 0.1296 GQ293096 0.8156 0.8156 0.8164 0.0000 0.7713 0.7705 AY235570 0.1844 0.1819 0.1803 0.7713 0.0000 0.1803 AY235571 0.1329 0.1312 0.1296 0.7705 0.1803 0.0000 Qua bảng 3.2 và so sánh sự sai khác trên trình tự gen cho thấy sự sai khác trình tự nucleotide giữa giống gà DA với giống gà Gallus galuss Murghi gốc Ấn Độ là cao nhất 81,64% (996 điểm đa hình), gà DA với giống gà Gallus galuss gốc Nhật là 15 điểm đa hình chiếm 1,23% , gà RI và gà DA là 14 điểm đa hình chiếm 1,15%, và sai khác về trình tự nucleotide giữa gà RI với giống gà Gallus galuss gốc Nhật là thấp nhất 0,33% (4 điểm đa hình). Mối quan hệ di truyền giữa các giống gà trên đƣợc thể hiện ở hình 3.4. AB114078 RI DA GQ293096 AY235570 AY235571 Hình 3.4. Quan hệ di truyền của một số giống gà Kết quả thu đƣợc hình 3.4 cho thấy các giống gà trên đƣợc chia thành 2 nhánh : Nhánh 1 gồm giống Gallus gallus gốc Nhật đƣợc đăng kí với mã số AB114078 có quan hệ gần nhất với giống gà RI, mức độ đồng nhất về thành phần nucleotide giữa chúng là 99,67%. Nhánh 2 gồm giống Gallus galuss Murghi gốc Ấn Độ, và 2 giống gà gốc Mỹ đƣợc đăng kí với mã số AY235570 và AY235571, trong đó giống gà đƣợc đăng kí với mã số AY235570 có quan hệ gần với giống gà đƣợc đăng kí với mã số AY235571, mức đồng nhất về thành phần nucleotide là 99,82%. 3.2. THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN HUYẾT THANH GÀ THÍ NGHIỆM Nghiên cứu xác định tính đa hình protein huyết thanh đã đƣợc tiến hành trên các mẫu huyết thanh của 3 giống gà: Ri, Mông và Đa cựa theo phƣơng pháp điện di SDS-PAGE, SDS-PAGE theo LaemLi, nguyên tắc và phƣơng pháp đã trình bày trong mục 2.3.3. Phổ điện di trong huyết thanh của các giống gà đặc trƣng cho loài. Giữa các cá thể cùng loài cũng có thể có phổ điện di có độ đậm nhạt khác nhau. Vì vậy để nghiên cứu sâu hơn về thành phần protein ở mức độ tiểu đơn vị cấu thành các đại phân tử protein trong máu gà và đánh giá chất lƣợng thịt cũng nhƣ phát hiện sự sai khác về protein máu của các dòng gà chúng tôi tiến hành phân tích thành phần điện di protein trong máu của các giống gà thí nghiệm, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.3. Hình 3.5: Phổ điện di SDS – PAGE protein huyết thanh. Đƣờng chạy M: Thang protein marker chuẩn; Đƣờng chạy 1 đến 3: Dung dịch huyết thanh pha loãng của ba đại diện của giống gà Ri Mông và Đa cựa. Kết quả điện di cho thấy hệ protein trong huyết thanh gà tƣơng đối phức tạp về thành phần và hàm lƣợng: số lƣợng băng – vạch thu đƣợc rất nhiều nhƣng cũng rất đa dạng về hàm lƣợng. Trong khi đa số các băng protein đều nhỏ và có hàm lƣợng thấp thì 2 protein có hàm lƣợng lớn nhất trong huyết thanh là Albumin (chiếm từ 50 – 75%) và IgG (khoảng 10%) lại hiện băng khá lớn. Số băng điện di protein huyết thanh gà thí nghiệm dao động từ 7 đến 10 băng. Trong đó gà Ri có 10 băng, gà Mông có 8 băng, gà Đa cựa có 9 băng. Trong đó gà Ri xuất hiện thêm 4 băng ở các kích thƣớc: 15.4 KDa; 16.4Kda ; 32Kda ; 36KDa . Gà Mông xuất hiện băng 16.4 Kda, 32Kda; mất băng 14.4 Kda, 15.4KDa; Gà Đa cựa xuất hiện băng 15.4Kda; 