Luận văn Nghiên cứu trích ly màu hạt điều màu (Bixa orellana L.) tạo chế phẩm nhũ Annatto

ởng của nồng độ ammonia đến hiệu suất trích ly màu annatto Ammonia có vai trò điều chỉnh độ pH của môi trường và cung cấp gốc NH4+ để biến bixin và norbixin thành dạng muối ammonium. Nồng độ ethanol được cố định ở 600, nồng độ ammonia thay đổi từ 0,1 đến 0,7 M. Kết quả được biểu diễn trên Hình 3.3. Kết quả cho thấy hiệu suất khác nhau rõ rệt khi thay đổi nồng độ ammonia, trong đó tại nồng độ ammonia 0,5 M đạt được hiệu suất cao nhất và khác biệt có ý nghĩa với các nồng độ khác ở mức p < 0,05 (Phụ lục 2). Hiệu suất tăng dần khi nồng độ ammonia tăng từ 0,1 M đến 0,5 M nhưng nếu nồng độ ammonia cao hơn 0,5 M thì hiệu suất lại bị giảm. Như vậy qua thí nghiệm thăm dò này, nồng độ ammonia 0,5 M được chọn làm yếu tố cố định để tiến hành thí nghiệm thăm dò nồng độ ethanol và khoảng nồng độ ammonia 0,3 – 0,6 M được dùng để thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa nồng độ dung môi và chất hỗ trợ bằng phương pháp bề mặt đáp ứng. Hình 3.3. Hiệu suất trích ly annatto ở các nồng độ ammonia khác nhau 47 3.3.3. Tối ưu hóa nồng độ dung môi và chất hỗ trợ Từ kết quả thăm dò sau hai thí nghiệm trước, mức khảo sát hai yếu tố độc lập là nồng độ ammonia và nồng độ ethanol được thể hiện trong Bảng 3.3. Bảng 3.3. Mức khảo sát của 2 yếu tố Yếu tố Mức khảo sát –α –1 0 +1 +α Nồng độ ammonia (M) 0,24 0,3 0,45 0,6 0,66 Nồng độ ethanol (0) 45,86 50 60 70 74,14 Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm RSM kiểu CCD 2 yếu tố Nghiệm thức Mã hóa X1 – Nồng độ ammonia (M) X2 – Nồng độ ethanol (0) Hiệu suất trích ly annatto (%) 1 −− 0,3 50 1,89 2 −+ 0,3 50 1,99 3 +− 0,6 70 1,92 4 ++ 0,6 70 2,18 5 a0 0,24 60 1,77 6 A0 0,66 60 1,96 7 0a 0,45 45,86 2,2 8 0A 0,45 74,14 2,29 9 00 0,45 60 2,36 10 00 0,45 60 2,4 11 00 0,45 60 2,43 12 00 0,45 60 2,45 13 00 0,45 60 2,41 48 Sau khi thực hiện các nghiệm thức một cách ngẫu nhiên, kết quả được tổng hợp trong Bảng 3.4. Nhìn chung từ bảng kết quả cho thấy các nghiệm thức tại tâm cho hiệu suất trích ly annatto cao hơn cả (từ nghiệm thức 9 đến 13). Đây là dấu hiệu cho biết điểm tối ưu có thể nằm gần tâm khảo sát. Sau khi tiến hành phân tích kết quả bằng phần mềm JMP 9.0.2, kết quả phân tích số liệu lần lượt được trình bày sau đây. Giá trị thực nghiệm và giá trị dự đoán theo mô hình toán học có độ tương thích cao, thể hiện ở giá trị R2 = 0,97 và hình ảnh trực quan trong Hình 3.4a, các điểm thực nghiệm phân bố gần đường chéo trên biểu đồ và đại đa số giá trị nằm trong khoảng biên độ sai số 5 %. Như vậy là có 97 % giá trị thực nghiệm tương thích với giá trị tính theo mô hình toán học. Các điểm phân bố không theo quy luật trong biểu đồ phân bố phần dư (Hình 3.4b) chứng tỏ sai số thực nghiệm là ngẫu nhiên, không có sai số hệ thống khi thực hiện thí nghiệm này. Thêm vào đó Bảng 3.5 cho biết sự “thiếu phù hợp” của mô hình toán học không có ý nghĩa do giá trị Prob > F là 0,1 lớn hơn mức p = 0,05. Tóm lại có thể kết luận mô hình toán học do phần mềm JMP 9.0.2 đưa ra có thể sử dụng để biểu diễn và giải thích quan hệ giữa nồng độ hai thành phần dung môi với hiệu suất trích ly annatto. Hình 3.4. Độ tương thích của số liệu thực nghiệm với mô hình toán học (a) và phân bố phần dư của số liệu thực nghiệm so với số liệu dự đoán (b) 49 Bảng 3.5. Sự “thiếu phù hợp” của mô hình toán học Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố và tương tác giữa chúng lên đáp ứng Y được sắp xếp và minh họa trên đồ thị Pareto (Hình 3.5). Theo đó, mức độ ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly annatto theo thứ tự giảm dần như sau: tương tác X12 có ảnh hưởng lớn nhất, kế đến là tương tác X22, xếp thứ ba là nồng độ NH3 (X1), tiếp theo là nồng độ ethanol (X2) và cuối cùng tương tác X1X2 ảnh hưởng không đáng kể. Như vậy nếu so sánh ảnh hưởng nồng độ của hai thành phần dung môi thì tác động của ammonia đến hiệu suất trích ly annatto quan trọng hơn ethanol. Hình 3.5. Biểu đồ Pareto thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố Theo Bảng 3.6 thì tương tác X1X2 ảnh hưởng không ý nghĩa đến hiệu suất Y (do chỉ số Prob >│t│lớn hơn mức p = 0,05) cho nên sẽ không có mặt trong phương trình hồi quy, nói cách khác là không có sự tương tác giữa ảnh hưởng của nồng độ ammonia và ethanol trong phạm vi khảo sát. Có thể biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng Y – Hiệu suất trích ly annatto với hai yếu tố X1 – Nồng độ ammonia và X2 – Nồng độ ethanol bằng phương trình hồi quy như sau: Y = 2,41 + 0,061X1 + 0,061X2 – 0,288X12 – 0,098X22 50 Bảng 3.6. Các hệ số của phương trình hồi quy Biến / tương tác giữa các biến Ước lượng Sai số chuẩn Hệ số t Prob > │t│ Intercept 2,41 0,023 103,8 < 0,0001* X1 – Nồng độ NH3 (0,3 – 0,6 M) 0,061 0,018 3,33 0,0126* X2 – Nồng độ ethanol (50 – 700) 0,061 0,018 3,32 0,0128* X1*X2 0,04 0,026 1,54 0,1672 X1*X1 – 0,288 0,02 – 14,61 < 0,0001* X2*X2 – 0,098 0,02 – 4,95 0,0016* Từ phương trình trên, bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của nồng độ hai thành phần dung môi và chất hỗ trợ đến hiệu suất trích ly annatto có dạng như trong Hình 3.6. Bề mặt đáp ứng có đỉnh phía trên, nghĩa là điểm tối ưu nằm trong khoảng khảo sát. Hình 3.6. Bề mặt đáp ứng thể hiện quan hệ giữa hiệu suất trích ly và nồng độ hai thành phần dung môi 51 Bảng 3.7. Dự đoán điểm tối ưu và giá trị hai yếu tố tương ứng Yếu tố Giá trị X1 – Nồng độ NH3 (0,3 – 0,6 M) 0,47 X2 – Nồng độ ethanol (50 – 700) 63 Giá trị đáp ứng dự đoán: 2,42 Kết quả tối ưu dự đoán do phần mềm đề xuất ước đạt 2,42 %; đạt được khi nồng độ ammonia là 0,47 M và nồng độ ethanol là 630 (Bảng 3.7). Tại điểm tối ưu, mặt cắt của bề mặt đáp ứng có dạng như trong Hình 3.7. Hình 3.7. Mặt cắt của bề mặt đáp ứng tại điểm tối ưu Sau khi tiến hành kiểm tra thực tế độ tin cậy của dự đoán điểm tối ưu bằng cách tiến hành thí nghiệm theo các thông số do phần mềm đưa ra (nồng độ ammonia 0,47 M và nồng độ ethanol 630; hiệu suất trích ly annatto thu được từ thí nghiệm kiểm chứng thực tế là 2,36 ± 0,035 %. Sai lệch giữa số liệu kiểm tra thực nghiệm và số liệu dự đoán nhỏ hơn 5 % nên mô hình do phần mềm đưa ra là chấp nhận được. So với công trình của Pimentel công bố năm 1995 thì nồng độ ammonia tối ưu ở thí nghiệm này thấp hơn nhưng nồng độ ethanol lại cao hơn (NH4OH 0,52 N và ethanol 58 %). Tuy nhiên, công trình của Pimentel không tiến hành tối ưu hóa và cũng không sử dụng vi sóng để hỗ trợ quá trình trích ly. Nồng độ tối ưu 52 ammonia (0,47 M) và ethanol (630) sẽ được sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu và chế độ hỗ trợ vi sóng đến hiệu suất trích ly màu annatto 3.4.