Luận văn Nghiên cứu thiết lập tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người biểu hiện gen gfp (Green fluorescent protein)

ữa các gen khiếm khuyết trong tế bào là thêm gen và sửa chữa bộ gen. Các gen liệu pháp được chuyển vào tế bào gốc bằng vector virus, bằng transposon hay bằng các vi nhiễm sắc thể tổng hợp. Sử dụng các DNA sửa chữa hay các quá trính tái tổ hợp tương đồng để sửa một trình tự gen khiếm khuyết và các gen này có thể được phục hồi trở thành trạng thái bình thường [1]. Để tiến hành liệu pháp gen - tế bào gốc, đầu tiên cần thu nhận tế bào gốc từ phôi, tủy xương, máu ngoại vi, máu cuống rốn tiếp tục nuôi cấy và biến đổi di truyền. Phải có một lượng nhất định các tế bào gốc hay các tế bào con cháu biệt hóa của chúng biến đổi di truyền được phân phối hiệu quả vào các mô in vitro [1]. Sự biến đổi di truyền của các EPC nhằm biểu hiện tốt các nhân tố phát triển mạch máu, kích thích hoạt động truyền tín hiệu của đáp ứng tạo mạch, trẻ hóa hoạt tính sinh học hay kéo dài đời sống của EPC sẽ đóng góp vào chiến lược tiềm năng qua đó giải quyết được các giới hạn của việc cấy ghép EPC trực tiếp [1], [51]. Trong nghiên cứu của Satoshi Murasawa (2003), bằng chứng đầu tiên về việc cấy ghép EPC có chuyển nhiễm VEGF hoặc hTERT (human telomerase reverse transcriptase) không chỉ cho thấy sự biến đổi gen làm tăng cường tạo mạch máu mới mà còn phục hồi dòng máu. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về EPC, nghiên cứu khả năng ứng dụng của EPC trong điều trị bệnh. Tuy nhiên các nghiên cứu liên quan đến chuyển gen ở EPC còn ít. Trong vài năm tiếp cận nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc các nhà khoa học Việt Nam đã cố gắng và đã thu được một số kết quả ban đầu: cấy ghép tế bào tạo máu, cấy ghép tế bào sừng, cấy ghép tế bào gốc giác mạc. Các nghiên cứu về EPC hay chuyển gen vào EPC đã có một số nghiên cứu khởi đầu ở phòng Nghiên Cứu và Ứng Dụng Tế bào Gốc Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh nhưng vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào được công bố. 1.5.2. Chuyển gen vào tế bào tiền thân nội mô bằng vector virus 1.5.2.1. Chuyển gen vào tế bào tiền thân nội mô bằng vector virus Hơn hai thập niên qua, các nhà khoa học tập trung nhiều vào việc phát triển các vectơ virus và hoàn thiện các qui trình chuyển nhiễm sao cho có thể đưa các thông tin di truyền vào tế bào gốc một cách hiệu quả và ổn định. Vector Retrovirus, vector Lentivirus, virus kết hợp Adeno là các vectơ được sử dụng phổ biến nhất trong việc chuyển gen vào tế bào gốc. Các biến đổi di truyền trong việc phát triển vector vẫn giữ được khả năng sát nhập DNA vào bộ gen tế bào chủ nhưng loại bỏ khả năng vector sản xuất các Retrovirus hoàn chỉnh. Trong chu kì sống tự nhiên của Retrovirus, DNA của virus sẽ sát nhập ngẫu nhiên vào DNA nhiễm sắc thể của tế bào mục tiêu và DNA sát nhập được truyền cho con cháu qua quá trình phân chia tế bào [1]. Daniel P. Griese và cs nghiên cứu chuyển gen chống đông máu vào EPC bằng vector Retrovirus (2003) [12]. Năm 2004, Choi và cs đã chuyển GSK3β vào EPC bằng vector Adenovirus nhằm tăng khả năng tái tạo mạch, kết quả mạch được phục hồi nhanh chóng trong điều kiện in vivo và in vitro [51]. Một năm sau, Chen 2Tvà cs sử dụng virus Adenoassociated biến đổi 2TEPC 2Tvới Angiopoietin2T-1 2Tvà VEGF, 2Tkết quả chuyển VEGF tạo 2Tthuận lợi cho 2Tđiều trị 2Tnhững mô hình chuột thiếu máu cục bộ cơ tim2T [52]. Những nghiên cứu liên quan đến biến đổi di truyền của EPC có thể nâng cao tiềm năng mạch máu tái sinh và áp dụng cho thử nghiệm lâm sàng trong tương lai. 1.5.2.2. Vector Lentivius [2], [3], [15], [20], [30], [46] Khi xâm nhiễm tế bào, virus có khả năng chuyển bộ gen của virus hoặc chuyển một số gen của chúng vào bộ gen tế bào chủ tạo thành một thể thống nhất. Các gen virus gắn bộ gen tế bào chủ có thể tồn tại lâu dài cùng với quá trình phân chia tế bào tạo nên các provirus. Trong quá trình tồn tại và phân chia tế bào, bộ gen virus gắn với bộ gen tế bào cũng được nhân lên tạo nên vô số các tế bào mang các gen virus. Các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu nhiều về vector trong đó vector lentivirus có tiềm năng lớn trong liệu pháp gen và hầu hết các vector này có nguồn gốc từ HIV. Nguyên lý chung của thiết kế vector Lentivirus phải loại bỏ gen độc của virus, chỉ giữ lại một số gen cần thiết của quá trình xâm nhiễm, tái bản, gắn và cày thêm các gen liệu pháp. Vector phải có khả năng hòa nhập vào gen tế bào đích với tần số cao, không gây đột biến cho tế bào đích, ít hoặc không gây hiệu ứng phụ bất lợi. Thiết kế vector là một quá trình phức tạp gồm nhiều giai đoạn như: loại bỏ các gen chủ yếu của virus (gag, pol, env) thay thế bằng gen mục tiêu tạo thành vector bộ gen; xử lý cắt riêng các gen gag, pol, env nhưng vẫn đảm bảo chức năng gen; đưa vector bộ gen cùng với các gen gag, pol, env đã xử lý của virus vào tế bào đóng gói; trong tế bào đóng gói các gen virus hoạt động tổ hợp các thành phần vỏ của virus, các thành phần vỏ kết hợp với vector mang gen mục tiêu hình thành nên vector Lentivirus. Hình 1.10. Các plasmid tổ hợp trong tế bào 293T tạo vector Lentivirus [20], [61] . CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu vật – Địa điểm – Thời gian nghiên cứu Mẫu vật nghiên cứu: - Máu cuống rốn người thu từ Bệnh viện Phụ Sản Hùng Vương. - Mẫu máu cuống rốn thu nhận sử dụng cho nghiên cứu: âm tính với HIV, HBV, HCV. - Thời gian thu mẫu: 08/2010 - 03/2011. - Số lượng mẫu: 37 Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí Nghiệm Nghiên Cứu và Ứng Dụng Tế Bào Gốc – Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Thời gian nghiên cứu: Tháng 6/2010 đến tháng 08/2011. 2.1.2. Vector Lentivirus: copGFP Lentivirus được mua từ Công ty Santa Cruz Biotechnology, USA và được sử dụng để biểu hiện gen phát quang màu xanh lá ở tế bào động vật có vú. So với GFP, copGFP Lentivirus phát quang mạnh và ổn định gấp 1,3 lần. 2.1.3. Hóa chất 2.1.3.1. Dung dịch đệm rửa tế bào PBS pH 7,4 Bảng 2.1. Công thức pha dung dịch PBS. Thành phần Hàm lượng Cách pha - Bảo quản NaCl 0,80 g - Cân và khuấy tan lần lượt các thành phần trong 800 ml nước cất 2 lần. - Bổ sung nước cất vừa đủ 1000 ml - Chuẩn pH 7,4. - Hấp vô trùng ở 121P0PC, 30 phút. KCl 0,20 g NaR2RHPOR4R.12HR2RO 0,29 g KHR2RPOR4 0,20 g Gentamycin 1µl/ml - Bảo quản trong tủ mát 4P0PC, sử dụng trong 1 tháng. 