16.4Kda ;32Kda ;mất băng 14.4. Quan sát hình ta thấy băng Albumin của gà Đa cựa là lớn nhất, băng lớn thứ 2 là gà Mông, băng nhỏ nhất là băng của gà Ri. Hàm lƣợng IgG (protein miễn dịch) của gà Đa cựa lớn nhất biểu hiện ở băng ta thấy đậm và lớn nhất so với băng của gà Mông và gà Ri. Điều đó có khả năng gà Đa cựa có hệ thống miễn dịch tốt hơn so với gà Mông và gà Ri, có tác dụng chống chịu với điều kiện khí hậu khắc nghiệt, chống lại các kháng nguyên lạ xâm nhập vào cơ thể và có vai trò quan trọng trong bảo tồn nòi giống. Bảng 3.3. Thống kê sự xuất hiện các băng điện di protein huyết thanh gà thí nghiệm Kích thƣớc KDa Số lƣợng băng điện di huyết thanh gà thí nghiệm RI Mo Da 14.4 1 0 0 15.4 1 0 1 16.4 1 1 1 18.4 1 1 1 25.0 1 1 1 32.0 1 1 1 36.0 1 1 1 45.0 1 1 1 66.2 1 1 1 116 1 1 1 Tổng 10 8 9 Nhƣ vậy giữa các mẫu gà thí nghiệm có sự khác nhau về số lƣợng, vị trí và độ đậm nhạt của các băng điện di chứng tỏ protein trong huyết thanh gà thí nghiệm đã biểu hiện tính đa hình. Mặt khác, protein trong huyết thanh có tính bảo thủ di truyền khá cao nên sự khác nhau về cấu trúc gen mã hóa protein trong huyết thanh hoặc sự biểu hiện của các gen này khác nhau giữa các giống. Đây là cơ sở để giải thích sự khác nhau về chất lƣợng của các giống gà thí nghiệm. KẾT LUẬN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Đã tách chiết và tinh sạch đƣợc DNA tổng số từ mẫu gà thuộc ba giống Ri, H'Mông và Đa cựa. 2. Đã nhân bản thành công đoạn điều khiển (Vùng D-Loop) của DNA ty thể của ba giống gà này với kích thƣớc khoảng 1,3 kb của ba mẫu trên bằng kĩ thuật PCR nhờ cặp mồi H1255 và L16725. 3. Đã xác định đƣợc trình tự của vùng D-Loop gồm 1220 nucleotit của vùng D-Loop của hai trong ba mẫu gà nghiên cứu và phát hiện đƣợc 16 điểm đa hình/ đột biến về nucleotit giữa đại diện của hai mẫu giống gà nghiên cứu với trình tự chuẩn. 4. Kết quả phân tích thành phần điện di protein trong huyết thanh của ba mẫu gà thí nghiệm cho thấy sự khác nhau về số lƣợng, độ đậm nhạt và vị trí của một số băng điện di của các giống gà. Protein huyết thanh trong máu gà thể hiện tính đa hình. ĐỀ NGHỊ Trong phạm vi nghiên cứu này, với số lƣợng chỉ lấy từ một cá thể thuộc mỗi giống, chúng tôi chỉ đƣa ra đƣợc số liệu ban đầu về đặc điểm đa hình vùng D-Loop trên ty thể của hai giống gà Ri và Đa cựa thuộc loài Gallus gallus domesticus. Để có thể đánh giá đƣợc toàn diện hơn về ý nghĩa c ủa các vị trí đa hình/ đột biến trên vùng D-Loop hoặc đƣa ra đƣợc các kết luận đày đủ hơn về sự đa dạng DNA giữa các giống gà này cần phải tiến hành nghiên cứu và phân tích trên một số lƣợng mẫu lớn hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Ân (1983), Di truyền học động vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 2. Trịnh Đình Đạt (2003), Di truyền và chọn giống động vật, Nxb Đại Học Quốc Gia Hà Nội. 3. Nguyễn Hải Hà (2000), Tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển ADN ty thể của hai loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam, khóa luận tốt nghiệp nghành công nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội, Trƣờng ĐHKHTN. 