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu đến hiệu suất trích ly màu annatto Trong quá trình trích ly bằng dung môi nói chung, tìm ra tỷ lệ dung môi / nguyên liệu hợp lý là việc quan trọng. Tỷ lệ hợp lý là tỷ lệ cân đối nhằm đảm bảo hiệu suất trích ly cao đồng thời tiết kiệm dung môi. Để thăm dò ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu, công suất và thời gian hỗ trợ vi sóng được cố định ở 240 W trong thời gian 60 giây, kết quả thể hiện trên Hình 3.8. Hình 3.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu đến hiệu suất trích ly annatto Từ kết quả so sánh trung bình hiệu suất tương ứng với các tỷ lệ khác nhau bằng phương pháp Tukey’s HSD cho thấy tỷ lệ 10/1 cho hiệu suất cao nhất và khác biệt có ý nghĩa với các hiệu suất tương ứng với các tỷ lệ còn lại (Phụ lục 4). Có thể thấy khi tỷ lệ dung môi / nguyên liệu tăng từ 4/1 đến 10/1 thì hiệu suất tăng, nhưng khi lớn hơn tỷ lệ 10/1 hiệu suất không tăng nữa mà lại có xu hướng giảm. Tỷ lệ này 53 cao hơn tỷ lệ 6/1 mà các tác giả Pimentel (1995), Silva (2007) và Silva et al. (2010) đã sử dụng để trích ly màu annatto bằng dung môi KOH và NH4OH + ethanol. Tuy nhiên, đó là tỷ lệ được sử dụng mà không thấy dẫn chứng hoặc minh chứng thực nghiệm. Tóm lại, qua thí nghiệm này tỷ lệ 10/1 được chọn làm yếu tố cố định khi tiến hành hai thí nghiệm thăm dò tiếp theo. Khoảng tỷ lệ 8/1 – 12/1 thích hợp để thiết kế và tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa tỷ lệ dung môi / nguyên liệu cùng với chế độ hỗ trợ vi sóng. 3.4.2. Ảnh hưởng của công suất vi sóng đến hiệu suất trích ly màu annatto Hình 3.9. Ảnh hưởng của công suất vi sóng đến hiệu suất trích ly annatto Vi sóng có tác dụng cung cấp năng lượng để kích hoạt các phân tử phân cực như H2O, từ đó phá vỡ cấu trúc tế bào thực vật giúp giải phóng chất mục tiêu dễ dàng hơn. Nhưng nếu cung cấp năng lượng vi sóng quá lớn (công suất lớn hoặc thời gian dài hoặc kết hợp cả hai) thì nhiệt độ dung môi sẽ tăng cao, điều này có thể làm cho chất màu bị thoái hóa do bản chất cấu trúc annatto là carotenoid có rất nhiều nối đôi trong phân tử. Trước tiên chúng tôi tiến hành thí nghiệm thăm dò ảnh hưởng của công suất vi sóng đến hiệu suất trích ly annatto, với các yếu tố cố định là tỷ lệ dung 54 môi / nguyên liệu là 10/1 và thời gian hỗ trợ vi sóng là 60 giây. Kết quả thí nghiệm được biểu diễn trong Hình 3.9. Từ kết quả so sánh trung bình bằng phương pháp Tukey’s HSD cho thấy hiệu suất tương ứng với công suất 800 W là cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với hiệu suất tương ứng với các công suất còn lại (Phụ lục 5). Qua Hình 3.10 có thể thấy hiệu suất trích ly annatto tăng dần khi công suất vi sóng tăng từ 80 đến 800 W. Nếu công suất tiếp tục tăng thì hiệu suất không tăng nữa mà lại giảm nhanh. Năm 2006, Smiths và Wallin đã dẫn chứng về tính kém bền của màu annatto trong điều kiện khắc nghiệt, cụ thể ở nhiệt độ trên 70 0C, phản ứng thoái hóa màu annatto diễn ra dẫn đến hình thành một số sản phẩm không mong muốn như sắc tố McKeown hay còn gọi là sắc tố C17. Đây có thể là nguyên nhân làm giảm hàm lượng annatto trong thí nghiệm này khi năng lượng vi sóng được cung cấp quá lớn. Tóm lại từ kết quả thăm dò này, công suất vi sóng 800 W được chọn để tiến hành thí nghiệm thăm dò ảnh hưởng của thời gian hỗ trợ vi sóng và khoảng công suất 560 W – 1000 W thích hợp để thiết kế và thực hiện thí nghiệm tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng. 3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian hỗ trợ vi sóng đến hiệu suất trích ly annatto Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian hỗ trợ vi sóng đến hiệu suất trích ly annatto 55 Thời gian hỗ trợ vi sóng hợp lý không chỉ giúp quá trình trích ly annatto diễn ra triệt để mà còn tác động đến sự thoái hóa khi tiếp xúc với năng lượng cao trong thời gian quá dài. Để tiến hành thí nghiệm thăm dò này, tỷ lệ dung môi / nguyên liệu được cố định là 10/1, công suất vi sóng 800 W; kết quả được thể hiện trên Hình 3.10. Từ kết quả so sánh trung bình bằng phương pháp Tukey’s HSD cho thấy hiệu suất tương ứng với thời gian hỗ trợ 50 giây và 60 giây là khác biệt không ý nghĩa và cao hơn có ý nghĩa với hiệu suất ở các mức thời gian khác (Phụ lục 6). Qua biểu đồ trên Hình 3.10 có thể thấy hiệu suất trích ly annatto tăng dần khi thời gian hỗ trợ tăng từ 30 lên 50 giây, nhưng khi tăng lên quá 60 giây thì hiệu suất giảm rõ rệt. Như vậy, trong điều kiện thời gian hỗ trợ vi sóng quá dài (trên 1 phút ở 800 W) thì lượng annatto bị giảm do bản chất màu annatto là carotenoid dễ bị thoái hóa khi được cung cấp năng lượng lớn. Tóm lại từ kết quả thăm dò này, khoảng thời gian hỗ trợ vi sóng 40 – 70 giây thích hợp để thiết kế và thực hiện thí nghiệm tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng. 3.4.4. Tối ưu hóa tỷ lệ dung môi / nguyên liệu và chế độ hỗ trợ vi sóng Từ kết quả thăm dò từ ba thí nghiệm trước, khoảng khảo sát ba yếu tố độc lập là tỷ lệ dung môi / nguyên liệu, công suất và thời gian hỗ trợ vi sóng thể hiện trong Bảng 3.8. Bảng 3.8. Mức khảo sát của 3 yếu tố Yếu tố Mức khảo sát –1 0 +1 Tỷ lệ dung môi / hạt 8 10 12 Công suất vi sóng (W) 560 780 1000 Thời gian hỗ trợ vi sóng (s) 40 55 70 Sau khi tiến hành thí nghiệm với thứ tự ngẫu nhiên, kết quả được tổng hợp trong Bảng 3.9. Nhìn chung, kết quả cho thấy nghiệm thức số 10 và các nghiệm 56 thức tại tâm cho hiệu suất trích ly annatto cao hơn cả (từ nghiệm thức 13 đến 15). Đây là dấu hiệu cho biết điểm tối ưu có thể nằm gần tâm khảo sát. Sau khi tiến hành phân tích kết quả bằng phần mềm JMP 9.0.2 thu được kết quả phân tích số liệu chi tiết và lần lượt liệt kê sau đây. Bảng 3.9. Kết quả thí nghiệm RSM kiểu Box-Behnken 3 yếu tố Nghiệm thức Mã hóa X1 − Tỷ lệ dung môi / hạt X2 – Công