2.1.3.2. Dung dịch tách tế bàoTrypsin/EDTA 0,25 % Bảng 2.2. Công thức pha dung dịch tách tế bào. Thành phần Hàm lượng Cách pha - Bảo quản Bột Trypsin (Sigma) 0,250 g - Cân và khuấy tan lần lượt các thành phần trong 80 ml PBS. - Bổ sung PBS đủ 100 ml. - Lọc qua màng lọc vô trùng 0,2 µm. - Bảo quản trong tủ mát 4P0PC, sử dụng trong 3 tuần. EDTA (Merck) 0,093 g 2.1.3.3. Dung dịch làm giàu tế bào đơn nhân Ficoll-Paque (17-1440-02, Amerstam Pharmacia Biotech) Ficoll- Paque là hỗn hợp ficoll và sodium diatrizoate được dùng để làm giàu tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn . 2.1.3.4. Môi trường ưu thế nuôi EPC từ máu cuống rốn người (Endothelial Cell Growth Medium BulletKit-2) Bảng 2.3. Một số thành phần trong EGM-2. Một số thành phần trong EGM-2 Tác dụng hEGF Điều hòa sự phát triển, tăng sinh, biệt hóa tế bào. hFGF-b Tạo mạch, làm lành vết thương, có vai trò quan trọng trong quá trình tăng sinh và biệt hóa tế bào. VEGF Tạo ra mạch máu mới trong quá trình phát triển phôi thai, tái tạo mạch máu sau khi bị tổn thương Ascrobic Acid (Vitamin C) Kìm hãm sự lão hóa tế bào Hydrocortisone Kháng viêm Long R3-IGF-1 Chống thoái hóa tế bào Heparin Chống đông máu FBS Cung cấp nhiều thành phần dinh dưỡng cho tế bào, trung hòa các chất độc hại Gentamicin, Amphotericin Chống nhiễm khuẩn 2.1.3.6. Hóa chất dùng cho kỹ thuật flow cytometry Dung dịch FACSFlow (BD Biosciences, USA). Kháng thể đơn dòng kháng CD133, CD34, CD90, CD14 (BD Biosciences, USA). 2.1.4. Dụng cụ và thiết bị Bảng 2.4. Danh sách một số dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm. STT Tên dụng cụ Hãng sản xuất Nước sản xuất 1 Bercher (100ml; 50ml) Schott Đức 2 Bình Duran (100ml; 50ml) Schott Đức 3 Bình định mức (1000ml) Schott Đức 5 Erlen (250ml) Schott Đức 6 Eppendorf (2ml) Kartell Pháp 7 Falcon (15ml; 50ml) Corning Hoa kỳ 9 Kim tiêm (10ml) Vikimco Việt Nam 10 Màng lọc 20µm Minisart Hoa kỳ 11 Micropipette (10 - 1000µl) Nichiro Nhật 12 Pipette (10ml, Paster) Schott Đức 14 Roux (25cmP2P) Nunc Đan Mạch 15 Các dụng cụ khác Kéo, parafilm, kẹp... Bảng 2.5. Danh sách các thiết bị sử dụng trong luận văn. STT Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất 1 Máy li tâm Hettich Đức 2 Máy vortex VX100 Labnet Đức 3 Máy khuấy từ Stuart Đức 5 Máy BD FACS Calibur BD BioScience Hoa kỳ 8 Nồi hấp vô trùng Hyrayama Nhật 9 Tủ lạnh Sanyo Nhật 10 Tủ ấm Memmert Anh 12 Tủ cấy vô trùng Telstar Hoa kỳ 13 Buồng thao tác vô trùng Sanyo Nhật 16 Kính hiển vi huỳnh quang Olympus Nhật 17 Kính hiển vi đảo ngược Olympus Nhật Hình 2.1. Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu. (A), (B) hệ thống máy phân tích Flow cytometry; (C) máy ly tâm (D) tủ cấy telstar; (E) hệ thống kính hiển vi huỳnh quang. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu nhận máu cuống rốn người Nguyên tắc: 4TMáu cuống rốn thu nhận theo qui trình của Ngân hàng máu cuống rốn – Công ty Công nghệ sinh học Canada (Healthcord Cryogenics Corporation). Qui trình tiến hành: - Sau khi trẻ được sinh ra và trước khi xổ nhau thai, dùng hai kẹp, kẹp cuống rốn cách trẻ sơ sinh khoảng 20 cm cầm máu và cắt dây rốn (cắt tại vị trí giữa hai kẹp). - Đặt nhau thai và dây vào khay vô trùng, nhau thai trên bề mặt cao hơn dây rốn. - Khử trùng kim, dây túi máu. - Đâm kim vào tĩnh mạch dây rốn và thu thập mẫu nhiều càng tốt thông qua dòng chảy trọng lực (tối thiểu là 80 ml). Nhẹ nhàng xoay lắc túi máu để máu pha trộn với thuốc kháng đông máu (CPDA _4Tcitrate-phosphate-dextrose anticoagulant)4T. - Rút kim ra khỏi cuống rốn, đậy nắp kim. Mẫu máu được cho vào hộp thu mẫu bảo quản ở 4P0PC và chuyển về phòng thí nghiệm. Đánh giá kết quả: Những mẫu máu được sử dụng để phân lập tế bào tiền thân nội mô không xuất hiện các cục máu đông, thể tích không dưới 80 ml. 2.2.2. Phương pháp li tâm thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người Nguyên tắc: Việc làm giàu phân đoạn tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn nhằm làm nâng cao khả năng thu nhận quần thể tế bào gốc trong máu cuống rốn. Tiến hành thu nhận quần thể tế bào đơn nhân bằng phương pháp li tâm trên gradient nồng độ Ficoll-paque (Sigma), các tế bào có cùng tỷ trọng nằm cùng một pha. Qui trình tiến hành [54]: - Pha loãng máu cuống rốn với PBS với tỉ lệ 1:1. - Hút 5 ml Ficoll-Paque vào ống ly tâm 15 ml. - Nhẹ nhàng đặt 10 ml hỗn hợp PBS và máu cuống rốn lên trên lớp Ficoll-Paque (1,077 g/ml). - Li tâm ở 450g trong 20 – 30 phút, ở nhiệt độ 18 – 20P0PC. - Sau khi li tâm, một lớp tế bào đơn nhân nằm tại lớp giữa, ngay trên lớp mặt của Ficoll-Paque vì chúng có tỷ trọng nhỏ hơn. - Sử dụng pipette pasteur chuyển lớp giữa chứa MNC vào ống ly tâm mới. - Rửa tế bào với PBS và li tâm ở tốc độ 200g trong 10 phút, ở nhiệt độ 18 – 20P0PC. - Đổ bỏ dịch nổi, tái huyền phù cặn tế bào trong PBS và lặp lại hai lần quy trình rửa. - Tái huyền phù tế bào trong một thể tích môi trường EGM-2. Đánh giá kết quả: Mẫu tế bào đơn nhân thu được tách thành từng tế bào đơn có kích thước các tế bào tương đối đồng nhất và mẫu không lẫn tế bào hồng cầu, tế bào tiểu cầu. 2.2.3. Phương pháp nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô ứng viên từ máu cuống rốn người Nguyên tắc: Quần thể tế bào đơn nhân gồm nhiều loại tế bào khác nhau như: MSC, HSC, EPC, USSC, CBE, CB-MPC [44]. Chúng có thể được phân thành hai nhóm tế bào: nhóm tế bào có khả năng bám vào bề mặt của dụng cụ nuôi và nhóm tế bào không có khả năng này. Các tế bào không bám, lơ lửng trong dịch nuôi được loại ra khỏi bình nuôi qua lần đầu tiên thay môi trường. Còn quần thể tế bào bám, tiếp tục nuôi trong môi trường ưu thế dành cho tế bào tiền thân nội mô cho nên hầu hết các tế bào gốc không phải là tế bào tiền thân nội mô khó có khả năng sống và phát triển. Qui trình tiến hành [35]: - Lấy 3ml huyền phù tế bào (10P6 Ptế bào/ml) cho vào bình nuôi 25 cmP2P. - Đặt bình nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37P0PC, 5% COR2. - Thay môi trường sau