Luận văn Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis có trong Natto Nhật Bản hướng tới thực phẩm chức năng

thì hoạt tính enzyme giảm ở cả hai trường hợp với lượng giống 107 cfu/g cũng như lượng giống 108 cfu/g môi trường, Nhưng khi có bổ sung thêm NaCl 0,5% + 0,1% nấm men trích ly và tỉ lệ cấy giống là 108 cfu/g thì hoạt tính enzyme tăng so với đối chứng ở cả hai mật độ giống. Vì vậy chúng tôi chọn MT có bổ sung thêm NaCl 0,5% + 0,1% nấm men trích ly và tỉ lệ cấy giống là 108 cfu/g cho các khảo sát tiếp theo. 3.4.6. Ảnh hưởng của Zn2+ và K+ Ngoài các yếu tố như Magnesium, calcium, thì kẽm và kali cũng là những nguyên tố cần thiết cho sư tổng hợp Nattokinase. Xue Jian et al., (2005)[59] đã chỉ ra rằng MgSO4 0,2%, CaCl2 0,2% cho hoạt tính protease cao nhất. Trên môi trường cơ sở có magnesium và calcium chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của kẽm và kali. Kết quả được trình bầy ở bảng 3.10 và hình 3.15. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của Zn2+ và K+ đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18 STT Nguyên tố khoáng Hoạt độ Protease ( U/g) 1 Đối chứng 227,30c ± 0,78 77 215.0 220.0 225.0 230.0 235.0 240.0 245.0 250.0 255.0 Đối chứng ZnCl2 KCl 227.30 250.20 231.60 H oạ t tí nh p ro te as e (U /g ) Muối khoáng 2 ZnCl2 250,20a ± 0,47 3 KCl 231,60b ± 0,75 *Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05) Hình 3.15. Ảnh hưởng của Zn2+ và k+ đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18 Nhận xét: Qua kết quả thể hiện ở bảng 3.10 và hình 3.15 cho thấy Zn2+ là nguồn khoáng cần thiết cho B.subtilis tổng hợp protease. Điều này có thể giải thích là do ion Zn2+ đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính của serine protease. Đối với nguyên tố K+ được bổ sung dưới dạng KCl đã cho kết quả cao trong nghiên cứu này (231,60 U/g). Tuy nhiên hoạt tính protease không cao bằng trường hợp bổ sung ion Zn2+ (250,20 U/g). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Cong Wang et al.,(2009) [26] cho rằng hoạt tính enzyme được hoạt hóa bởi Zn2+ .Từ kết quả này chúng tôi chọn ZnCl2 0,01% để tiến hành cho các khảo sát tiếp theo. 3.4.7. Ảnh hưởng thời gian lên men đến phát triển sinh khối và hoạt tính protease Trên môi trường cơ sở gồm cám mì và bột đậu nành theo tỷ lệ 7/3 và các yếu tố khác đã tối ưu, chúng tôi tiến hành lên men bán rắn, nhiệt độ 37oC, từng khoảng thời gian 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, lấy mẫu phân tích hoạt tính enzyme theo phương pháp Anson cải tiến và phương pháp đếm KL. Kết quả trình bày ở bảng 3.11 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến phát triển sinh khối và hoạt tính protease của chủng B.subtilis N18 78 Chỉ tiêu theo dõi Thời gian lên men 24 giờ 48 giờ 72 giờ Hoat tính protease U/g 220,23 258,34 257,56 Số lượng tế bào 109 CFU/g 1,7 3,5 3,5 Nhận xét: Qua kết quả bảng 3.11 cho thấy hoạt tính enzyme và mật độ tế bào tăng dần từ 24 giờ lên 48 giờ, còn từ 48 giờ đến 72 giờ cả hoạt tính enzyme và mật độ tế bào hầu như thay đổi không đáng kể, vì vậy để tiết kiệm năng lượng và thời gian, chúng tôi dừng thời gian lên men ở 48 giờ. 3.4.8. Tối ưu hóa nồng độ tween 80 và glucose bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao, cấu trúc có tâm Các chất hoạt động bề mặt (surfactant inclusions) có vai trò quan trọng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, glucose cung cấp nguyên liệu ban đầu để vi sinh vật phát triển trước khi tổng hợp được các enzyme để phân giải glucose từ nguồn tinh bột có trong môi trường. Egwin et al.,(2012)[31] đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt như tween 80, acetonitrile cho vào môi trường nuôi cấy B.subtilis đến lượng protease sinh ra. Kết quả thấy rằng cho tween 80 vào môi trường thì lượng protease tăng lên 5 lần và enzyme có tính ổn định hơn ở nhiệt độ 50-60oC. Sự phát triển của vi sinh vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố và chúng ta cần phải xem sự tác động của những yếu tố đó như thế nào. Hoạt tính của enzyme thu được không chỉ bị ảnh hưởng bởi từng yếu tố riêng lẻ mà còn bị ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa các yếu tố với nhau. Vì thế, nếu chỉ dựa trên những nghiên cứu rời rạc để đưa ra giá trị tối ưu thì kết quả sẽ không đạt được độ chính xác cao. Để quá trình nuôi cấy vi khuẩn B.subtilis N18 đạt hiệu quả và đánh giá chính xác, toàn diện hơn về ảnh hưởng của từng yếu tố Tween 80 và Glucose cũng như ảnh hưởng đồng thời của hai yếu tố này đến hoạt tính enzyme protease, chúng tôi nuôi chủng VK B.subtilis N18 trên môi trường theo mục 3.4.7, đồng thời tiến hành thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm với hàm mục tiêu là hoạt tính enzyme protease [27][36][37]. 79 Chúng tôi thay đổi đồng thời hai yếu tố khảo sát là nồng độ Tween 80 và Glucose, từ đó xác định quy luật ảnh hưởng của hai yếu tố này đến hàm mục tiêu. Trên cơ sở đó chúng tôi sẽ chọn ra các thông số tối ưu. Số thí nghiệm tối ưu là 11 thí nghiệm, trong đó 3 thí nghiệm ở tâm phương án. Hàm mục tiêu là hoạt tính enzyme protease y . Các giá trị khảo sát của hai yếu tố tối ưu như sau: - x1 là nồng độ Glucose với khoảng khảo sát là 1 – 4%, mức tâm là 2,5%, khoảng biến thiên là 1,5% - x2 là nồng độ Tween 80 với khoảng khảo sát là 0,02 – 0,04%, mức tâm là 0,03%, khoảng biến thiên là 0,01%. Kết quả của thí nghiệm tối ưu nồng độ Tween 80 và glucose với hàm mục tiêu là hoạt tính enzyme protease được trình bầy trong bảng 3.12. Bảng 3.12. Ma trận quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm và kết quả TN X1 x2 x1 (%) x2 (%) y (U/g) 1 -1 -1 1 0,02 258,72 2 1 -1 4 0,02 222,87 3 -1 1 1 0,04 47,16 4 1 1 4 0,04 291,67 5 -1 0 1 0,03 195,42 6 1 0 4 0,03 300,71 7 0 -1 2,5 0,02 234,50 8 0 1 2,5 0,04 156,01 9 0 0 2,5 0,03 281,01 10 0 0 2,5 0,03 287,15 11 0 0 2,5 0,03 282,30 Sử dụng chương trình Modde 5.0 để giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và kiểm định sự tương thích của các hệ số hồi quy và phương trình. Các kết quả được thể hiện ở bảng 3.15. Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ tween 80 và glucose đến hoạt tính protease của chủng B.subtilis N18 Y Coeff. SC Std. Err P Constant 273,954 8,37476 5,01693e-007 x1 52,3257 6,66482 0,000538267 80 x2 -36,8755 6,66483 0,00264498 x1 x1 -11,5939 10,2569 0,309617 x2 x2 -64,4044 10,2569 0,00150484 x1 x2 70,0907 8,16271 0,000353221 N = 11 Q2 = 0,847 RSD = 16,3254 DF = 5 R2 = 0,977 Conf. lev. = 0,95 Hệ số in nghiêng là hệ số không có ý nghĩa (Coefficients: Các giá trị của hệ số; Std.Err: Sai số chuẩn; P (P – value): Giá trị của hệ số; R2: Độ biến thiên thực; Q2: Độ biến thiên ảo; Conf. lev.: Mức ý nghĩa; DF: Bậc tự do; RSD: Độ lệch chuẩn). Mức độ phù hợp của mô hình được kiểm định thông qua các giá trị Q2, R2. Độ biến thiên thực R2 và độ biến thiên ảo Q2 cho ta biết một cách tổng quát sự thích hợp của mô hình thí nghiệm. R2 là tiêu chuẩn đánh giá cao nhất và Q2 là tiêu chuẩn đánh giá thấp nhất. Cả hai giá trị này là các số dao động trong khoảng từ 0 đến 1 và Q2 đạt giá trị âm nếu mô hình không phù hợp, kết quả không đáng tin cậy. Q2 và R2 đạt giá trị 1 chỉ ra mô hình rất tốt. Eriksson et al.,(2000) cho biết R2 dao động trong khoảng 0,8 – 0,9 và Q2 lớn hơn 0,5 là những giá trị chấp nhận được [39]. Điều này cũng tương đồng với các nghiên cứu của nhiều tác giả khác [40][38][42][44] Giá trị R2 và Q2 trong thí nghiệm này lần lượt là 0,977 và 0,847 đều thõa mãn với điều kiện đã nêu trên. Kết quả này chứng tỏ mô hình tương thích với thực nghiệm. Sau khi loại trừ hệ số không có ý nghĩa, chúng tôi xác định được phương trình hồi quy như sau: Y = 273,954 + 52,3257 x1 - 36,8755 x2 - 64,4044 x22 + 70,0907 x1 x2 (1) Ảnh hưởng của mỗi biến số trong hàm hồi quy được thể hiện trong bảng 3.13 ở mức ý nghĩa 95%. Theo phương trình hồi quy (1) với hàm đáp ứng là hoạt tính protease thì nồng độ tween 80 và glucose đều ảnh hưởng đến hoạt tính protease. Nồng độ glucose ảnh hưởng đến hoạt tính protease theo hàm bậc một. Nồng độ tween 80 ảnh hưởng đến hoạt tính protease theo hàm bậc hai. Mặt khác sự hiện diện của hệ số tương hỗ x1 x2 trong phương trình chứng tỏ nồng độ glucose và tween 80 không tác động độc lập mà tương tác giữa hai yếu tố này cũng ảnh hưỡng rõ rệt đến hoạt tính protease. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả trước đó. Theo Rowe (1987), Keshavarzi và cộng sự (2005), môi trường gồm nhiều 81 thành phần dinh dưỡng thường được sử dụng trong nuôi cấy Bacillus, các thành phần trong môi trường tác động tương hỗ, ảnh hưởng đến hoạt tính protease [48][49]. Trong thí nghiệm này, phương trình hồi quy (1) tương thích với kết quả đó. Do vậy nếu ta chỉ xét ảnh hưởng của nồng độ glucose và tween 80 một cách rời rạc rồi kết luận nồng độ thích hợp nhất thì kết quả này sẽ không đáng tin cậy. Phương trình hồi quy (1) được biểu diễn dưới dạng đồ thị đáp ứng bề mặt ở hình 3.16 trên ba trục tọa độ không gian và biểu diễn dưới dạng đồ thị các đường cong ở hình 3.17. Hình 3.16. Đồ thị đường cong biểu diễn mối quan hệ của x1(nồng độ Glucose), x2 (nồng độ Tween 80) và y (hoạt tính protease) Hình 3.17. Đồ thị đáp ứng bề mặt biểu diễn mối quan hệ của x1(nồng độ Glucose), x2 (nồng độ Tween 80) và y (hoạt tính protease) Nhận xét: Đồ thị hình 3.16 và 3.17 cho thấy ảnh hưởng rõ của nồng độ glucose và tween 80 đến hoạt tính protease. Chúng tôi nhận thấy không phải nồng độ glucose và tween 80 càng cao thì hoạt tính protease càng cao. Amin và Doelle (1990), Arcas et al.,(1987) cho rằng nồng độ chất dinh dưỡng quá cao sẽ ức chế sự phát triển của tế bào vi khuẩn [50][51]. 82 Kết quả tối ưu đạt được theo phương trình hồi quy như sau: - Nồng độ glucose: 3,9% - Nồng độ tween 80: 0,03% - Hoạt tính protease dự đoán theo phương trình hồi quy là 318.96 U/g Tiến hành kiểm tra thực nghiệm hoạt tính protease với nồng độ glucose và tween 80 thu được từ phương trình hồi quy. Kết quả đạt được như sau: Hoạt tính protease thu được là 315,26 U/g ứng với nồng độ glucose là 3,9% và nồng độ tween 80 là 0,03% Sự khác biệt về hoạt tính protease giữa giá trị dự đoán theo phương trình hồi quy và giá trị thực nghiệm là 1,16%. Như vậy giá trị thực nghiệm thu được là rất gần với giá trị tính toán từ phương trình hồi quy. Vậy mô hình dự đoán có tính chính xác cao Kết quả thu được bằng thực nghiệm cho thấy sự thay đổi nồng độ glucose và tween 80 đã làm thay đổi có ý nghĩa hoạt tính protease. Nồng độ glucose 3,9% và tween 80 là 0,03% được xem là các thông số tối ưu để thu được giá trị hoạt tính protease cực đại. Kết quả thí nghiệm cũng phù hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả. Egwin et al., (2012)[31] đã nghiên cứu ảnh hưởng của Tween 80 (chất hoạt động bề mặt) đến lượng protease sinh ra khi cho vào môi trường nuôi cấy B.subtilis. Kết quả thấy rằng khi cho tween 80 đã tăng lượng protease lên 5 lần. Theo các tác giả thì việc lựa chọn chất hoạt động bề mặt thích hợp trong nuôi cấy B.subtilis là yêu cầu cần thiết để sản xuất tối ưu protease. Ting wei Ku et al., (2009) [55] và Cong Wang et al., (2009)[26] đã chỉ ra rằng nguồn carbon tốt nhất trong nuôi cấy B.subtilis là glucose. Nadeem et al.,(2008)[43] nghiên cứu sản xuất protease bằng chủng Bacillus licheniformis đã khẳng định nguồn carbon tốt nhất là glucose. Saurabi S. et al., (2007)[50] đã kiểm tra sự phát triển và sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis SBP 29 cũng chỉ ra rằng glucose là nguồn carbon tốt nhất. 3.5. Nghiên cứu tạo chế phẩm protease giàu nattokinase 3.5.1. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase theo phương pháp sản xuất natto của Nhật Bản Từ hai chủng B.subtilis N18 và B. subtilis N441 đã phân lập được, chúng tôi tiến hành làm Natto theo phương pháp được trình bầy ở mục 2.3.17. Sáu nghiệm thức đã được thực hiện gồm đậu nành hấp chín với chủng B.subtilis N18, đậu nành hấp chín và cơm gạo lức với chủng B.subtilis N18, đậu nành hấp chín với chủng B.subtilis N441, đậu nành hấp 83 chín và cơm gạo lức với chủng B.subtilis N441, đậu nành hấp chín với hai chủng B.subtilis N18 và B.subtilis N441, đậu nành hấp chín và cơm gạo lức với hai chủng B.subtilis N18 và B.subtilis N441, tỷ lệ đậu nành/ cơm gạo lức là 5/4. Thí nghiệm thực hiện trong hộp Polypropylen 20x10x5cm, lên men thực hiện ở 40oC. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.13 và hình 3.14. Bảng 3.14. Hoạt tính protease trong các sản phẩm natto từ hai chủng B.subtilis N18 và B.subtilis N441 Các nghiệm thức Hoạt tính protease (U/g tươi) ĐN, B.subtilis N18 57,95 ± 0,01 ĐN + GL, B.subtilis N18 50,97 ± 0,04 ĐN, B.subtilis N441 49,53 ± 0,06 ĐN + GL, B.subtilis N441 42,56 ± 0,16 ĐN, B.subtilis N18+ B.subtilis N441 55,60 ± 0,06 ĐN + GL, B.subtilis N18+ B.subtilis N441 49,31 ± 0,00 Natto Nhật Bản 58,16 ± 0,16 Hình 3.18. Hoạt tính protease trong các sản phẩm natto 84 từ hai chủng B.subtilis N18 và B.subtilis N441 85 Độ nhớt cuả Natto chủng B.subtilis N441 Hình 3.19. Một số sản phẩm Natto từ hai chủng B.subtilis N18 và B.subtilis N441 Nhận xét: Kết quả thử nghiệm lên men đậu nành hạt hấp chín làm Natto cho thấy cả hai chủng B.subtilis N18 và B. subtilis N441 đều có khả năng sử dụng làm Natto. Hoạt lực protease trong các sản phẩm Natto làm ra đều tương đương với hoạt lực protease trong Natto Nhật. Đánh giá cảm quan chấp nhận tốt. Do Natto sản xuất bằng chủng B.subtilis N18 Natto chủng B.subtilis N18 & B.subtilis N441 (đậu nành & gạo lức) Natto chủng B.subtilis N18 & B.subtilis N441 (đậu nành) Độ nhớt cuả Natto chủng B.subtilis N18 86 có hoạt lực protease cao hơn, nhưng độ nhớt thấp so với Natto sản xuất với chủng B. subtilis N441, vì vậy chủng B. subtilis N18 thích hợp để sản xuất protease (Nattokinase) còn chủng B. subtilis N441 thích hợp để sản xuất Natto. Kết quả thí nghiệm cũng thấy rằng khi kết hợp thêm gạo lức, hoạt tính enzyme giảm so với nghiệm thức chỉ một mình đậu nành hấp chín. Ở nghiệm thức đậu nành hấp chín cùng với cơm gạo lức hoạt lực enzyme thấp hơn so với nghiệm thức chỉ mình đậu nành hấp chín, nhưng khi ăn ở nghiệm thức có gạo lức dễ ăn hơn, thích hợp cho một số đối tượng. Mùi vị của Natto không hấp dẫn nhiều người ( 20% người Nhật không thích mùi natto), cũng như nước mắm, mắm tôm, chao đối với nhiều người trong chúng ta, tất cả do thói quen, natto là một món ăn rất tốt cho sức khỏe do enzyme Nattokinase trong Natto có hoạt tính mạnh gấp bốn lần plasmin nội sinh, có khả năng làm tan huyết khối và giảm huyết áp. Natto sẽ là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và phòng chống các bệnh tim mạch tốt đối với người Việt nam, nếu được sản xuất trong nước với giá bán phải chăng, cũng như cung cấp giống và cách làm dễ dàng thì nhiều người Việt Nam chúng ta cũng có thể tự làm ở nhà để vừa nâng cao chất lượng dinh dưỡng trong bữa ăn hàng ngày vừa phòng ngừa được các bệnh tim mạch, nguy hiểm và rất tốn kém khi bị bệnh. 3.5.2. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase trên MT lên men bán rắn 3.5.2.1. Thu nhận chế phẩm enzyme protease sau lên men bằng ethanol Nhiều tác giả đã nghiên cứu tinh sạch enzyme Nattokinase từ canh trường nuôi cấy B.subtilis (Dubey R. et al., 2011)[30]. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng B. subtilis N18 trên môi trường bán rắn có bổ sung tỉ lệ cám mì / bột đậu nành là 7/3, nuôi ở 370C. Sau 48 giờ tiến hành tách chiết enzyme theo phương pháp trình bầy ở mục 2.3.19 và tủa enzyme theo mục 2.3.20. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến mục 2.3.13. Kết quả được trình bầy ở bảng 3.18 Bảng 3.15. Kết quả thu nhận chế phẩm enzyme protease bằng ethanol Sản phẩm sau lên men (g) Hoạt tính protease (U/g) Tổng hoạt tính sau lên men (U/g) Khối lượng CPE (g) Hoạt tính protease trong CPE (U/g) Tổng hoạt tính protease trong CPE (U/g) Hiệu suất thu hồi (%) 100 300 30000 3,79 3399,34 12883,50 42,9 87 Hiệu suất thu nhận enzyme protease sau lên men bằng ethanol đạt 42,9%. Có thể giải thích nguyên nhân làm cho hiệu suất thu hồi không cao là: - Các enzyme sau khi tủa hoặc tinh sạch có xu hướng kết tụ lại. Điều này ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt tính của enzyme do các trung tâm phản ứng bị vùi lấp bên trong và không phục hồi được sau khi hòa tan trở lại. - Do thời gian có hạn nên chúng tôi chỉ thực hiện tủa enzyme bằng tác nhân tủa là etanol với tỉ lệ 3 Etanol : 1ddE. Đây là tỉ lệ tham khảo từ các đề tài nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzyme protease khác. Vì vậy kết quả này chưa phải là kết quả tối ưu để tủa protase từ canh trường nuôi cấy chủng B. subtilis N18. Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn có các protein và nhiều tạp chất khác nhau. Hoạt tính riêng đặc trưng cho mức độ tinh sạch, vì vậy việc xác định hoạt tính riêng của các CPE sau khi tủa là cần thiết. Chúng tôi tiến hành hòa CPE vào dung dịch đệm phosphate có pH 8 và xác định hoạt tính chung của CPE theo phương pháp Anson cải tiến trình bày ở mục 2.3.13, xác định hàm lượng protein có trong CPE theo phương pháp Lowry mục 2.3.14, qua đó xác định được hoạt tính riêng của các CPE. Kết quả được trình bày ở bảng 3.19 Bảng 3.16. Hoạt tính riêng của chế phẩm enzyme protease thu nhận bằng kết tủa với Ethanol Hoạt tính chung protease (U/g) Hàm lượng protein (mg protein/g CPE) Hoạt tính riêng (U/mg protein) 3399,34 16187,33 0,21 Qua quá trình tham khảo từ các công trình nghiên cứu về thu nhận và tinh sạch enzyme, chúng tôi nhận thấy khi dùng tác nhân tủa là Ethanol thì hiệu suất thu nhận và hoạt tính chung, hoạt tính riêng của CPE cao hơn so với các tác nhân tủa khác như aceton, sulphate amon v.v.. Do vậy, chúng tôi chọn Ethanol làm tác nhân tủa để thu CPE. Hoạt tính này có thể cao hơn nếu CPE được tinh sạch bằng các phương pháp hiện đại như sắc ký, điện di, lọc gel. 3.5.2.2. Khảo sát đặc tính của chế phẩm enzyme protease thu nhận bằng ethanol Khảo sát pH tối ưu cho hoạt động của enzyme pH là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của enzyme vì khi pH thay đổi mức ion hóa cơ chất – enzyme sẽ ảnh hưởng tới vận tốc phản ứng và độ bền của enzyme. Enzyme có bản chất là protein nên mỗi enzyme có khả năng hoạt động tại một giá trị pH tối 88 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 6 7 8 9 10 11 pH Ho ạt tí nh p ro te as e (U /g ) 0 20 40 60 80 100 120 Ho ạt tí nh tư ơn g đố i ( % ) Hoạt tính Hoạt tính tương đới (%) ưu khác nhau. Vì vậy việc nghiên cứu ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme là cần thiết ( Hu Sheng et al.,(2003)[36]. Để khảo sát ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính của CPE, chúng tôi tiến hành trên cơ chất casein 1,5%, ở nhiệt độ 370C, tỉ lệ enzyme ở các mẫu là như nhau, thay đổi pH các mẫu ở các mức khác nhau: 6, 7, 8, 9, 10, 11. Xác định hoạt tính protease của CPE . Kết quả được trình bầy trong bảng 3.17 và hình 3.20. Bảng 3.17. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE STT pH Hoạt tính protease (U/g) Hoạt tính tương đối so với cực đại (%) 1 6 1221,18f ± 3,61 29,99 2 7 2778,37d ± 3,61 68,23 3 8 4071,81a ± 3,63 100,00 4 9 3497,35b ± 7,22 85,89 5 10 3197,47c ± 6,25 78,53 6 11 1878,74e ± 3,61 46,14 *Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05) Hình 3.20. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE Nhận xét: Kết quả từ bảng 3.17 và hình 3.20 cho thấy hoạt tính của CPE thay đổi theo pH, pH tối ưu cho hoạt động của CPE protease là 8 (100%), ở pH 6 là 29,99% và tăng 89 68,23% ở pH 7,0. Tại các giá trị pH 9, 10, 11 hoạt tính CPE lần lượt là 85,89%, 78,53%, 46,14% so với hoạt tính cực đại. Như vậy ta có thể kết luận CPE có khoảng pH hoạt động rộng từ 8,0 – 10,0. Trong khoảng này pH dao động từ 78,53% đến 100% so với hoạt tính tối ưu tại pH 8,0. Vậy có thể kết luận pH tối ưu cho hoạt động của CPE là 8 Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính xúc tác và vận tốc phản ứng của enzyme. Về nguyên tắc, khi nhiệt độ tăng thì vận tốc xúc tác sẽ tăng, khi nhiệt độ quá thấp, vận tốc xúc tác của enzyme không đáng kể, nhưng nhiệt độ quá cao enzyme sẽ bị biến tính. Để tìm ra giá trị thích hợp cho hoạt động của CPE, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính protease của CPE trong môi trường đệm phosphat pH = 8, cơ chất là casein 1,5%, các mẫu được bố trí thí nghiệm ở các mức nhiệt độ 350C, 400C, 450C, 500C, 550C, 600C. Sau thời gian phản ứng, tiến hành xác định hoạt tính protease của CPE theo Anson cải tiến. Kết quả được trình bày ở bảng 3.18 và hình 3.21 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của CPE STT Nhiệt độ (0C) Hoạt tính CPE (U/g) Hoạt tính tương đối so với cực đại ( %) 1 25 3197,47g ± 6,25 78,39 2 30 3295,02e ± 6,25 80,78 3 35 3656,32d ± 3,61 89,64 4 40 4079,03a ± 7,22 100,00 5 45 3988,71b ± 10,83 97,79 6 50 3844,19c ± 7,22 94,24 7 55 3226,37f ± 9,56 79,09 8 60 2998,76h ± 3,61 73,51 * Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05) 90 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 25 30 35 40 45 50 55 60 Nhiệ độ 0C H oạ t t ín h pr ot ea se (U /g 0 20 40 60 80 100 120 H oạ t tí nh t ư ơ ng đ ối ( % ) Hoạt tính protease (U/g) Hoạt tính tương đối ( %) Hình 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của CPE Nhận xét: Từ kết quả bảng 3.18 và hình 3.21 cho thấy khi nhiệt độ phản ứng tăng dần thì hoạt tính của CPE cũng tăng và đạt cực đại là 400C (4079,03 U/g). Nhiệt độ tiếp tục tăng cao hơn thì hoạt tính CPE giảm dần. Đến 600C thì hoạt tính chỉ còn 2998,76 (đạt 73,51% so với hoạt tính cực đại). Như vậy CPE có thể chịu được nhiệt độ từ 400C đến 500C. Do bản chất của enzyme là protein nên khác với các phản ứng hóa học, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định. Ở nhiệt độ cao, enzme bị tê liệt và bị phá hủy do rối loạn về cấu trúc phân tử bậc 2,3 làm hỏng trung tâm hoạt động được tạo nên từ các acid quan trọng và các nhóm ghép. Vậy có thể kết luận nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của CPE là 400C. Khảo sát nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt động của enzyme Thí nghiệm nhằm xác định nồng độ cơ chất thích hợp cho hoạt động của CPE. Tiến hành phản ứng enzyme ở nhiệt độ 400C, pH 8, thay đổi nồng độ cơ chất casein ở các mức khác nhau: 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5%; 3,0%. Xác định hoạt tính protease của CPE. Kết quả được trình bầy trong bảng 3.19 và hình 3.22 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của CPE STT Nồng độ cơ chất (%) Hoạt tính CPE (U/g) Hoạt tính tương đối so với cực đại 91 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Nồng độ cơ chất (%) H oạ t t ín h pr ot ea se (U /g ) ( %) 1 0,5 1434,34e ± 9,55 33,08 2 1,0 3482,90d ± 9,55 80,33 3 1,5 4335,56a ± 6,25 100,00 4 2,0 4248,84b ± 6,25 98,00 5 2,5 4212,71c ± 3,61 97,17 6 3,0 4205,49c ± 6,25 97,00 *Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05) Hình 3.22. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của CPE Nhận xét: Kết quả bảng 3.19 và hình 3.22 cho thấy hoạt tính của CPE tăng dần khi nồng độ cơ chất tăng, nồng độ cơ chất tại 0,5% và 1,0% hoạt tính tương ứng là 1434,34 U/g và 3482,90 U/g và đạt cực đại (4335,56 U/g) ở nồng độ 1,5%. Tại các gía trị nồng độ 2,0%; 2,5%; 3,0% hoạt tính CPE lần lượt là 4248,84 U/g; 4212,71 U/g và 4205,49 U/g, đã giảm so với hoạt tính cực đại. Khi tăng nồng độ cơ chất thì vận tốc phản ứng tăng theo nghĩa là hoạt tính của enyme tăng. Tuy nhiên vận tốc phản ứng đạt cực đại ở một giới hạn nồng độ cơ chất nhất định, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì vận tốc phản ứng cũng không tăng nữa do các trung tâm hoạt động của enzyme bị bão hòa bởi cơ chất. 3.5.3. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase và sinh khối Bacillus subtilis 92 Tế bào B. subtiliis đóng vai trò probiotic, gamma polyglutamic acid là chất làm ổn định hoạt tính enzyme rất tốt nên sử dụng toàn thể môi trường sau lên men dưới dạng bột khô hoặc dạng patte đều có thể sản xuất thành thực phẩm chức năng. Sơ đồ quy trình: Chuẩn bị giống → Chuẩn bị môi trường lên men → Thanh trùng, làm nguội → Cấy giống → Lên men→ Thu sản phẩm → Sản phẩm sau lên men→Sấy khô dưới 45oC→ Nghiền mịn → Rây thu hạt mịn → Kiểm tra chất lượng → Đóng bao → sản phẩm (nguyên liệu để làm thực phẩm chức năng) Giải thích quy trình: - Chủng VSV: Bacillus subtilis N18 → Chuẩn bị giống (từ ống đông khô→Thạch nghiêng → Nhân giống) - Chuẩn bị môi trường: Cám mì 66,40%, bột đậu nành 28,46%, glucose 3,9%, Tween 80 0,03%, Zn 0,01%, dung dịch A 5ml, dung dịch B 5ml, dung dịch C 5ml, NaCl 0,5%, nấm men trích ly 0,1%, pH MT ban đầu 9, độ ẩm 60%. - Thanh trùng môi trường 1 kg/cm2 trong 1 giờ - Cấy giống: Giống đã được chuẩn bị trước đó 14h, lượng giống cấy 108 cfu/g môi trường. - Lên men: Nuôi trên khay, chiều cao môi trường 3-5cm, nhiệt độ nuôi 370 C, thời gian nuôi 48 giờ. - Tạo sản phẩm: Phơi khô, nghiền mịn, xác định chất lượng - Sản phẩm: Nguyên liện cho sản xuất thực phẩm chức năng. - Chất lượng sản phẩm : 252,48 U/g Kết quả bảo quản sản phẩm Thí nghiệm bảo quản ở 4oC sau 1 tháng hoạt tính còn 238,16 U/g (đạt 94,33%), còn nếu bảo quản ở nhiệt độ phòng, sau một tháng hoạt tính còn 223,32 U/g (đạt 88,45%). Mẫu sản phẩm gửi Viện Pasteur Tp. Hồ chí Minh kiểm tra độ an toàn vi sinh. Kết quả kiểm nghiệm cho thấy sản phẩm không có E.coli, Salmonella. 93 Hình 3.23. Chế phẩm protease dạng bột khô giàu Nattokinase Tỷ lệ Nattokinase trong chế phẩm enzyme protease Từ chế phẩm enzyme thu được, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính Nattokinase trên cơ chất fibrin theo phương pháp trình bầy ở mục 2.3.15. Kết quả thu được ở bảng 3.23. Bảng 3.20. Tỷ lệ hoạt tính nattokinase trong chế phẩm enzyme protease Hoạt tính protease (U/g) Hoạt tính Nattokinase (FU/g) Tỷ lệ Nattokinase/ Protease (%) 4334,38 2915,09 67,23 Nhận xét: Từ kết quả bảng 3.23 cho thấy hoạt tính Nattokinase trong chế phẩm enzyme protease là 2915,09 FU/g, chiếm 67,23% hoạt tính protease tổng số, qua đó chứng tỏ khi CPE có protease tổng cao thì hoạt tính Nattokinase cũng cao. 94 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1) Chúng tôi đã phân lập, chọn lọc được một số chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh protease cao từ bốn mẫu Natto của Nhật Bản, hai chủng tốt nhất là B.subtilis N18 và B.subtilis N441 đã được sử dụng để định danh và xác định các điều kiện lên men tối ưu sản xuất chế phẩm enzyme protease. 2) Kết quả định danh bằng phương pháp cổ điển và phương pháp sinh học phân tử cho thấy hai chủng B.subtilis N18 và B.subtilis N441 thuộc loài Bacillus subtilis (so sánh với trình tự 16S-rARN của loài VK đã được định danh trong ngân hàng gen BLAST SEARCH. Kết quả cho thấy mức độ giống nhau của hai chủng B.subtilis N18 và B.subtilis N441 với loài B. subtilis là 100%.). 3) Đã xác định thành phần môi trường và điều kiện lên men tối ưu cho sản xuất protease ở chủng B.subtilis N18 bằng phương pháp cổ điển và phương pháp quy hoạch thực nghiệm với phần mềm Modde 5, như tỷ lệ cám mì/bột đậu nành, tỷ lệ cám mì, cám gạo, bột đậu nành, nồng độ glucose, ZnCl2, KCl, Tween 80 và các điều kiện lên men như độ ẩm, pH môi trường, tỷ lệ giống ban đầu và thời gian lên men. 5) Đã xây dựng ba phương pháp sản xuất chế phẩm enzyme protease giàu Nattokinase. - Phương pháp thứ nhất: Sản xuất theo phương pháp làm natto của Nhật Bản: Natto được sản xuất bằng đậu nành và đậu nành kết hợp với cơm gạo lức bằng hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis N18 và Bacillus subtilis N441 cho thấy sản phẩm làm ra cho hoạt tính protease tương đương với Natto Nhật Bản, hoạt tính đạt 57,95 U/g tươi, mùi vị màu sắc cảm quan tốt, Bacillus subtilis N441 tạo sản phẩm có độ nhớt cao, thích hợp để sản xuất Natto còn chủng Bacillus subtilis N18 hoạt tính protease cao, ít nhớt thích hợp để sản xuất chế phẩm protease giàu Nattokinase. - Phương pháp thứ hai: Trích ly enzyme từ sản phẩm sau khi lên men bằng nước muối sinh lý, sau đó kết tủa bằng Ethanol, thu sản phẩm, sấy khô, nghiền mịn, sản phẩm. Với phương pháp này hoạt tính đạt 3399,34 U/g, hiệu xuất thu hồi đạt 42,9%. Enzyme thu nhận có pH tối ưu 8, nhiệt độ tối ưu 40oC. Tỷ lệ Nattokinase chiếm 67,23%. - Phương pháp thứ ba: Sử dụng toàn bộ sản phẩm sau lên men bán rắn, sấy khô, nghiền mịn, kiểm tra chất lượng, đóng bao, hiệu suất thu nhận 80%. chất lượng sản phẩm: 252,48 U/g, Sau 4 tuần bảo quản ở 40C, hoạt tính của chế phẩm còn 238,16 U/g (94,33%), 95 khi bảo quản ở nhiệt độ phòng (khu vực Thành phố Hồ Chí Minh và Thủ Dầu Một, Bình Dương), hoạt tính còn 223,32 U/g (88,45%). Kiến nghị - cách nâng cao năng suất lên men, tinh sạch và tạo chế phẩm phù hợp yêu cầu của sản phẩm chức năng. - Phân lập các chủng Bacillus từ các loại thực phẩm cổ truyền ở Việt nam nhằm tìm được các chủng có hoạt tính cao... 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tiếng Việt 1. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2011), Công nghệ sinh học - tập 3, enzyme và ứng dụng, Nxb Giáo Dục Việt Nam, Tr. 111 – 136 2. Dương Thị Thanh Diễm (2010). Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy Bacillus và bước đầu ứng dụng trong xử lí nước nuôi cá tra. Luận văn Tiến sĩ Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Tp. HCM, tr. 4 – 6. 3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi Sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr. 25 – 38. 4. Nguyễn Thùy Dương (2012). Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn, Luận văn Thạc sĩ sinh học. Trường Đại học Sư phạm Tp. HCM, tr. 33 – 38. 5. Trần Thị Minh Định (2012). Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm Aspergillus sp. Phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Sư Phạm Tp. HCM, tr. 36 – 37 6. Trần Ngọc Hùng (2010), Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis để sử dụng trong chế biến thức ăn gia cầm, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, tr. 36 – 42. 7. Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006), Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá Ba Sa. Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ, tập 9, số 11, 2006, tr. 59 – 67. 8. Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ Thuật Sinh Hóa, Nxb Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh, tr. 81 – 93. 9. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), (2003), Thí nghiệm Vi sinh vật học, Tập 2, Nxb ĐH Quốc gia Tp.HCM, tr. 112 – 115. 10. Đỗ Thị Thu Nga (2011), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng Bacillus, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp. HCM, tr. 30-36. 