suất vi sóng (W) X3 − Thời gian hỗ trợ vi sóng (s) Y − Hiệu suất trích ly annatto (%) 1 −−0 8 560 55 2,24 2 −+0 8 1000 55 2,01 3 +−0 12 560 55 2,40 4 ++0 12 1000 55 2,19 5 0−− 10 560 40 2,24 6 0−+ 10 560 70 1,85 7 0+− 10 1000 40 2,21 8 0++ 10 1000 70 1,80 9 −0− 8 780 40 2,37 10 +0− 12 780 40 2,58 11 −0+ 8 780 70 2,04 12 +0+ 12 780 70 2,22 13 000 10 780 55 2,65 14 000 10 780 55 2,54 15 000 10 780 55 2,56 57 Hình 3.11. Độ tương thích của số liệu thực nghiệm với mô hình toán học (a) và phân bố phần dư của số liệu thực nghiệm so với số liệu dự đoán (b) Giá trị thực nghiệm và giá trị dự đoán theo mô hình toán học có độ tương thích cao, thể hiện ở giá trị R2 = 0,97 và hình ảnh trực quan trong Hình 3.11a, các điểm thực nghiệm phân bố gần đường chéo trên biểu đồ và đại đa số giá trị nằm trong khoảng biên độ sai số 5 %. Như vậy, có 97 % giá trị thực nghiệm có thể biểu diễn bởi mô hình toán học do phần mềm đưa ra. Các điểm trong biểu đồ phân bố phần dư sắp xếp không có quy luật (Hình 3.11b) chứng tỏ là sai số thực nghiệm là ngẫu nhiên, không có sai số hệ thống khi thực hiện thí nghiệm. Thêm vào đó, kết quả trong Bảng 3.10 cho biết sự “thiếu phù hợp” của mô hình toán học không có ý nghĩa do giá trị Prob > F là 0,3838 lớn hơn mức p = 0,05. Tóm lại mô hình toán học do phần mềm JMP 9.0.2 đề xuất có thể sử dụng để biểu diễn và giải thích quan hệ giữa tỷ lệ dung môi / nguyên liệu, công suất và thời gian hỗ trợ vi sóng với hiệu suất trích ly annatto. Bảng 3.10. Sự “thiếu phù hợp” của mô hình toán học 58 Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố cũng như tương tác giữa chúng lên đáp ứng Y được minh họa và sắp xếp trên đồ thị Pareto (Hình 3.12). Theo đó, mức độ ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly annatto sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: X22 – (Công suất vi sóng)2 ảnh hưởng mạnh nhất, X3 – Thời gian hỗ trợ vi sóng ảnh hưởng ít hơn xếp thứ hai, tiếp theo là tương tác X32 – (Thời gian hỗ trợ vi sóng)2 và X1 – Tỷ lệ dung môi / hạt, sau đó mới là Công suất vi sóng – X2; 3 cặp tương tác từng đôi của 3 yếu tố ảnh hưởng không đáng kể đến đáp ứng. Như vậy, nếu so sánh ảnh hưởng của 3 yếu tố thì ảnh hưởng của công suất vi sóng đến hiệu suất trích ly annatto quan trọng hơn so với ảnh hưởng của thời gian, còn tỷ lệ dung môi / hạt ít ảnh hưởng nhất trong số 3 yếu tố đang khảo sát. Hình 3.12. Biểu đồ Pareto thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố Từ Bảng 3.11 cho thấy các cặp tương tác X1X2; X1X3; X2X3 và X12 ảnh hưởng không có ý nghĩa đến hiệu suất Y (do chỉ số Prob >│t│lớn hơn mức p = 0,05) nên sẽ vắng mặt trong phương trình hồi quy. Dựa vào giá trị các hệ số có ý nghĩa còn lại, có thể biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng Y – Hiệu suất trích ly annatto với 3 yếu tố X1 – Tỷ lệ dung môi / hạt, X2 – Công suất vi sóng và X3 – Thời gian hỗ trợ vi sóng bằng phương trình hồi quy như sau: Y = 2,583 + 0,091X1 – 0,065X2 – 0,186X3 – 0,325X22 – 0,233X32 Từ phương trình trên, bề mặt đáp ứng tương ứng với từng cặp yếu tố được thể hiện trong Hình 3.13, 3.14 và 3.15. Bề mặt đáp ứng của hai cặp yếu tố X1X2 và X1X3 có đỉnh phía trên nhưng nằm sát biên vùng khảo sát của yếu tố tỷ lệ dung môi / hạt, còn đỉnh bề mặt đáp ứng của cặp yếu tố X2X3 nằm giữa khoảng khảo sát. 59 Bảng 3.11. Các hệ số của phương trình hồi quy Biến / tương tác giữa các biến Ước lượng Sai số chuẩn Hệ số t Prob > │t│ Intercept 2,583 0,041 63,42 < 0,0001* X1 – Tỷ lệ dung môi / hạt (4 – 8) 0,091 0,025 3,66 0,0146* X2 – Nhiệt độ ủ (50 – 70 0C) – 0,065 0,025 – 2,61 0,0479* X3 – Thời gian ủ (20 – 40 phút) – 0,186 0,025 – 7,47 0,0007* X1*X2 0,005 0,035 0,14 0,8928 X1*X3 – 0,007 0,035 – 0,21 0,8400 X2*X3 – 0,005 0,035 – 0,14 0,8928 X1*X1 – 0,048 0,037 – 1,3 0,2487 X2*X2 – 0,325 0,037 – 8,86 0,0003* X3*X3 – 0,233 0,037 – 6,34 0,0014* Hình 3.13. Bề mặt đáp ứng thể hiện tương quan giữa hiệu suất đối với tỷ lệ dung môi / hạt và công suất vi sóng 60 Hình 3.14. Bề mặt đáp ứng thể hiện tương quan giữa hiệu suất đối với tỷ lệ dung môi / hạt và thời gian hỗ trợ vi sóng Hình 3.15. Bề mặt đáp ứng thể hiện tương quan giữa hiệu suất đối với công suất và thời gian hỗ trợ vi sóng 61 Kết quả tối ưu dự đoán do phần mềm đề xuất (Bảng 3.12) đạt được khi tỷ lệ dung môi / hạt gần 12/1, công suất vi sóng 760,4 W và thời gian hỗ trợ gần 49 giây, khi đó hiệu suất trích ly annatto ước đạt 2,67 %. Tại điểm tối ưu, mặt cắt của bề mặt đáp ứng có dạng như trong Hình 3.16. Bảng 3.12. Dự đoán điểm tối ưu và giá trị 3 yếu tố tương ứng Yếu tố Giá trị X1 – Tỷ lệ dung môi / hạt (8 – 12) 11,96 X2 – Công suất vi sóng (560 – 1000 W) 760,4 X3 – Thời gian hỗ trợ vi sóng (40 – 70 s) 48,8 Giá trị đáp ứng dự đoán: 2,67 Hình 3.16. Mặt cắt của bề mặt đáp ứng tại điểm tối ưu Sau khi tiến hành kiểm tra thực tế độ tin cậy của dự đoán điểm tối ưu bằng cách tiến hành thí nghiệm theo các thông số do phần mềm gợi ý (tỷ lệ dung môi / hạt 12/1; công suất 760 W và thời gian hỗ trợ 49 giây), kết quả thu được hiệu suất 62 trích ly annatto là 2,58 ± 0,038 %. Sai lệch giữa số liệu kiểm tra thực nghiệm và số liệu dự đoán nhỏ hơn mức 5 % nên mô hình do phần mềm đưa ra là đáng tin cậy. Các thông số đã tối ưu hóa này sẽ được sử dụng để tiến hành trích ly thu dịch trích sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.5. Ảnh hưởng của thời gian trích ly phụ sau khi hỗ trợ vi sóng Hình 3.17. Ảnh hưởng của thời gian trích ly phụ sau hỗ trợ vi sóng đến hiệu suất trích ly annatto Do thời gian tối ưu để hỗ trợ vi sóng quá ngắn (49 giây) nên sẽ không đủ để trích ly triệt để annatto có trong hạt điều màu. Do vậy, việc tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly phụ sau khi hỗ trợ vi sóng là cần thiết. Khoảng thời gian được khảo sát trải từ 0 đến 60 phút, với kết quả được biểu diễn trên Hình 3.17. Từ kết quả so sánh trung bình bằng phương pháp Tukey’s HSD (Phụ lục 7) cho thấy thời gian trích ly phụ tốt nhất là 30 hoặc 37,5 phút và khác biệt có ý nghĩa với hiệu suất trích ly khi áp dụng các khoảng thời gian khác ở mức p < 0,05. Tuy nhiên, để tiết kiệm thời gian cho nên khoảng thời gian 30 phút được chọn. Qua biểu đồ trong Hình 3.17 có thể thấy hiệu suất trích ly annatto tăng nhẹ khi thời gian tăng từ 0 đến 22,5 phút, trong thời gian ngắn như vậy quá trình trích ly màu xảy ra chưa 63 triệt để. Nhưng khi tăng lên 30 tới 37,5 phút thì hiệu suất tăng lên rõ rệt. Nếu thời gian quá dài (khoảng hơn 40 phút) thì hiệu suất lại giảm do bản chất màu annatto kém bền, dễ bị oxy hóa trong điều kiện trích ly kéo dài với sự thâm nhập của oxy từ không khí xung quanh. 