mỗi 3 – 5 ngày nuôi cấy. - Tiến hành cấy chuyền tế bào khi mật độ tế bào trong bình nuôi đạt khoảng 70 – 80% diện tích. - Quan sát và theo dõi các mẫu nuôi tế bào bằng kính hiển vi đảo ngược. - Đếm và phân loại tế bào bằng kỹ thuật flow cytometry. - Thu kết quả. Đánh giá kết quả: - Bước đầu đánh giá xác nhận EPC dựa vào khả năng bám dính, tăng sinh trong môi trường nuôi cấy và quan sát hình thái tế bào. EPC muộn có dạng hình viên sỏi trong khi EPC sớm là dạng hình thoi và chúng có thể tạo tập đoàn hoặc mọc rải rác phụ thuộc vào tiềm năng tăng sinh tế bào [14], [22], [37], [47]. - Xác nhận EPC qua sự biểu hiện đương tính, âm tính với các marker CD14, CD90, CD34, CD133. Kết P Pquả, số liệu được xử lý bằng phần mềm Cell Quest Pro 2.2.4. Phương pháp flow cytometry [21], [45] Nguyên tắc: Flow cytometry là kỹ thuật cho phép đếm và phân loại tế bào (hoặc các hạt) dựa trên nguyên lý về tán xạ ánh sáng, kích thích ánh sáng và phát xạ của các phân tử phát huỳnh quang. Trong thiết bị Flow cytometer, các tế bào di chuyển theo dòng chất lỏng ngang qua nguồn sáng kích thích, tia sáng va vào tế bào, chúng sẽ tán xạ hoặc hấp thu và phát ra một ánh sáng tán xạ. Ánh sáng tán xạ là hệ quả khi một chùm sáng va chạm vào tế bào dẫn đến chúng sẽ phản xạ hoặc khúc xạ đến đầu dò. Ánh sáng này được phân thành hai loại: (1) ánh sáng có góc hợp với tia tới một góc nhỏ hơn 90P0P phản ánh kích thước tế bào; (2) ánh sáng có góc hợp với tia tới một góc lớn hơn 90P0P tạo nên bởi độ hạt và mức độ phức tạp bên trong tế bào. Dựa trên thông số thu được khi đo đồng thời hai loại ánh sáng nói trên có thể phân biệt, nhận diện các dạng tế bào trong một quần thể tế bào hổn độn và tính được tỷ lệ phần trăm tương ứng giữa chúng [50]. Qui trình tiến hành [21], [45]: - Thu tế bào. - Mẫu tế bào được bỏ dịch nổi và rửa 2 lần PBS. - Ủ với trypsin/ EDTA 0,25% ở nhiệt độ phòng đến khi tế bào tách ra khỏi bề mặt dụng cụ nuôi (khoảng 3 – 5 phút). - Ly tâm thu cặn tế bào (3000 vòng/phút, trong 5 phút). - Ủ, lắc với kháng thể (CD14, CD34, CD90, CD133) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. - Ủ, lắc trong 15 phút, ở 4P0 PC. - Ly tâm loại bỏ kháng thể thừa bằng dung dịch FACS Flow. - Huyền phù tế bào trong dung dịch FACS Flow. - Tế bào được đưa vào hệ thống FACS phân tích. - Thu kết quả. Đánh giá kết quả: - Phần mềm Cell Quest Pro được dùng để xử lí dữ liệu - Kết quả phân tích biểu diễn dưới dạng dot blot sử dụng hai thông số để vẽ khung dữ liệu tổng quát trong quá trình phân tích dòng chảy. Mỗi điểm thể hiện sự di chuyển của một tế bào khi nó đi qua đầu dò. Trục X và Y đo các mức độ phát sáng khác nhau, một điểm biểu thị tương ứng với một tế bào có dạng phát sáng khác nhau. Kết quả phân tích cũng được biểu diễn dưới dạng biểu đồ: trục X biểu diễn tín hiệu thu được, trục Y biểu diễn số lượng tế bào. - Căn cứ vào tỷ lệ phần trăm tế bào dương tính với các marker sử dụng. 2.2.5. Phương pháp chuyển gen gfp vào tế bào tiền thân nội mô bằng vector Lentivirus Nguyên tắc: Lentivirus có khả năng sát nhập vật liệu di truyền vào nhân của tế bào chủ, vì thế vector Lentivirus được sử dụng để chuyển gen mục tiêu vào nhiễm sắc thể tế bào đích và đảm bảo được tính an toàn cho dòng tế bào chuyển gen vì vector này không có khả năng nhân lên trong tế bào chủ. Qui trình tiến hành [10], [31]: - Cấy chuyển EPC trước 24 giờ chuyển nhiễm với mật độ 10P4P tế bào/ml/giếng. - Cho thêm 5 µl CaClR2R vào giếng 2; 5µl polybrene vào giếng 3. - Cho 20 µl vector Lentivirus vào mỗi giếng và ủ qua đêm ở 37P0PC, 5% COR2R. - Sau 24 giờ hút bỏ dịch môi trường cũ và cho vào mỗi giếng 1ml EGM-2. - Cho 20 µl vector Lentivirus vào mỗi giếng và ủ qua đêm ở 37P0PC, 5% COR2R. Đánh giá kết quả: Kết quả chuyển gfp vào EPC được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng 395 – 495 nm và đánh giá hiệu quả bằng kỹ thuật flow cytometry. 2.2.6. Phương pháp đánh giá biểu hiện protein GFP Nguyên tắc: Protein GFP có 2 đỉnh hấp thụ cực đại: đỉnh lớn ở bước sóng 395 nm và đỉnh nhỏ ở bước sóng 495 nm. Phổ phát xạ của GFP có đỉnh tại 509 nm với ánh sáng màu lục nằm trong vùng thấp của phổ ánh sáng thấy được. Đánh giá kết quả bằng cách quan sát tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang với ánh sáng kích thích màu xanh lam (bước sóng từ 395 – 495 nm), tế bào chuyển nhiễm thành công sẽ phát ánh sáng màu xanh lá. Qui trình tiến hành: Quan sát mẫu dưới kính hiển vi huỳnh quang. Đánh giá kết quả: gen gfp được chuyển gắn vào bộ gen của EPC phát sáng màu xanh lá. 2.2.7. Phương pháp chọn lọc tế bào kháng puromycin Nguyên tắc: Vector Lentivirus có gen kháng kháng sinh puromycin nên khi chèn bộ gen của virus vào bộ gen của EPC thì EPC này lại có khả năng kháng puromycin. Các EPC chuyển nhiễm gen gfp thành công mang cả gen kháng puromycin nên có khả năng sống sót trong môi trường có kháng sinh puromycin còn EPC chuyển gen không thành công thì chúng không có đặc tính kháng puromycin. Vì thế sau 24 giờ EPC không mang gen gfp sẽ chết trong môi trường có kháng sinh puromycin. Qui trình tiến hành: - Sau 5 - 6 ngày chuyển nhiễm, cho 5µg/ml puromycin vào môi trường nuôi. - Kiểm tra kết quả sau 24 giờ bằng kỹ thuật flow cytometry. Đánh giá kết quả: - Phần mềm Cell Quest Pro được dùng để xử lí dữ liệu. 2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu Tất cả số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel, Cell Quest Pro. Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và độ tin cậy ở mức độ tin cậy 95%. Qui trình nghiên cứu được tóm tắt ở hình 2.2. Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt qui trình nghiên cứu. Flow cytometry với CD14, CD34, CD90, CD133 Máu cuống rốn Tế bào đơn nhân EPC ứng viên Khẳng định EPC Đánh giá sự thay đổi tính gốc của EPC sau chuyển gen gfp bằng flow cytometry Hỗn hợp EPC mang gen gfp EPC mang gen gfp Đánh giá tỷ lệ biểu hiện gen gfp sau chọn lọc bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật flow cytometry Chọn lọc tế bào mang gen gfp biểu hiện ổn định bằng puromycin Li tâm bằng Ficoll - paque Nuôi chọn lọc trong EGM-2 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Thu nhận máu cuống rốn người Trong thời gian từ tháng 08/2010 đến tháng 03/2011, tổng thu 37 mẫu máu cuống rốn trong đó có 06 mẫu loại trừ, 31 mẫu đạt tiêu chuẩn tiến hành thí nghiệm. 