11. Đỗ Trần Ngoan (2007). Nghiên cứu tổng hợp protease kiềm tính bằng phương pháp lên men bởi tế bào vi khuẩn Bac.subtilis cố định. Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học. Trường Đại học Bách khoa Tp. Hồ Chí Minh, Tr. 4 – 16. 97 12. Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị hạnh, Trần Thạnh phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê Thị Hương (2012). “Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh tổng hợp nattokinase”. Tạp chí Sinh Học, 34, (3se). Tr 99 - 104 13. Trần Thị Bích Quyên (2012), Nghiên cứu và tuyển chọn một số chủng Bacillus làm probiotic trong chăn nuôi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh, tr. 33 – 43. 14. Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành sinh hóa vi sinh vật, Nxb Giáo dục, tr. 45 – 56, 97 – 102. 15. Đồng Thị Thanh Thu (2003), Sinh hóa ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, tr. 8 –13. 16. Đồng Thị Thanh Thu, Giáo trình sinh hóa cơ bản, tủ sách Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh, Tr. 45 – 70. 17. Hoàng Thị Kim Thoa (2013). Thiết lập chủng Bacillus subtilis đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm thực phẩm. Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học. Trường Đại học Bách khoa Tp. Hồ Chí Minh, Tr. 3 – 15. 18. Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007). Tương lai ứng dụng enzyme trong xử lý phế thải. Tạp chí khoa học Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Khoa học tự nhiên và công nghệ 23 (2007), Tr. 75 – 85 19. Nguyễn Minh Tuyển (2005). Quy hoạch thực nghiệm. Nxb Khoa học và Kỹ thuật 20. Nam Việt – Khánh Linh, Bệnh tai biến mạch máu não, phương pháp chẩn đoán và điều trị, Tr. 5 – 28. 21. Võ Thị Xuyến (2006), Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase từ một số chủng vi sinh vật và khả năng thủy phân cellulose, Luận văn thạc sĩ sinh học, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Tp. HCM.  Tiếng Anh 22. Chu Y. H., Han I . S. and Han C., (2002). “Improved Evolutionary Operation Based on D – Design and Response Surface Method”. Korean Journal of Chemical Engineering, vol 19(4), pp: 535 – 544 23. Chen et al. (2007), “Strategy To Approach Stable Production of Recombinant. Nattokinase in Bacillus subtilis”, Biotechnol.Prog, 23, pp: 808 -813. 24. Chang Jin Liu, Yan Li Z, Wei Zhong Cao (2004). “Optimization of fermentation process on a fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis SBS(J)”. Biotechnology 6. 98 25. Chen Tiên Chang, Ming Hui Fan, Fei Chi Kun Hsien Yi Sung (2000). “Potent fibrinolytic enzyme from a mutant of Bacillus subtilis IMR-NK1”. J. Agrc. Fodd. Chem. 48, pp: 3210-3216 26. Cong Wang, Ming Du, Dongmei Zheng, Fandong Kong, Guoren Zu, Yibing Feng (2009). “Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B12”. J.Agric.Food Chem 57, pp: 9722-9729. 27. Deepak V. Kalishwaralal K., Ramkumarpandian S., Venkatesh Babu S., Senthilkumar S.R.,Sangiliyandi G., (2008). “Optimization of media composition for nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology”. Bioresource Terchnology 99, pp: 8170-8174 28. Dong Mingsheng Jiang, Xiao Liu Cheng, Jiang Hanhu (2001). “Screening of extracellular fibrinolytic strain NK5 and its enzyme production condiction’. J. Food Fermentation Industries 1. 29. Dong Mingsheng Jiang, Xiao Liu Chen, Jiang Hanhu (2001). “Study on the stability of Nattokinase from Bacillus subtilis NK 5”. J. Food Fermentation Industries 1 30. Dubey R., Kumar J., Agrawala D., Char T., and Pusp P. (2011). “Isolation, production, purification, assay and characterization of fibriolytic enzymes (nattokinase, streptokinase, and Urokinase) from bacterial sources”. American journal of Biotechnology 10(8), pp: 1408-1420 31. Egwin C. Evans and Abdullahi A. (2012). “Effect of surfactant inclusions on the yield and characteristics of protease from Bacillus subtilis. Proc”.Rom.Acad. Scies B, pp: 108-112. 32. Essam F. Al-juamily and Bushara H. Al-Zaidy (2012). “Optimization condiction of production fibrinolytic enzyme from Bacillus lichniformis B4 local isolate”. British Journal of Pharmacology and Technology 3(6), pp: 289-295. 33. Fujita, M., Ito Y., Homh K., and Nishimura S. (1995). “Characterization of Nattokinase –degraded products from humam fibrinogen or cross linked fi”. Fibriolysis, pp: 157. 34. Han Xin-mian, GUO Run-fang, YU Hong -wei and JIA Ying-min (2009), “Cloning and Expression of One Fibrinolytic Enzyme from Bacillus sp. zlw-2”, Agricultural Sciences in China, 8(5), pp: 591-596. 99 35. Han Xin-mian, GUO Run-fang, YU Hong -wei and JIA Ying-min (2009), “Cloning and Expression of One Fibrinolytic Enzyme from Bacillus sp. zlw-2”, Agricultural Sciences in China, 8(5), pp: 591-596 36. Hu Sheng Mei Leha Yao Shajing (2003). “Optimization of submerged fermentation of nattokinase production by Bacillus subtilis with Response Surface Methodology”. J. Food and Fermentation Industries .1. 37. Jiunn –Min Wang, Hsuan Ying Chen, shiu- Min Cheng, Su Hua Chen, Lin-Lan Yang, and Fu-Chou Cheng. (2012). “Nattokinase reduces brain infarction, fibrinogen and activated partial thromboplastin time against cerebral ischemia-reperfusion injury”. Journal of Food and Drug Analysis 30(3), pp: 686-691. 38. Junguo Liu, Jianmin Xing, Tianshi Chang, Zhiya Ma, Huizhou Liu. (2005), “Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods”, Process Biochemistry, 40, pp: 2757-2762. 39. Kim.JY, Gum SN, Lim HH, Kim KC, Ogasawara K, Inoue K, Park S, Jang Y, and Lee JH (2008). “Effect of nattokinase on blood pressure: a randomized, controlled trial”. Hypertens Resource (8), pp: 1583-1588 40. Kumar A.,KK Pulicherla, K. Seetha Ram, KRS Sambasiva Rao (2010). “Evolutionarytrend Thrombolytic. International Journal of Bio-Science and Bio- Technolohy”. vol. 2 No. 4. pp: 51- 67. 41. Liang X, Jia S, Sun Y, et al. (2007), “Secretory expression of nattokinase from Bacillus subtilis YF38 in Escherichia coli”, Mol Biotechnol, 37, pp: 187-194. 