Luận văn Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sản xuất Chitin theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học

dụng thu protein và asthaxanthin dùng để sản xuất thức ăn chăn nuôi. Phần bã được rửa sạch, phơi khô, tiếp tục khử protein bằng NaOH, khử khoáng bằng C6H5COOH và HCl, ở mỗi công đoạn cũng tiến hành thực hiện để chọn được chế độ tối ưu (nồng độ, thời gian xử lý) sau đó rửa sạch và thu được Chitin. Quy trình dự kiến sản xuất chitin từ phế liệu tôm: Rửa Rửa Chitin Khử khoáng bằng acid benzoic Khử khoáng bằng HCl Đầu tôm CM = 1÷3% Thời gian: 8÷10h Nhiệt độ phòng CM=0,6÷0,8M Thời gian: 4÷10h Nhiệt độ phòng Rửa Xay nhỏ Tách protein bằng enzyme Alcalase Dịch protein Tỉ lệ E/NL:[0,1-0,5%] Nhiệt độ: [40-60oC] Thời gian:[4-10h] Khử protein bằng NaOH CM= 0,012÷0,018M Thời gian: 4÷10h Nhiệt độ phòng Hình 13.Quy trình dự kiến sản xuất. Sau khi tìm được các thông số tối ưu của các công đoạn, ta tiến hành sản xuất Chitin theo các thông số tối ưu của công đoạn khử protein bằng enzyme và NaOH, còn ở công đoạn khử khoáng ta chỉ dùng HCl, không dùng C6H5COOH. Theo Nguyễn Văn Toàn và cộng sự đã nghiên cứu [22], công đoạn khử khoáng chỉ dùng HCl 1,1M; ngâm trong 12 giờ ở 30oC được áp dụng đối với phế liệu đầu vỏ tôm, kết quả hàm lượng khoáng còn lại trong Chitin là 1,11±0,01%. Ở đây đối tượng nguyên liệu được nghiên cứu là phế liệu đầu tôm, đầu tôm thường thì hàm lượng khoáng cao hơn cho nên em đã dự kiến quy trình đối chứng với nồng độ HCl là 1,2M; và ngâm trong 16 giờ ở nhiệt độ phòng. Quy trình dự kiến sản xuất đối chứng như sau: Đầu tôm Xay nhỏ Tách protein bằng enzyme Alcalase Bã đã tách protein Dịch protein Tỉ lệ E/NL:0,42% Nhiệt độ: 56oC Thời gian:8,8 giờ Khử protein bằng NaOH Nồng độ:2,4% Thời gian:12,2 giờ. Nhiệt độ phòng Khử khoáng bằng HCl Chitin Nồng độ:1,2M Thời gian:16 giờ Nhiệt độ phòng Hình 14.Quy trình sản xuất Chitin không dùng acid benzoic.(đối chứng) Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn của phương pháp Microbiuret và phương pháp Biuret ● Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Microbiuret: Hòa tan 0.1 gam huyết thanh bò (BSA) trong NaOH 3% tạo thành các nồng độ khác nhau sao cho nồng độ protein trong dịch thuộc khoảng từ 0.05-0.5g/l. Chuẩn bị 7 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 1 đến 7, sau đó cho các dung dịch hóa chất vào các ống nghiệm với thể tích và thứ tự như sau: Bảng 3.Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Microbiuret Ống nghiệm Nồng độ Số ml dịch BSA(ml) Số ml NaOH 3%(ml) 1 0 0 4 2 0,05 0,2 3,8 3 0,1 0,4 3,6 4 0,2 0,8 3,2 5 0,3 1,2 2,8 6 0,4 1,6 2,4 7 0,5 2 2 Sau đó lấy mỗi mẫu 4ml, thêm vào đó 200μl thuốc thử Microbiuret,vortex cho đều và ủ sau 15 phút mang đi đo ở bước sóng 330nm. (Sử dụng ống 0 làm mẫu blank). ● Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Biuret: Pha dung dịch chuẩn BSA: Hòa tan 0,5 gam BSA vào trong 50ml nước cất, khuấy dần dần khi BSA tan hết rồi định mức lên 100ml bằng nước cất (Hàm lượng BSA: 10mg/ml). Xây dựng đường chuẩn: Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 0-5 sau đó cho các dung dịch hóa chất vào các ống nghiệm với thể tích và thứ tự như sau: Bảng 4. Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Biuret Dung dịch hóa chất Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 BSA chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Nước cất (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Thuốc thử Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 Hàm lượng BSA(mg/ml) 0 2 4 6 8 10 Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất, ủ các ống nghiệm trên ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút. Sau khi ủ, dung dịch trong các ống nghiệm trên được đo mật độ quang học ở bước sóng 570nm để đọc giá trị OD570 (Sử dụng ống 0 làm mẫu blank) Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng –Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Biuret. –Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 600oC Thí nghiệm xác định chế độ khử protein tối ưu Khử lần 1: dùng enzyme alcalase Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm [8][9] Mục đích của quá trình tối ưu là chọn một chế độ công nghệ thích hợp cho quá trình loại bỏ protein từ đầu tôm bằng enzyme Alcalase sao cho hàm lượng protein khử được là tốt nhất. Phân tích ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thủy phân, qua các thí nghiệm thăm dò và kế thừa kết quả nghiên cứu trước đây, đề tài chọn các yếu tố cố định như sau: - pH = 8 - Tỷ lệ nguyên liệu / nước là 1:1 - Còn lại 3 thông số: tỷ lệ enzyme bổ sung, nhiệt độ và thời gian thủy phân ảnh hưởng đến hiệu suất khử protein. Đề tài nghiên cứu quy hoạch thực nghiệm phân tích hồi quy 3 yếu tố, sau đó tối ưu hóa quá trình bằng phương pháp đường dốc nhất để tìm giá trị tối ưu. Các thông số cần tối ưu là: - Nồng độ enzyme trong khoảng: [0,1%-0,5%] - Nhiệt độ thủy phân trong khoảng: [40oC-60oC] - Thời gian thủy phân trong khoảng: [4h-10h] Hàm mục tiêu là: Hàm lượng protein còn lại trong mẫu sau khi thủy phân (Y) (% theo vật chất khô) → Min. Bảng 5. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase. N U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) X0 X1 X2 X3 Y(%) 1 0,1 40 4 1 -1 -1 -1 2 0,5 40 4 1 1 -1 -1 3 0,1 60 4 1 -1 1 -1 4 0,5 60 4 1 1 1 -1 5 0,1 40 10 1 -1 -1 1 6 0,5 40 10 1 1 -1 1 7 0,1 60 10 1 -1 1 1 8 0,5 60 10 1 1 1 1 Bảng 6. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase STT U1 U2 U3 Y(%) 9 0,3 50 7 10 0,3 50 7 11 0,3 50 7 U1: nồng độ enzyme (%) U2: nhiệt độ thủy phân (oC) U3: thời gian thủy phân (giờ) Khử lần 2 dùng NaOH: Các thí nghiệm của mẫu khử protein bằng NaOH theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm: Khử protein bằng xút loãng là phương pháp sử dụng xút ở nồng độ thấp để thủy phân các liên kết peptit của protein không hòa tan tạo thành các dạng peptit, pepton, acid amin hòa tan trong nước và dễ dàng loại bỏ ra khỏi nguyên liệu. Như trên đã nói protein trong phế liệu tôm tồn tại dưới hai dạng là dạng tự do thường là phần thịt trong đầu, chân, đuôi tôm và phần protein liên kết với chitin và các thành phần khác vì vậy muốn loại bỏ protein ra khỏi nguyên liệu phải sử dụng các tác nhân hóa học hoặc sinh học để thủy phân protein. Tuy nhiên, phương pháp sinh học không thể loại bỏ protein một cách triệt để được, do đó ta phải kết hợp cả 2 phương pháp sinh học và hóa học để đảm bảo hàm lượng protein còn lại trong Chitin là < 1%. Phương trình phản ứng biểu diễn quá trình khử protein như sau: NaOH to cao H2N-CH-CO-NH-CH-CO- H2N-CH-CO-NH-CH- + H2N-CH-COOH R1 R2 R1 R2 R3 Polypeptid Peptid Acid amin Quá trình khử protein thường kèm theo quá trình khử lipid do lipid có thể phản ứng với kiềm tạo thành xà phòng theo phương trình phản ứng sau: CH2OCOR1 CH2OH CHOCOR2 + 3NaOH CHOH + R1COONa + R2COONa + R3COONa CH2OCOR3 CH2OH Triaxylglycerol Glycerol Xà phòng Thông thường hàm lượng của lipid trong nguyên liệu không cao do vậy không cần nghiên cứu loại bỏ lipid trong công nghệ sản xuất chitin-chitosan vì phần nhỏ lipid đã bị thủy phân theo phản ứng trên. Các yếu tố cố định: Nhiệt độ : 40oC Tỷ lệ mẫu đem đi xử lý NaOH/dung dịch NaOH là: 1/10(w/v) Các thông số cần tối ưu là: Nồng độ NaOH trong khoảng: [0,1%-0,3%] Thời gian xử lí NaOH trong khoảng: [8h-10h] Hàm mục tiêu là: Hàm lượng protein còn lại trong mẫu sau khi thủy phân (Y) (% theo vật chất khô) → Min. Bảng 7. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử protein bằng NaOH N U1(Nồng độ NaOH(%)) U2 (Thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,1 8 1 -1 -1 2 0,3 8 1 1 -1 3 0,1 10 1 -1 1 4 0,3 10 1 1 1 Bảng 8. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng NaOH. STT U1 U2 Y(%) 5 0,2 11 6 0,2 11 7 0,2 11 U1 : Nồng độ NaOH(%) U2: Thời gian xử lí NaOH(giờ) Thí nghiệm xác định chế độ khử khoáng Khử lần 1: Dùng acid benzoic Các thí nghiệm của mẫu khử khoáng bằng acid benzoic theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm Mục đích của công đoạn này là nghiên cứu khả năng khử khoáng của axít benzoic trên nguyên liệu là đầu tôm đã được khử protein bằng enzym Alcalaza và NaOH ở điều kiện tối ưu. Công đoạn khử khoáng được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tôm trong dung dịch acid benzoic. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003. Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử khoáng như sau: Các yếu tố cố định: Nhiệt độ : nhiệt độ phòng Tỷ lệ mẫu đem đi khử khoáng/dung dịch acid benzoic =1/15(w/v) Các thông số cần tối ưu là: Nồng độ C6H5COOH trong khoảng: [0,012M- 0,018M] Thời gian xử lí C6H5COOH trong khoảng: [4h-10h] Hàm mục tiêu là: Hàm lượng khoáng còn lại trong mẫu sau khi khử khoáng (Y) (% theo vật chất khô) → Min. Bảng 9. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử khoáng bằng C6H5COOH N U1 (nồng độ C6H5COOH (M)) U2 (thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,012 4 1 -1 -1 2 0,018 4 1 1 -1 3 0,012 10 1 -1 1 4 0,018 10 1 1 1 Bảng 10. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng C6H5COOH STT U1 U2 Y(%) 5 0,015 7 6 0,015 7 7 0,015 7 U1 : Nồng độ C6H5COOH(M) U2: Thời gian xử lí ngâm C6H5COOH (giờ) Khử lần 2: Dùng acid chlohydric Các thí nghiệm của mẫu khử khoáng bằng HCl theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm: Sau khi khử protein bằng enzyme và NaOH thì % hàm lượng khoáng còn lại rất lớn, dùng acid benzoic không thể loại bỏ khoáng một cách triệt để được, do đó ta phải kết hợp sử dụng cả acid hữ cơ kết hợp acid vô cơ để đảm bảo hàm lượng khoáng còn lại trong Chitin là < 1%. Mục đích của công đoạn này là nghiên cứu khả năng khử khoáng của axít chlohydric trên nguyên liệu là đầu tôm đã được khử protein bằng enzym Alcalaza và NaOH và đã khử khoáng một phần bằng acid benzoic ở điều kiện tối ưu. Công đoạn khử khoáng được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tôm trong dung dịch HCl. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003. Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử khoáng như sau: Các yếu tố cố định: Nhiệt độ : nhiệt độ phòng Tỷ lệ mẫu đem đi khử khoáng/dung dịch HCl =1/10(w/v) Các thông số cần tối ưu là: Nồng độ HCl trong khoảng: [0,6M- 0,8M] Thời gian xử lí HCl trong khoảng: [4h-10h] Hàm mục tiêu là: Hàm lượng khoáng còn lại trong mẫu sau khi khử khoáng (Y) (% theo vật chất khô) → Min. Bảng 11. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử khoáng bằng HCl. N U1(Nồng độ HCl(M)) U2 (Thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,6 4 1 -1 -1 2 0,8 4 1 1 -1 3 0,6 10 1 -1 1 4 0,8 10 1 1 1 Bảng 12. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng HCl STT U1 U2 Y(%) 5 0,7 7 6 0,7 7 7 0,7 7 U1 : Nồng độ HCl (M) U2: Thời gian xử lí ngâm HCl (giờ) CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC:[1] Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105oC theo TCVN 3700-1990. Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 600oC. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Microbiuret: Nguyên lý: Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu++ thành một phức chất màu tím (phản ứng biuret). Màu sắc của phức chất tỷ lệ với số liệu peptid (-CO-NH) của protein và gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin. Hình 15.Công thức của phức Biuret. 2.3.3.1. Dụng cụ -Dụng cụ thủy tinh(ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức, bình tam giác, pipette), vật liệu thông thường của phòng thí nghiệm - Micropipet (100-1000μl) -Thiết bị đo UV-Vis mini1240 2.3.3.2. Hóa chất NaOH Na2CO3 (Sodium Cabonate) CuSO4.5H2O Na3C6H5O7.2H2O (Sodium citrate) 2.3.3.3. Tiến hành ● Pha dung dịch thuốc thử Microbiuret: Lấy 173g Sodium citrate và 100g Sodium carbonate, đem hòa tan trong nước nóng nhưng không để nước sôi. Lấy 17,3g CuSO4 hòa tan trong 100ml nước cất và thêm vào hỗn hợp trên. Sau đó thêm nước cất vào cho đủ 1 lít. ● Xây dựng đường chuẩn: được bố trí như đã nói ở phần bố trí thí nghiệm ● Xử lý mẫu: Lấy 1g mẫu + 20ml NaOH 3% →ủ ở 80oC,trong 6 giờ. Sau đó, hỗn hợp này được làm lạnh ở nhiệt độ phòng, rồi sau đó mang đi lọc. Khi lọc, dùng từ 10-15ml NaOH 3% để rửa bã. Sau đó đem dịch đi li tâm ở 5000 vòng/15 phút → Lấy dịch → Pha loãng sao cho hàm lương protein nằm trong dãi bước sóng. Lấy 4ml + 200μl Microbiuret → đo ở bước sóng 330nm. Kết quả đo được tương ứng với giá trị y (OD330nm), dựa vào phương