4. Trịnh Hữu Hằng, Trần Công Yên (1998), Sinh học cơ thể động vật, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội. 5. Nguyễn Trƣờng Huy (2008), Nghiên cứu đa hình trình tự đoạn D-Loop trong hệ gen ty thể ở một số giống gà Việt Nam, khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng ĐHKH tự nhiên, Hà Nội 6. Địch Thị Kim Hƣơng (2006), phân định một số chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) qua ADN ty thể , khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng ĐHKH tự nhiên, Hà Nội. 7. Nguyễn duy Hoan (1999), Chăn nuôi gia cầm (giáo trình dùng cho cao học và nghiên cứu sinh), NXB Nông Nghiệp Hà Nội. 8. Nguyễn Trọng Lạng, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Tâm (2005), Sinh học tế bào, NXB Nông Nghiệp. 9. Dƣơng Văn lộc (2004), Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, năng suất thịt và một số chỉ tiêu hóa sinh gà lai F1 Lương Phượng - Ri và Ai Cập - Ri nuôi bán chăn thả tại Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ, Trƣờng Đại Học Sƣ Phạm, Đại Học Thái Nguyên. 10. Nguyễn Thị Mai (2007), chăn nuôi gia cầm, Nxb Hà Nội. 11. Lê Minh (2002), Ảnh hưởng của thuốc Avicoc và Rigecocsin đến khả năng sản xuất gà thịt Lương Phượng và Sasso nuôi bán chăn thả tại Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại Học Nông Lâm, Đại Học Thái Nguyên. 12. Trần Thanh Vân, Hoàng Văn Tiêu, Nguyễn Khánh Quắc (1997), Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu vịt Khakicampbell, vịt cỏ và con lai F1 của chúng nuôi chăn thả tại Thái Nguyên, Báo cáo khoa học NCTY, hội nghị khoa học Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn 8/1997 Nha Trang, Khánh Hòa. 13. Kim Thị Phƣơng oanh (1999), Ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu sự khác biệt di truyền ở một số loài gà lôi Việt Nam, luận án Thạc sĩ Sinh học, trƣờng Đại Học Sƣ Phạm, ĐHQG Hà Nội. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14. Baker A. J., Marshall H. D. (1997), "Mitochondrial control region sequences astools of understanding evolution of avian taxa", In "Avian Molecular Systematics and Evolution" (Mindell D. P., Ed), 51-80, Academic Press, San Diego. 15. Chinnery P. F., Schon E. A. (2003), "Mitochondria", J. neurol. Neurosurg. Psychiatry, 74: 1188-1199. 16. Desjadins P., Morais R. (1990), "Sequence DNA gene organisation of the chicken mitochondrial genome, A novel gene order in higher vertebrates", J.Mol.Biol.,212,pp.599-635). 17. Ingman M.,(2001), "Mitochondrial DNA Clarifies Human Evolution", 18. Ingman M.,(2003), "Mitochondrial and Clarifies Human Evolution", summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Medicine 1288. 50, Acta University, Uppsala. 19. Gilbert, A.B (1971), "The egg, ist physical and biochemical aspectc", In:domestic fowl, Bd.3, Academic press, London/ NewYork,1971). 20. Hillis D. M., Moritz C., Mable B. K., 1996. Molecular Systematics. Sinamer Associates, Inc., second edition. 21. Kimball R.T.,Braun E.L., Zwarrtjes P.W., Crowe T.M.