Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hạt cam thảo dây Quế sơn - Quảng nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHẠM THỊ CẨM LAI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT HẠT CAM THẢO DÂY QUẾ SƠN-QUẢNG NAM Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số : 60 44 27 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng – Năm 2013 Công trình được hoàn thành tại ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: TS. TRẦN MẠNH LỤC Phản biện 1: PGS.TS. Trương Thị Minh Hạnh Phản biện 2: PGS.TS. Lê Tự Hải Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 31 tháng 5 năm 2013. * Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin- Học liệu, Đại học Đà Nẵng. - Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng. 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam n m ở v ng nhiệt đới c thảm thực vật phong ph , rất nhiều loài cây thuộc chi Abrus thuộc họ Fabaceae được d ng đ bào ch thuốc ch a nhiều bệnh. M c d nh ng loài thuộc c c chi k trên c nhiều gi trị sử dụng như vậy nhưng c c công trình nghiên c u về thành ph n ho học, hoạt t nh c a c c cây thuộc chi n i trên vẫn chưa hoàn toàn đ y đ và c t nh hệ thống. Việc nghiên c u chi t t ch, c định thành ph n h a học, ng dụng c c phương ph p hiện đại đ c định cấu tr c và nghiên c u hoạt t nh sinh học c a một số hợp chất c c loài cây thuộc c c chi trên ở Việt Nam là một hướng nghiên c u c nhiều tri n vọng, c nghĩa khoa học và thực ti n cao. Cây cam thảo dây c tên khoa học là Abrus precatorius L. thuộc họ Đậu (Fabaceae). Cam thảo dây là một trong nh ng vị thuốc Ðông y lâu đời nhất; trong s ch "Th n nông bản thảo" th kỷ th 3 trước công nguyên đã n i đ n cam thảo. Nhìn chung c c s ch bản thảo (s ch n i về dược) Ðông y đều cho r ng Cam thảo vị ngọt t nh bình, c t c dụng bổ trung ch kh , giải co thắt giảm đau, nhuận ph giảm kh t, thanh nhiệt giải độc, giải độc thuốc và th c ăn, điều hòa t nh vị c a c c vị thuốc kh c. Vì vậy, ch ng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu t n p n c d c c t ạt cây c m t ảo dây Qu Sơn- Quảng N m” làm luận văn Thạc sĩ. 2. Mục đích nghiên cứu - Tìm c c điều kiện chi t t ch th ch hợp c c chất t hạt cây cam thảo dây b ng c c dung môi kh c nhau. 2 - X c định thành ph n h a học c c chất t dịch chi t hạt cây cam thảo dây. - Thăm dò hoạt t nh sinh học c a protein phân lập t dịch chi t nước c a hạt cây cam thảo dây. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Hạt cây cam thảo dây ở Qu Sơn-Quảng Nam. 3.2. Phạm vi nghiên cứu Thành ph n hóa học c a một số dịch chi t hạt cam thảo dây. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết + Thu thập, tổng hợp, phân t ch c c tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, thành ph n h a học và ng dụng c a cây và hạt cam thảo dây. + Tổng hợp tài liệu về phương ph p lấy mẫu, chi t t ch và c đinh thành ph n h a học c c chất t thực vật . 4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm + X c định độ m b ng phương ph p trọng lượng. + X c định hàm lượng kim loại b ng phương ph p quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS). + Chi t t ch c c chất b ng c c dung môi kh c nhau theo phương ph p ngấm kiệt. + K t hợp gi a thực nghiệm ho học với việc sử dụng c c thi t bị hiện đại như c c phương ph p HPLC, GC-MS và LC-MS đ định danh c c chất trong dịch chi t. + Thử nghiệm hoạt t nh sinh học c a protein phân lập t dịch chi t nước. 