42. Mishra V., Nag V. L., Tandon R. and Awasthi S., (2009). “Response Surface Methodology-Based Optimisetion of Agarose Gel Electrophoresis for Screening and Electropherotyping of Rotavirus”. Appl Biochem Biotechnol, vol 160(8), pp: 2322 – 2331 43. Nadeem M, Qazi JI, Baig S, Syed QA (2008) “Effect of medium composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis N-2”. Food Technol Biotechnol 46 (4), pp: 388–394 44. Nurullah Akcan and Fkeret Uyar (2011). “Production of extracellular alkaline protease from Bacillis subtilis RSKK96 with solid state fermentation”. Euraria J. BioSci 5, pp: 64-72 100 45. Okamoto Akiko, Hanagata Hiroshi, Matsumoto Eiko, Kawamura Yukio, Koizumi Yokimichi (1995). “Angiotensin I converting enzyme inhihitory activities of various fermented foods”. Bioesci Biotech Biochem 59(6), pp: 1147-1149 46. Prabhavathy G., rajasekara Pandian M., Senthilkumsr B. (2012). “Optimization and production of extracellular alkaline protease by solid state fermentation using Bacillus subtilis”. J. Acad. Indus Res 1(7), pp: 427- 430 47. Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS, Deshpande VV (1998) “Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases”. Microbiol Mol Biol Rev 62(3), pp: 597-635 48. Ruei- Lin Hsu , Kung-Ta lee, jung –Hao Wang, Lily Y-.L. Lee, and Ria P.-y. Chen (2009). “Amyloid degradating ability of nattokinase from Bacillus subtilis Natto”. J. Agric Food Chem 57, pp: 503- 508 49. Sharma A. K., Sarkar B. C. and Sharma H. K., 2005. “Optimization of enzymeatic process parameters for increased juice yield from carrot (Daucus carota L.) using response surface methodology”. Eur Food Res Technol, vol 221, pp: 106 – 112. 50. Saurabh, S., Jasmine, I., Pritesh, G., G., and Rajendra Kumar, S., (2007). “Enhanced productivity of serine alkaline protease by Bacillus sp. using soybean as substrate”. Malaysian journal of microbiology. (1), pp: 1-6. 51. Singhal P., V.K.Nigam, A.S.Vidyarthi (2012). “Studies on production, characterization and applications of microbial alkaline proteases”. International . Journal of advanced and research ISSN 0976-2612 Vol.3, issue 3, pp: 653-669. 52. Sumi H., Hamada H., Tsushima H., Mihara H., & Muriki H. (1987). “A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto: a typical and popular soybean food in the Japanese diet”. Expientia 43 (10), pp: 1110-1111. 53. Sumi H., Hamada H., Nakanishi K.,& Hiratani H. (1990). “Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of Nattokinase”. Acta Haematologia. 84 (3), pp: 139-143. 54. Sumi H.,Nakajima N.,yatagai C. (1995). “ unique strong fibrinolytic enzyme (katsuwokinase) in skipjack”. Competitive biochemistry and physiology part B: Biochemistry and Molecular Biology 112(3), pp: 543-547. 101 55. Ting wei Ku, Ruei –Lan Tsai and Tzu-Ming Pan (2009). “A simple and Cost – Saving Approach ro optimize the production of subtilisin NAT by submerged cultivation of Bacillus subtilis Natto”. J. Agric Food Chem. 57, pp: 292-296. 56. Xiaoyan zu, Zhenya Zhang, et al. (2010), “Thrombolytic Activities of Nattokinase Extracted from Bacillus subtilis Fermented Soybean Curd Residues”, International Journal of Biology, 2(2), pp: 120-125. 57. Xiaoyan Zu, Zhenya Zhang, Yingnan Yang, Haittao Che, Guihua zhang Ji Li (2010). “Thrombolytic activities of nattokinase extracyed from Bacillus subtilis fermented soybean curd residues”. International Journal of Biology 2(2), pp: 120-125. 58. Xie Quiling Gao Yong (1999). “The optimization of fermentation condiction of nattokinase”. Journal of south China University of Technology (National Science).5. 59. Xue Jian, Xue- Li Z, Quuang C. Guang W. Jun Peng Gao (2005). “Optimization of liquid fermentation condiction of nattokinase” . Journal of Jilin Agricultural University 5. 60. Xu X., Skands A.R.H., Hoy C.-E., Mub H., Balchena S. and Adler- Nissenna J., 1998. “Prodution of Specific – structured Lipids by Enymatic Interesterification: Elucidation of Acyl Migration by Response Surface Design”. Journal of the American Oil Chemists’ Society, vol 75 (9), pp: 1179 – 1186 61. Yeon Kyoung Kim, Sang Mi Kim, Ji Yeon Kim, and Oran Kwon (2011). “The culture filtrates from Bacillus subtilis natto lowers blood pressure via rennin –angiotensin system in spontaneously hypertensive rats fed with a high cholesterol diet”. J.Korean Soc appl Biol. Chem 54(6), pp: 959-965.  Internet 62. 63. 64. 65. 102 103 104 105 106 107 108 y = 0.0094x R² = 0.9980 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 0 20 40 60 80 100 ∆ O D Đường chuẩn Tyrosine (µg) Tyrosine PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đường chuẩn Tyrosin Tyrosine (µg) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 ∆OD (660nm) 0,000 0,086 0,181 0,281 0,371 0,465 0,560 0,645 0,780 Đồ thị đường chuẩn Tyrosin 109 y = 0.0006x R² = 0.999 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0 50 100 150 200 250 300 Δ O D Nồng độ Albumin (μg/ml) Phụ lục 2: Đường chuẩn Albumin Albumin (µg/ml) 0 50 100 150 200 250 ∆OD (750nm) 0,000 0,03 0,06 0,09 0,12 0,15 Đồ thị đường chuẩn Albumin 110 Phụ lục 3: Hoạt tính protease của 10 mẫu VK đã tuyển chọn Thời gian Kí hiệu chủn g ΔOD Hoạt độ protease (U/g) 24 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 T,B Sai số N 24 0,04 0,04 0,04 27,10 25,81 27,10 26,67 0,43 N 17 0,07 0,07 0,06 41,93 42,58 41,29 41,93 0,37 BC 0,11 0,11 0,11 70,96 71,61 72,26 71,61 0,37 N 21 0,03 0,02 0,03 17,42 14,19 18,71 16,77 1,34 N 32 0,03 0,03 0,03 18,06 16,13 19,35 17,85 0,94 8.1 0,10 0,10 0,11 67,09 67,09 67,74 67,31 0,22 N 23 0,03 0,03 0,03 18,71 20,64 17,42 18,92 0,94 N 18 0,08 0,09 0,09 52,90 55,48 55,48 54,62 0,86 N441 0,08 0,07 0,08 50,97 47,74 52,26 50,32 1,34 N36 0,04 0,04 0,04 27,10 27,10 27,10 27,10 0,00 40 N 24 0,07 0,07 0,07 42,58 41,93 43,22 42,58 0,37 N 17 0,07 0,07 0,07 45,16 43,87 45,80 44,94 0,57 BC 0,12 0,13 0,12 78,71 80,64 78,71 79,35 0,65 N 21 0,03 0,03 0,03 18,71 19,35 18,06 18,71 0,37 N 32 0,03 0,03 0,03 21,93 20,00 21,93 21,29 0,65 8.1 0,12 0,12 0,12 76,13 76,13 75,48 75,91 0,22 N 23 0,05 0,05 0,05 32,90 34,19 32,26 33,12 0,57 N 18 