(1999),and ligon J.D.A Molecula phylogeny of the pheasants and partridges suggests that these lineages are not monophyletic. Mol. Phylogenet. Evol., 11(1)tr.38-54). 22. Komiyama T., Ikeo K., Tateno Y., Gojobori T. (2004), "Japanese domesticated chickens have been derived from Shamo traditional fighting cocks", Mol. Phylogenet. Evol., 33(1):16-21). 23. Komiyama T., Ikeo K., Gojobori T (2004)," The evolutionary origin of long-crowing chicken: its evolutionary relationship with fighting cocks disclose by the mtDNA sequence analysis", Gene,333: 91-99)) 24. krist L.(2000), Phylogeny DNA phylogeography of European parids, Oulu university, Oulu). 25. Kris L (2002) "Phylogeny and phylogeography of Euro pean Parids", chapter 1. Introduction: Evolution and mitochondrial DNA in birds. Department of Biology, Oulu Universsity library. 26. Laemli U.K(1970), Cleava of structural proteins during the assembly of head of baterio phage T4, Nature, 277, pp.680.685. 27. Lander E. S., Botstein D. (1989), "Mapping Mendelian factors underlying quantitive traits using RFLP linkege maps", Genet. 121: 185-199. 28. Litti M., Luty J. A. (1989), "A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of dinucleotide repeat winthin the cardiac muscle actin gene", Am. J .hum. Genet. 44:397-401. 29. Moulin S., Randi E., Tabarroni C., Hennache A.(2003),"Mitochondrial DNA diversification among the subspecies of the Silver and Kalij pheasants, Lophura nycthemera and L. leucomelanos, phasinidae", Ibis, 145(online), E1-E11.) 30. Mindell D. P, Sorenson M. D., Dimcheff D. E (1998), "Multi endependent origins of mitochondrial gene order in birds", Mol. Biol. Evol., 95, pp. 10693-10697. 31. Niu D., Fu Y., Luo., Ruan H., Yu X., Chen G., Zhang Y. (2002),"The origin and genetic diversity of Chinese native chicken breeds",Biochem. Genet., 40:5-6.) 32. Niu D., Fu Y., Luo J., Ruan H., Yu X.P., Chen G., Zang Y. P. (2002),"The origin DNA genetic diversity of Chinese native chicken breeds", Biochem. Gene., 40(5),pp. 163-174)) 33. Fuhimito A., Miyake T.,Takada M., Shinggu R., Endo T., Gojobori T., Kondo N., Ohno S.(1996), "Monophyletic origin DNA unique dispersal patterns of domestic fowls", Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93(13),pp.6792-6795). 34. Pereira S. L., Bakern A. J (2004),"Low number of mitochondrial pseudogenes in the chiken (GALLUS GALLUS) nuclear genome: implications for molecular inference of population history DNA phylogenetics", BMC Evol. Biol., 4(17).) 35. SambrookJ., Russell D.W, (2001), Moleular Cloning: Alabroratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, NewYork. 36. Wang J., He X., Ruan J., Dai M., Chen J.,Zhang Y., Hu C., Cong L., Fang L., Liu B., Li S., Wang L., Burt D. W., Ka G., Wong S., Yu J., Yang H., Wang J.(2005)"Chick VD: A sequence variation database for the chicken genome", Nucle Acids Res., 33(5),pp.438-441. 37. 38. ncbi.nlm.nih.gov. Phô lôc Ảnh 1: Gà Ri (RI) nuôi tại Bắc Kạn Ảnh 2a: Gà Đa Cựa (Da) nuôi tại Bắc Kạn Ảnh 2b: Gà Đa Cựa (Da) nuôi tại Bắc Kạn Ảnh 3: Gà Mông (Mo) nuôi tại Bắc Kạn