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic dùng để kết tủa annatto Hình 3.18. Dịch trích ly ban đầu (trái) và dịch trích ly kết tủa sau 20 phút bổ sung acid acetic (phải) Trước tiên, ống nghiệm chứa 20 mL dịch trích ly được để ở điều kiện nhiệt độ 0 0C trong 1 giờ và quan sát thấy không có lớp chất béo và sáp nổi lên, chứng tỏ dịch trích ly không có hoặc có rất ít chất béo và sáp. Nguyên nhân có thể do hỗn hợp dung môi ethanol + ammonia phân cực nên chất béo và sáp khó hòa tan vào dung môi trong quá trình trích ly. Do đó, có thể bỏ qua bước loại béo và sáp để chuyển sang công đoạn tách annatto tự do ra khỏi dịch trích ly bằng phương pháp acid hóa. Do giá trị HLB của bixin và norbixin tự do nhỏ hơn nhiều so với 7, lần lượt là 1,375 và 2,65 theo Belitz et al. (2009) nên rất khó tan trong nước đặc biệt là nước có pH thấp. Vì vậy, có thể lợi dụng tính chất này để tách annatto tự do ra khỏi dịch trích ly bằng cách cho chúng kết tủa trong điều kiện môi trường trung hòa hoặc acid hóa dịch trích. Trước khi tiến hành khảo sát nồng độ acid acetic thích hợp, các loại acid thông dụng đã được khảo sát sơ bộ gồm sulfuric, chlohydric, citric và acetic; trong số đó chỉ có acid acetic là phù hợp nhất khi cho hiệu suất thu hồi cao (Hình 3.18). Kết quả này khác với phương pháp của Pimentel (1995) khi tác giả sử dụng 64 acid citric 2 N để kết tủa annatto thu được sau khi trích ly bằng dung môi 0,52 N NH4OH trong 58 % ethanol. Với 10 mL dịch trích ly ở mỗi nghiệm thức, kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích acid acetic lên hiệu suất thu hồi annatto được thể hiện trong Hình 3.19. Hình 3.19. Ảnh hưởng của tỷ lệ acid acetic đến hiệu suất thu hồi annatto Từ kết quả so sánh trung bình bằng phương pháp Tukey’s HSD (Phụ lục 8) cho thấy tỷ lệ thể tích acid acetic đậm đặc kết tủa annatto tốt nhất là 15 % và khác biệt có ý nghĩa với hiệu suất thu hồi khi sử dụng các thể tích acetic khác ở mức p < 0,05. Với lượng dịch trích trong mỗi nghiệm thức là 10 mL thì khi được trộn lẫn với 1,5 mL acid acetic 99,5 % sẽ trở thành hỗn hợp trong đó tương đương với nồng độ 2,37 M. Qua tham khảo tài liệu cho thấy màu annatto chủ yếu được kết tủa bằng acid H2SO4 và HCl nhưng đó là đối với trường hợp sử dụng dung môi kiềm để trích ly chất màu (KOH hoặc NaOH). Khi tiến hành thăm dò khả năng tủa annatto bằng H2SO4 thì hiệu suất thu hồi đạt rất thấp dù acid đã được pha loãng trước khi sử dụng nhằm tránh sinh nhiệt khi hòa tan acid H2SO4 đậm đặc vào nước. Lý do có thể là ngoài tính acid mạnh, acid sulfuric còn có khả năng oxy hóa nên dễ làm biến tính màu annatto vốn rất nhạy cảm với sự oxy hóa. Tóm lại từ kết quả thí nghiệm này, 65 nồng độ acid acetic 2,37 M (tương đương 15 % thể tích acid acetic 99,5 % so với thể tích dịch trích) được chọn để thu hồi annatto tự do từ dịch trích ly. Sau khi acid hóa dịch trích ly bằng acid acetic 2,37 M sẽ thu được kết tủa annatto, ly tâm thu tủa rồi rửa lại 3 lần bằng nước cất, sau đó sấy khô ở 50 0C trong 5 giờ (Pimentel, 2005; Dinda et al., 2008; Phan Thục Uyên, 2012). Kết tủa khô màu nâu đỏ được nghiền thành bột mịn lọt hoàn toàn qua rây 250 (Hình 3.20). Theo phân loại của JECFA (Smith và Wallin, 2006), có thể coi chế phẩm bột annatto của chúng tôi là annatto E. Hình 3.20. Bột annatto E điều chế trong phòng thí nghiệm 3.7. Chỉ tiêu chất lượng, quy trình thử nghiệm và tính toán giá thành 3.7.1. Chỉ tiêu chất lượng Các chỉ tiêu cơ bản của chế phẩm như sau: độ ẩm 7,1 ± 0,32 %; hàm lượng annatto 64,89 ± 1,23 %, trong đó bixin chiếm 82 % màu tổng số. Như vậy, tỷ lệ bixin trong tổng số chất màu gần như không đổi sau khi trải qua quá trình trích ly (81,44 % ở vật liệu nghiên cứu so với 82 % trong chế phẩm). Độ ẩm chế phẩm bột annatto trong khoảng 4 – 8 % là đạt yêu cầu theo quy trình sản xuất chế phẩm annatto quy mô công nghiệp của nhà máy Cusco ở Peru (Hyman et al., 1990). Hàm lượng màu trong bột tủa annatto thu được cao hơn so với yêu cầu của QCVN 4– 10:2010/BYT là 35 % đối với chế phẩm annatto F và mong muốn 30 % đối với chế 66 phẩm annatto E theo phân loại của FAO JECFA (Smith và Wallin, 2006). Hàm lượng annatto cao có nhiều lợi ích như tăng giá trị của chế phẩm và giảm chi phí vận chuyển nhờ tỷ lệ tạp chất thấp hơn. 3.7.2. Quy trình thử nghiệm và tính toán giá thành Từ kết quả các thí nghiệm trên, quy trình thử nghiệm sản xuất 1 kg chế phẩm bột annatto 64,89 % màu được tóm tắt trong Hình 3.21. Tóm lại, quy trình của chúng tôi đã trích ly được hàm lượng annatto vượt 43,78 % so với phương pháp của McKeown và Mark công bố năm 1962 (3,08 % so với 2,14 %). Từ quy trình trong Hình 3.21, giá thành tạm tính để điều chế thử nghiệm 1 kg chế phẩm bột annatto E theo thời giá tháng 3/2014 được kê chi tiết trong Bảng 3.13. Chi phí lớn nhất là nguyên liệu hạt điều màu và dung môi ethanol. Như vậy, giá thành sản xuất 1 kg chế phẩm bột annatto E 64,89 % màu khoảng 6.665.680 đồng. Hình 3.21. Quy trình điều chế thử nghiệm chế phẩm bột annatto E 67 Bảng 3.13. Giá thành sản xuất thử nghiệm 1 kg chế phẩm bột annatto E STT Nguyên vật liệu ĐVT Số lượng Đơn giá (vnd) Chi phí (vnd) 1 Hạt điều màu khô (10 % ẩm) kg 33,7 60 000 2 022 000 2 NH3 25 % L 14,2 10 900 154 780 3 Ethanol 960 L 267,3 12 500 3 341 000 4 acetic 99,5 % L 58,7 17 000 997 900 5 Năng lượng, điện, nước 50 000 6 Công lao động và chi phí khác 100 000 7 Giá thành 1 đơn vị chế phẩm kg 1 6 665 680 3.8. Thử nghiệm sơ bộ khả năng tạo chế phẩm nhũ annatto ổn định trong dung môi nước pH thấp 3.8.1. Lựa chọn chất nhũ hóa thích hợp Hình 3.22. Bột annatto E hòa tan trong propylene glycol kiềm Bột annatto E thu được hầu như không hòa tan trong nước nên rất hạn chế trong việc ứng dụng làm màu thực phẩm vì hầu hết các thành phần trong thực phẩm đều ưa nước. Dựa trên US patent số 2 831 775 của tác giả Kocher (1958) và phương pháp của Satyanarayana et al. (2010), bột annatto E được nhũ hóa để cải thiện khả năng hòa tan trong nước. Trước tiên 0,5 g bột annatto được hòa tan trong 5 g hỗn hợp propylene glycol + NaOH có pH bằng 10, sau đó bổ sung một trong các chất nhũ hóa với giá trị HLB tăng dần gồm lecithin, polyethylene glycol 400 monostearate, tween 80 và sodium stearoyl lactate (Hình 3.22). 