0,15 0,15 0,15 94,83 93,54 95,48 94,62 0,57 N441 0,08 0,08 0,08 50,97 50,32 51,61 50,97 0,37 N36 0,06 0,06 0,06 37,42 38,06 35,48 36,99 0,78 48 N 24 0,07 0,07 0,07 44,51 44,51 45,16 44,73 0,22 N 17 0,10 0,10 0,10 63,87 63,87 63,87 63,87 0,00 BC 0,15 0,15 0,15 97,42 98,06 96,77 97,42 0,37 N 21 0,06 0,06 0,06 39,35 38,71 40,00 39,35 0,37 N 32 0,06 0,06 0,05 35,48 37,42 34,19 35,70 0,94 8.1 0,15 0,15 0,15 98,06 98,71 96,77 97,85 0,57 N 23 0,07 0,06 0,07 42,58 41,29 43,22 42,36 0,57 N 18 0,17 0,17 0,18 109,67 109,03 112,90 110,53 1,20 N441 0,09 0,09 0,09 59,35 60,00 58,06 59,14 0,57 N36 0,08 0,08 0,07 49,03 50,32 47,10 48,82 0,94 72 N 24 0,06 0,07 0,06 41,29 41,93 39,35 40,86 0,78 N 17 0,07 0,07 0,07 42,58 43,87 41,93 42,79 0,57 BC 0,12 0,11 0,12 74,19 71,61 74,84 73,55 0,99 N 21 0,04 0,04 0,04 23,23 23,23 23,23 23,23 0,00 N 32 0,04 0,04 0,04 24,52 23,87 23,23 23,87 0,37 8,1 0,08 0,08 0,09 54,19 51,61 55,48 53,76 1,14 N 23 0,03 0,03 0,03 17,42 16,77 18,71 17,63 0,57 N 18 0,09 0,09 0,09 58,71 58,71 59,35 58,92 0,22 N441 0,08 0,08 0,08 53,55 51,61 54,19 53,12 0,78 N36 0,04 0,04 0,05 28,39 28,39 29,03 28,60 0,22 Phụ lục 4: Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18 111 Tỉ lệ cám mì/đậu nành Δ OD Hoạt độ protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Sai số 0/10 0,05 0,05 0,05 33,55 32,90 34,19 33,55 0,37 3/7 0,08 0,08 0,08 52,90 52,90 51,61 52,47 0,43 4/6 0,10 0,01 0,10 63,87 63,45 61,93 62,69 0,76 5/5 0,12 0,12 0,12 77,42 76,77 80,00 78,06 0,99 6/4 0,15 0,15 0,15 94,83 95,48 93,54 94,62 0,57 7/3 0,23 0,23 0,23 149,67 148,38 150,96 149,67 0,75 10/0 0,07 0,07 0,07 46,45 45,80 45,80 46,02 0,22 Phụ lục 5: Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18 Độ ẩm (%) Δ OD Hoạt độ protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Sai số 40 0,23 0,23 0,23 149,03 150,96 147,74 149,24 0,94 50 0,27 0,28 0,27 175,48 179,35 174,19 176,34 1,55 60 0,28 0,28 0,28 178,06 177,41 178,70 178,06 0,37 70 0,18 0,18 0,18 112,90 112,90 112,90 112,90 0,00 80 0,09 0,09 0,09 56,77 55,48 57,42 56,56 0,57 Phụ lục 6: Ảnh hưởng của nồng độ nấm men đến khả năng tổng hợp protease của chủng B. subtilis N18 Nồng độ Δ OD Hoạt độ protease (U/g) 112 Nấm Men Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Sai số Đối chứng 0,29 0,29 0,29 189,67 189,02 188,38 189,02 0,37 0,1 0,30 0,30 0,30 194,19 194,19 194,19 194,19 0,00 0,2 0,30 0,30 0,30 195,48 194,19 196,12 195,26 0,57 0,3 0,19 0,19 0,19 122,58 123,22 121,29 122,36 0,57 Phụ lục 7: Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18 pH Δ OD Hoạt độ protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Sai số 6 0,21 0,21 0,21 137,41 138,06 137,41 137,63 0,22 7 0,30 0,29 0,30 190,31 189,67 190,96 190,31 0,37 8 0,34 0,35 0,34 220,64 222,57 219,35 220,85 0,94 9 0,36 0,36 0,36 230,31 229,02 231,60 230,31 0,75 10 0,30 0,30 0,30 190,31 192,89 192,89 192,03 0,86 11 0,11 0,11 0,11 72,90 72,26 72,90 72,69 0,22 12 0,05 0,05 0,05 33,55 33,55 34,19 33,76 0,22 Phụ lục 8: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18 MT Tỉ lệ cấy giống (ml) Δ OD Hoạt độ protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Sai số 113 Đối chứng 107 0,32 0,31 0,32 203,22 202,57 203,22 203,00 0,22 108 0,32 0,32 0,32 206,44 207,73 205,15 206,44 0,75 NaCl, 0,5% 107 0,19 0,19 0,19 122,58 123,22 123,22 123,01 0,22 108 0,30 0,30 0,30 194,19 194,19 194,19 194,19 0,00 NaCl 0,5%, 0,2% (YE) 107 0,37 0,37 0,37 239,34 239,34 240,63 239,77 0,43 108 0,38 0,38 0,38 245,15 247,73 243,86 245,58 1,14 Phụ lục 9: Ảnh hưởng của Zn2+ và k+ đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18 Vi khoáng Δ OD Hoạt độ protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Sai số Đối chứng 0,35 0,35 0,35 227,73 225,80 228,38 227,30 0,78 ZnCl2 0,39 0,34 0,39 250,96 249,35 250,31 250,20 0,47 KCl 0,36 0,36 0,36 231,60 232,89 230,31 231,60 0,75 Phụ lục 10 : Hoạt tính protease trong các sản phẩm natto từ hai chủng B.subtilis N18 và B.subtilis N441 Natto Δ OD Hoạt độ protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Sai số N18 ĐN 0,54 0,53 0,54 57,99 57,77 58,10 57,95 0,10 N18 ĐN - GL 0,47 0,47 0,47 50,94 51,05 50,94 50,98 0,04 N441 ĐN 0,46 0,46 0,46 49,53 49,64 49,43 49,53 0,06 N441 ĐN - 0,39 0,39 0,40 42,60 42,27 42,81 42,56 0,16 114 GL N18 & N441 ĐN 0,51 0,51 0,51 55,60 55,50 55,71 55,60 0,06 N18 & N441 ĐN -GL 0,46 0,46 0,46 49,32 49,32 49,32 49,32 0,00 Natto Nhật Bản 0,54 0,54 0,53 58,21 58,42 57,88 58,17 0,16 Phụ lục 11: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease của CPE pH Δ OD Hoạt độ CPE (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Sai số 6 0,11 0,11 0,11 1224,80 1224,80 1213,96 1221,18 3,61 7 0,26 0,26 0,26 2774,76 2785,60 2774,76 2778,37 3,61 8 0,38 0,38 0,38 4064,59 4075,43 4075,43 4071,81 3,61 9 0,32 0,32 0,32 3511,80 3490,13 3490,13 3497,35 7,23 10 0,30 0,30 0,29 3208,31 3197,48 3186,64 3197,48 6,26 11 0,18 0,17 0,18 1875,13 1885,97 1875,13 1878,74 3,61 Phụ lục 12, Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính protease của CPE Nhiệt độ (0C) Δ OD Hoạt độ protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Sai số 25 0,30 0,30 0,29 3208,31 3197,48 3186,64 3197,48 6,26 30 0,30 0,30 0,31 3284,19 3295,03 3305,87 3295,03 6,26 35 0,34 0,34 0,34 3652,71 3652,71 3663,55 3656,32 3,61 40 0,38 0,38 0,38 4064,59 4086,27 4086,27 4079,04 7,23 45 0,37 0,37 0,37 3999,55 3999,55 3967,04 3988,72 10,84 50 0,35 0,35 0,36 3836,97 3836,97 3858,65 3844,20 7,23 55 0,30 0,30 0,30 3208,31 3229,99 3240,83 3226,38 9,56 60 0,28 0,28 0,28 2991,54 3002,38 3002,38 2998,76 3,61 115 Phụ lục 13: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính protease của CPE Nồng độ cơ chất (%) Δ OD Hoạt độ protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Sai số 0,5 0,13 0,13 0,13 1430,74 1419,90 1452,41 1434,35 9,56 1,0 0,32 0,32 0,32 3468,45 3479,29 3500,97 3482,90 9,56 1,5 0,40 0,40 0,40 4346,40 4335,56 4324,72 4335,56 6,26 2,0 0,39 0,39 0,39 4238,01 4248,85 4259,69 4248,85 6,26 2,5 0,39 0,39 0,39 4205,49 4216,33 4216,33 4212,72 3,61 3,0 0,39 0,39 0,39 4194,65 4205,49 4216,33 4205,49 6,26