trình đường chuẩn tính ra được hàm lượng protein có trong 1 ml dịch. Từ đó tính ra được phần trăm protein có trong mẫu theo công thức tính sau: V: Thể tích mẫu sau khi pha loãng(ml) C: Hàm lượng protein trong 1 ml(mg/ml) m: Khối lượng mẫu đem đi ủ (gam) Mc: Độ ẩm của mẫu đem đi phân tích (%) Xác định hàm lượng Protein theo phương pháp Biuret: Dụng cụ: giống như phương pháp Microbiuret. Hóa chất: NaOH CuSO4.5H2O C4H4NaKO6.4H2O (Kali Natri tartrat) BSA (Bovine serum albumin) Tiến hành: Pha thuốc thử Biuret: Hòa tan 2,35375 gam CuSO4.5H2O và 8,0571 gam C4H4NaKO6.4H2O trong 500ml nước cất, khuấy đều và cho thêm 300ml NaOH 10%. Dung dịch trên được khuấy trộn đều rồi làm đầy đến 1000ml bằng nước cất . Xây dựng đường chuẩn: được bố trí như đã nói ở phần bố trí thí nghiệm. Xử lí mẫu: Cách 1: Ngâm 3-5gam nguyên liệu khô hoặc 3-10 gam nguyên liệu ướt trong NaOH 4% với tỷ lệ 1:10 tới 1:15w/v. Sau đó đem ủ ở 95oC trong 6 giờ. Cách 2: Xử lí mẫu giống như trên nhưng không ủ ở 95oC trong 6 giờ mà ủ ở nhiệt độ phòng 12 giờ, sau đó nâng nhiệt lên 95oC trong 1 giờ. Sau khi ủ: Đối với dịch thủy phân thu được, nếu không đủ 100ml thì thêm nước cất vào cho đủ 100ml. Lấy khoảng 10ml dịch thủy phân đem đi lọc chân không bằng giấy lọc Whatman Filter paper. Phần dịch lọc được đem đi phân tích hàm lượng protein bằng thiết bị đo UV-Vis mini1240. Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu được xử lý theo phần mềm Excel 2003. Mỗi thí nghiệm bố trí song song 3 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình cộng 3 lần thí nghiệm. PHẦN 3. kẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Kết quả đường chuẩn xây dựng được theo phương pháp Microbiuret và phương pháp Biuret: Kết quả xây dựng đường chuẩn của phương pháp Microbiuret : Kết quả đo được (ở phụ lục) Phương trình đường chuẩn. Hình 16. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Microbiuret Kết quả xây dựng đường chuẩn của phương pháp Biuret: Kết quả đo mật độ quang học của các mẫu đường chuẩn (ở phụ lục) Hình 17. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Biuret. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ: Kết quả phân tích thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ chân trắng được trình bày tại bảng 3.1. Bảng 13. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ chân trắng (%) Chỉ tiêu Protein Lipid Tro Chitin Thành phần hóa học (%) 49 4,7 25,2 18,3 (Tính theo vật chất khô) Kết quả phân tích cho thấy tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) có hàm lượng protein trong phế liệu tôm khá cao. Kết quả này cho thấy cần sử dụng phương pháp sinh học để thủy phân protein để tận dụng lượng protein có chất lượng vào việc chế biến thức ăn gia súc,… đồng thời nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin vừa có hiệu quả kinh tế, vừa mang ý nghĩa môi trường.Hàm lượng khoáng trong đầu tôm cũng khá cao, hàm lượng lipid và hàm lượng Chitin được tham khảo.[13] Kết quả nghiên cứu công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase: Công đoạn khử protein này được thực hiện bằng cách bổ sung enzyme Alcalase để thủy phân phế liệu tôm. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003. Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử protein như sau: Bảng 14. Kết quả hàm lượng protein còn lại ở các chế độ khử protein bằng enzyme Alcalase N U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) X0 X1 X2 X3 Y(%) lượng protein còn lại 1 0,1 40 4 1 -1 -1 -1 19,6183 2 0,5 40 4 1 1 -1 -1 11,8941 3 0,1 60 4 1 -1 1 -1 13,023 4 0,5 60 4 1 1 1 -1 14,233 5 0,1 40 10 1 -1 -1 1 11,5383 6 0,5 40 10 1 1 -1 1 10,5916 7 0,1 60 10 1 -1 1 1 9,9975 8 0,5 60 10 1 1 1 1 9,3423 Bảng 15. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase N0 U1 U2 U3 Y(%) 9 0,3 50 7 12,67 10 0,3 50 7 12,7970 11 0,3 50 7 13,8167 Phương trình hồi quy của hàm lượng protein xác định được như sau: Y= 12,5298 – 1,0145*X1 – 0,8808*X2 – 2,1623*X3 (1) Thảo luận: Phương trình (1) tương thích với thực nghiệm :qúa trình thủy phân để khử protein của phế liệu tôm bằng enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ enzyme, nhiệt độ, thời gian …Qua phương trình trên ta thấy quy luật biến đổi của hàm lượng protein là khi tăng nồng độ enzyme (X1), nhiệt độ thủy phân (X2) và thời gian khử protein (X3) thì hàm lượng protein còn lại trong phế liệu tôm (Y) giảm xuống, nhưng thời gian thủy phân và nồng độ enzyme ảnh hưởng tới hàm lượng protein nhiều hơn so với nhiệt độ thủy phân. Từ phương trình (1) nếu muốn khử protein một cách triệt để ta phải tăng nồng độ enzyme, thời gian khử protein và nhiệt độ thủy phân; song việc tăng cao nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân và kéo dài thời gian khử protein như thế nào cho hợp lí để tiết kiệm được thời gian và chi phí sản xuất mà vẫn đảm bảo được lượng protein còn lại trong phế liệu tôm là ít nhất. Như vậy xuất phát từ mức cơ sở, tiến hành làm thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất và thu được kết quả các thí nghiệm tiếp theo ở bảng 16 Bảng 16. Kết quả hàm lượng protein các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu hóa Tên U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) Y(%) Mức cơ sở 0,3 50 7 Bước làm tròn 0,04 2 0,6 Thí nghiệm 12 0,34 52 7,6 9,451 Thí nghiệm 13 0,38 54 8,2 9,2528 Thí nghiệm 14 0,42 56 8,8 8,0102 Thí nghiệm 15 0,46 58 9,4 8,655 Từ bảng thí nghiệm trên ta nhận thấy ở thí nghiệm thứ 14 hàm lượng protein còn lại trong phế liệu tôm là thấp nhất. Hình 18. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ thủy phân bằng enzyme theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson. Nhận xét và thảo luận: Bố trí thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm toán học cho phép dần tới điểm tối ưu nhất. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa toán học cao với độ tin cậy là 95%. Điểm tối ưu đạt được ở thí nghiệm thứ 14 với nồng độ enzyme là 0,42%, ở nhiệt độ 56oC và ứng với thời gian tương ứng là 8,8 giờ. Kết quả nghiên cứu công đoạn khử protein bằng NaOH: Công đoạn khử protein được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tôm trong dung dịch acid NaOH loãng. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003. Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử protein như sau. Bảng 17. Kết quả hàm lượng protein ở các chế độ khử protein bằng NaOH N U1 (nồng độ %) U2 (thời gian) X0 X1 X2 Y (%) lượng protein còn lại 1 1 8 1 -1 -1 1,78 2 3 8 1 1 -1 1,04 3 1 14 1 -1 1 1,34 4 3 14 1 1 1 0,82 Bảng 18. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng NaOH N0 U1 U2 Y(%) 9 2 11 1,1214 10 2 11 1,0764 11 2 11 1,1319 Phương trình hồi quy của hàm lượng protein xác định được như sau : Y= 1,245 – 0,315*X1 – 0,165*X2 (2) Thảo luận: Phương trình (2) tương thích với thực nghiệm và qua phương trình trên ta thấy quy luật biến đổi của hàm lượng protein là khi tăng nồng độ dung dịch NaOH (X1) và thời gian khử protein (X2) thì hàm lượng protein trong phế liệu tôm (Y) giảm xuống, nhưng nồng độ NaOH ảnh hưởng tới hàm lượng protein nhiều hơn. Từ phương trình (2) nếu muốn khử protein một cách triệt để ta phải tăng nồng độ NaOH và thời gian khử protein; song việc tăng cao nồng độ NaOH và kéo dài thời gian khử protein sẽ gây ảnh hưởng lên cấu trúc của chitin-chitosan làm cắt mạch polymer từ đó làm giảm độ nhớt dung dịch chitosan. Như vậy xuất phát từ mức cơ sở, tiến hành làm thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất và thu được kết quả các thí nghiệm tiếp theo ở bảng 19 Bảng 19. Kết quả hàm lượng protein các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất Tên U1 (nồng độ %) U2 (thời gian) Y(%) Mức cơ sở 0,2 11 Bước chuyển động 4 4 Bước làm tròn 0,2 0,6 Thí nghiệm 9 2,2 11,6 1,08 Thí nghiệm 10 2,4 12,2 0,96 Thí nghiệm 11 2,6 12,8 0,91 Thí nghiệm 12 2,8 13,4 0,86 Từ bảng thí nghiệm trên ta nhận thấy ở thí nghiệm thứ 10 hàm lượng protein trong chitin tương đối thấp tương ứng với nồng độ NaOH là 2,4%, ở 12,2 giờ. Nếu nâng cao nồng độ protein và thời gian xử lý khử protein thì hàm lượng giảm không đáng kể. Mặt khác, tăng nồng độ NaOH làm tăng chi phí sản xuất và giảm độ nhớt chitosan. Hàm lượng protein trong chitin ảnh hưởng lớn đến chất lượng chitin vì protein làm giảm độ tan của chitin trong acid HCl đặc và ảnh hưởng tới chất lượng của các chế phẩm được sản xuất từ chitin như: Glucosamin, chitosan… Khi hàm lượng protein trong chitin cao thì trong công đoạn deacetyl ta phải tăng hàm lượng NaOH và kéo dài thời gian deacetyl để khử hết protein và làm tăng độ deacetyl. Nhưng nồng độ NaOH càng cao và thời gian xử lý khử protein càng dài thì dễ gây cắt mạch glucoside từ đó làm giảm độ nhớt dung dịch chitosan. Vì vậy em quyết định chọn các thông số tối ưu cho công đoạn xử lý khử protein như trên. Từ các thí nhiệm ở phần tối ưu hoá công đoạn khử protein theo quy hoạch thực nghiệm ta vẽ được đồ thị sau: Hình 19. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ ngâm NaOH theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson Nhận xét: Qua đồ thị trên ta thấy khi nồng độ NaOH thấp thì dù thời gian có kéo dài thì hàm lượng protein trong chitin cũng rất cao (1,34%). Khi nồng độ NaOH tăng dần và thời gian khử protein tăng dần thì hàm lượng protein giảm dần. Ở nồng độ NaOH 2,4% protein trong mẫu <1% là hàm lượng protein đạt tiêu chuẩn của chitin-chitosan hiện nay. Ở nồng độ NaOH 2,4% cho hàm lượng protein tương đối thấp (0,96%), ở nồng độ NaOH 2,6% và 2,8% hàm lượng protein còn lại trong phế liệu tôm thấp hơn 0,96% nhưng nồng độ NaOH cao có ảnh hưởng đến chất lượng của Chitin-Chitosan sau này, mặc khác còn tốn thêm chi phí. Vì vậy có thể chọn nồng độ NaOH=2,4% trong thời gian 12,2 giờ làm thông số tối ưu cho công đoạn khử protein. Vậy thông số tối ưu cho công đoạn khử protein là: Nồng độ NaOH=2,4%, thời gian xử lý 12,2 giờ, tỷ lệ w/v=1/10, nhiệt độ (40±1 oC). Kết quả nghiên cứu công đoạn khử khoáng bằng acid benzoic: Phế liệu tôm đã qua khâu xử lý enzyme và NaOH có thành phần hoá học được trình bày ở bảng 20. Bảng 20. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ Chân Trắng sau khi khử lý khử protein bằng enzyme Alcalase và NaOH ở điều kiên tối ưu STT Thành phần Hàm lượng (%) trong phế liệu tôm 1 Protein 0,96 2 Khoáng 62,4 3 Độ ẩm 13,86 Từ bảng 20 ta thấy sau khi xử lý protein bằng enzyme Alcalase và NaOH hàm lượng protein giảm đáng kể (hiệu quả khử protein 98%). Nhưng hàm lượng khoáng còn rất nhiều vì môi trường khử protein bằng enzyme là môi trường kiềm (pH=7,2). Một phần khoáng được tách ra do phần protein liên kết với khoáng được tách ra. Nhưng thành phần phần trăn theo khôi lượng của hàm lượng khoáng tăng do hàm lượng protein trong phế liệu giảm Công đoạn khử khoáng được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tôm trong dung dịch acid benzoic. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003. Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử khoáng như sau. Bảng 21. Kết quả hàm lượng khoáng còn lại trong phế liệu tôm ở các chế độ khử khoáng bằng C6H5COOH N U1 (nồng độ C6H5COOH (M)) U2 (thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,012 4 1 -1 -1 35,21 2 0,018 4 1 1 -1 34,38 3 0,012 10 1 -1 1 25,09 4 0,018 10 1 1 1 18,57 Bảng 22. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng C6H5COOH N0 U1 U2 Y(%) 9 0,015 7 26,05 10 0,015 7 25,14 11 0,015 7 26,23 Phương trình hồi quy của hàm lượng khoáng xác định được như sau: Y= 26.3125 - 1.8375*X1 - 6.4825*X2 (3) Quy luật biến đổi của hàm lượng khoáng là khi tăng nồng độ dung dịch acid benzoic (X1), tăng thời gian khử khoáng (X2) thì hàm lượng khoáng trong phế liệu tôm (Y) giảm xuống, nhưng thời gian ngâm acid benzoic ảnh hưởng tới hàm lượng khoáng nhiều hơn . Từ phương trình (3) nếu muốn khử khoáng một cách triệt để ta phải tăng nồng độ acid benzoic, thời gian khử khoáng; song việc tăng cao nồng độ acid benzoic, kéo dài thời gian khử khoáng sẽ gây ảnh hưởng lên cấu trúc của chitin-chitosan làm cắt mạch polymer từ đó làm giảm độ nhớt dung dịch chitosan. Như vậy xuất phát từ mức cơ sở em tiến hành các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất. Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu hóa Tên U1(nồng độ M) U2(thời gian) Y(%) Mức cơ sở 0,015 7 Hệ số bj -1,8375 -6,4825 Bước chuyển động 3 3 Bước làm tròn 0,0006 0,6 Thí nghiệm 9 0,0156 7,60 25,01 Thí nghiệm 10 0,0162 8,20 22,29 Thí nghiệm 11 0,0168 8,80 20,83 Thí nghiệm 12 0,0174 9,4 19,02 Hình 20. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ ngâm C6H5COOH theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson. Nhận xét: Từ các thí nghiệm và nhìn vào đồ thị, nhận thấy khi tăng nồng độ acid benzoic, thời gian khử khoáng thì hàm lượng khoáng giảm dần, khi nồng độ C6H5COOH 0,0168M, thời gian ngâm 8,8 giờ thì hàm lượng khoáng còn lại là 20,83%. Khi tiếp tục tăng nồng độ benzoic và thời gian khử khoáng thì hàm lượng khoáng giảm không đáng kể. Do vậy nếu chitin-chitosan yêu cầu hàm lượng khoáng thấp và độ nhớt cao thì ta có thể chọn các thông số tối ưu cho quá trình khử khoáng để giảm được nồng độ C6H5COOH và thời gian xử lý C6H5COOH sau này nhằm đảm bảo được chất lượng của Chitin-Chitosan một cách tốt nhất. Ta có thể chọn các thông số tối ưu cho quá trình khử khoáng như sau: nồng độ C6H5COOH là 0,0168M, thời gian ngâm 8,8 giờ. Kết quả nghiên cứu công đoạn khử khoáng bằng HCl: Phế liệu tôm đã qua khâu xử lý acid benzoic có thành phần hoá học được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 23. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ Chân Trắng sau khi khử protein bằng enzyme Alcalase, NaOH và C6H5COOH ở điều kiên tối ưu. STT Thành phần Hàm lượng (%) trong phế liệu tôm 1 Protein 0,96 2 Khoáng 20,83 3 Độ ẩm 12,23 Bảng 24. Kết quả hàm lượng khoáng còn lại trong phế liệu tôm ở các chế độ khử khoáng bằng HCl N U1(Nồng độ HCl(M)) U2 (Thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,6 4 1 -1 -1 4,98 2 0,8 4 1 1 -1 2,24 3 0,6 10 1 -1 1 2,86 4 0,8 10 1 1 1 0,73 Bảng 25. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng HCl N0 U1 U2 Y(%) 9 0,7 7 1,94 10 0,7 7 1,81 11 0,7 7 1,79 Phương trình hồi quy của hàm lượng khoáng xác định được như sau: Y= 2.7025 - 1.2425 * X1 - 0.9325 * X2 (4) Quy luật biến đổi của hàm lượng khoáng là khi tăng nồng độ dung dịch acid chlohydric (X1), tăng thời gian khử khoáng (X2) thì hàm lượng khoáng trong phế liệu tôm (Y) giảm xuống, nhưng nồng độ HCl ảnh hưởng tới hàm lượng khoáng nhiều hơn . Từ phương trình (4) nếu muốn khử khoáng một cách triệt để ta phải tăng nồng độ HCl, thời gian khử khoáng; song việc tăng cao nồng độ HCl, kéo dài thời gian khử khoáng sẽ gây ảnh hưởng lên cấu trúc của chitin-chitosan làm cắt mạch polymer từ đó làm giảm độ nhớt dung dịch chitosan. Như vậy xuất phát từ mức cơ sở em tiến hành các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất. Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu hóa Tên U1(nồng độ %) U2(thời gian) Y Mức cơ sở 0.7 7 Hệ số bj -1.2425 -0.9325 Khoảng biến thiên 0.1 3 bj*khoảng biến thiên -0.12425 -2.7975 Bước chuyển động 4 4 Bước làm tròn 0.02 0.6 Thí nghiệm 9 0.72 7.6 1.53 Thí nghiệm 10 0.74 8.2 0.98 Thí nghiệm 11 0.76 8.8 0.83 Thí nghiệm 12 0.78 9.4 0.77 Hình 21. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ ngâm HCl theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson. Nhận xét: Từ các thí nghiệm và nhìn vào đồ thị, nhận thấy khi tăng nồng độ acid chlohydric và thời gian khử khoáng thì hàm lượng khoáng giảm dần, khi nồng độ HCl 0,74M, thời gian ngâm 8,2 giờ thì hàm lượng khoáng còn lại là 0,98%. Khi tiếp tục tăng nồng độ HCl và thời gian khử khoáng thì hàm lượng khoáng giảm không đáng kể, mặt khác, hàm lượng khoáng còn lại cũng đã < 1%. Do vậy nếu chitin-chitosan yêu cầu hàm lượng khoáng thấp và độ nhớt cao thì ta có thể chọn các thông số tối ưu cho quá trình khử khoáng để giảm được nồng độ HCl và thời gian xử lý HCl sau này nhằm đảm bảo được chất lượng của Chitin-Chitosan một cách tốt nhất. Ta có thể chọn các thông số tối ưu cho quá trình khử khoáng như sau: nồng độ HCl là 0,74M, thời gian ngâm 8,2 giờ. Thảo luận: Từ qui trình đối chứng khử khoáng bằng HCl nồng độ 1,4M và thời gian ngâm là 16 giờ ở nhiệt độ phòng, không dùng C6H5COOH, ta thu được Chitin, trong đó hàm lượng khoáng còn lại là 0.78%, còn quy trình dự kiến sản xuất thì hàm lượng khoáng còn lại 0,98%. Ta thấy, Chitin thu được từ 2 qui trình trên đều có hàm lượng khoáng còn lại là <1%, nhưng ở qui trình khử khoáng có sử dụng kết hợp với C6H5COOH thì chất lượng Chitin sẽ tốt hơn vì thời gian xử lí HCl ngắn hơn do đó giảm tác động không có lợi đến mạch polysaccharid của Chitin, acid hữu cơ có khả năng bảo toàn mạch Chitin. Mặc khác, khi xử lý acid benzoic nó còn làm yếu liên kết giữa protein-chitin-khoáng, do đó khi xử lý HCl sẽ dễ dàng tách khoáng ra khỏi phế liệu tôm ở nồng độ thấp (0,74M) và thời gian ngắn hơn (8,2 giờ). Khi chỉ dùng HCl thôi thì phải dùng ở nồng độ cao hơn (1,2M), thời gian xử lý dài hơn (16 giờ), vì ở nồng độ và thời gian dài như vậy sẽ làm ảnh hưởng xâu đến mạch polysaccharid của Chitin. Do đó, việc kết hợp khử khoáng bằng acid hữu cơ và vô cơ là vấn đề quan trọng cần được nghiên cứu thêm. PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Kết luận: 1. Đã nghiên cứu được điều kiện khử protein bằng enzyme và NaOH thích hợp để sản xuất chitin như sau: Điều kiện khử protein bằng enzyme Alcalase: Nồng độ enzyme 0,42%, nhiệt độ 56oC,thời gian là 8.8 giờ,tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1:1. Điều kiện khử protein bằng NaOH: Nồng độ NaOH 0,24%, nhiệt độ 40oC,thời gian là 12,2 giờ, tỷ lệ 1w/5v. Khử protein từ phế liệu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bằng enzyme Alcalase đã giảm thiểu hóa chất sử dụng, giảm ô nhiễm môi trường, đồng thời đã tận dụng nguồn protein từ đầu tôm làm thúc ăn chăn nuôi. 2. Đã nghiên cứu được điều kiện khử khoáng bằng acic benzoic thích hợp: nồng độ acid benzoic là 0,0168M, thời gian xử lý là 8,8 giờ, ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục khử khoáng bằng acid chlohydric thích hợp là: 0,74M,thời gian ngâm là 8,2 giờ, ở nhiệt độ phòng. Một số đề xuất cần tiếp tục nghiên cứu: Cần tiếp tục nghiên cứu công đoạn deacetyl để hoàn thiện qui trình sản xuất Chitin-Chitosan theo phương pháp sinh học Cần phân tích chất lượng Chitosan từ chitin sản xuất theo qui trình đề xuất để đánh giá mức độ ảnh hưởng của các thông số công nghệ. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đặng Văn Hợp, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Thuần Anh, Vũ Ngọc Bội – Phân tích thực phẩm kiểm nghiệm thủy sản – Nhà xuất bản Nông nghiệp, 2006. Nguyễn Hữu Tào, Lê Văn Liễn, Bùi Văn Chính,Vũ Chí Cương – Viện chăn nuôi – Kỹ thuật chế biến, bảo quản, và sử dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp và hải sản làm thức ăn chăn nuôi. Nguyễn Thị Ngọc Tú , 2003,76tr. Nghiên cứu dùng vật liệu Chitosan làm phụ gia thực phẩm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. [Tên tạp chí] Trần Thị Luyến, 2004, Báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử nghiệm cấp bộ sản xuất chitin, Chitosan từ phế liệu chế biến thủy sản, Mã số B2002-33-01-DA,8-15 Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, 03/2005, Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu Thủy sản- NXB Nông nghiệp. Trần Thị Luyến và cộng sự (2003), Nghiên cứu sản xuất Chitosan từ vỏ tôm sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm, Tạp chí KHCN Thủy sản, Đại học Thủy Sản, số 5, 18-20 Trần Thị Luyến, (2006), Các phản ứng cơ bản và biến đổi của thực phẩm trong quá trình công nghệ - NXB Nông nghiệp, 2-17 Nguyễn Cảnh (1993), Quy hoạch thực nghiệm, Trường Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh, 10-15 Phan Hiếu Hiền (2001), Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu – NXB Nông nghiệp,22-24. M.T.DenSiKov, Nguyễn Văn Đạt, Bùi Huy Thanh (1997), Tận dụng phế liệu của công nghiệp thực phẩm, NXB Khoa hoc và Kỹ thuật, Hà Nội, 60-64 Roelof Schoemaker, Chuyên gia tư vấn (2005), Tận dụng phế liệu tôm, Dự án cải thiện chất lượng và xuất khẩu Thủy sản (Seaquip), NXB Nông nghiệp, 10-15. Một số đồ án tốt nghiệp trên thư viện. Tài liệu tiếng Anh Adler – Niesen. J.,(1986), Enzyme Hydrosis of Food Proteins, Elsevier Applied Science Publishers, New York. Asbjorn Gildberg, Even Stenberg., (2000), A new process for advanced utilisention of shrimp waste, pp.2-7. Birch. G.G., Blakerough. N., and Parker. K.J., (1981), Enzymes and Food Processing Applied, Science Publishers Ltd, London. Bustos. R.O.,and Michael. H., (1994), Microbial deproteinisation of waste prawn shell, Institution of Chemical Engineers Symposium Series, Institution of Chemical Engineers, Rugby, England, pp. 13-15. Dalev. P. G., Simeonova. L.S., (1992), An enzyme biotechnology for thetotal utilization of leather wastes, Biotechnol Lett Vol. 14, pp.531-534. Gagne. N. and Simpson. B.K.,(1993), Use of proteolytic enzymes to facilitate recovery from shrimp wastes, Food Biotechnol,pp. 253-263. Holanda, H. D. D, Netto, F. M., 2006. Recovery of components from shirmp (Xiphopenaeus kroyeri) processing waste by enzymatic hydrolysis. Journal of Food Science, 71, 298-303. Nguyen Van Toan, Chuen-How Ng, Kyaw Nyein Aye, Trung Si Trang and Willem F.Stevens, Production of high-quality chitin and chitosan from preconditioned shrimp shells, F. Chem Technol Biotechnol 81:1113-1118(1006) ảng PHỤ LỤC Bảng 26. Kết quả đo OD330nm Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 Hàm lượng BSA(mg/ml) 0 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 OD330nm 0,075 0,148 0,296 0,448 0,594 0,732 Bảng 27. Kết quả đo OD570nm Ống nghiệm Hàm lượng BSA(mg/ml) OD570 1 2 0,101 2 4 0,201 3 6 0,305 4 8 0,409 5 10 0,506 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa cho công đoạn khử protein từ phế liệu tôm bằng enzyme Alcalase Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thì số thí nghiệm cần tiến hành để đánh giá vai trò của từng yếu tố là: N = nk Trong đó: N : Số thí nghiệm; n: Số mức, ở đây n = 3 k: Số yếu tố ảnh hưởng; k = 3 vậy N = 23 = 8 thí nghiệm. Tính các hệ số của phương trình hồi quy: Ở đây: j = 0, 1,2, …k với k là số yếu tố độc lập. N là số thí nghiệm trong ma trận quy hoạch thực nghiệm N=8 Bảng 28. Bảng bố trí thí nghiệm N U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) X0 X1 X2 X3 Y(%)lượng protein còn lại 1 0,1 40 4 1 -1 -1 -1 19,6183 2 0,5 40 4 1 1 -1 -1 11,8941 3 0,1 60 4 1 -1 1 -1 13,023 4 0,5 60 4 1 1 1 -1 14,233 5 0,1 40 10 1 -1 -1 1 11,5383 6 0,5 40 10 1 1 -1 1 10,5916 7 0,1 60 10 1 -1 1 1 9,9975 8 0,5 60 10 1 1 1 1 9,3423 Thay số ta tính được các hệ số: b0 = 12,5298 ; b1 = -1,0145; b2 = - 0,8808 ; b3= -2,1623 Phương trình hồi quy tuyến tính dạng rút gọn là: 12,5298 – 1,0145 * X1 – 0,8808 * X2 – 2,1623 * X3(1) Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy. Bố trí 3 thí nghiệm song song thủy phân phế liệu tôm bằng enzyme Alcalase theo các điều kiện ở tâm phương án. Các thí nghiệm được bố trí như sau: Bảng 29.Các thí nghiệm ở tâm phương án N U1 U2 U3 Y 1 03 50 7 12,67 2 0,3 50 7 12,797 3 0,3 50 7 13,8167 Bảng 30. Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase. N0 A 1 12,67 - 0,3912 0,1531 2 12,797 - 0,2642 0,0698 3 13,8167 0,6555 0,4296 Ta sẽ được phương sai tái hiện là: : số thí nghiệm ở tâm phương án Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy: Cấu trúc: với Trong đó là độ lệch quân phương của hệ số thứ j Tính toán ta có: to= 62,0449 t1= 5,0237 t2 = 4,3616 t3 = 10,7075 Tra bảng phân vị phân bố Student với p= 0,05; f = - 1 = 2 Suy ra : Như vậy các hệ số đều có ý nghĩa. Khi đó phương trình hồi quy có dạng: =12,5298 – 1,0145*X1 – 0,8808*X2 – 2,1623*X3 (1) Kiểm định sự tương thích của mô hình thực nghiệm được thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher. Các số liệu dùng để tính toán phương sai dư ( ) được cho ở bảng sau: Bảng 31.Các số liệu dùng để tính toán STT 1 19,6183 15,7066 3,9117 15,3013 2 11,8941 13,6776 -1,7835 3,1808 3 13,023 15,7066 -2,6836 7,2018 4 14,233 13,6776 0,5554 0,3085 5 11,5383 11,3819 0,1564 0,0244 6 10,5916 9,3529 1,2387 1,5344 7 9,9975 11,3819 -1,3844 1,9167 8 9,3423 9,3529 0,0106 0,0001 Phương sai dư Trong đó: N: Số thí nghiệm 1: Số hệ số có nghĩa Tiêu chuẩn Fisher: Tra bảng phân vị phân bố Fisher F (f1,f2) với: =0,05 f1=N-L=3: Bậc tự do của tử. f2=N0-1=2 : Bậc tự do của mẫu. Tra bảng ta có: F0,05(3,2) = 19,3 Vì F = 18,0641 < F0,05(3,2) = 19,3; nên phương trình tương thích với thực nghiệm. Nhìn vào phương trình hồi quy (1), ta có nhận xét: Cả 3 yếu tố nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân và tỷ lệ E/S đều có ảnh hưởng đến mức độ thủy phân nhưng thời gian có ảnh hưởng mạnh nhất. Các hệ số b1, b2, b3 đều cùng dấu âm, có nghĩa là Y(hàm lượng protein còn lại) đồng biến với X1 (tỷ lệ E/S), X2 (nhiệt độ thủy phân), X3 (thời gian thủy phân) Từ phương trình (1) ta tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp đường dốc nhất. Chọn bước chuyển động của nhiệt độ thủy phân X1 là 2oC. Các bước chuyển động của yếu tố X2, X3 được tính theo công thức dưới đây: Chọn bước nhảy thích hợp với X1 là 0,04. Bảng 32. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn thủy phân khử protein bằng enzyme . Tên X1 X2 X3 Y Mức cơ sở 0.3 50 7 Hệ số bj -1.0145 -0.8808 -2.1623 Khoảng biến thiên 0.2 10 3 bj -0.2029 -8.808 -6.4869 Bước 0.036 2 0.58 Bước làm tròn 0.04 2 0.6 Thí nghiệm 9 0.34 52 7.6 9.451 Thí nghiệm 10 0.38 54 8.2 9.2528 Thí nghiệm 11 0.42 56 8.8 8.0102 Thí nghiệm 12 0.46 58 9.4 8.655 Bảng 33.Các thông số tối ưu. Các thông số tối ưu Hàm lượng protein (%) Nồng độ enzyme Alcalase:4,2 % Thời gian: 8,8 giờ Nhiệt độ: 56oC 8,0102 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa cho công đoạn khử protein từ phế liệu tôm bằng NaOH: Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thì số thí nghiệm cần tiến hành để đánh giá vai trò của từng yếu tố là: N=nk Trong đó: N : Số thí nghiệm; n: Số mức, ở đây n=2 k: Số yếu tố ảnh hưởng; k=2 vậy N= 22 =4 thí nghiệm. Tính các hệ số của phương trình hồi quy: Ở đây: j = 0, 1,2, …k với k là số yếu tố độc lập. N là số thí nghiệm trong ma trận quy hoạch thực nghiệm N=4 Bảng 34. Bảng bố trí thí nghiệm N U1(nồng độ %) U2(thời gian) X0 X1 X2 Y(%)lượng protein còn lại 1 0,1 8 1 -1 -1 1,78 2 0,3 8 1 1 -1 1,04 3 0,1 14 1 -1 1 1,34 4 0,3 14 1 1 1 0,82 Thay số ta tính được các hệ số: b0 = 1,245 ; b1= -0,315; b2= -0,165 Phương trình hồi quy tuyến tính dạng rút gọn là: 1.245 - 0.315*X1 - 0.165*X2 Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy. Bố trí 3 thí nghiệm song song khử protein trong phế liệu tôm bằng NaOH theo các điều kiện ở tâm phương án. Các thí nghiệm được bố trí như sau: Bảng 35.Các thí nghiệm ở tâm phương án N0 U1 U2 Y(%) 9 0,2 11 1,1214 10 0,2 11 1,0764 11 0,2 11 1,1319 Bảng 36.Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng NaOH N0 A 1 1,1214 1,1099 0,0115 0,0001 0,0017 2 1,0764 - 0,0335 0,0011 3 1,1319 0,0220 0,0005 Ta sẽ được phương sai tái hiện là: : số thí nghiệm ở tâm phương án Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy: Cấu trúc: với Trong đó là độ lệch quân phương của hệ số thứ j Tính toán ta có: to= 84,4553 t1= 21,3682 t2 = 11,1929 Tra bảng phân vị phân bố Student với p= 0,05; f = - 1 = 2 Suy ra : Như vậy các hệ số t1,12 đều có ý nghĩa. Khi đó phương trình hồi quy có dạng: = 1,245 – 0,315*X1 – 0,165*X2 (2) Kiểm định sự tương thích của mô hình thực nghiệm được thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher. Các số liệu dùng để tính toán phương sai dư ( ) được cho ở bảng sau: Bảng 37. Các số liệu dùng để tính toán STT 1 1,78 1,7250 0,0550 0,003 2 1,04 1,0950 -0,0550 0,003 3 1,34 1,3950 -0,0550 0,003 4 0,82 0,7650 0,0550 0,003 Phương sai dư Trong đó: N: Số thí nghiệm 1: Số hệ số có nghĩa Tiêu chuẩn Fisher: Tra bảng phân vị phân bố Fisher F (f1,f2) với: =0,05 f1=N-L=2: Bậc tự do của tử. f2=N0-1=2 : Bậc tự do của mẫu. Tra bảng ta có: F0,05(2,2) =18,5 Vì F =6,96 < F0,05(2,2) =18,5; nên phương trình tương thích với thực nghiệm. Nhìn vào phương trình hồi quy (2), ta có nhận xét: Cả 2 yếu tố nồng độ NaOH, thời gian ngâm đều có ảnh hưởng đến mức độ khử protein nhưng nồng độ có ảnh hưởng mạnh nhất. Các hệ số b1, b2 đều cùng dấu âm, có nghĩa là Y(hàm lượng protein còn lại) đồng biến với X1 (nồng độ NaOH), X2 (thời gian ngâm). Từ phương trình (2) ta tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp đường dốc nhất. Chọn bước chuyển động của nồng độ NaOH là 0,2%. Các bước chuyển động của yếu tố X2, X3 được tính theo công thức sau hay được chọn theo kinh nghiệm. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn thủy phân khử protein bằng NaOH được ghi trong bảng : Bảng 38.Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn khử protein bằng NaOH Tên X1 X2 Y Mức cơ sở 0,2 11 Hệ số bj -2,3238 -2,6763 Khoảng biến thiên 0,1 3 bj -0,3238 -8,0289 Bước 0,2 0,607 Bước làm tròn 0,2 0,6 Thí nghiệm 9 2,2 11,6 1,08 Thí nghiệm 10 2,4 12,2 0,96 Thí nghiệm 11 2,6 12,8 0,91 Thí nghiệm 12 2,8 13,4 0,86 Bảng 39.Các thông số tối ưu Các thông số tối ưu Hàm lượng protein (%) Nồng độ NaOH:2,4 % Thời gian: 12,2 giờ Tỷ lệ w/v: 1/15 0,96 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa cho công đoạn khử khoáng từ phế liệu tôm bằng C6H5COOH: Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thì số thí nghiệm cần tiến hành để đánhgiá vai trò của từng yếu tố là: N=nk Trong đó: N : Số thí nghiệm; n: Số mức, ở đây n=2 k: Số yếu tố ảnh hưởng; k=2 vậy N = 22 = 4 thí nghiệm. Tính các hệ số của phương trình hồi quy: Ở đây: j = 0, 1,2, …k với k là số yếu tố độc lập. N là số thí nghiệm trong ma trận quy hoạch thực nghiệm N=4 Bảng 40. Bảng bố trí thí nghiệm N U1(nồng độ M) U2(thời gian) X0 X1 X2 Y(%)lượng khoáng còn lại 1 0,012 4 1 -1 -1 35,21 2 0,018 4 1 1 -1 34,38 3 0,012 10 1 -1 1 25,09 4 0,018 10 1 1 1 18,57 Thay số ta tính được các hệ số: b0 = 26,3125 ; b1= -1,8375; b2= -6,4825 Phương trình hồi quy tuyến tính dạng rút gọn là: 26,3125 – 1,8375*X1 – 6,4825*X2 (3) Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy. Bố trí 3 thí nghiệm song song khử khoáng trong phế liệu tôm bằng C6H5COOH theo các điều kiện ở tâm phương án. Các thí nghiệm được bố trí như sau: Bảng 41. Các thí nghiệm ở tâm phương án N0 U1 U2 Y(%) 9 0,015 7 26,05 10 0,015 7 25,14 11 0,015 7 26,23 Bảng 42. Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng C6H5COOH N0 A 1 26,05 0,2433 0,0592 2 25,14 - 0,6667 0,4444 3 26,23 0,4233 0,1792 Ta sẽ được phương sai tái hiện là: : số thí nghiệm ở tâm phương án Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy: Cấu trúc: với Trong đó là độ lệch quân phương của hệ số thứ j Tính toán ta có: to= 96,907 t1= 6,2893 t2 =22,1881 Tra bảng phân vị phân bố Student với p= 0,05; f = - 1 = 2 Suy ra : Như vậy các hệ số t1,12 đều có ý nghĩa. Khi đó phương trình hồi quy có dạng: = 26,3125 – 1,8375*X1 – 6,4825*X2 (3) Kiểm định sự tương thích của mô hình thực nghiệm được thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher. Các số liệu dùng để tính toán phương sai dư ( ) được cho ở bảng sau: Bảng 43.Các số liệu dùng để tính toán STT 1 35,21 36,6325 -1,4225 2,0235 2 34,38 32,9575 1,4225 2,0235 3 25,09 23,6675 1,4225 2,0235 4 18,57 19,9925 -1,4225 2,0235 Phương sai dư Trong đó: N: Số thí nghiệm 1: Số hệ số có nghĩa Tiêu chuẩn Fisher : Tra bảng phân vị phân bố Fisher F (f1,f2) với: =0,05 f1=N-L=2: Bậc tự do của tử. f2=N0-1=2 : Bậc tự do của mẫu. Tra bảng ta có: F0,05(2,2) =18,5 Vì F =11,853 < F0,05(2,2)=18,5; nên phương trình tương thích với thực nghiệm. Nhìn vào phương trình hồi quy (3), ta có nhận xét: Cả 2 yếu tố nồng độ C6H5COOH, thời gian ngâm đều có ảnh hưởng đến mức độ khử khoáng nhưng thời gian khử khoáng có ảnh hưởng mạnh nhất. Các hệ số b1, b2 đều cùng dấu âm, có nghĩa là Y(hàm lượng khoáng còn lại) đồng biến với X1 (nồng độ C6H5COOH), X2 (thời gian ngâm). Từ phương trình (3) ta tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp đường dốc nhất. Chọn bước chuyển động của nồng độ C6H5COOH là 0.0006M. Các bước chuyển động của yếu tố X1, X2 được tính theo công thức sau hay được chọn theo kinh nghiệm. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn thủy phân khử khoáng bằng acid benzoic được ghi trong bảng : Bảng 44. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn khử khoáng bằng C6H5COOH . Tên X1 X2 Y Mức cơ sở 0,015 7 Hệ số bj - 1,8375 -6,4825 Khoảng biến thiên 0,003 3 bj -0,000945 -1,845 Bước 0,0006 0,59 Bước làm tròn 0,0006 0,6 Thí nghiệm 9 0,0156 7,6 25,01 Thí nghiệm 10 0,0162 8,2 22,29 Thí nghiệm 11 0,0168 8,8 20,83 Thí nghiệm 12 0,0174 9,2 19,02 Bảng 45. Các thông số tối ưu Các thông số tối ưu Hàm lượng khoáng (%) Nồng độ C6H5COOH : 0,0168M Thời gian: 8,8 giờ Tỷ lệ w/v: 1/10 20,83 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa cho công đoạn khử khoáng từ phế liệu tôm bằng HCl: Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thì số thí nghiệm cần tiến hành để đánhgiá vai trò của từng yếu tố là: N=nk Trong đó: N : Số thí nghiệm; n: Số mức, ở đây n=2 k: Số yếu tố ảnh hưởng; k=2 vậy N = 22 = 4 thí nghiệm. Tính các hệ số của phương trình hồi quy: Ở đây: j = 0, 1,2, …k với k là số yếu tố độc lập. N là số thí nghiệm trong ma trận quy hoạch thực nghiệm N=4 Bảng 46. Bảng bố trí thí nghiệm N U1(nồng độ M) U2(thời gian) X0 X1 X2 Y(%)lượng khoáng còn lại 1 0,6 4 1 -1 -1 4,98 2 0,8 4 1 1 -1 2,24 3 0,6 10 1 -1 1 2,86 4 0,8 10 1 1 1 0,63 Thay số ta tính được các hệ số: b0 = 2,7025 ; b1= -1,2425; b2= -0,9325 Phương trình hồi quy tuyến tính dạng rút gọn là: 2,7025 – 1,2425*X1 – 0,9325*X2 (4) Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy. Bố trí 3 thí nghiệm song song khử khoáng trong phế liệu tôm bằng C6H5COOH theo các điều kiện ở tâm phương án. Các thí nghiệm được bố trí như sau: Bảng 47. Các thí nghiệm ở tâm phương án N0 U1 U2 Y(%) 9 0,7 7 1,94 10 0,7 7 1,81 11 0,7 7 1,79 Bảng 48. Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng NaOH N0 A 1 1,94 0,0933 0,0087 2 1,81 -0,0367 0,0013 3 1,79 -0.0567 0,0032 Ta sẽ được phương sai tái hiện là: : số thí nghiệm ở tâm phương án Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy: Cấu trúc: với 0,0407 Trong đó là độ lệch quân phương của hệ số thứ j Tính toán ta có: to= 65,7479 ; t1= 30,5113; t2 =22,89 Tra bảng phân vị phân bố Student với p= 0,05; f = - 1 = 2 Suy ra : Như vậy các hệ số t1,12 đều có ý nghĩa. Khi đó phương trình hồi quy có dạng: = 2,7025 – 1,2425*X1 – 0,9325*X2 (4) Kiểm định sự tương thích của mô hình thực nghiệm được thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher. Các số liệu dùng để tính toán phương sai dư ( ) được cho ở bảng sau: Bảng 49. Các số liệu dùng để tính toán STT 1 4,98 4,8525 0,1275 0,0163 2 2,24 2,3675 -0,1275 0,0163 3 2,86 2,9875 -0,1275 0,0163 4 0,63 0,5025 0,1275 0,0163 Phương sai dư Trong đó: N: Số thí nghiệm 1: Số hệ số có nghĩa Tiêu chuẩn Fisher : Tra bảng phân vị phân bố Fisher F (f1,f2) với: =0,05 f1=N-L=2: Bậc tự do của tử. f2=N0-1=2 : Bậc tự do của mẫu. Tra bảng ta có: F0,05(2,2) =18,5 Vì F =4,9014 < F0,05(2,2) =18,5; nên phương trình tương thích với thực nghiệm. Nhìn vào phương trình hồi quy (4), ta có nhận xét: Cả 2 yếu tố nồng độ HCl, thời gian ngâm đều có ảnh hưởng đến mức độ khử khoáng nhưng nồng độ có ảnh hưởng mạnh nhất. Các hệ số b1, b2 đều cùng dấu âm, có nghĩa là Y(hàm lượng khoáng còn lại) đồng biến với X1 (nồng độ HCl), X2 (thời gian ngâm). Từ phương trình (4) ta tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp đường dốc nhất. Chọn bước chuyển động của nồng độ HCl là 0,02M. Các bước chuyển động của yếu tố X1, X2 được tính theo công thức sau hay được chọn theo kinh nghiệm. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn thủy phân khử khoáng bằng acid chlohydric được ghi trong bảng : Bảng 50. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn khử khoáng bằng HCl. Tên X1 X2 Y Mức cơ sở 0,7 7 Hệ số bj - 1,2425 -0,9325 Khoảng biến thiên 0,1 3 bj -0,12425 -2,7975 Bước 0,02 0,579 Bước làm tròn 0,02 0,6 Thí nghiệm 9 0,72 7,6 1,53 Thí nghiệm 10 0,74 8,2 0,98 Thí nghiệm 11 0,76 8,8 0,83 Thí nghiệm 12 0,78 9,2 0,77 Bảng 51. Các thông số tối ưu Các thông số tối ưu Hàm lượng khoáng (%) Nồng độ HCl : 0,74M Thời gian: 8,2 giờ Tỷ lệ w/v: 1/10 0,98 Một số thiết bị sử dụng trong đề tài: Hình 22.Thiết bị ổn nhiệt Memmert. Hình 23. Thiết bị đo Uvmini-1240. Hình 24.Máy li tâm. Hình 25.Thiết bị Vortex. Hình 26.Sự bắt màu của dung dịch BSA sau khi cho thuốc thử Biuret. Hình 27. Công thức cấu tạo của Sodium citrate. Hình 28. Mono Sodium Citrate Anhydrous. Hình 29. Dung dịch protein và thuốc thử Biuret Hình 30. Thủy phân đầu tôm Hình 31. Đầu tôm đã được vô hoạt enzyme sau khi thủy phân(dùng nhiệt) Hình 32. Phế liệu tôm sau khi thủy phân Hình 33. Phế liệu tôm sau khi thủy phân bằng enzyme Alcalase và xử lý NaOH Hình 34. Phế liệu tôm đã khử protein và khư khoáng lần 1 bằng C6H5COOH Hình 35. Phế liệu tôm(PLT) đã khử protein bằng enzyme(trái), PLT đã khử protein bằng enzyme và NaOH Hình 36. PLT đã khử protein bằng enzyme và NaOH(trái), PLT đã khử protein và khử khoáng bằng C6H5COOH