3.2. Thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người Kết quả thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người bằng phương pháp li tâm trên gradien nồng độ Fillcol-paque được minh họa trên hình 3.1 Hình 3.1. Phân đoạn tế bào đơn nhân sau li tâm. Kết quả li tâm cho thấy huyết tương ở lớp bên trên, hồng cầu và bạch cầu hạt có tỷ trọng lớn sẽ lắng ở đáy ống li tâm, các tế bào đơn nhân có tỷ trọng thấp hơn lắng tại mặt trung gian của lớp Ficoll-paque và huyết tương. Quần thể tế bào đơn nhân được thu nhận và nuôi cấy trong bình 25 cmP2P, mật độ 10P6 Ptế bào/ml, sử dụng môi trường EGM-2 có bổ sung 20% FBS và kháng sinh. Ngay sau khi nuôi cấy quan sát tế bào dưới kính hiển vi (hình 3.2) có thể nhận biết và phân biệt một số dạng tế bào, quần thể tế bào đơn nhân có dạng tròn đều tuy nhiên mẫu tế bào vẫn còn sót lại một ít Huyết tương Lớp tế bào đơn nhân Ficoll-paque Hồng cầu tế bào hồng cầu với hình đĩa lõm hai mặt và kích thước to hơn so với quần thể tế bào có nhân. Hình 3.2. Quần thể tế bào đơn nhân sau khi thu nhận (Độ phóng đại 100 lần). ( tế bào hồng cầu) 3.3. Nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô ứng viên Quần thể tế bào đơn nhân thu nhận được từ phương pháp li tâm trên gradient – Ficoll có thể phân thành ba quần thể tế bào khác nhau: (1) hồng cầu còn sót lại trong mẫu; (2) bạch cầu; (3) tế bào gốc. Các bạch cầu và hồng cầu không bám vào dụng cụ nuôi vì thế khi nuôi các tế bào này trên giá thể cho phép bám dính thì hồng cầu và bạch cầu sẽ bị loại bỏ sau lần thay môi trường đầu tiên. Quần thể tế bào gốc trong máu cuống rốn rất đa dạng gồm nhiều loại tế bào khác nhau như: MSC, HSC, EPC, USSC, CBE, CB-MPC. Nhưng trong đó HSC không có khả năng bám vào bề mặt dụng cụ nuôi, riêng CBE có khả năng bám sau 7 ngày nuôi ở môi trường ưu thế dành cho CBE. Như vậy, sau 48 giờ thay môi trường các tế bào lơ lửng trong dịch nuôi (HSC, CBE) bị loại và quần thể tế bào còn bám lại trong bình nuôi là MSC, EPC, USSC, CB-MPC (hình 3.3). Hình 3.3. Quần thể tế bào đơn nhân còn lại sau 48 giờ nuôi. (Độ phóng đại 100 lần). Mẫu có nhiều tế bào bám , (b) Mẫu có ít tế bào bám. Mỗi loại tế bào gốc có khả năng sống và phát triển trong một môi trường nuôi cấy nhất định, EGM-2 được sử dụng trong nghiên cứu này là môi trường ưu thế dành cho EPC, do đó các tế bào gốc khác sẽ không phát triển hoặc phát triển yếu và chúng sẽ bị loại dần trong quá trình nuôi cấy. Sau 7 ngày nuôi cấy các tế bào bám dính bắt đầu tăng sinh và các tế bào này tương đối đồng dạng. Kết quả được thể hiện trên hình 3.4. Hình 3.4. Tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 7 ngày (Độ phóng đại 100 lần). a) Mẫu tế bào bám trải và tăng sinh. (b) Mẫu tế bào bám ít và không có dấu hiệu tăng sinh. Sau 12 ngày các tế bào tiền thân nội mô ứng viên tăng sinh mạnh và hình thành colony (hình 3.5). a b ( Tế bào tăng sinh) . Hình 3.5. Colony tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 12 ngày (Độ phóng đại 100 lần). Theo Daniel P. Sieveking và cộng sự, 2008 [11] nghiên cứu phân lập EPC từ quần thể tế bào đơn nhân máu ngoại vi, mật độ nuôi cấy 1 x 10P7P tế bào/ml đến 1,5 x 10P7 Ptế bào/ml và sử dụng môi trường nuôi EGM-2, kết quả sau 14 – 21 ngày các tế bào tăng sinh mạnh và tạo thành colony EPC dạng hình viên sỏi. Nếu so sánh kết quả nghiên cứu này (1 x 10P6P tế bào/ml) với nghiên cứu của Daniel P. Sieveking thì thời gian tạo thành colony sớm hơn ít nhất 2 ngày và kết quả lại phù hợp với nghiên cứu của David A. Ingram và cộng sự (2004) [14] là EPC thu từ máu cuống rốn có thời gian tăng sinh và phát triển sớm hơn EPC thu từ máu ngoại vi. Tế bào được tiến hành cấy chuyền (theo tỉ lệ 1: 3) khi quần thể tế bào chiếm khoảng 70 - 80% diện tích bề mặt bình nuôi. Theo dõi kết quả cho thấy thời gian tế bào bám trong nuôi thứ cấp nhanh hơn (12 - 24 giờ đã có tế bào bám – hình 3.6). Các quần thể tế bào cấy chuyền sau 7 ngày có dấu hiệu tăng sinh (hình 3.7; 3.8; 3.9), sau 12 ngày tế bào tăng sinh mạnh và tạo thành colony. Hình 3.6. Quần thể tế bào bám sau 24 giờ cấy chuyền ở lần 1 (Độ phóng đại 100 lần). Hình 3.7. Quần thể tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 7 ngày cấy chuyền ở lần 1 (Độ phóng đại 200 lần). Hình 3.8. Quần thể tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 7 ngày cấy chuyền ở lần 2 (Độ phóng đại 200 lần). Hình 3.9. Quần thể tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 7 ngày cấy chuyền ở lần 3 (Độ phóng đại 200 lần). Trong máu cuống rốn EPC chiếm khoảng 10P-6P – 10P-4P [42] nên việc thu nhận EPC phải tiến hành chọn lọc trên nhiều mẫu. Sau khi thay môi trường nhiều tế bào lơ lửng trong mẫu bị loại đi, còn lại một ít tế bào bám vào đáy bình nuôi (10P3 Ptế bào/ml) nên khả năng tăng sinh của tế bào bám này là rất khó. Mặt khác, nuôi cấy trong môi trường chọn lọc ưu thế dành cho EPC, cho nên nếu các tế bào bám mà không phải là EPC thì khó có khả năng sinh trưởng và sau đó chúng cũng chết dần. Kết quả chọn lọc ứng viên EPC được tổng hợp ở phụ lục 1. 3.4. Kết quả định danh tế bào tiền thân nội mô Các tế bào phát triển phủ khoảng 70% diện tích bề mặt bình nuôi được xử lý Trysin/EDTA 0,25%, tách và thu nhận tế bào sau đó nhuộm tế bào với kháng thể CD14, CD34, CD90, CD133 trong 30 phút, ở 4P0PC. Sau khi phân tích tế bào bằng hệ thống FACS, kết hợp xử lý bằng phần mềm Cell Quest Pro, kết quả được thể hiện trên hình 3.11 và bảng 3.3. Hình 3.10. Kết quả xác định EPC bằng phương pháp flow cytometry (lần 1). Kết quả xác định EPC bằng phương pháp flow cytometry lần 2, lần 3 xem phụ lục 2, phụ lục 3. Tế bào được kiểm tra marker CD14, CD34, CD90, CD133 qua 3 lần lặp lại được thể hiện ở bảng 3.3. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel (xem phụ lục 4) Bảng 3.1. Tỷ lệ phần trăm EPC ứng viên biểu hiện dương tính với marker khảo sát. Số lần thí nghiệm CD14 (%) CD34 (%) CD90 (%) CD133 (%) Lần 1 0,32 71,35 0,85 64,87 Lần 2 2,41 56,32 2,12 65,08 Lần 3 1,67 45,98 3,21 52,84 Trung bình 1,47 ± 1,06 57,88 ± 12,76 2,06 ± 1,18 60,93 ± 7,01 Từ bảng 3.1 vẽ biểu đổ 3.1 Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ phần trăm trung bình EPC ứng viên biểu hiện dương tính với các marker khảo sát. Thông qua kết quả ở bảng 3.1 xác định tỷ lệ phần trăm tế bào biểu hiện dương tính và âm tính với từng marker khảo sát (bảng 3.2). Bảng 3.2. Tỷ lệ trung bình EPC biểu hiện với marker khảo sát. Marker bề mặt Tỷ lệ trung bình tế bào dương tính với marker (%) Tỷ lệ trung bình tế bào âm tính với marker (%) CD14 1,47 ± 1,06 98,53 ± 1,06 CD34 57,88 ± 12,76 42,11 ± 12,76 CD90 2,06 ± 1,18 97,94 ± 1,18 CD133 60,93 ± 7,01 39,07 ± 7,01 Quần thể EPC ứng viên có thể gồm EPC, MSC, USSC, CB-MPC. Do sự trùng lấp về marker giữa các tế bào gốc nên phải kết hợp chọn lọc âm tính và dương tính bằng kĩ thuật flow cytometry để chọn lọc chính xác loại tế bào gốc mong muốn. EPC biểu hiện dương tính với CD34, CD133 [36], [56] trong khi đó biểu hiện âm tính với CD90 [1]. Đối với CD14, EPC sớm biểu hiện dương tính [33], [56], EPC muộn biểu hiện âm tính [41]. Các loại MSC, USSC biểu hiện dương tính mạnh với CD90 nhưng biểu hiện âm tính với CB- MPC [1]. Vậy có thể dùng CD90 để loại MSC, USSC; CD14 để loại CB-MPC. Kết quả kiểm tra marker ở bảng 3.4 cho thấy âm tính với CD90 (97,94%) và CD14 (98,53%) nên có thể MSC, USSC, CB-MPC chiếm tỷ lệ thấp trong quần thể EPC ứng viên. Từ đây kết luận rằng trong quần thể EPC ứng viên thì EPC là ứng viên ưu thế nhất. Kết quả xác định marker của nghiên cứu này khá cao so với kết quả nghiên cứu của Xin Zhang và cộng sự (2008) [63] thu nhận nuôi cấy EPC từ tủy xương chuột, môi trường EGM-2, EPC biểu hiện dương tính với CD34 là 16,5%, với CD133 là 13,9%. Ngoài ra kết quả nghiên cứu không những biểu hiện CD34P+ P/CD133P+ P mà còn biểu hiện CD14P-P phù hợp với nghiên cứu của Toshio Imanishi và cộng sự (2008) [56]. Theo Bailey EPC có thể biệt hóa thành các tế bào nội mô, đóng góp vào sự duy trì và sửa chữa mạch máu. Các nghiên cứu khác [11], [26], [42] cũng khẳng định vai trò này của EPC nhưng lại cho rằng chỉ có EPC muộn đóng vai trò quan trọng trong sự tạo mạch máu mới còn loại EPC sớm có thể sát nhập vào lớp nội mạch nhưng không tham gia trực tiếp hình thành mạch. Tuy nhiên EPC sớm có thể tiết ra các nhân tố tạo mạch kích thích tăng sinh EC, tăng sinh EPC. Không những thế mà khi chết EPC sớm còn tiết ra cytokine tạo mạch. EPC muộn được phát triển từ quần thể CD14P-P và được xác định biểu hiện CD34P+P /CD133P+P còn EPC sớm biểu hiện CD14P+ P/CD34P+ P/ CD133P+P. Như vậy với kết quả kiểm tra marker EPC CD34P+ P/CD133P+ P/CD14P-P (CD14 là 1,47%) nên có thể kết luận thêm rằng EPC thu được có EPC muộn là khá cao. Từ kết quả thu nhận được có thể rút kết luận sau: Quy trình phân lập EPC từ máu cuống rốn bằng phương pháp nuôi cấy chọn lọc với môi trường EGM-2 sẽ tạo quần thể tế bào tiền thân nội mô tương đối đồng nhất vào lần cấy chuyền thứ 3 và kết hợp với phương pháp chọn lọc tế bào bằng dòng chảy nguồn EPC được chọn lọc và đã được tinh sạch có thể sử dụng cho mục đích nghiên cứu chuyển gfp tiếp theo. 3.5. Chuyển gfp vào tế bào tiền thân nội mô bằng vector Lentivirus EPC được tách và chuyển vào đĩa 6 giếng trước 24 giờ chuyển nhiễm với mật độ tế bào 10P4 Ptế bào/ml/giếng. Khảo sát chuyển gfp vào EPC bằng vector Lentivirus với ba cách: (1) bằng vector Lentivirus; (2) bằng vector Lentivirus + CaClR2R; (3) bằng vector Lentivirus + polybrene. Kết quả chuyển gen thể hiện lần lượt ở hình 3.11, 3.12, 3.13. b c a a b c Hình 3.11. EPC mang gen gfp chuyển nhiễm bằng vector Lentivirus (Độ phóng đại 100 lần). a. Hình chụp ở kính hiển vi thường. b. Hình chụp đơn sắc ở kính hiển vi huỳnh quang. c. Hình chụp đa sắc ở kính hiển vi huỳnh quang. Hình 3.12. EPC mang gen gfp chuyển nhiễm bằng vector Lentivirus + CaCl2 (Độ phóng đại 100 lần) a. Hình chụp ở kính hiển vi thường. b. Hình chụp đơn sắc ở kính hiển vi huỳnh quang. c. Hình chụp đa sắc ở kính hiển vi huỳnh quang. . a b c Hình 3.13. EPC mang gen gfp chuyển nhiễm bằng vector Lentivirus + polybrene (Độ phóng đại 100 lần). a. Hình chụp ở kính hiển vi thường. b. Hình chụp đơn sắc ở kính hiển vi huỳnh quang. c. Hình chụp đa sắc ở kính hiển vi huỳnh quang. 3.5.1. So sánh kết quả chuyển gen Kết quả chuyển gen được tiếp tục xác định bằng phương pháp flow cytometry và được thể hiện ở hình 3.14. Hình 3.14. Kết quả xác định EPC mang gen gfp (giếng 1) bằng kỹ thuật flow cytometry. (1) chuyển nhiễm gen gfp vào EPC bằng vector Lentivirus (2) chuyển nhiễm gen gfp vào EPC bằng vector Lentivirus + CaClR2 (3) chuyển nhiễm gen gfp vào EPC bằng vector Lentivirus + polybrene Mỗi cách chuyển gen được tiến hành lặp lại 3 lần trên các giếng khác nhau, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel (xem phụ lục 5). Bảng 3.3. Kết quả xác định EPC mang gen gfp bằng kỹ thuật Flow cytometry. Giếng Tỷ lệ tế bào dương tính với gfp (%) (1) (2) (3) 1 28,71 13,21 47,78 2 34,01 10,31 53,21 3 27,89 9,09 45,67 Trung bình 30,20 ± 3,32 10,87 ± 2,12 48,89 ± 3,89 (1) chuyển nhiễm gen gfp vào EPC bằng vector Lentivirus (2) chuyển nhiễm gen gfp vào EPC bằng vector Lentivirus + CaClR2 (1) (2) (3) (3) chuyển nhiễm gen gfp vào EPC bằng vector Lentivirus + polybrene Biểu đồ 3.2. Kết quả chuyển gen gfp vào EPC. Kết quả cho thấy chuyển gen bằng vector Lentivirus có bổ sung polybrene có hiệu quả cao nhất (48,89 ± 3,89%) còn chuyển gen bằng vector Lentivirus có bổ sung CaClR2R có hiệu quả thấp nhất (30,20 ± 3,32%). Dung dịch chuyển gen polybrene là một phân tử tích điện dương liên kết với điện tích âm trên bề mặt tế bào làm trung hòa điện tích màng dẫn đến làm tăng khả năng bám của virus lên màng tế bào do đó làm tăng hiệu quả chuyển gen. Đối với CaClR2R, là chất làm thay đổi điện tích và tính thấm của màng tế bào chỉ thích hợp trong trường hợp chuyển gen bằng hóa chất. Ỏ đây cơ chế chuyển gen bằng vector Lentivirus không theo cơ chế biến nạp mà theo cơ chế xâm nhiễm của virus, CaClR2 Rlàm cho các virus không phân tán trong môi trường do đó hạn chế khả năng hấp phụ vector Lentivirus với màng tế bào nên tỷ lệ chuyển gen thấp hơn cả cách (1) và (3). Ngoài ra khi ủ tế bào trong CaClR2 Rđến 24 giờ, CaClR2 Rsẽ gây độc cho tế bào ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen. 