68 (mẫu mới pha loãng; từ trái qua phải: ĐC, LC, PG 400 MS, TW 80 và SSL) (sau 18 h ở 55 0C; từ trái qua phải: ĐC, LC, PG 400 MS, TW 80 và SSL) (sau 42 h ở 55 0C; từ trái qua phải: ĐC, LC, PG 400 MS, TW 80 và SSL) Hình 3.23. Nhũ tương annatto trong propylene glycol được nhũ hóa với các chất nhũ hóa khác nhau và pha loãng trong nước cất ở pH 7 (dãy trái) và pH 4 (dãy phải) 69 Lấy 0,01 g mỗi hỗn hợp hòa tan vào 10 mL nước cất ở pH 7 và pH 4, kết quả thể hiện trên Hình 3.23. Ngay sau khi pha và qua quá trình quan sát trong khi ủ ở nhiệt độ tăng cường 55 0C, có thể thấy mẫu tương ứng với chất nhũ hóa tween 80 ổn định màu tốt nhất trong số các chất nhũ hóa khảo sát và tốt hơn đối chứng. Như vậy, qua thí nghiệm sơ bộ này chúng tôi tạm thời chọn tween 80 làm chất nhũ hóa hỗ trợ tạo nhũ cho màu annatto. 3.8.2. Khảo sát tỷ lệ chất nhũ hóa tween 80 Nồng độ tween 80 dùng để khảo sát trong quá trình tạo nhũ annatto được dựa trên các khuyến nghị của JECFA (2006) và FSCJ (2007), qua đó liều lượng ADI (acceptable daily intake) của annatto và tween 80 gần tương đương nhau (12 và 10 mg/kg), hơn nữa hàm lượng annatto trong bột chế phẩm là 64,89 % nên chúng tôi bố trí thí nghiệm với 1 g bột chế phẩm annatto hòa tan trong 5 g hỗn hợp propylene glycol kiềm (pH 10), sau đó bổ sung tween 80 với khối lượng từ 0,1 đến 0,5 g. Lấy 0,01 g mỗi hỗn hợp đã trộn đồng nhất đem hòa tan vào 10 mL nước cất ở pH 7 và pH 4, kết quả thể hiện trên Hình 3.24. Ngay sau khi pha và qua quá trình quan sát sau thời gian ủ nhất định ở nhiệt độ tăng cường 55 0C, có thể thấy ở nồng độ càng cao thì tween 80 tạo và ổn định màu càng tốt. Đồng thời ở điều kiện pH thấp, tween 80 tỏ ra hiệu quả hơn vì cho màu đậm và lâu phai. Tóm lại, qua thí nghiệm này chúng tôi chọn tỷ lệ 50 % khối lượng tween 80 so với khối lượng bột annatto E để tạo nhũ annatto. 70 (mẫu mới pha loãng; từ trái qua phải: 10, 20, 30, 40 và 50 % TW 80 so với annatto) (sau 29 h ở 55 0C; từ trái qua phải: 10, 20, 30, 40 và 50 % TW 80 so với annatto) (sau 77 h ở 55 0C; từ trái qua phải: 10, 20, 30, 40 và 50 % TW 80 so với annatto) Hình 3.24. Nhũ tương annatto trong propylene glycol được nhũ hóa với tween 80 ở các tỷ lệ khác nhau và pha loãng trong nước cất ở pH 7 (dãy trái) và pH 4 (dãy phải) 71 3.8.3. Khảo sát sự ổn định của chế phẩm nhũ annatto trong dung môi nước có pH khác nhau (mẫu mới pha loãng; từ trái qua phải: pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10) (sau 7 ngày ở 55 0C; từ trái qua phải: pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10) (sau 12 ngày ở 55 0C; từ trái qua phải: pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10) Hình 3.25. Nhũ annatto ổn định ở pH thấp Để đánh giá độ ổn định của nhũ annatto tạo bởi chất nhũ hóa tween 80, chúng tôi sử dụng phương pháp mô tả trong công bố của Zhang và Zhong (2013) kết hợp với phương pháp của Yang et al. (2013). Nhũ annatto được hòa tan trong nước có pH thay đổi từ 2 đến 10 (Hình 3.25). Qua đó có thể thấy nhũ annatto ổn định ở pH thấp dưới 5, khá ổn định ở pH trung tính (khoảng 6 – 7) và mất màu nhanh ở pH kiềm. Ở pH 10, màu đỏ của bixin chuyển sang màu cam do pH cao xúc tác phản ứng xà phòng hóa bixin và norbixin tự do thành natri norbixinate có màu 72 cam. Kết quả này chứng tỏ tiềm năng ứng dụng chế phẩm nhũ annatto tạo bằng tween 80 trong đồ uống có tính acid. 3.8.4. Sử dụng chế phẩm nhũ annatto phối màu cho nước cam ép (mẫu mới phối màu, từ trái qua phải: ĐC; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 % chế phẩm) (và sau 5 ngày ở 55 0C; từ trái qua phải: ĐC; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 % chế phẩm) Hình 3.26. Nước cam ép được phối nhũ annatto Để khẳng định thêm lần nữa tiềm năng ứng dụng của chế phẩm nhũ annatto trong việc tạo màu cho đồ uống có tính acid. Nước ép trái cam sành trồng ở Việt Nam được lựa chọn do đây là đồ uống có bản chất pH thấp và lạt màu hơn so với nước cam ép xuất xứ từ nơi khác, hơn nữa màu tự nhiên của annatto khá giống với màu của nước cam ép. Nước cam sành ép được chuẩn bị theo quy trình chế biến nước cam ép mô tả trong tài liệu của Taylor (2005). Trước tiên, lựa chọn trái cam sành chín tới loại 35 trái / 10 kg, sau đó rửa sạch, bổ đôi trái rồi ép lấy nước, lọc bỏ 73 bã rắn còn lại trong nước ép bằng vải lọc. Pha loãng nước cam với nước cất theo tỷ lệ 1/1 để giảm độ chua, pH của mẫu pha loãng là 3,2 ± 0,12. Bổ sung chế phẩm nhũ annatto vào nước cam pha loãng với tỷ lệ khối lượng tăng dần (0; 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 và 0,05 g), tiếp theo cho vào ống nghiệm và thanh trùng (Pasteurize) ở 63 0C trong 30 phút (Ray, 2005). Kết quả theo dõi hình ảnh mẫu nước cam trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ 55 0C trong tối cho thấy màu nước cam ép khá ổn định sau 5 ngày để trong tối ở nhiệt độ tăng cường 55 0C (Hình 3.26). Như vậy có thể kết luận chế phẩm nhũ annatto tạo bởi tween 80 có khả năng ứng dụng để tăng cường màu sắc cho nước cam sành ép. 74 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Sau khi thực hiện các nội dung đề ra, có thể tổng kết một cách khái quát như sau: – Màu annatto trong hạt điều màu ở Đồng Nai có thể được trích ly bằng dung môi ethanol kết hợp ammonia. Hiệu suất tối đa đạt được là 3,08 % trong các điều kiện như sau: nồng độ ethanol 630; nồng độ ammonia 0,47 M; tỷ lệ dung môi / nguyên liệu 12/1; công suất và thời gian hỗ trợ vi sóng lần lượt là 760 W và 49 giây; thời gian trích ly phụ sau hỗ trợ vi sóng là 30 phút. – Sau khi trích ly, annatto tự do có thể được tách ra khỏi dịch trích ly bằng biện pháp kết tủa bởi acid. Acid acetic nồng độ 2,37 M (hay 15 % thể tích acetic 99,5 % so với thể tích dịch trích) thích hợp để thu hồi annatto tự do. Sau khi sấy kết tủa ở 50 0C đã thu được bột annatto E kết tủa với 64,89 % annatto. – Bột annatto E có thể được phối chế thành chế phẩm màu dạng nhũ bởi chất nhũ hóa tween 80 với tỷ lệ khối lượng 1/2 (tween 80 / bột annatto E). Chế phẩm này hòa tan tốt trong nước và ổn định trong nước ở pH thấp (từ 2 đến 5) và khá ổn định ở pH trung tính (khoảng 6 đến 7). ĐỀ NGHỊ Để kết quả nghiên cứu có thể triển khai ứng dụng vào thực tiễn, đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn cho cây điều màu và góp phần tạo ra những sản phẩm thực phẩm an toàn, các nghiên cứu sau đây là cần thiết: – Nghiên cứu khả năng hòa tan trong dầu và tính ổn định của màu annatto của chế phẩm nhũ tương. – Nghiên cứu định lượng annatto trong chế phẩm dạng nhũ tạo bởi chất nhũ hóa tween 80 và độ bền trong một số thực phẩm khác nhau như bánh kẹo, nước giải khát. 