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Nh ng k t quả nghiên c u trong công trình này sẽ g p ph n cung cấp c c thông tin c nghĩa khoa học về thành ph n và c c hoạt t nh sinh học được chi t t ch t loài Abrus precatorius và qua đ g p ph n nâng cao gi trị ng dụng c a ch ng trong ngành dược liệu. 6. Bố cục của luận văn Luận văn bao gồm trang, 14 bảng, 10 hình, 52 tài liệu tham khảo và 2 phụ lục. Cấu tr c luận văn như sau: Mở đ u (3 trang) Chương 1. Tổng quan (20 trang) Chương 2. Nguyên liệu và phương ph p nghiên c u (12 trang) Chương 3. K t quả và thảo luận (21 trang) K t luận và ki n nghị (3 trang) Tài liệu tham khảo (5 trang) CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. MÔ TẢ THỰC VẬT 1.1.1. Đặc điểm chung của chi Abrus 1.1.2. Giới thiệu về cây cam thảo dây a. Tên g b. P ân loạ k o c c. P ân bố d. Đặc đ ểm t ực vật 1.2. GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA CÂY CAM THẢO DÂY 1.2.1. Dùng làm thuốc chữa bệnh 4 1.2.2. Dùng làm trang sức 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÂY CAM THẢO DÂY 1.4. TÁC DỤNG DƢỢC LÍ CỦA HẠT CAM THẢO DÂY 1.4.1. Tính chất của abrin 1.4.2. Cơ chế hoạt động của abrin CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu Nguyên liệu nghiên c u là hạt cây cam thảo dây được thu hái vào tháng 4/2012 tại huyện Qu Sơn, tỉnh Quảng Nam (Hình 2.1), c định tên khoa học thuộc loài Abrus precatorius L. Hình 2.1. Cây cam thảo dây 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phƣơng pháp xác định các thông số hóa lý a. P ương p áp tr ng lượng b. P ương p áp vật lý 5 2.2.2. Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật 2.2.3. Phƣơng pháp phân tích và định danh thành phần hóa học của các dịch chiết 2.2.4. Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 2.3. CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.3.1. Sơ đồ thực nghiệm 2.3.2. Xử lí nguyên liệu Nguyên liệu là hạt cây cam thảo dây được thu hái vào tháng 4/2012 tại huyện Qu Sơn, tỉnh Quảng Nam. Chọn h i nh ng quả đã chín, già. Thu nguyên liệu Xử l thành dạng bột X c định hàm lượng kim loại X c định độ m, hàm lượng h u cơ Khảo s t điều kiện tối ưu: thời gian, tỉ lệ rắn/lỏng Định danh b ng c c phương ph p GC-MS, LC- MS, HPLC Chlorofo m n n-hexane Etylaxeta t methanol Nước Hình 2.2. Sơ đồ thực nghiệm 6 Sau đ b c quả ra đ thu lấy hạt. Hạt hình tr ng, nhẵn b ng, to b ng hạt đậu gạo, màu đỏ ch i, c một đốm đen rộng bao quanh t , rất độc, dài khoảng 0,5 cm. Hạt cam thảo sau khi h i, loại bỏ nh ng hạt đã bị hư, sâu, rửa sạch và đ khô tự nhiên. Lấy một ph n đi khảo s t độ m, ph n còn lại đem đi phơi khô rồi đem ay nhỏ, bảo quản trong bình k n. Hình 2.3. Nguyên liệu hạt cây cam thảo dây tươi và bột khô 2.3.3. Xác định các thông số hóa lí của nguyên liệu a. Xác đ n độ ẩm b. Xác đ n m lượng tro c. Xác đ n m lượng một số k m loạ nặng 2.3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tách chất a. K ảo sát ản ưởng củ các loạ dung mô b. K ảo sát t ờ g n c. K ảo sát ản ưởng củ tỉ lệ R/L 2.3.5. Chiết tách và xác định thành phần hóa học của các dịch chiết hạt cây cam thảo dây * Trong dung môi h u cơ thông thường: Cho 20g nguyên liệu bột khô được ngâm chi t trong bốn dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol ba l n với mỗi 7 l n 200 ml dung môi ở nhiệt độ phòng trong thời gian 9 ngày, thu lấy dịch chi t. Lấy ở mỗi dịch chi t khoảng 5 ml đ đem phân t ch GC – MS c định thành ph n và hàm lượng c c cấu tử c trong mỗi dịch chi t. Hệ thống GC-MS với cột t ch mao quản DB-5MS, khí mang He 10psi, th t ch tiêm mẫu 1μl (split 10:1), ghép máy MS EI+ kèm ngân hàng d liệu và theo chương trình gradient nhiệt độ: t 500C đ n 3000C (5 phút); injector 2500C và detector 500, ch độ quét Fullscan. * Qu trình chi t abrin b ng nước: Bột hạt cam thảo dây cho vào cốc, cho nước đ n th t ch gấp đôi ph n bột, đun sôi nh , khuấy đều đ n khi th t ch ph n nước ph a trên ấp ỉ ph n bột nhão