3.5.2. Kiểm tra kết quả chuyển gen gfp trước chọn lọc puromycin Lấy kết quả chuyến gen bằng vector Lentivirus bổ sung polybrene tiếp tục phân tích khả năng chuyển gen gfp này bằng kỹ thuật flow cytometry. Kết quả phân tích được thể hiện trên hình 3.15 Hình 3.15. Kiểm tra kết quả chuyển gen gfp trước chọn lọc puromycin bằng kỹ thuật flow cytometry. (a) Kết quả phân tích biểu diễn dưới dạng Dot blot. (b) Kết quả phân tích biểu diễn dạng biểu đồ. Mỗi điểm trên đồ thị dạng Dot blot (a) thể hiện sự di chuyển của một tế bào khi nó đi qua đầu dò. Trục X và Y đo các mức độ phát sáng khác nhau, một điểm biểu thị tương ứng với một tế bào có dạng phát sáng khác nhau. Kết quả từ khung dữ liệu tổng quát khi phân tích dòng chảy cho thấy các tế bào phân hóa trên một vùng tương đối rộng và có thể chia thành hai tiểu vùng khác nhau. Kết quả ở dạng biểu đồ (b) EPC-GFP cho thấy có sự phân vùng tế bào rõ ràng là vùng tế bào phát quang mạnh và vùng tế bào không phát quang. Chuyển gen gfp vào EPC có thể xảy ra hai khả năng sau: gen gfp vào nhân nhưng không gắn vào bộ gen của tế bào và gen gfp vào nhân đồng thời gắn vào bộ gen của EPC. Gen gfp không gắn vào bộ gen EPC nhưng trong thời điểm nhất thời có thể copGFP có khả năng hoạt động với cường độ thấp nên phát quang yếu, cường độ lệch nhau nên máy ghi nhận ở dạng Dot blot bằng các dấu chấm và các dấu chấm tương đối rời rạc. Nếu phân tích ở dạng biểu đồ thì kết quả phát quang yếu và tạm thời không được ghi nhận, kết quả âm tính với tín hiệu huỳnh quang. Đối với khả năng chuyển gfp gắn vào nhân EPC, gen gfp tạo ra các protein GFP phát quang mạnh biểu hiện ở dạng Dot blot và biểu hiện vùng dương tính trên dạng biểu đồ. Như vậy khi chưa chọn lọc tế bào với puromycin thì trong tổng số các tế bào mang gen gfp vẫn còn khả năng EPC mang gen gfp chưa gắn vào bộ gen của EPC. 3.5.3. Kiểm tra kết quả chuyển gen gfp sau chọn lọc puromycin (a) (b) Ủ EPC-GFP với puromycin nhằm loại bỏ EPC mang gen gfp chưa sát nhập vào bộ gen EPC, sau 24 giờ kiểm tra kết quả bằng phương pháp flow cytometry. Kết quả biểu hiện ở hình 3.16. Hình 3.16. Kết quả sau chọn lọc puromucin bằng kỹ thuật flow cytometry. copGFP Lentivirus có mang gen kháng puromycin cho nên EPC mang gen gfp có khả năng kháng puromycin. Sau 24 giờ ủ puromycin, EPC không mang gen kháng puromycin chết và lơ lửng trong dịch nuôi còn EPC mang gen kháng puromycin mới có thể sống và phát triển. Kết quả chọn lọc puromycin sau 24 giờ cho thấy có sự phân thành hai vùng rõ rệt, vùng tế bào biểu hiện dương tính (98,13%) với gen gfp và vùng biểu hiện âm tính (1,87%) với gen gfp. Vector Lentivirus đã chuyển gen gfp vào nhân EPC, gen gfp sát nhập vào bộ gen của EPC, gen gfp và gen kháng puromycin đã hoạt động hiệu quả còn EPC-GFP biểu hiện âm tính với tính hiệu huỳnh quang nhưng chúng vẫn có thể sống sót chứng tỏ gen kháng puromycin được gắn vào bộ gen EPC và hoạt động có hiệu quả còn gen gfp cũng được gắn vào bộ gen EPC nhưng gen gfp không tạo sản phẩm protein GFP nên tế bào không phát tín hiệu huỳnh quang. Chuyển gen gfp vào EPC bằng vector Lentivirus + polybrene kết hợp với chọn lọc puromycin kết quả có hiệu suất 98,13% là khá cao so với kết quả nghiên cứu của L Cheng và cộng sự [32] khi chuyển gen gfp vào HSC chỉ thu được 28% dương tính với GFP. 3.6. Đánh giá sự thay đổi tính gốc của tế bào sau chuyển gen gfp Trong kỹ thuật chuyển gen, các gen mục tiêu chèn vào bộ gen tế bào gốc một cách ngẫu nhiên và có thể sẽ làm thay đổi tính gốc của tế bào. Do đó việc kiểm tra tính gốc của tế bào sau chuyển gen bằng phương pháp flow cytometry với các marker CD14, CD34, CD90, CD133 được thực hiện, kết quả thể hiện ở hình 3.17. Hình 3.17. Kết quả kiểm tra tính gốc của EPC-GFP. Kết quả kiểm tra tính gốc của EPC-GFP được trình bày ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Tỷ lệ EPC-GFP biểu hiện với các marker khảo sát. Marker bề mặt Tỷ lệ tế bào dương tính với marker (%) Tỷ lệ tế bào âm tính với marker (%) CD14 0,98 99,02 CD34 54,19 45,81 CD90 1,21 98,79 CD133 58,46 41,54 Kết quả thu được cho thấy EPC-GFP thể hiện dương tính với marker CD34, CD133; âm tính với CD14, CD90 tương tự như kết quả định danh EPC ở mục 3.4. Như vậy sau khi gắn gen gfp vào bộ gen EPC, tính gốc của tế bào không thay đổi. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết quả nghiên cứu rút ra các kết luận sau: 1. Thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người thực hiện phương pháp làm giàu tế bào đơn nhân bằng li tâm gradient Ficoll-paque kết hợp nuôi cấy chọn lọc trong môi trường EGM-2 cho quần thể tế bào tương đối tinh sạch và ổn định từ lần cấy chuyền thứ 3. 2. Kết hợp kiểm tra hình thái và kiểm tra marker bề mặt các tế bào tiền thân nội mô ứng viên biểu hiện dương tính với CD34 là 57,89 ± 12,76%, CD133 là 60,93 ± 7,01%. 3. Kết quả chuyển gen bằng copGFP Lentivirus + polybrene cho hiệu quả cao nhất (48,89 ± 3,89%). 4. Tế bào tiền thân nội mô biểu hiện GFP ổn định với hiệu quả 98,13%. 5. Sau khi gắn gen gfp vào bộ gen EPC, tính gốc của tế bào không thay đổi. KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nuôi cấy tăng sinh và bảo quản dòng tế bào EPC biểu hiện GFP ổn định phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 2. Đánh giá tính gốc và tính ổn định của dòng EPC qua thời gian nuôi cấy lâu dài. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Phan Kim Ngọc, Phạm văn Phúc, Trương Định (2009), Công nghệ tế bào gốc, Nxb Giáo Dục, 556 trang. 2. Khuất Hữu Thanh (2004), Liệu pháp gen - Nguyên lý và ứng dụng, Nxb Khoa học và kỹ thuật, trang. 24 -35 3. Khuất Hữu Thanh (2010), Cơ sở công nghệ tế bào động vật và ứng dụng, Nxb Khoa học và kỹ thuật, trang. 43 -50. Tiếng Anh 4. Anna M. Wobus Kesneth Boheler (2005), Stem cell (Handbook of experimental pharmacology), Springer, Germany. 5. Anotonio M.L., Marco V., Maria B.G., Vincenzo Z., Matteo P., Domenico D.A., Antonio G.R., Filippo C. (2009), From bone marrow to the arterial wall: the ongoing tale of endothelical progenitor cells. European Heart Journal 30, 890-899. 6. Ariff B., Eng Hin Lee (2005), Stem cells from bench to beside, Word scientific, Singapore. 