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Affandi M.M.M., Julianto T., and Majeed A., 2011. Development and stability evaluation of astaxanthin nanoemulsion. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 4 (1): 142 – 148. 2. Afoakwah A.N., Owusu J., Adomako C., and Teye E., 2012. Microwave assisted extraction (MAE) of antioxidantconstituents in plant materials. Global Journal of Bio–science & Biotechnology 1 (2): 132 – 140. 3. Amaral L.I.V., Cortelazzo Â.L., Buckeridge M.S., Pereira L.A.R., and Pereira M.F. D.A., 2009. Anatomical and biochemical changes in the composition of developing seed coats of annatto (Bixa orellana L.). Trees 23: 287 – 293. 4. American Color Research Center, Inc., 2009. Sunset Yellow FCF (Orange Yellow S, FD&C Yellow #6) Replacement Announcement. August 24, 2013. <URL: > 5. Anarjan N., and Tan C.P., 2013a. Chemical stability of astaxanthin nanodispersions in orange juice and skimmed milk as model food systems. Food Chemistry 139: 527 – 531. 6. Anarjan N., and Tan C.P., 2013b. Developing a three component stabilizer system for producing astaxanthin nanodispersions. Food Hydrocolloids 30: 437 – 447. 7. Anarjan N., and Tan C.P., 2013c. Effects of Selected Polysorbate and Sucrose Ester Emulsifiers on the Physicochemical Properties of Astaxanthin Nanodispersions. Molecules 18: 768 – 777. 8. Aparnathi K.D., and Sharma R.S., 1991. Annatto colour for food: a review. Indian Food Packer 45: 13 – 27. 9. Balaswamy K., Prabhakara Rao P.G., Satyanarayana A., and Rao D.G., 2006. Stability of bixin in annatto oleoresin and dye powder during storage. LWT 39: 952 – 956. 10. Balaswamy K., Prabhakara Rao P.G.., Prabhavathy M.B., and Satyanarayana A., 2012. Application of annatto (Bixa orellena L.) dye formulations in Indian traditional sweetmeats: Jilebi and jangri. Indian Journal of Traditional Knowledge 11 (1): 103 – 108. 11. Barbosa M.I.M.J., Borsarelli C.D., and Mercadante A.Z., 2005. Light stability of spray–dried bixin encapsulated with differentedible polysaccharide preparations. Food Research International 38: 989–994. 76 12. Bareth A., Strohmar W., and Kitzelmann E., 2002. HPLC and spectrophotometric determination of annatto in cheese. Eur. Food. Res. Technol. 215: 359 – 364. 13. Belitz H.D., Grosch W., and Schieberle P., 2009. Food Chemistry. Springer- Verlag Berlin Heidelberg. 4th revised and extended edition, pp. 459 – 460. 14. Bộ Khoa học và Công nghệ, 2002. TCVN 7038:2002 (ISO 928:1997) Gia vị – Xác định tro tổng số. Hà Nội, 6 trang. 15. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2004. 10TCN 592 – 2004:Ngũ cốc và đậu đỗ – Thóc tẻ – Yêu cầu kỹ thuật và Phương pháp thử. Hà Nội, 21 trang. 16. Bộ Y tế, 2010. Phụ lục 24: Quy định kỹ thuật và phương pháp thử đối với cao annatto. Trong QCVN 4–10: 2010/BYT – Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm – phẩm màu. Hà Nội, trang 78 – 79. 17. Bùi Thị Mỹ Lệ, 2012. Nghiên cứu chiết tách phẩm nhuộm màu annatto theo độ chín của hạt điều nhuộm ở Gia Lai. Luận văn thạc sĩ khoa học, ĐH Đà Nẵng. 18. Cardarelli C.R., Benassi M.T., and Mercadante A.Z., 2008. Characterization of different annatto extracts based on antioxidant and colour properties. LWT – Food Science and Technology 41: 1689 – 1693. 19. Cerimedo M.S.Á., Iriart C.H., Candal R.J., and Herrera M.L., 2010. Stability of emulsions formulated with high concentrations of sodium caseinate and trehalose. Food Research International 43: 1482 – 1493. 20. Chengaiah B., Mallikarjuna Rao K., Mahesh Kumar K., Alagusundaram M., and Madhusudhana Chetty C., 2010. Medicinal importance of natural dyes – a review. International Journal of PharmTech Research 2 (1): 144 – 154. 21. Đỗ Tất Lợi, 1999. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học, Hà Nội, trang 203. 22. Emerton V., and Choi E., 2008. Essential guide to food additives. Leatherhead Publishing, Leatherhead Food International, Ltd., UK. 3rd edition. p. 123. 23. FDA, 2011. Microwave Oven Radiation. 28th June 2013. <– emittingproducts/resourcesforyouradiationemittingproducts/ucm252762.htm> 24. FSCJ – Ủy ban An toàn thực phẩm Nhật Bản, 2007. Evaluation Report of Food Additives – Polysorbates (Polysorbates 20, 60, 65 and 80). Original: Japanese, Provisional translation. 77 25. Ganzler K., Salgó A., and Valkó K., 1986. Microwave extraction – a novel sample preparation method for chromatography. Journal of Chromatography 371: 299 – 306. 26. Garcia C.E.R., Bolognesi V.J., Dias J.F.G., Miguel O.G., and Costa C.K., 2012. Carotenoides bixina e norbixina extraídos do urucum (Bixa orellana L.) como antioxidantes em produtos cárneos. Ciência Rural, Santa Maria 42 (8): 1510 – 1517. 27. Hou Z., Zhang M., Liu B., Yan Q., Yuan F., Xu D., and Gao Y., 2012. Effect of chitosan molecular weight on the stability and rheological properties of beta– carotene emulsions stabilized by soybean soluble polysaccharides. Hydrocolloids 26: 205 – 211. 28. Huma Z., 2010. Hydrodiffusion assistée par micro-ondes Nouvelle technique d’eco-extraction d’antioxydants. Doctorat these, Academie d’Aix-marseille Universite d’Avignon et des pays de Vaucluse, France. 29. ITC, 1993. Market brief on Annatto seeds – Overview of the world market. International Trade Centre, UNCTAD/WTO, Geneva. 30. Ito Y., Ishizuki K., Sekiguchi W., Tada A., Akiyama T., Sato K., Yamazaki T., and Akiyama H., 2012. Analysis of Residual Solvents in Annatto Extracts Using a Static Headspace Gas Chromatography Method. American Journal of Analytical Chemistry 3: 638 – 645. 