ở dưới thì ng ng đun. Đ nguội, gạn lấy dung dịch ở trên vào cốc. Sau đ ti p tục cho vào một lượng nước cất c th t ch gấp đôi lượng dung dịch v a gạn ra và đun ti p cho đ n khi th t ch ph n dung dịch t ch ra ph a trên ấp ỉ ph n bột nhão ở dưới thì ng ng đun. Đ nguội gạn lấy dung dịch cho vào cốc. Ti p tục làm như vậy một l n n a và đem lọc lấy ph n dung dịch b ng ph u lọc ở p suất thấp (k cả ph n lọc gạn ban đ u). Gộp chung tất cả c c dung dịch v a lọc đem đi cô cạn bớt. Đ nguội, lọc lại và cho vào ethanol khan, đ yên cho k t t a uất hiện. Lọc lấy k t t a, rửa b ng cồn. Tinh ch b ng c ch hòa tan k t t a trong nước n ng, k t t a lại b ng cồn, lọc lấy k t t a và đem thử hoạt t nh gây độc t bào. CHƢƠNG 3 8 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ 3.1.1. Độ ẩm Độ m trung bình c a hạt cam thảo dây là 13.85 %. Độ m trung bình c a nguyên liệu bột là 9.36 %. Qua k t quả ta thấy độ m trung bình c a hạt cam thảo dây và c a nguyên liệu bột là chênh lệch nhau không nhiều. Hạt cam thảo dây là loài hạt khô nên độ m c a hạt tương đối thấp. Với độ m này, ch ng tôi đã bảo quản nguyên liệu trong thời gian dài nhưng không bị mốc, nguyên liệu c độ ổn định tốt. 3.1.2. Hàm lƣợng tro Hàm lượng tro trung bình trong hạt cam thảo dây là 0.883%. Điều này dự b o hàm lượng kim loại c trong hạt cam thảo dây là rất ít. 3.1.3. Hàm lƣợng kim loại Bảng 3.4. Hàm lượng kim loại trong hạt cam thảo dây TT Kim loại Phương ph p thử (AAS) K t quả (mg/l) K t quả (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg) [1] 1 Pb TCVN 6193:1996 0.0094 0.094 2 2 Cu TCVN 6193:1996 0.2755 2.755 30 3 Zn TCVN 6193:1996 1.079 10.79 40 4 As TCVN 6826:2000 0.0018 0.018 1  Nhận xét: Thành ph n kim loại n ng c trong hạt cam thảo dây thấp. Đây là một trong nh ng chỉ số quan trọng đ đ nh gi việc sử dụng hạt 9 cam thảo dây làm dược liệu an toàn, không ảnh hưởng đ n s c khoẻ con người. 3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TÁCH CHẤT VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG PHƢƠNG PHÁP GC-MS 3.2.1. Kết quả ảnh hƣởng của các loại dung môi Hình 3.1. Dịch chiết hạt cam thảo dây trong các dung môi: n-hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol C c dịch chi t thu được c màu nhạt d n theo độ phân cực giảm d n c a dung môi: methanol, ethyl acetate, chloroform và n- he ane. Dịch chi t methanol c a hạt cam thảo dây c màu nâu đỏ, dịch chi t ethyl acetate c a hạt cam thảo dây c màu vàng chanh, dịch chi t chloroform c a hạt cam thảo dây c màu chanh nhạt, dịch chi t n-he ane c a hạt cam thảo dây c vàng rất nhạt. * N ận xét: Khả năng hòa tan hạt cam thảo dây trong các dung môi giảm d n theo th tự sau: methanol, ethyl acetate, chloroform và n-he ane theo đ ng độ giảm d n t nh phân cực c a các dung môi. Điều này dự b o hạt cam thảo dây ch a nhiều chất 10 phân cực. Vì vậy, ch ng tôi sử dụng 4 loại dung môi này ti n hành t ch chất b ng phương ph p chi t ngâm d m. 3.2.2. Kết quả khảo sát thời gian, tỉ lệ R/L trong quá trình chiết tách và thành phần hóa học trong các dịch chiết a. Trong dung môi n-hexane * K t quả k ảo sát t ờ g n, tỉ lệ R/L trong quá trìn c t tách: Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích n-hexane đến khối lượng cao chiết Th t ch n-hexane (ml) 100 125 150 175 200 Thời gian chi t (ngày) Khối lượng cao chi t (gam) 0.139 0.148 0.168 0.169 0.175 4 0.148 0.159 0.165 0.173 0.183 6 0.149 0.164 0.186 0.187 0.188 8 0.149 0.168 0.183 0.188 0.189 10  N ận xét: Qua bảng 3.6 và hình 3.2 ta thấy, thời gian chi t t 4 ngày đ n 10 ngày và th t ch dung môi t 100 ml đ n 200 ml thì khối lượng cao chi t tăng lên và đạt khối lượng cao nhất ở thời gian chi t 8 ngày với tỉ lệ R/L là 10/150 là 0.186g. Vậy thời gian chi t tối ưu là 8 ngày và tỉ lệ R/L th ch hợp là 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 150ml dung môi n-hexane. * T n p n c trong d c c t n-hexane: Bảng 3.7. Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane ST T RT Area % Name Formula 1 3.64 0.74 p-xylene C8H10 11 2 3.76 2.22 m-xylene C8H10 3 4.06 1.57 Styrene C8H8 4 5.27 4.91 2,2,4,6,6-pentamethylheptane C12H26 5 5.41 0.92 n-decane C10H22 6 5.85 0.59 2,2,4,4-tetramethyloctane C12H26 7 6.9 1.29 n-undecane C11H24 8 8.38 0.81 n-dodecane C12H26 9 11.14 0.85 n-tetradecane C14H30 10 15.84 26.82 Chưa c định 11 16.12 16.02 Chưa c định 12 16.83 21.23 n-heptacosane C27H56 13 17.83 10.46 Palmitic acid, ethyl ester C18H36O2 14 20.34 6.79 Phenanthrene, 7-isopropyl-1- methyl C18H18 15 21.40 6.78 Adipic acid, bis(2-ethylhexyl) ester C22H42O4  Nhận xét: T k t quả ở bảng 3.7 cho thấy phương ph p GC-MS đã định danh được 15 cấu tử trong dịch chi t n-he ane t hạt cam thảo dây. Thành ph n h a học trong dịch chi t n-he ane ch y u là nh ng cấu tử c độ phân cực y u đ n không phân cực, bao gồm c c hidrocacbon mạch dài 10C ÷ 27C và hidrocacbon thơm. C c cấu tử c hàm lượng cao > 5% là n-heptacosane (21.23%), palmitic acid, ethyl ester (10.46%), phenenthrene, 7-isopropyl-1- methyl (6.79%), adipic acid, bis(2-ethylhe yl) ester (6.78%). C c cấu tử còn lại đều c hàm lượng thấp < 5%, bao gồm hidrocacbon no và hidrocacbon thơm. 12 Trong dịch chi t n-hexane, palmitic acid ethyl ester là một monoesters béo, đây là chất độc nhưng độc t nh thấp. Retene (7-isopropyl- 1-methyl phenanthrene) là một hydrocarbon thơm đa vòng (PAH) cũng gây ra độc t nh như như dio in, tăng tỷ lệ tử vong, khuy t tật. Adipic acid,bis(2- ethylhexyl)ester (DEHA) gây ra u tuy n và ung thư bi u mô gan ở chuột, nhưng không được cho là chất gây ung thư cho con người theo cơ quan ung thư quốc t . b. Trong dung môi ethyl acetate * K t quả k ảo sát t ờ g n, tỉ lệ R/L trong quá trìn c t tách: Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích EtOAc đến khối lượng cao chiết Th t ch EtOAc (ml) 100 125 150 175 200 Thời gian chi t (ngày) Khối lượng cao chi t (gam) 0.323 0.374 0.435 0.464 0.496 4 0.395 0.456 0.497 0.508 0.523 6 0.401 0.447 0.534 0.549 0.574 8 0.435 0.516 0.605 0.613 0.621 10  N ận xét: Qua bảng 3.8 và hình 3.4 ta thấy, khi th t ch dung môi tăng và thời gian khảo s t tăng thì khối lượng cao chi t cũng tăng d n. Ở tỉ lệ 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 150 ml dung môi ethyl acetate trong thời gian 10 ngày, khối lượng cao chi t thu được là 0.605g cao hơn khối lượng cao chi t ở tỉ lệ 10g mẫu/ 125ml là 0.516g và nhỏ hơn so với khối lượng cắn ở tỉ lệ 10g mẫu/ 175ml là 0.613g nhưng không đ ng k , đồng thời cũng cao hơn hẳn so với chi t c ng tỉ lệ R/L trong thời gian 8 ngày là 0.534g. Vậy tỉ lệ R/L 13 th ch hợp đ chi t hạt cam thảo dây là 10g mẫu hạt/ 150ml dung môi ethyl acetate trong thời gian 10 ngày. * Thàn p n c trong d c c t ethyl acetate: Bảng 3.9. Thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate ST T RT Area % Name Formula 1 5.27 1.37 2,2,4,6,6- pentamethylheptane C12H26 2 6.98 1.72 Acetin, monoacetate C5H10O4 3 7.32 2.03 Maltol C6H6O3 4 9.07 1.78 Acetin, diacetate C7H12O5 5 14.56 5.13 3-o-methyl-d-glucose C7H14O6 6 15.9 1.41 4-o-methylmannose C7H14O6 7 16.22 1.40 2-o-methyl-d-mannopyranosa C7H14O6 8 17.54 0.34 Hexadecanoic acid C16H32O2 9 17.82 0.84 Palmitic acid, ethyl ester C18H36O2 10 17.92 0.17 2-[1-(4-cyano-1,2,3,4- tetrahydronaphthyl)]propanen itrile C14H14N2 11 17.99 0.40 3-[1-(4-cyano-1,2,3,4- tetrahydronaphthyl)]propanen itrile C14H14N2 12 18.88 0.51 Oleic