7. Ariris P., Peter v.G. (2008), “Biological considerations of mesenchymal stem cells and endothelical progenitor cells”, Injury-international Journal of The Care of The Injured 39S2, S21-S32. 8. Ashay D. B., Josephine V.G., Gang L., Tim M.C., Tom A.G.,Alan W. S. (2008), “Advanced glycation of fibronectin im pairs vascular repain by endothelial progenitor cells: Implications for vasodegeneration in diabetic retinopathy”, Invertigative Ophthalmology & Visual Science 49, 1232-1241. 9. Carmen U., Stefanie D. (2004), “Endothelial progenitor cells: Charaterization and role in vascular biology”, Circulation Research 95, 343-353. 10. Crestwood Place Richmond, BC, Canada V6V 2G2 Retroviral and Lentiviral Infection of Target Cells Protocol, Applied Biological Materials Inc. 11. Daniel P.S., Andrew B., David S.C., Martin K.C. (2008), “Strikingly different angiogenic properties of endothelical progenitor cells subpopulations”, Journal of the American College of Cardiology vol. 51, 660-668. 12. Daniel P.G., Stefan A., Christian A.B., Ulrike G.S., Bernhard G., Joachim .W., Gu¨nter A.J, ( 2003), “Riegge V ascular gene delivery of anticoagulants by transplantation of retrovirally-transduced endothelial progenitor cells”, Cardio-vascular Research 58, 469–477. 13. DA Dean, D Machado-Aranda, K Blair- Parks, AV Yeldandi, JL Young (2003), “ Electroporation as a method for high- level nonviral gene transfer to the lung”, Gene therapy 10, 1608-1615. 14. David A.I., Laura E.M., Hiromi T., Virginia M., Amy F., Kelly M., Karen P., Michael J.F., David G., Mervin C.Y. (2004), “Identification of novel hierarchy of endothelical progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood”, Blood 104, 2752- 2760. 15. Ekaterina K., Joseph D.R., Vicente P. (1999), “Lentiviral vectors and gene therapy”, Frontiers in Bioscience 4, d481-496. 16. Femke H., Arjan W.G. (2007), “Tumour vascularization: sprouting angiogenesis and beyond”, Canner and Metastasis Reviews 26 , 489-502. 17. Gain P.F., Carlo A., Angelo A. (2005), “Endothelial Progenitor Cells and vascular Biology in Diabetes Mellitus: Current Knowledge and Future Prespectives”, Current Diabetes Reviews 1, 41-58. 18. Gerald J.S. (2003), “Stem cells and tissue regeneration when is a stem cell really a stem cell?”, Bone Marrow Transplantation 32, S7-S11. 19. Gian P.F., Carlo A., Angelo A. (2007)., “Endothelial progenitor cells in coronary artery disease”, Journal of the American College of Cardiology 49, 1585. 20. Gustavo Tiscornia, Oded Singer, Inder M. verma (2006), “Production and purification of lentivirus vector”, Nature protocol 1, 241-245. 21. Hawley, Robert C.; Teresa S. Hawley (2004). Flow Cytometry Protocol. Humana Press. 22. Heidi Bompais, Jalila Chagraoui, Xavier Caron, Mihaela Crisan, Xu Hui Liu, Aurora Anjo, Carine Tolla-Le Port, Marylene Leboeuf, Pierre Charbord, Andreas Bikfalvi and Georges Uzan (2004), “Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells”, Blood 103, 2577-2584. 23. Hidesuke Yamamoto, Hidefumi Kato, Motoaki Uruma, Masakazu Nitta, Shigeru Takamoto (2008), “Identification of two distinct populations of endothelial progenitor cells differing in size and antigen expression from human cord blood”, Ann Hematol 87, 87-95. 24. HU Cheng Heng, LI Zhi- ming, DU Zhi-min, ZHANG Ai-xia, YANG Da-ya and WU Gui-fu (2009), “Human umbilical cord- derived endothelial progenitor cells promote growth cytokines- mediated neorevascularization in rat myocardial infarction”, Chinese Medical Journal 12 (25), 548-555. 25. Jason H.C., Charles L.C., Candace C.C., (1990), Issues about the human umbilical cord, Silent Risk, North America. 26. Juliane E., Stefanie K., Gergely J., Karin H., Ulrike M.B., Klaus M.D., Johannes W., Christian B. (2003), “Endothelial progenitor cell cuture and differentiation in vitro: a methodological comparison using human umbilical cord blood”, Cardiovascular Research 58, 478-486. 27. Jin Hur, Chang- Hwan Yoon, Hyo- Soo Kim, Jin- Ho Choi, Hyun- Jea Kang, kyung- Kook hwang, Byung- Hee Oh, Myoung- Mook Lee and Young-Bea Park (2004), “Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis”, Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 288-293. 28. Ju-Yeon Kim, Hong Bea Jeon, Yoon Sun Yang, Woil Oh, Jong Wook Chang (2010), “Application of human umbilical cord blood- derived mesenchymal stem cells in disease models.”, World Journal of Stem Cells 2 (2), 34-38. 29. Karen K.H., David A.I., Mervin C.Y., (2008), “Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells”, Arterioscler Thromb Vasc Bio 28, 1584-1595. 30. Krzysztof P, Magdalena M.K, (2009), “Use of HIV as a gene transfer vector”, Acta Biochimica Polonica Vol. 56, 531–595. 31. Lane, Suite, Rockville, Product Information and Protocols (V2.2), biogenova, United States. 32. L Cheng, C Du, D Murray, X Tong, YA Zhang, BP Chen and Hawley (1997), “A GFP reporter system to assess gene transfer and expression in human hematopoietic progenitor cells”, Gene Therapy 4, 1013-1022. 33. L. Fouillard (1996), “Physical method for gene transfer: an alternative to viruses”, Hematol cell ther 38, 214-216. 34. Masumi Nagano, Toshiharu yamashita, Hiromi Hamada, Kinuko Ohneda, Ken-ichi Kimura, Tomoki Nakagawa, Masabumi Shibuya, Hiroyuki Yoshikawa and Osamu Ohneda (2007), “Identification of functional endothelial progenitor cells suitable for the treatment of ischemic tissue using human umbilical cord blood”, Blood 110, 151- 160. 35. Mehdi Kadivar, Shohreh Khatami, Yousef Mortazavi, Masoud Solemani, Mohammad Taghikhani, Mohammad ali shokrgozar (2005), “Isolation, culture and characterization of postnatal human umbilical vein- derived mesenchymal stem cells” DARU - Journal of Faculty of Pharmacy 6T 6T vol.13, 170-176. 36. M. Hacker, A.G. Mikos (2007), Bio 620: Tissue engineering gene transfer, Springer, Germanay. 37. Monica B. (2004), “Endothelial progenitor cells: Reporting for duty”, Blood vol. 104, 2616-1617. 38. Nair S., Jun R. (2007), Vascular biology protocols, Humana Press Inc, USA. 39. Pat M., Noel M.C. (2007), “Vascular disease: A new progenitor biology”, Current Vascular Pharmacology 5, 61-68. 40. Patrick A., Laurence M.D., Dan G.D., Kenneth S.C., James A.T., Ryan M.L., Dai F., David T., Rakesh K.J (2008), “Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to from functional” Blood 111, 1302-1305. 41. Pat M., Noel M.C. (2007)., “Vasccular disesse: a new progenitor biology”, Current vascular pharmacology 5, 61-68. 42. Paul E.S., Paul W.M.F., Richard D.W., Duncan J.S., Micheal J.B.K ., Subodh V. (2002), “Endothelial progenitor cells: New hope for a broken hear”, Circulation 107, 3093-3100. 43. Pengxia Liu, Bin Zhou, Dongsheng Gu, Lei Zhang, Zhongchao Han (2009), “Endothelial progenitor cell therapy in atherosclerosis: A double-edged sword?”, Ageing Research Reviews 8, 83-93. 44. R.Ian Freshrey, Phd; Glyn n. Stacey, Phd; Jonathan M. Auerbach, Phd (2007), Culture of human stem cells, Wiley, Canada. 45. Ricardo B. deMedeiros, PhD and Joy Aho, PhD, immunostaining protocols for Flow Cytometric Analysis of adhereht cells. R&D Systems Tools for Cell Biology Research™. 46. R.M. Twyman (2005), Gene transfer to animal cells, Taylor & Francis, USA., 47. Rob P.W.R., Robert T.V.O.,Jan.D., Jan W.O.T, Lodder (2008), “Endothelial progenitor cells research in stroke: A potential shift in pathophysiological and theraapeutical concepts”, Stroke 39, 2158-2165. 48. Roger Y. Tsien (1998), “The green fluorescent protein”, Annual Review of Biochemistry 67, 509-544. 49. Ronald A. Bergman, Ph.D. Atlas of Microscopic AnatomyPlate 13.261 Umbilical Cord. 50. Sadettin S. Ozturk, Wei-Shou Hu (2006), Cell culture technology for pharmaceutical and cell- based therapies, Taylor & Francis, USA. 51. Satoshi Murasawa and Takayuki Asahara (2005), “Endothelial progenitor cells for vasculogensis”, Physiology 20, 36-42. 52. Satoshi Murasawa and Takayuki Asahara (2007), “Gene modified cell transplantation for vascular regeneration”, Current Gene Therapy 7, 1-6. 53. S.-.Lee, K. Chu, K.-H. Jung, D.-H.Kim, E.-H. Kim, V.N. Choe, J.-H. Kim, W.-S. Im, L. Kang, J.-E. Park, H.-J. Park, H.-K. Park, E.-C. Song, S.K.Lee, M.kim and J.-K. Roh (2009), “Decreased number and function of endothelial progenitor cells in patients with migraine”, Neurology 70, 1510-1517. 54. Taina Jaatinen, Jarmo Laine (2007), “Isolation of Mononuclear Cells from Human Cord Blood by Ficoll-Paque Density Gradient”, Current Protocols in Stem Cell Biology 2A.1.1-2A.1.4. 55. Tatjana Mitrovié (2003), “Gene transfer systems”, Medicine and Biology vol. 10, 101- 105. 56. Toyoaki Murohara (2001), “Therapeutic vasculogenesis using human cord blood- derived endothelial progenitors”, Trends in Cardiovascular Medicine 11, 303-307. 57. Toshio Imanishi, Hiroto Tsujiola and Takashi Akasaka (2008), “Endothelial progenitor cells dysfunction and senescence: Contribution to Oxidative stress”, Current Cardiology Reviews 4, 275-286. 58. Toyoaki Murohara (2003), “Angiogensis and vasculogenesis for therapeutic neovasculazation”, Nagoya Journal of Medical Science 66, 1-7. 59. Toyoaki Murohara (2003), “Angiogenesis and vasculogenesis for therapeutic neovascularization”, Nagoya Journal of Medical Science 66, 1-7. 60. Yukiko Yamazaki, Takesshi Yaki, Tsuyoshi Ozaki and Keiji Imoto (2000), “In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker”, Journal of experimental zoology 286, 212-218. 61. Victor J. Dzau, Massimiliano Gnecchi, Alok S. Pachori, Fulvio Morello and Luis G. Melo (2005), “Therapeutic potential of endothelial progenitor cells in cardiovascular diseases”, Hypertension 46, 7-18. 62. William C. Heiseer (2004), Gene delivery to mammalian cells, Volume 2: Viral gene transfer techniquea, Humana Press, United States. 63. Xialin Liu, yongjun Li, Yizhi Liu, Yan Lou, Dingding Wang, Brian H. Annex and Pascal J. Goldschmidt-Clermont (2010), “EPCs mobilized and activated by neurotrophic factor may contribute to pathologic neovascularization in diabetic retinopathy”, The American Journal of Pathology vol. 176, 1-12. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1. Chọn lọc ứng viên EPC từ các mẫu tế bào đơn nhân máu cuống rốn người. Thời gian theo dõi mẫu tế bào Tiêu chuẩn đánh giá mẫu tế bào Phân loại mẫu tế bào Nguyên nhân các mẫu tế bào không đạt Đạt Không đạt 0 ngày Mẫu tế bào thu nhận tách thành từng tế bào đơn, kích thước tế bào tương đối đồng nhất và không lẫn tế bào hồng cầu, bạch cầu. 29 02 Tán huyết 3 ngày Tế bào bám trải. 25 04 Rất ít tế bào bám 5 ngày Tế bào bám trải, dạng hình viên sỏi hoặc dạng hình thoi. 21 04 Rất ít tế bào bám 7 ngày Tế bào bám trải, dạng hình viên sỏi hoặc dạng hình thoi. 18 03 Rất ít tế bào bám 12 ngày Tế bào bám trải, dạng hình viên sỏi hoặc dạng hình thoi. Tế bào có dấu hiệu tăng sinh hoặc tạo thành cụm. 06 12 Rất ít tế bào bám 15 ngày Tế bào tăng sinh mạnh. 04 02 Tế bào không tăng sinh hoặc tế bào chết dần. 18 ngày Tế bào tăng sinh mạnh. 04 00 21 ngày Tế bào tăng sinh mạnh. 04 00 >21 ngày Tế bào tăng sinh mạnh. 04 00 PHỤ LỤC 2. Kết quả xác định EPC bằng phương pháp flow cytometry lần 2. PHỤ LỤC 3. Kết quả xác định EPC bằng phương pháp flow cytometry lần 3. PHỤ LỤC 4. Xử lý số liệu sau chạy marker khảo sát. Các đặc trưng thống kê CD14 CD34 CD90 CD133 Mean 1.47 57.88 2.06 60.93 Standard Error 0.61 7.37 0.68 4.05 Median 1.67 56.32 2.12 64.87 Mode #N/A #N/A #N/A #N/A Standard Deviation 1.06 12.76 1.18 7.01 Sample Variance 1.12 162.74 1.40 49.10 Kurtosis #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! Skewness -0.83 0.54 -0.23 -1.73 Range 2.09 25.37 2.36 12.24 Minimum 0.32 45.98 0.85 52.84 Maximum 2.41 71.35 3.21 65.08 Sum 4.40 173.65 6.18 182.79 Count 3.00 3.00 3.00 3.00 Confidence Level (95.0%) 2.63 31.69 2.93 17.41 PHỤ LỤC 5. Xử lý số liệu sau chuyển gen gfp bằng 3 cách Các đặc trưng thống kê Lentivirus Lentivirus + CaClR2 Lentivirus + polybrene Mean 30.20 10.87 48.89 Standard Error 1.92 1.22 2.25 Median 28.71 10.31 47.78 Mode #N/A #N/A #N/A Standard Deviation 3.32 2.12 3.89 Sample Variance 11.04 4.48 15.13 Kurtosis #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! Skewness 1.61 1.11 1.18 Range 6.12 4.12 7.54 Minimum 27.89 9.09 45.67 Maximum 34.01 13.21 53.21 Sum 90.61 32.61 146.66 Count 3.00 3.00 3.00 Confidence Level (95.0%) 8.25 5.26 9.66