31. JECFA – Joint FAO/WHO Expert Committee of Food Additives, 2006. Combined compendium of food additive specifications – JECFA monograph 1 – vol. 4 – Analytical methods, test procedures and laboratory solutions used by and referenced in the food additive specifications. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, 2006. p. 200. 32. Kiokias S., and Gordon M.H., 2003. Antioxidant properties of annatto carotenoids. Food Chemistry 83: 523 – 529. 33. Kocher R.B., 1958. Edible annatto coloring compositions and method of preparing same. US patent N0 2 831 775. 34. Lee K.Y., Shim J., Bae I.Y., Cha J., Park C.S., and Lee H.G., 2003. Characterization of gellan/gelatin mixed solutions and gels. Lebensmittel– Wissenschaft und–Technologie 36: 795–802. 35. Leonardo S.B., 2007. Extração de pigmentos de urucum e estabilidade de seus extratos e de sementes. MEn. dissertação, Centro Universitário do Instituto Mauá de Tecnologia, São Caetano do Sul, Brasil. 78 36. Levy L.W., and Rivadeneira D.M., 2000. Annatto. In Natural Food Colorants: Science and Technology (Eds. G. J. Lauro, and F. J. Francis). Marcel Dekker Inc., New York, USA, pp. 115 – 152. 37. Lê Thị Anh Đào, Đinh Ngọc Thức và Phan Thị Sửu, 2000. Tách chiết chất màu đỏ cho thực phẩm từ hạt điều nhuộm (Bixa orellana L.) Việt Nam. Trong Tuyển tập các công trình Hội nghị khoa học và công nghệ hoá học hữu cơ toàn quốc lần thứ hai, Quy Nhơn, Bình Định, tháng 9/2000. Hội Hoá học Việt Nam, Trang 264 – 268. 38. Lê Thị Hoa, 2012. Nghiên cứu chiết tách, phân lập phẩm màu annatto từ hạt điều nhuộm bằng phương pháp KOH. Luận văn thạc sĩ khoa học, ĐH Đà Nẵng. 39. Magestea A.B., Senraa T.D.A., da Silvaa M.C.H., Bonomob R.C.F., and da Silva L.H.M., 2012. Thermodynamics and optimization of norbixin transfer processes in aqueous biphasic systems formed by polymers and organic salts. Separation and Purification Technology 98: 69 – 77. 40. Mahendranath G., Venugopalan A., Giridhar P., and Ravishanakar G.A., 2011. Improvement of Annatto Pigment Yield in Achiote Through Laminarin Spray : An Ecofriendly Approach. Int. Jr. of Agril., Env. and Biotech. 4 (2): 163 – 166. 41. Mahendranath G., Venugopalan A., Parimalan R., Giridhar P., and Ravishankar G. A., 2011. Annatto pigment production in root cultures of Achiote. Plant Cell Tiss Organ Cult 106: 517 – 522. 42. Mandal V., Mohan Y., and Hemalatha S., 2007. PHCOG REV.: Review Article Microwave Assisted Extraction – An Innovative and Promising Extraction Tool for Medicinal Plant Research. Pharmacognosy Reviews 1 (1): 7 – 18. 43. Mantovani N.C., Grando M.F., Xavier A., and Otoni W.C., 2013. Avaliação de genótipos de urucum (Bixa orellana L.) por meio dacaracterização morfológica de frutos, produtividade de sementes e teor de bixina.Ciência Florestal, Santa Maria 23 (2): 355 – 362. 44. Mao L., Xu D., Yang J., Yuan F., Gao Y. and Zhao J., 2009. Effects of Small and Large Molecule Emulsifiers on the Characteristics of beta–carotene Nanoemulsions Prepared by High Pressure Homogenization. Food Technol. Biotechnol. 47 (3): 336 – 342. 45. Marco R.D., Vieira A.M.S., Ugri M.C.A., Monteiroa A.R.G., and Bergamasco R.C., 2013. Microencapsulation of Annatto Seed Extract: Stability and Application. Chemical Engineering Transactions 32: 1777 – 1782. 46. Mason T.J, Riera E., Vercet A., and Lopez–Buesa P., 2005. Application of Ultrasound. In Emerging Technologies for Food Processing (Eds. D. Sun), Elsevier Academic Press, USA. Part 13: pp. 323 – 351. 79 47. Mc Keown G.G., and Mark E., 1962. The composition of oilsoluble annatto food colors. Journal of the Association of Official Analytical Chemists 45: 761 – 766. 48. Nobre B.P., Mendes R.L., Queiroz E.M., Pessoa F.L.P., Coelho J.P., and Palavra A.F., 2006. Supercritical carbon dioxide extraction of pigments from Bixa orellana seeds (experiments and modeling). Brazilian Journal of Chemical Engineering 23 (2): 251 – 258. 49. Pan X., Liu H., Jia G., and Shub Y.Y., 2000. Microwave–assisted extraction of glycyrrhizic acid from licorice root. Biochemical Engineering Journal 5: 173 – 177. 50. Pan X., Niu G., and Liu H., 2002. Comparison of microwave–assisted extraction and conventional extraction techniques for the extraction of tanshinones from Salvia miltiorrhiza bunge. Biochemical Engineering Journal 12: 71 – 77. 51. Parimalan R., Mahendranath G., Giridhar P., and Ravishankar G.A., 2011. Abiotic elicitor mediated augmentation of annatto pigment production in standing crop of Bixa orellana L. Indian Journal of Fundamental and Applied Life Sciences 1 (4): 229 – 236. 52. Phạm Thành Quân, Tống Văn Hằng, Nguyễn Hải Hà, Nguyễn Xuân Đề và Trương Ngọc Tuyền, 2006. Trích ly có hỗ trợ vi sóng các polyphenol từ búp trà tươi. Tạp chí phát triển KH và CN 9 (8): 69 – 75. 53. Prabhakara Rao P.G., Jyothirmayi T., Balaswamy K., Satyanarayana A., and Rao D.G., 2005. Effect of processing conditions on the stabilityof annatto (Bixa orellana L.) dye incorporated into some foods. LWT 38: 779 – 784. 54. Prabhakara Rao P.G., Satyanarayana A., and Rao D.G., 2002. Effect of Storage on the Stability of Water Soluble Annatto Dye Formulation in a Simulated Orange–RTS Beverage Model System. Lebensm.–Wiss. u.–Technol., 35 (7): 617 – 621. 55. Preston H.D. and Rickard M.D., 1980. Extraction and chemistry of annatto. Food Chemistry 5: 47 – 56. 56. Qian C., Decker E.A., Xiao H., and McClements D.J., 2012. Inhibition of beta– carotene degradation in oil–in–water nanoemulsions: Influenceof oil–soluble and water–soluble antioxidants. Food Chemistry 135: 1036 – 1043. 57. Santos D.T., Albuquerque C.L.C., and Meireles M.A.A., 2011. “11th International Congress on Engineering and Food (ICEF11)” Antioxidant dye and pigment extraction using a homemade pressurized solvent extraction system. Procedia Food Science 1: 1581 – 1588. 80 58. Satyanarayana A., Rao P.P., and Rao D.G., 2010. Influence of source and quality on the color characteristics of annatto dyesand formulations. LWT – Food Science and Technology 43: 1456 – 1460. 