acid, methyl ester C19H36O2 13 19.29 1.05 Methyl 4- hydroxyoctadecanoate C19H38O3 14 19.46 2.16 Ethyl oleate C20H38O2 15 20.87 3.01 Decanamide, N-(2- hydroxyethyl)- C12H25NO2 14 16 21.37 17.90 Hexanedioic acid, bis(2- ethylhexyl) ester C22H42O4 17 23.85 3.95 Olein, 1-mono- C21H40O4 18 24.57 2.14 Squalene C30H50 19 26.58 5.70 γ-Tocopherol C28H48O2 20 28.78 5.01 Campesterol C28H48O 21 29.09 32.13 Stigmasterol C29H48O 22 29.94 9.86 β-Sitosterol C29H50O  Nhận xét: T k t quả ở bảng 3.9 cho thấy phương ph p GC-MS đã định danh được 22 cấu tử trong dịch chi t ethyl acetate t hạt cam thảo dây. Thành ph n h a học trong dịch chi t ch y u là nh ng cấu tử c độ phân cực trung bình và y u như c c acid h u cơ tồn tại ch y u ở dạng tự do và este, do c cấu tr c tương tự nên c c cấu tử này d dàng phân bố vào pha dung môi ethyl acetate, ngoài ra còn có các dẫn uất phenol. C c cấu tử c hàm lượng cao là hexanedioic acid, bis(2-ethylhexyl) ester (17.90%), γ-tocopherol (5.70%), campesterol (5.01%), stigmasterol (32.13%) và b-sitosterol (9.86%). Trong dịch chi t ethyl acetate, các phytosterol c hàm lượng cao nhất. Nhiều nghiên c u đã chỉ ra r ng c c hợp chất phytosterol c ch trong việc c ch ung thư phổi, dạ dày, buồng tr ng và ung thư v . C c nghiên c u cũng chỉ ra r ng phytosterol c th c ch hấp thụ cholesterol, làm giảm nồng độ cholesterol trong máu và giảm nguy cơ bệnh tim mạch. Stigmasterol rất h u ch trong việc ngăn ng a một số bệnh ung thư, bao gồm cả buồng tr ng, tuy n tiền liệt, vú và ung thư ruột k t. Stigmasterol đã được ch ng minh r ng c th c ch sự suy 15 thoái viêm ương khớp do thoái hóa sụn và nó là chất chống o y hóa mạnh. Cũng như stigmasterol, β-sitosterol cũng được sử dụng cho người c bệnh tim và cholesterol cao. β-sitosterol được d ng đ th c đ y hệ thống mi n dịch và ngăn ng a ung thư ruột k t, cũng như sỏi mật, phổ bi n cảm lạnh và c m, HIV / AIDS, viêm khớp dạng thấp, bệnh lao, bệnh v y n n, dị ng, ung thư cổ tử cung, đau ơ cơ, hen suy n, rụng t c, viêm ph quản, ch ng đau nửa đ u đau đ u, và hội ch ng mệt mỏi mãn t nh. Campesterol cũng là một loại phytosterol, c t c dụng c ch sự hấp thu cholesterol trong ruột, chống viêm. Dịch chi t c ch a c c hợp chất đ ng quan tâm là γ-tocopherol và squalene. Γ-tocopherol là một trong 3 dạng c a vitamin E, c khả năng chống o y ho cao do đ ngăn ng a được c c bệnh liên quan đ n gốc tự do như ung thư, bệnh tim mạch. Squalene là một triterpen, là một chất chống o y h a, ngăn ng a nh ng t c hại c a pero y lipid, ngăn ch n tổn thương o y h a t tia tử ngoại và một t c nhân chống ung thư. c. Trong dung môi chloroform * K t quả k ảo sát t ờ g n, tỉ lệ R/L trong quá trìn c t tách: Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích chloroform đến khối lượng cao chiết Th t ch chloroform (ml) 100 125 150 175 200 Thời gian chi t (ngày) Khối lượng 0.329 0.399 0.418 0.426 0.439 4 16 cao chi t (gam) 0.335 0.397 0.443 0.437 0.448 6 0.376 0.445 0.484 0.488 0.491 8 0.381 0.449 0.486 0.492 0.492 10  N ận xét: T bảng 3.10 và hình 3.6 ta thấy khi tăng d n th t ch dung môi và thời gian chi t, khối lượng cao chi t thu được cũng tăng d n. Khối lượng cao chi t khi chi t trong thời gian 8, 10 ngày cao hơn đ ng k so với trong thời gian 4, 6 ngày; đồng thời ở c c tỉ lệ R/L cũng tăng lên. Ở tỉ lệ 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 150 ml dung môi chloroform trong thời gian 8 ngày, khối lượng cao chi t thu được là 0.484g nhỏ hơn so với khối lượng cao chi t ở tỉ lệ 10g mẫu/ 175ml là 0.488g và cao hơn khối lượng cao chi t ở tỉ lệ 10g mẫu/ 125ml là 0.376g, đồng thời cũng nhỏ hơn c ng tỉ lệ trong thời gian 10 ngày nhưng không đ ng k . Vậy tỉ lệ R/L th ch hợp là 10g mẫu hạt quả cam thảo dây/ 150 ml dung môi chloroform trong thời gian 8 ngày. * T n p n c trong d c c t chloroform: Bảng 3.11. Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform ST T RT Area % Name Formula 1 3.14 2.79 Ethylidene acetone C5H8O 2 4.42 0.40 Butyrolactone C4H6O2 3 5.27 0.79 2,2,4,6,6-pentamethylheptane C12H26 4 7.32 4.70 Maltol C6H6O3 5 9.40 0.95 2-butyl-1-octanol C12H26O 6 12.38 0.40 4,6-dimethyl- 2(1H)pyridone,3- (phenylmethylenamino) C14H14N2O 17  Nhận xét: T k t quả ở bảng 3.11 cho thấy phương ph p GC-MS đã định danh được 17 cấu tử trong dịch chi t chloroform t hạt cam thảo dây. C c chất h u cơ chi m hàm lượng cao nhất là c c phytosterol và ester như: stigmasterol (19.63%), β-sitosterol (7.65%), adipic acid, bis(2-ethylhexyl) ester (30.66%) và 3-β-myristoylolean-12-en- 16-β-ol (25.53%). Hàm lượng c c phytosterol acid này trong dịch chi t chloroform thấp hơn khi so s nh với dịch chi t etyl acetat; còn 7 14.5 1.45 Tricyclopentadeca-3,7- dien[8.4.0.1(11,14)] C15H22 8 15.84 0.56 Fornamide,N-{4-[2-(1,1,- dimethylethyl)-5-oxo-1,3- dioxolan-4-yl]butyl} C12H21NO4 9 17.81 1.06 Palmitic acid, ethyl ester C18H36O2 10 17.99 0.41 4-(1-cyanoethyl)-1,2,3,4- tetrahydro-1- naphthalenecarbonitrile C14H14N2 11 18.87 0.67 Methyl (10E)-10- octadecenoete C19H36O2 12 19.47 1.61 Ethyl oleate C20H38O2 13 20.87 0.77 Hexadecanedioic acid C16H30O4 14 21.37 30.66 Adipic acid, bis(2- ethylhexyl) ester C22H42O4 15 28.55 25.53 3-β-myristoylolean-12-en-16- β-ol C44H76O3 16 29.09 19.63 Stigmasterol C29H48O 17 29.93 7.65 β-sitosterol C29H50O 18 dipic acid, bis(2-ethylhe yl) ester lại c hàm lượng cao hơn trong dịch chi t n-he ane. Ngoài ra, dịch chi t chloroform còn ch a c c thành ph n kh c như lacton, ether, ancol và ester c a a it béo. Ethyl oleate một este c a a it béo được hình thành bởi sự ngưng tụ c a axit oleic và ethanol được sử dụng trong nhiều ng dụng như c c ch ph m dược, thực ph m, mỹ ph m và các ng dụng s c khỏe và sắc đ p, nó còn là một dung môi tốt và kem dưỡng m tuyệt vời phù hợp cho việc chăm s c da, chăm s c t c và mỹ ph m màu. Butyrolactone là nh ng chất thường được sử dụng như thuốc k ch th ch, được sử dụng làm thuốc, đ cải thiện hiệu năng th thao, giấc ng , và hoạt động tình dục và niềm vui. d. Trong dung môi methanol * K t quả k ảo sát t ờ g n, tỉ lệ R/L trong quá trìn c t tách: Bảng 3.12. Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích MeOH đến khối lượng cao chiết Th t ch MeOH (ml) 100 125 150 175 200 Thời gian chi t (ngày) Khối lượng cao chi t (gam) 0.652 0.786 0.923 0.953 1.015 4 0.781 0.993 1.045 1.087 1.155 6 0.963 1.089 1.098 1.214 1.233 8 1.022 1.121 1.129 1.232 1.265 10  N ận xét: Qua bảng 3.6 và hình 3.2 ta thấy, khối lượng cao chi t tăng lên theo thời gian chi t t 4 ngày đ n 10 ngày và th t ch dung môi t 100 ml đ n 200 ml và đạt khối lượng cao nhất ở thời gian chi t 8 ngày với tỉ lệ R/L là 10/175 là 1.214g; thời gian chi t trong 10 ngày thì khối lượng cao chi t tăng không đ ng k . C th giải 19 th ch khi tăng thời gian chi t c c chất trong hạt cam thảo dây không hòa tan thêm được. Vậy thời gian chi t tối ưu là 8 ngày và tỉ lệ R/L th ch hợp là 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 175 ml dung môi methanol với khối lượng cao chi t thu được là 1.214g. * T n p n c trong d c c t methanol: Bảng 3.13. Thành phần hóa học trong dịch chiết methanol ST T RT Area % Name Formula 1 5.06 0.06 Methyl 3,3- dimethoxypropionate C6H12O4 2 5.31 0.28 2,4-dihydroxy-2,5-dimethyl- 3(2H)-furan-2-one C6H8O4 3 6.34 0.35 Acetaldehyde, phenyl- C8H8O 4 7.33 0.50 Maltol C6H6O3 5 7.81 0.90 4H-pyran-4-one,2,3-dihydro- 3,5-dihydroxy-6-methyl- C6H8O4 6 7.96 0.11 Benzoic acid C7H6O2 7 9.75 0.96 2,4-dihydroxy-2,5-dimethyl- 3(2H)-furan-3-one C6H8O4 8 10.08 0.10 Indole C8H7N 9 11.02 21.23 1,2,3-benzenetriol C6H6O3 10 13.62 0.99 3-methylquinoline C10H9N 11 15.23 28.50 3-o-methyl-d-glucose C7H14O6 12 17.04 38.13 Gallic acid, methyl ester C8H8O5 13 17.54 1.09 N-hexadecanoic acid C16H32O2 14 17.9 0.25 N-vinylthio-naphthalene-l- amine C12H11NS 20 15 18.35 0.19 10,10- spirocyclohexanotetrahydrop yrimido[1,2-a]indole C16H20N2 16 18.46 0.13 Indole-3-lactic acid, methyl ester C12H13NO3 17 18.88 0.33 Tran-13-octadecenoic acid, methyl ester C19H36O2 18 19.26 0.98 Cis-13-octadecenoic acid C18H34O2 19 19.99 1.90  -carboline, 1,2-dimethyl- C13H12N2 20 20.02 3-(N,N- dimethylamino)carbazole C14H14N2 21 23.71 0.38 4-methoxy-l-cacboxaldehyde naphthaldehyde thiosemicarbazone C13H13N3OS 22 24.8 0.39 Ellipticine C17H14N2 23 25.2 1.75 3-allyl-5-(1H-indol-3- ylmethyl)-2-thioxo- imidazolidin-4-one C15H15N3OS 24 29.13 0.52 Phenol,4-(phenylamino) C12H11NO  Nhận xét: T k t quả ở bảng 3.12 cho thấy phương ph p GC-MS đã định danh được 24 cấu tử trong dịch chi t methanol t hạt cam thảo dây. Thành ph n h a học trong dịch chi t ch y u là nh ng cấu tử c độ phân cực lớn như: 1,2,3-benzenetriol (21.23%), 3-o-methyl-d- glucose (28.50%), Gallic acid, methyl ester (38.13%). 1,2,3- benzenetriol là một a it độc hại, được sử dụng trong sản uất chất màu như thuốc nhuộm azo và ph t tri n nhi p ảnh trong và như một 21 kh ng sinh đ điều trị c c bệnh về da. Gallic acid, methyl ester có hoạt động chống o i h a. Ngoài ra, dịch chi t methanol còn ch a c c thành ph n kh c như ancaloid, phenol, flavonoid, các axit và ester c hàm lượng thấp 0.11÷1.90% nhưng c nhiều t c dụng trong đời sống. Chẳng hạn như 4H-Pyran-4-một, 2,3-dihydro- 3,5-dihydroxy-6-methyl- c hoạt t nh kh ng khu n, kh ng viêm; Cis-13-octadecenoic acid được sử dụng như một t dược trong dược ph m; ellipticine là một t c nhân chống ung thư mạnh; benzoic acid c ch sự ph t tri n c a nấm mốc, nấm men và một số vi khu n, được sử dụng đ điều trị c c bệnh nấm da như nấm da, nấm ngoài da, benzoic acid còn được sử dụng đ giảm đau, và chất khử tr ng trong đ u th kỷ 20.  Nhận xét chung B ng phương ph p GC-MS, một số thành ph n h a học trong c c dịch chi t t hạt cam thảo dây được c định. Trong đ dịch chi t methanol định danh được nhiều cấu tử nhất với 24 cấu tử. Trong 2 dịch chi t ethyl acetate và chloroform c chung nh ng cấu tử steroid với hàm lượng cao là: stigmasterol và β-sitosterol; dịch chi t methanol và ethyl acetate c chung cấu tử lacton và glucosid là maltol và 3-o-methyl-d-glucose; dịch chi t n-hexane và chloroform c chung cấu tử là adipic acid, bis(2-ethylhexyl) ester. Tổng k t quả đã c định được 71 cấu tử kh c nhau c trong hạt cam thảo dây b ng phương ph p GC-MS bao gồm ankan 10C÷27C, acid h u cơ, ester, dẫn uất phenol, terpene, ancol, ketone và amine dị vòng. Trong đ , sterol và ester c a c c acid h u cơ chi m hàm lượng cao. Đồng thời t hình 3.6 đối với dịch chi t b ng n-he ane cho thấy c c pic không cân đối, chân pic c a không rõ ch ng tỏ c c pic đã c hiện 22 tượng chồng pic, còn ở hình 3.7, 3.8 và hình 3.9 đối với dịch chi t b ng methanol, ethyl acetate và chloroform thì c c pic cân đối và độ phân giải cao. Như vậy c th nhận ét: trong c ng điều kiện thực nghiệm ở phòng th nghiệm c c dung môi chi t được c c chất kh c nhau c th do ch ng c độ phân cực kh c nhau. Stigmasterol và squalene trước đây đã được c định. 3.2.3. Chiết xuất abrin và thử hoạt tính gây độc tế bào Bảng 3.14. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào Số TT Tên mẫu IC50 (µg/ml) KB LU MCF–7 Hep. G2 1 Mẫu 1 > 128 > 128 > 128 > 128 2 Mẫu 2 76.41 125.81 > 128 > 128 Theo k t quả ở bảng 3.14 ta thấy, dịch chi t hạt cam thảo dây sau khi k t t a b ng ethanol có hoạt tính với 2 dòng t bào ung thư thử nghiệm là: KB (ung thư bi u mô) và LU (ung thư phổi) với giá trị IC50 l n lượt là: 76.41 µg/ml và 125.81 µg/ml. Dịch chi t nước không có hoạt tính c ch các dòng t bào ung thư thử nghiệm. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ * Kết luận Qua qu trình nghiên c u, đề tài đã thu được c c k t quả như sau: 1. B ng phương ph p sấy khô, phương ph p tro h a mẫu và phương ph p hấp thụ nguyên tử AAS đã c định được độ m, hàm lượng tro và hàm lượng kim loại trong hạt cam thảo dây thu h i ở Qu Sơn- Quảng Nam cho thấy: 23 - Độ m c a hạt cam thảo dây là 13.85%, độ m c a nguyên liệu bột khô là 9.36%. - Hàm lượng tro trung bình trong hạt cam thảo dây là 0.883%. - Hàm lượng c c kim loại n ng Cu, Pb, Zn, As n m trong khoảng cho phép theo quy định tại Quy t định số 867/1998/QĐ-BYT c a Bộ Y T ngày 4 th ng 4 năm 1998 về việc ban hành Danh mục Tiêu chu n vệ sinh đối với lương thực, thực ph m. 2. Tìm được điều kiện tối ưu cho qu trình chi t t ch một số hợp chất t hạt cam thảo dây với c c loại dung môi sau: - Dung môi methanol: Chi t ngâm d m 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 175 ml dung môi methanol trong thời gian 8 ngày. - Dung môi ethyl acetate: Chi t ngâm d m 10g mẫu hạt/ 150ml dung môi ethyl acetate trong thời gian 10 ngày. - Dung môi n-hexane: Chi t ngâm d m 10g mẫu hạt cam thảo dây/ 150ml dung môi n-hexane trong thời gian 8 ngày. - Dung môi chloroform: Chi t ngâm d m 10g mẫu hạt/ 150ml dung môi chloroform trong thời gian 10 ngày. 3. Thành ph n h a học c a dịch chi t hạt cam thảo dây trong các dung môi khác nhau: B ng phương ph p GC-MS đã c định được một số thành ph n h a học trong c c dịch chi t t hạt cam thảo dây. T dịch chi t n-he ane đã định danh được 15 cấu tử, bao gồm c c hidrocacbon mạch dài và hidrocacbon thơm. T dịch chi t ethyl acetate đã định danh được 22 cấu tử, bao gồm acid h u cơ, este, terpen, steroid. T dịch chi t methanol đã định danh được 24 cấu tử, bao gồm c c acid h u cơ, ancaloid, phenol, flavonoid và ester. T dịch chi t chloroform đã định danh được 17 cấu tử, bao gồm lacton, ether, ancol và ester c a a it béo. 24 4. K t t a thu được t dịch chi t nước c a hạt cam thảo dây b ng ethanol có hoạt tính với dòng t bào ung thư thử nghiệm là: KB (ung thư bi u mô) với giá trị IC50 là: 76.41 µg/ml và LU (ung thư phổi) với giá trị IC50 là: 125.81 µg/ml. * Kiến nghị Trong qu trình nghiên c u, tôi c ki n nghị sau: - Ti p tục nghiên c u phương ph p t ch chất và c định cấu tr c c a một số cấu tử ch nh trong c c dịch chi t c a hạt cam thảo dây. - M c d hạt cam thảo dây c ch a một số chất ảnh hưởng không tốt đ n s c khỏe con người như: gallic acid, methyl ester, 1,2,3-benzenetriol, m-xylene, p-xylene, adipic acid,bis(2- ethylhexyl)ester, retene và palmitic acid ethyl ester; tuy nhiên n vẫn ch a một số chất c ng dụng trong y học như: squalene, γ- tocopherol, campesterol, stigmasterol, β-sitosterol, butyrolactone, vì vậy c n nghiên c u phương ph p t ch c c cấu tử c t nh chất qu trong y học và thực ph m đ nh m đ p ng nhu c u c a cuộc sống. Đồng thời thử hoạt t nh sinh học c a c c chất t ch được đ c c i nhìn tổng th về ho thực vật cũng như hoạt t nh sinh học c a hạt cam thảo dây, g p ph n làm tăng gi trị sử dụng cũng như ch a bệnh c a hạt cam thảo dây trong c c bài thuốc dân gian. - Nghiên c u c c bộ phận kh c c a cây cam thảo dây, đ c biệt là l và r bởi vì theo c c thử nghiệm về hoạt t nh sinh học đã được công bố thì dịch chi t t r và l cây c hoạt t nh kh tốt.