59. Scotter M., 2009. The chemistry and analysis of annatto food colouring: a review. Food Additives and Contaminants 26 (8): 1123 – 1145. 60. Scotter M.J., Wilson L.A., Appleton G.P., and Castle L., 1998. Analysis of Annatto (Bixa orellana) Food Coloring Formulations. 1. Determination of Coloring Components and Colored Thermal Degradation Products by High– Performance Liquid Chromatography with Photodiode Array Detection. J. Agric. Food Chem. 46: 1031−1038. 61. Silva P.I., 2007. Métodos de extração e caracterização de bixina e norbixina em sementes de urucum (Bixa orellana L.). MSc. tese, Universidade Federal de Vicosa, Viçosa, Minas Gerais, Brasil. 62. Silva H.D., Cerqueira M.A., Souza B.W.S., Ribeiro C., Avides M.C., Quintas M.A.C., Coimbra J.S.R., Carneiro–da–Cunha M.G., and Vicente A.A., 2011. Nanoemulsions of beta–carotene using a high–energy emulsification– evaporation technique. Journal of Food Engineering 102: 130 – 135. 63. Sinha K., Chowdhury S., Saha P.D., and Datta S., 2013. Modeling of microwave–assisted extraction of natural dye from seeds of Bixa orellana (Annatto) using response surface methodology (RSM) and artificial neural network (ANN). Industrial Crops and Products 41: 165 – 171. 64. Smiths J., and Wallin H., 2006. Annatto Extracts. Chemical and Technical Assessment 65th JECFA (CTA). 65. Tan C.P., and Nakajima M., 2005. Beta–carotene nanodispersions: preparation, characterization and stability evaluation. Food Chemistry 92: 661 – 671. 66. Taylor B., 2005. Fruit and juice processing. In Chemistry and Technology of Soft Drinks and Fruit Juices (P. R. Ashurst editor), 2nd edition, Blackwell Publishing Ltd., UK, p. 53. 67. Teixeira Z., and Durán N., 2008. Annatto Polymeric Microparticles: Natural Product Encapsulation by the Emulsion–Solvent Evaporation Method. Journal of Chemical Education 85 (7): 946 – 947. 68. The RaintreeGroup, 1997. Database file for annatto (Bixa orellana). August 19th 2013. 69. Vasu S., Palaniyappan V., Kothandam H.P., and Badami S., 2010. Microwave facilitated extraction of Bixin from Bixa orellana and it’s in–vitro antioxidant activity. Der Pharmacia Lettre 2 (2): 479 – 485. 81 70. Veríssimo S.A., 2003. Extração, caracterização e aplicação do corante de urucum (Bixa orellana L.). no tingimento de fibras naturais. MSc. tese, Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Tecnologia, Brasil. 71. Võ Văn Chi, Vũ Văn Chuyên, 1998. Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam – Tập 1. NXB Khoa học Hà Nội, trang 145. 72. Walmart, 2013. La Cholita Annatto Oil. August 24th 2013. <URL:–Cholita–Annatto–Oil–16.9–fl– oz/20751772> 73. WHO – World Health Organization, 1986. Ammonia – Environmental Health Criteria, No. 54. World Health Orgnization, Geneva, 1986. August 23th 2013. 74. Xu D., Wang X., Jiang J., Yuan F., Decker E.A., and Gao Y., 2013. Influence of pH, EDTA, alpha–tocopherol, and WPI oxidation on thedegradation of beta– carotene in WPI–stabilized oil–in–water emulsions. Science and Technology 54: 236 – 241. 75. Yang Y., Leser M.E., Sher A.A., and McClements D.J., 2013. Formation and stability of emulsions using a natural small molecule surfactant: Quillaja saponin (Q–NaturalR). Food Hydrocolloids 30: 589 – 596. 76. Yuan C., Du L., Jin Z., and Xu X., 2013. Storage stability and antioxidant activity of complex of astaxanthin with hydroxypropyl–beta–cyclodextrin. Carbohydrate Polymers 91: 385 – 389. 77. Zhang G., Hu M., He L., Fu P., Wang L., and Zhou J., 2013. Optimization of microwave–assisted enzymatic extraction of polyphenols from waste peanut shells and evaluation of its antioxidant and antibacterial activities in vitro. Food and Bioproducts Processing 9 (1): 158 – 168. 78. Zhang Y., and Zhong Q., 2013. Encapsulation of bixin in sodium caseinate to deliver the colorant in transparent dispersions. Food Hydrocolloids 33: 1 – 9. 79. Zheng L., and Sun D., 2005. Innovative applications of power ultrasound during food freezing processes – a review. 82 PHỤ LỤC Phụ lục 1. So sánh hiệu suất trích ly annatto của các loại dung môi a. Phụ lục 1a: So sánh hiệu suất của 4 loại dung môi không có hỗ trợ ammonia 83 b. Phụ lục 1b: So sánh hiệu suất của 3 loại dung môi có hỗ trợ ammonia 84 c. Phụ lục 1c: So sánh bắt cặp để đánh giá hiệu quả tương tác của ammonia với mỗi loại dung môi  Kết hợp với ethyl acetate: 85  Kết hợp với acetone 86  Kết hợp với ethanol 87 Phụ lục 1d: So sánh hiệu suất trích ly của chloroform với hỗn hợp dung môi ammonia + ethanol 88 Phụ lục 2. Ảnh hưởng của nồng độ ammonia đến hiệu suất trích ly annatto 89 Phụ lục 3. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly annatto 90 Phụ lục 4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / hạt đến hiệu suất trích ly annatto 91 Phụ lục 5. Ảnh hưởng của công suất vi sóng đến hiệu suất trích ly annatto 92 Phụ lục 6. Ảnh hưởng của thời gian hỗ trợ vi sóng đến hiệu suất trích ly annatto 93 Phụ lục 7. Ảnh hưởng của thời gian trích ly phụ sau khi hỗ trợ vi sóng 94 Phụ lục 8. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic dùng để kết tủa annatto 95 Phụ lục 9. Tiến độ thực hiện đề tài TT Các nội dung, công việc Thực hiện chủ yếu Sản phẩm phải đạt Thời gian (bắt đầu – kết thúc) Địa điểm thực hiện 1 2 3 4 5 1 Viết đề cương nghiên cứu Đề cương T4/2013 Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM 2 Nộp đề cương Báo cáo T8/2013 Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM 3 Báo cáo đề cương Báo cáo T9/2013 Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM 4 Chuẩn bị và đánh giá vật liệu nghiên cứu Mẫu, báo cáo T8/2013 ĐH Công nghiệp TP. HCM 5 Chọn và tối ưu nồng độ dung môi Báo cáo T9 – T10/2013 ĐH Công nghiệp TP. HCM 6 Tối ưu chế độ hỗ trợ vi sóng và tỷ lệ dung môi / nguyên liệu Báo cáo T11 – T12/2013 ĐH Công nghiệp TP. HCM 7 Tối ưu thời gian trích ly phụ Báo cáo T12/2013 ĐH Công nghiệp TP. HCM 8 Thử nghiệm khả năng tạo nhũ Báo cáo T12/2013 – T2/2014 ĐH Công nghiệp TP. HCM 9 Viết báo cáo kết quả nghiên cứu Báo cáo T3 – T4/2014 ĐH Công nghiệp TP. HCM 10 Báo cáo kết quả đề tài Báo cáo T5/2014 Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM 11 Bảo vệ luận văn tốt nghiệp Báo cáo T6/2014 Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM