Luận văn Nghiên cứu trích ly và chuyển đổi màu hạt điều màu (Bixa orellana L.) thành norbixin tạo chế phẩm bột norbixin tan trong nước

khi thực hiện thí nghiệm này. Thêm vào đó Hình 3.5 cho biết sự “thiếu phù hợp” của mô hình toán học không có ý nghĩa do giá trị 48 Prob > F là 0,0807 lớn hơn mức p = 0,05. Tóm lại có thể kết luận mô hình toán học do phần mềm JMP 9.0.2 đưa ra có thể sử dụng để biểu diễn và giải thích quan hệ giữa nồng độ hai thành phần dung môi với hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin. Bảng 3.5. Kết quả thí nghiệm CCD 2 yếu tố Nghiệm thức Mã hóa X1 – Nồng độ ethanol (0) X2 – Nồng độ NaOH (M) Hiệu suất trích ly norbixin (%) 1 −− 30 0,4 1,14 2 −+ 30 0,6 1,28 3 +− 70 0,4 1,3 4 ++ 70 0,6 1,42 5 a0 21,72 0,5 0,98 6 A0 78,28 0,5 1,11 7 0a 50 0,36 1,18 8 0A 50 0,64 1,46 9 00 50 0,5 1,78 10 00 50 0,5 1,74 11 00 50 0,5 1,72 12 00 50 0,5 1,7 13 00 50 0,5 1,8 Hình 3.4. Độ tương thích của số liệu thực nghiệm với mô hình toán học (a) và phân bố phần dư của số liệu thực nghiệm so với số liệu dự đoán (b) 49 Hình 3.5. Sự “thiếu phù hợp” của mô hình toán học Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố và tương tác giữa chúng lên đáp ứng Y được minh họa và sắp xếp trên đồ thị Pareto (Hình3.6). Theo đó, mức độ ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin theo thứ tự giảm dần như sau: tương tác X12 có ảnh hưởng lớn nhất, kế đến là tương tác X22, thứ ba là nồng độ NaOH (X2), sau đến nồng độ ethanol (X1) và cuối cùng là tương tác X1X2 ảnh hưởng không đáng kể. Như vậy nếu so sánh ảnh hưởng nồng độ của hai thành phần dung môi thì tác động của ethanol đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin quan trọng hơn NaOH. Hình 3.6. Biểu đồ Pareto thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố Dựa vào Bảng 3.6 cho thấy tương tác X1X2 ảnh hưởng không ý nghĩa đến hiệu suất Y (do chỉ số Prob >│t│lớn hơn mức p = 0,05) cho nên sẽ không có mặt trong phương trình hồi quy, nói cách khác là hai nồng độ ethanol và NaOH không tương tác với nhau trong phạm vi khảo sát. Có thể biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng Y – Hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin với hai yếu tố X1 – Nồng độ ethanol và X2 – Nồng độ NaOH bằng phương trình hồi quy như sau: 50 Y = 1,748 + 0,06X1 + 0,082X2 – 0,326X12 – 0,188X22 Bảng 3.6. Các hệ số của phương trình hồi quy Biến / tương tác giữa các biến Ước lượng Sai số chuẩn Hệ số t Prob > │t│ Intercept 1,748 0,030 57,91 < 0,0001* X1 – Nồng độ ethanol (30 – 700) 0,060 0,024 2,53 0,0390* X2 – Nồng độ NaOH (0,4 – 0,6 M) 0,082 0,024 3,44 0,0109* X1*X2 – 0,005 0,034 – 0,15 0,8864 X1*X1 – 0,326 0,026 – 12,73 < 0,0001* X2*X2 – 0,188 0,026 – 7,36 0,0002* Từ phương trình trên, bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của nồng độ hai thành phần dung môi đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin có dạng như trong Hình 3.7. Bề mặt đáp ứng có đỉnh phía trên, nghĩa là hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin cao nhất nằm trong khoảng khảo sát. Hình 3.7. Bề mặt đáp ứng thể hiện quan hệ giữa hiệu suất và nồng độ hai thành phần dung môi 51 Kết quả tối ưu dự đoán do phần mềm đề xuất (Bảng 3.7) đạt được khi nồng độ ethanol là 51,820 và nồng độ NaOH là 0,52 M, tại đó hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin ước đạt 1,76 %, tương đương hiệu suất thu hồi 82,24 %. Tại điểm tối ưu, mặt cắt của bề mặt đáp ứng có dạng như trong Hình 3.8. Bảng 3.7. Dự đoán điểm tối ưu và giá trị hai yếu tố tương ứng Yếu tố Giá trị X1 – Nồng độ ethanol (30 – 700) 51,82 X2 – Nồng độ NaOH (0,4 – 0,6 M) 0,52 Giá trị đáp ứng dự đoán: 1,76 Hình 3.8. Mặt cắt của bề mặt đáp ứng tại điểm tối ưu Sau khi tiến hành kiểm tra thực tế độ tin cậy của dự đoán điểm tối ưu bằng cách tiến hành thí nghiệm theo các thông số do phần mềm đưa ra (nồng độ ethanol 51,820 và nồng độ NaOH 0,52 M), kết quả hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin thu được từ thí nghiệm kiểm chứng thực tế là 1,70 ± 0,03 %. Sai lệch giữa số liệu kiểm tra thực nghiệm và số liệu dự đoán nhỏ hơn 5 % nên mô hình 52 do phần mềm đưa ra là chấp nhận được. Nồng độ tối ưu ethanol (51,820) và NaOH (0,52 M) sẽ được sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo và làm cơ sở xây dựng quy trình sản xuất. 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu và điều kiện ủ đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin 3.3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin Trong quá trình trích ly bằng dung môi nói chung, tìm ra tỷ lệ dung môi / nguyên liệu hợp lý là việc quan trọng. Tỷ lệ hợp lý là tỷ lệ cân đối nhằm đảm bảo hiệu suất trích ly cao đồng thời tiết kiệm dung môi. Để thăm dò ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu, nhiệt độ ủ được cố định ở 60 0C và trong thời gian 30 phút; kết quả thể hiện trên Hình 3.9. Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin Từ kết quả so sánh trung bình hiệu suất tương ứng với các tỷ lệ khác nhau bằng phương pháp Tukey’s HSD cho thấy tỷ lệ 6/1 cho hiệu suất cao nhất và khác 53 biệt có ý nghĩa với các hiệu suất tương ứng với các tỷ lệ còn lại (Phụ lục 5). Qua Hình 3.9 có thể thấy khi tỷ lệ dung môi / nguyên liệu tăng từ 4/1 đến 6/1 thì hiệu suất tăng, nhưng khi lớn hơn tỷ lệ 6/1 hiệu suất không tăng nữa mà lại có xu hướng giảm. Trong đó hiệu suất tương ứng với 3 tỷ lệ 10/1, 12/1 và 14/1 khác biệt không ý nghĩa ở mức p = 0,05. Các tác giả Pimentel (1995), Silva (2007) và Silva et al. (2010) cũng sử dụng tỷ lệ 6/1 để trích ly màu annatto bằng dung môi KOH và NH4OH + ethanol. Tóm lại, qua thí nghiệm này tỷ lệ 6/1 được chọn để làm yếu tố cố định khi tiến hành hai thí nghiệm thăm dò tiếp theo. Khoảng tỷ lệ 4/1 – 8/1 thích hợp để thiết kế và tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa tỷ lệ dung môi / nguyên liệu cùng với chế độ xà phòng hóa. 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin Phản ứng xà phòng hóa là cần thiết để chuyển hóa bixin (methyl ester của norbixin) thành muối natri norbixinate dễ tan trong nước. Hai thông số quan trọng của phản ứng xà phòng hóa là nhiệt độ và thời gian phản ứng. Trước tiên chúng tôi tiến hành thí nghiệm thăm dò ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất chuyển đổi màu thành norbixinate, với các yếu tố cố định là tỷ lệ dung môi / nguyên liệu 6/1 và ủ trong 30 phút. Kết quả thí nghiệm được biểu diễn trong Hình 3.10. Từ kết quả so sánh trung bình bằng phương pháp Tukey’s HSD cho thấy hiệu suất tại 60 0C cao nhất và khác biệt có ý nghĩa với hiệu suất ở các nhiệt độ còn lại (Phụ lục 6). Qua Hình 3.10 có thể thấy hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin tăng dần khi nhiệt độ tăng từ 30 đến 60 0C. Năm 2011, Angchotipan et al. khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng tạo xà phòng từ một biodiesel là methyl ester. Kết quả mà nhóm tác giả đạt được cũng tương tự khi lượng xà phòng tạo ra tăng dần tương ứng với nhiệt độ phản ứng tăng từ 30, 40, 50 đến 60 0C. Nếu nhiệt độ tiếp tục tăng thì hiệu suất không tăng nữa mà lại giảm nhanh. Theo Smiths và Wallin (2006), ở nhiệt độ trên 70 0C, phản ứng thoái hóa màu annatto diễn ra dẫn đến hình thành một số sản phẩm không mong muốn như sắc tố McKeown hay còn gọi là sắc tố C17. Đây là nguyên nhân làm giảm hàm lượng 54 norbixin trong thí nghiệm này khi nhiệt độ ủ cao hơn 60 0C. Tóm lại từ kết quả thăm dò này, nhiệt độ ủ 60 0C được chọn để tiến hành thí nghiệm thăm dò ảnh hưởng của thời gian ủ và khoảng nhiệt độ 50 – 70 0C thích hợp để thiết kế và thực hiện thí nghiệm tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng. Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin 3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin Thời gian ủ hợp lý không chỉ giúp phản ứng chuyển hóa bixin thành norbixin diễn ra triệt để mà còn bảo vệ màu khỏi bị thoái hóa khi tiếp xúc với nhiệt độ cao trong thời gian quá dài. Để tiến hành thí nghiệm thăm dò này, tỷ lệ dung môi / nguyên liệu được cố định là 6/1, còn nhiệt độ ủ là 60 0C, kết quả được thể hiện trên Hình 3.11. Từ kết quả so sánh trung bình bằng phương pháp Tukey’s HSD cho thấy hiệu suất tương ứng với thời gian ủ 30 phút là cao nhất và khác biệt có ý nghĩa với hiệu suất ở các mức thời gian khác (Phụ lục 7). Qua biểu đồ trên Hình 3.11 có thể thấy hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin tăng nhẹ khi thời gian ủ tăng từ 10 lên 20 phút, trong thời gian ngắn như vậy phản ứng chuyển đổi màu xảy 55 ra chưa triệt để. Nhưng khi tăng lên tới 30 phút thì hiệu suất tăng lên rõ rệt. Nếu thời gian quá dài (trên 40 phút) hiệu suất lại giảm do bản chất màu annatto là carotenoid dễ bị thoái hóa trong điều kiện nhiệt độ cao kéo dài. Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin 3.3.4. Tối ưu hóa tỷ lệ dung môi / nguyên liệu và điều kiện phản ứng xà phòng hóa Từ kết quả thăm dò từ ba thí nghiệm trước, khoảng khảo sát ba yếu tố độc lập là tỷ lệ dung môi / nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian ủ thể hiện trong Bảng 3.8. Bảng 3.8. Mức khảo sát của 3 yếu tố Yếu tố Mức khảo sát –α –1 0 +1 +α Tỷ lệ dung môi / nguyên liệu 2,64 4 6 8 9,36 Nhiệt độ ủ (0C) 43,2 50 60 70 76,8 Thời gian ủ (phút) 13,18 20 30 40 46,82 56 Sau khi tiến hành thí nghiệm với thứ tự ngẫu nhiên, kết quả được tổng hợp trong Bảng 3.9. Bảng 3.9. Kết quả thí nghiệm CCD 3 yếu tố Nghiệm thức Mã hóa X1 − Tỷ lệ dung môi / hạt X2 − Nhiệt độ ủ (0C) X3 − Thời gian ủ (phút) Y − Hiệu suất trích ly norbixin (%) 1 −−− 4 50 20 1,03 2 −−+ 4 50 40 1,17 3 −+− 4 70 20 0,83 4 −++ 4 70 40 0,98 5 +−− 8 50 20 1,46 6 +−+ 8 50 40 1,57 7 ++− 8 70 20 1,34 8 +++ 8 70 40 1,46 9 a00 2,64 60 30 0,85 10 A00 9,36 60 30 1,59 11 0a0 6 43,2 30 1,38 12 0A0 6 76,8 30 1,28 13 00a 6 60 13,18 0,98 14 00A 6 60 46,82 1,6 15 000 6 60 30 1,8 16 000 6 60 30 1,69 17 000 6 60 30 1,78 18 000 6 60 30 1,82 19 000 6 60 30 1,75 20 000 6 60 30 1,82 57 Nhìn chung kết quả trong Bảng 3.9 cho thấy các nghiệm thức tại tâm cho hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin cao hơn cả (từ nghiệm thức 15 đến 20). Đây là dấu hiệu cho biết điểm tối ưu có thể nằm gần tâm khảo sát. Sau khi tiến hành phân tích kết quả bằng phần mềm JMP 9.0.2, chúng tôi thu được kết quả phân tích số liệu chi tiết và lần lượt liệt kê sau đây. Hình 3.12. Độ tương thích của số liệu thực nghiệm với mô hình toán học (a) và phân bố phần dư của số liệu thực nghiệm so với số liệu dự đoán (b) Giá trị thực nghiệm và giá trị dự đoán theo mô hình toán học có độ tương thích cao, thể hiện ở giá trị R2 = 0,97 và hình ảnh trực quan trong Hình 3.12a, các điểm thực nghiệm phân bố gần đường chéo trên biểu đồ và đại đa số giá trị nằm trong khoảng biên độ sai số 5 %. Như vậy, có 97 % giá trị thực nghiệm có thể biểu diễn bởi mô hình toán học do phần mềm đề xuất. Các điểm trong biểu đồ phân bố phần dư sắp xếp không có quy luật (Hình 3.12b) chứng tỏ là sai số thực nghiệm là ngẫu nhiên, không có sai số hệ thống khi thực hiện thí nghiệm này. Thêm vào đó kết quả trong Hình 3.13 cho biết sự “thiếu phù hợp” của mô hình toán học không có ý nghĩa do giá trị Prob > F là 0,0626 lớn hơn mức p = 0,05. Tóm lại mô hình toán học do phần mềm JMP 9.0.2 đưa ra có thể sử dụng để biểu diễn và giải thích quan hệ giữa tỷ lệ dung môi / nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian ủ với hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin. 58 Hình 3.13. Sự “thiếu phù hợp” của mô hình toán học Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố cũng như tương tác giữa chúng lên đáp ứng Y được minh họa và sắp xếp trên đồ thị Pareto (Hình 3.14). Theo đó, mức độ ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin như sau: X1 – tỷ lệ dung môi / hạt ảnh hưởng mạnh nhất, tương tác X32 ảnh hưởng ít hơn xếp thứ hai, tiếp theo là tương tác X12 và X22, sau đó mới là thời gian ủ X3 và nhiệt độ ủ X2, 3 cặp tương tác từng đôi của 3 yếu tố ảnh hưởng không đáng kể đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin. Như vậy nếu so sánh ảnh hưởng của 3 yếu tố thì tác động của tỷ lệ đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin quan trọng hơn thời gian ủ, còn nhiệt độ ủ ít ảnh hưởng nhất trong số 3 yếu tố khảo sát. Hình 3.14. Biểu đồ Pareto thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố Từ Bảng 3.10 cho thấy cả ba cặp tương tác X1X2, X1X3 và X2X3 đều ảnh hưởng không có ý nghĩa đến hiệu suất Y (do chỉ số Prob >│t│ lớn hơn mức p = 0,05) nên sẽ vắng mặt trong phương trình hồi quy. Dựa vào giá trị các hệ số có ý nghĩa còn lại trong Bảng 3.10, có thể biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng Y – Hiệu 59 suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin với 3 yếu tố X1 – Tỷ lệ dung môi / hạt, X2 – Nhiệt độ ủ và X3 – Thời gian ủ bằng phương trình hồi quy như sau: Y = 1,777 + 0,224X1 – 0,058X2 + 0,114X3 – 0,201X12– 0,162X22 – 0,176X32 Bảng 3.10. Các hệ số của phương trình hồi quy Biến / tương tác giữa các biến Ước lượng Sai số chuẩn Hệ số t Prob > │t│ Intercept 1,777 0,034 52,57 < 0,0001* X1 – Tỷ lệ dung môi / hạt (4 – 8) 0,224 0,022 10,00 < 0,0001* X2 – Nhiệt độ ủ (50 – 70 0C) – 0,058 0,022 – 2,57 0,0278* X3 – Thời gian ủ (20 – 40 phút) 0,114 0,022 5,10 0,0005* X1*X2 0,02 0,029 0,68 0,5105 X1*X3 – 0,0075 0,029 – 0,26 0,8032 X2*X3 0,0025 0,029 0,09 0,9337 X1*X1 – 0,201 0,022 – 9,20 < 0,0001* X2*X2 – 0,162 0,022 – 7,42 < 0,0001* X3*X3 – 0,176 0,022 – 8,07 0,0001* Từ phương trình trên, bề mặt đáp ứng tương ứng với từng cặp yếu tố được thể hiện trong Hình 3.15, 3.16 và 3.17, các bề mặt đáp ứng có đỉnh phía trên, nghĩa là hiệu suất cao nhất nằm trong khoảng khảo sát. 60 Hình 3.15. Bề mặt đáp ứng thể hiện tương quan giữa hiệu suất đối với nhiệt độ ủ và tỷ lệ dung môi / hạt Hình 3.16. Bề mặt đáp ứng thể hiện tương quan giữa hiệu suất đối với thời gian ủ và tỷ lệ dung môi / hạt 61 Hình 3.17. Bề mặt đáp ứng thể hiện tương quan giữa hiệu suất đối với nhiệt độ và thời gian ủ Bảng 3.11. Dự đoán điểm tối ưu và giá trị ba yếu tố tương ứng Yếu tố Giá trị X1 – Tỷ lệ dung môi / hạt (4 – 8) 7,09 X2 – Nhiệt độ ủ (50 – 70 0C) 58,58 X3 – Thời gian ủ (20 – 40 phút) 33,12 Giá trị đáp ứng dự đoán: 1,86 Kết quả tối ưu dự đoán do phần mềm đề xuất (Bảng 3.11) đạt được khi tỷ lệ dung môi / hạt là 7,1/1, nhiệt độ ủ 58,58 0C và thời gian ủ là 33,12 phút, khi đó hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin ước đạt 1,86 %; tương đương hiệu suất thu hồi 86,92 %. Thông số tối ưu này cũng phù hợp với khuyến cáo của Nachtigall et al. (2009) rằng khi thực hiện phản ứng xà phòng hóa bixin thành norbixin không nên nâng nhiệt độ lên quá cao trong thời gian dài, nhiệt độ nên dưới 62 70 0C và thời gian nên ngắn hơn 1 giờ, bởi vì nhiệt độ cao kéo dài không làm tăng hiệu suất mà còn tốn kém thời gian cũng như chi phí năng lượng gia nhiệt. Tại điểm tối ưu, mặt cắt của bề mặt đáp ứng có dạng như trong Hình 3.18. Hình 3.18. Mặt cắt của bề mặt đáp ứng tại điểm tối ưu Sau khi tiến hành kiểm tra thực tế độ tin cậy của dự đoán điểm tối ưu bằng cách tiến hành thí nghiệm theo các thông số do phần mềm gợi ý (tỷ lệ dung môi / hạt 7,1/1; nhiệt độ ủ 58,6 0C và thời gian ủ 33,12 phút), kết quả thu được hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin là 1,82 ± 0,03 %. Sai lệch giữa số liệu kiểm tra thực nghiệm và số liệu dự đoán nhỏ hơn mức 5 % nên mô hình do phần mềm đưa ra là đáng tin cậy. Các thông số đã tối ưu hóa sẽ được sử dụng để tiến hành trích ly thu dịch trích sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Quá trình thực hiện thí nghiệm trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin ở điều kiện tối ưu được minh họa qua Hình 3.19. 63 Hình 3.19. Quá trình trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin (a: khuấy trích ly, b: bã hạt sau trích ly, c: dịch trích sau khi lọc, d: dịch trích đã ủ) 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ acid HCl để kết tủa norbixin tự do Khi để ống nghiệm chứa 20 mL dịch trích ly ở điều kiện nhiệt độ 0 0C, sau 1 giờ quan sát thấy không có lớp chất béo và sáp nổi lên, chứng tỏ dịch trích ly bằng hỗn hợp dung môi ethanol + NaOH không có hoặc có rất ít chất béo và sáp. Nguyên nhân có thể là ở điều kiện ủ tối ưu, phản ứng xà phòng hóa xảy ra thuận lợi nên phần lớn chất béo và sáp đã bị xà phòng hóa thành muối natri của acid béo tương ứng và glycerol hoặc alcohol chuỗi dài. Do vậy, có thể bỏ qua bước loại béo và sáp để chuyển sang công đoạn tách norbixin tự do ra khỏi dịch trích ly. Do giá trị HLB của norbixin tự do nhỏ hơn nhiều so với 7 (HLB = 2,65) nên rất khó tan trong nước đặc biệt là nước có pH thấp. Vì vậy, có thể ứng dụng tính chất này để tách norbixin tự do ra khỏi dịch trích ly bằng cách trung hòa hoặc acid hóa dịch trích. Trước khi tiến hành khảo sát nồng độ acid HCl thích hợp, các loại acid thông dụng đã được khảo sát sơ bộ gồm H2SO4, HNO3, HCl, H3PO4, HCOOH, 64 CH3COOH và acid citric. Acid HCl được chọn do khả năng tạo tủa nhanh, ít làm mất màu norbixin và quan trọng nhất là kết tủa thu được có thể hoàn nguyên trong dung dịch kiềm (KOH 0,5 %). Kết quả này phù hợp với phương pháp của Dinda et al. (2008) khi nhóm tác giả sử dụng acid HCl loãng để kết tủa norbixin thu được sau khi trích ly bằng dung môi KOH 5 %. Với 5 g dịch trích ly ở mỗi nghiệm thức, kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích acid HCl 36 % lên hiệu suất thu hồi norbixin được thể hiện trong Hình 3.20. Hình 3.20. Ảnh hưởng của thể tích acid HCl 36 % đến hiệu suất thu hồi norbixin Từ kết quả so sánh trung bình bằng phương pháp Tukey’s HSD (Phụ lục 8) cho thấy thể tích acid HCl đậm đặc kết tủa norbixin tốt nhất là 0,5 mL và khác biệt có ý nghĩa với hiệu suất thu hồi khi sử dụng các thể tích HCl khác ở mức p = 0,05. Với lượng dịch trích trong mỗi nghiệm thức là 5 g (5,43 mL) thì 0,5 mL HCl 36 % khi hòa tan vào dịch trích tương đương với nồng độ 1 M. Qua tham khảo tài liệu cho thấy màu annatto chủ yếu được kết tủa bằng acid H2SO4 và HCl. Nhưng khi tiến hành thăm dò khả năng tủa norbixin bằng H2SO4 thì hiệu suất thu hồi chỉ đạt hơn 10 % dù acid đã được pha loãng trước khi sử dụng nhằm tránh sinh nhiệt khi hòa tan acid H2SO4 đặc vào nước. Lý do có thể là ngoài tính acid mạnh, acid sulfuric còn có khả năng oxy hóa nên dễ biến đổi màu norbixin, vốn là một carotenoid rất nhạy cảm với sự oxy hóa. Tóm lại từ kết quả thí nghiệm này, nồng độ 65 acid HCl 1 M (tương đương 9,2 % thể tích acid HCl 36 % so với thể tích dịch trích) được chọn để tách norbixin tự do ra khỏi dịch trích. Hình 3.21 minh họa thí nghiệm kết tủa norbixin bằng acid HCl ở nồng độ 1 M. Hình 3.21. Dịch trích ly ban đầu (trái) và dịch trích ly đang kết tủa sau 30 phút acid hóa (phải) 3.5. Tỷ lệ chất trợ tan phù hợp để tạo chế phẩm bột norbixin tan trong nước 3.5.1. Khả năng hòa tan của bột tủa norbixin trong nước ở pH khác nhau Sau khi acid hóa dịch trích ly bằng HCl 1 M sẽ thu được kết tủa norbixin, ly tâm thu tủa rồi rửa lại 3 lần bằng nước cất, sau đó sấy khô ở 50 0C trong 5 giờ (Pimentel, 2005; Dinda et al., 2008; Phan Thục Uyên, 2012). Kết tủa khô màu nâu đỏ được nghiền thành bột mịn lọt hoàn toàn qua sàng 0,08 mm (Hình 3.22). Các chỉ tiêu cơ bản của bột tủa norbixin như sau: độ ẩm 7,6 ± 0,3 %, hàm lượng norbixin 44,25 ± 0,26 %. Độ ẩm chế phẩm bột norbixin trong khoảng 4 – 8 % là đạt yêu cầu theo quy trình sản xuất chế phẩm annatto quy mô công nghiệp của nhà máy Cusco ở Peru (Hyman et al., 1990). Hàm lượng màu trong bột tủa norbixin thu được cao hơn so với yêu cầu của QCVN 4–10:2010/BYT là 35 % và mong muốn 40 % của chế phẩm annatto F theo phân loại của FAO JECFA (Smith và Wallin, 2006). Hình 3.22. Bột tủa norbixin 66 Sử dụng 0,1 g bột tủa norbixin cho mỗi nghiệm thức để tiến hành khảo sát khả năng hòa tan trong nước của bột tủa norbixin ở các giá trị pH khác nhau, kết quả thể hiện trong Hình 3.23. Hình 3.23. Tỷ lệ norbixin hòa tan trong nước ở pH khác nhau Sau khi so sánh trung bình tỷ lệ tan của norbixin ở pH khác nhau bằng phương pháp Tukey’s HSD cho thấy chỉ có ở pH 5 và 6 tỷ lệ tan khác biệt không ý nghĩa, còn lại tỷ lệ tan khác biệt có ý nghĩa từng cặp (Phụ lục 9). Như vậy bột tủa norbixin rất khó tan trong nước ở pH dưới 7, còn ở pH trên 7 thì tỷ lệ tan tỷ lệ thuận với giá trị pH. Kết quả thí nghiệm đúng với các thông tin đã tham khảo về khả năng hòa tan của bột tủa norbixin trong nước (Dinda et al., 2008), lý do là norbixin tự do trong bột tủa có mạch carbon dài kỵ nước, cụ thể giá trị HLB là 2,65 thấp hơn nhiều so với 7. Ở pH kiềm, norbixin tự do – thực chất là một acid hữu cơ yếu có hai nhóm – COOH phản ứng với NaOH tạo thành muối dinatri norbixinate có giá trị HLB rất lớn so với 7 (36,65) nên tan hoàn toàn trong nước tạo màu cho dung dịch (Silva, 2007). pH của nước càng cao tương ứng với nồng độ NaOH càng lớn dẫn đến dinatri norbixinate sinh ra nhiều, từ đó cho màu dung dịch đậm hơn (Hình 3.24). 67 Hình 3.24. Khả năng hòa tan của bột tủa norbixin ở pH khác nhau 3.5.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất trợ tan Na2CO3 Yêu cầu của chất trợ tan phù hợp với bột tủa norbixin là phải tạo được pH cao khi hòa tan trong nước và/hoặc tạo muối norbixinate dễ tan. Đó phải là muối của kim loại kiềm (Na+ hoặc K+) và gốc acid yếu (CO32-, S2-). Thích hợp nhất trong trường hợp này là Na2CO3 và K2CO3 bởi đây là phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm (mã số E500 và E501) với liều thu nạp ADI không giới hạn và giới hạn sử dụng cao trong thực phẩm, tới 50 g/kg (QCVN 4–3:2010/BYT). Na2CO3 được chọn để tiến hành thí nghiệm lựa chọn tỷ lệ phối chất trợ tan. Phương pháp xác định tỷ lệ norbixin hòa tan tương tự thí nghiệm khảo sát khả năng hòa tan của bột tủa norbixin trong nước ở pH khác nhau (xem Mục 3.6). Kết quả thí nghiệm được biểu diễn trong Hình 3.25. Hình 3.25. Ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng Na2CO3 / bột tủa norbixin đến tỷ lệ hòa tan norbixin 68 Từ kết quả so sánh trung bình bằng phương pháp Tukey’s HSD (Phục lục 10) cho thấy tỷ lệ tan của norbixin tương ứng với tỷ lệ phối trộn Na2CO3 khác nhau là khác nhau có ý nghĩa ở mức p = 0,05. Trong đó tỷ lệ phối trộn 1/1 cho tỷ lệ tan cao nhất xấp xỉ 100 %. Như vậy, từ kết quả thí nghiệm này, tỷ lệ phối trộn Na2CO3 / bột tủa norbixin là 1/1 được chọn để điều chế chế phẩm bột norbixin tan trong nước. 3.6. Quy trình và giá thành sản xuất thử nghiệm chế phẩm bột norbixin Từ kết quả các thí nghiệm trên, quy trình sản xuất thử nghiệm 1 kg chế phẩm bột norbixin 22 % màu được tóm tắt trong Hình 3.26. Từ quy trình trong Hình 3.26, giá thành tạm tính để sản xuất thử nghiệm 1 kg chế phẩm bột norbixin 22 % màu theo thời giá tháng 9/2013 được kê chi tiết trong Bảng 3.12. Chi phí lớn nhất là nguyên liệu hạt điều màu và ethanol. Như vậy, giá thành sản xuất 1 kg chế phẩm bột norbixin 22 % màu khoảng 1 532 884 đồng. Hình 3.26. Quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm bột norbixin tan trong nước 69 Bảng 3.12. Giá thành sản xuất thử nghiệm 1 kg chế phẩm bột norbixin STT Nguyên vật liệu ĐVT Số lượng Đơn giá (vnd) Chi phí (vnd) 1 Hạt điều màu khô (10 % ẩm) kg 12 60 000 720 000 2 NaOH 96 % kg 1,76 10 900 19 184 3 Cồn 960 L 45,6 12 500 570 000 4 HCl 36 % L 7,5 2 800 21 000 5 Na2CO3 99 % kg 0,5 5 400 2 700 6 Năng lượng, điện, nước 100 000 7 Công lao động và chi phí khác 100 000 8 Giá thành 1 đơn vị chế phẩm kg 1 1 532 884 3.7. Chất lượng của chế phẩm bột norbixin Sau khi tiến hành sản xuất thử nghiệm theo quy trình trong Hình 3.26, chế phẩm bột norbixin thu được như trong Hình 3.27. Kết quả phân tích các chỉ tiêu quan trọng của chế phẩm lần lượt được trình bày dưới đây. Hình 3.27. Chế phẩm bột norbixin sản xuất thử nghiệm 3.7.1. Hàm lượng màu norbixin trong chế phẩm bột norbixin Hàm lượng màu norbixin trong chế phẩm bột norbixin của chúng tôi là 22,1 ± 0,13 %, cao hơn hàm lượng 14 % trong chế phẩm bột norbixin cùng loại của tác giả Satyanarayana et al. (2010), và cũng cao hơn hàm lượng 11,24 % trong chế phẩm của Balaswamy et al. (2012) và Mala et al. (2013). Hàm lượng norbixin cao 70 có nhiều lợi ích như tăng giá trị của chế phẩm và giảm khối lượng vận chuyển do tỷ lệ tạp chất giảm xuống. 3.7.2. Hàm lượng kim loại nặng trong chế phẩm bột norbixin Theo kết quả kiểm nghiệm mã số KT3–03398TP3, ngày 1/10 (Phụ lục 11) của Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn chất lượng 3, không phát hiện chì, thủy ngân và arsen trong chế phẩm bột norbixin gửi phân tích. So với Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm – Phẩm màu (QCVN 4–10:2010/BYT) là đạt yêu cầu về độ tinh khiết. Quy chuẩn của Việt Nam tương đồng với tiêu chuẩn do Ủy ban liên hiệp chuyên gia FAO–WHO về phụ gia thực phẩm ban hành năm 2006 trong FAO JECFA Monographs 3. Ngoài kim loại nặng, dư lượng các hóa chất sử dụng trong quy trình sản xuất thử nghiệm không đáng lo ngại bởi vì NaOH đã bị trung hòa hoàn toàn bởi lượng HCl dư trong công đoạn acid hóa. Muối NaCl tạo ra đã bị rửa trôi trong công đoạn rửa kết tủa bằng nước, nếu NaCl còn dư cũng không đáng lo ngại bởi đó là gia vị thực phẩm an toàn. Còn riêng ethanol và HCl tồn dư trong kết tủa, phần lớn sẽ bay hơi khi sấy kết tủa ở nhiệt độ 50 0C trong vài giờ. 3.7.3. Khả năng hòa tan trong nước Do lượng sử dụng màu norbixin trong thực phẩm không cao, chỉ khoảng 1 – 10 ppm (Lê Thị Anh Đào và ctv, 2002) hoặc cao hơn từ 10 – 50 ppm (Emerton và Choi, 2008; Balaswamy et al., 2012) nên cần phải pha loãng với nước trước khi phối màu cho thực phẩm. Như đã đề cập trong phần 1.2.4, do chế phẩm annatto tan trong nước dạng truyền thống không chịu được pH thấp nên không thể dùng cho thực phẩm dạng lỏng trong suốt có tính acid như nước ép không có thịt quả, nhưng lại rất thích hợp đối với thực phẩm dạng rắn và bán rắn. Các loại thực phẩm có thể phối màu bằng chế phẩm phụ gia norbixin tan trong nước bao gồm vỏ xúc xích, xúc xích, pudding, tương cà, tương ớt, ngũ cốc ăn sáng, món tráng miệng chứa bơ sữa, độn chocolate, cá xông khói và thức ăn cho vật nuôi (Smiths và Wallin, 2006). 71 Chế phẩm bột norbixin dễ tan trong nước theo phân loại của Santos (2003). Thời gian cần thiết để hòa tan hoàn toàn 0,4 % (w/v) bột norbixin trong nước ở tốc độ khuấy 100 v/p là 3 ± 0,4 phút. Chế phẩm màu tan nhanh trong nước là một ưu điểm giúp người sử dụng chế phẩm tiết kiệm thời gian chuẩn bị trước khi phối màu cho sản phẩm cuối cùng. 3.8. Sử dụng chế phẩm bột norbixin để phối màu sữa chua Một ưu điểm của màu annatto là dễ tạo phức bền với protein hoặc tinh bột, làm cho sản phẩm bền màu và hạn chế hiện tượng trôi màu. Do đó từ lâu màu annatto đã được sử dụng chủ yếu cho sản phẩm chế biến từ sữa, đặc biệt là phô mai. Hơn 70 % chế phẩm annatto nhập khẩu vào các nước là để phối màu cho sản phẩm phô mai (Venugopalan et al., 2011). Sở dĩ sản phẩm sữa chua được chọn trong nghiên cứu này do tính phổ biến trên thị trường, được nhiều đối tượng khách hàng ưu thích và có lợi cho sức khỏe nhất là hệ tiêu hóa. Thông thường chế phẩm annatto nói chung cho màu bắt mắt ở nồng độ khá thấp, chỉ từ 1 – 10 ppm (Lê Thị Anh Đào và ctv, 2002). Hình 3.28. Sữa chua được phối màu bằng chế phẩm bột norbixin Kết quả đánh giá theo phương pháp cảm quan cho điểm 6 mẫu sữa chua với 100 người thử được thể hiện trong Bảng 3.13 và Phụ lục 12. Qua đó cho thấy điểm 72 cảm quan của 2 mẫu 1 ppm và 3 ppm cao hơn cả và khác biệt có ý nghĩa với 4 mẫu còn lại ở mức p = 0,05. Trong đó mẫu 1 ppm có điểm trung bình cao nhất là 4,7 với độ lệch chuẩn 1,33; đạt loại khá (điểm trên 3,8) theo phân loại chất lượng thực phẩm trong TCVN 3215–79. Tương tự, mẫu 3 ppm cũng đạt loại khá nhưng điểm trung bình thấp hơn (4,28). Các mẫu 2, 4 và 5 ppm đều xếp loại trung bình (điểm từ 2,8 đến 3,8). Còn lại mẫu đối chứng (0 ppm) đạt được điểm ưa thích trung bình thấp nhất (2,53) xếp loại kém. Như vậy, sữa chua được phối màu da cam bằng chế phẩm bột norbixin được ưa chuộng hơn so với sữa chua trắng phổ biến trên thị trường. Hơn nữa sữa chua màu cam nhạt ở nồng độ norbixin thấp (1 ppm) được ưa chuộng hơn cả, bên cạnh đó cũng có một bộ phận người thử ưa thích màu cam đậm hơn (3 ppm). Bảng 3.13. Kết quả đánh giá cảm quan cho điểm 6 mẫu sữa chua Nồng độ norbixin (ppm) Điểm cảm quan 0 2,53b ± 1,65 1 4,7a ± 1,33 2 3,23b ± 1,72 3 4,28a ± 1,19 4 3,2b ± 1,62 5 3,05b ± 1,69 Ghi chú: các giá trị được kèm theo sau ký tự giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa ở mức p = 0,05 Như vậy, có thể kết luận chế phẩm bột norbixin thích hợp để tạo màu cho sữa chua, cho màu da cam ngay ở nồng độ thấp và đạt được sự ưa thích của người sử dụng. Hàm lượng màu thích hợp là 1 ppm theo kết quả đánh giá cảm quan cho điểm đối với phân khúc người tiêu dùng trẻ tuổi. Nếu tính theo giá thành sản xuất thử nghiệm chế phẩm bột màu norbixin là 1 532 884 đồng/kg thì 1 hũ sữa chua 100 g cần 0,7 đồng chi phí phẩm màu. 73 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài đã hoàn thành được các mục tiêu, nội dung đề ra và có thể tổng kết một cách khái quát như sau: – Màu annatto trong hạt điều màu ở Việt Nam có thể được trích ly và chuyển đổi thành norbixin bằng dung môi ethanol kiềm hóa bằng NaOH. Hiệu suất thu hồi đạt cao nhất là 87 % trong các điều kiện như sau: nồng độ ethanol 51,820; nồng độ NaOH 0,52 M; tỷ lệ dung môi / nguyên liệu là 7,1/1; nhiệt độ và thời gian ủ lần lượt là 58,6 0C và 33,12 phút. – Sau khi trích ly, norbixin tự do có thể được tách ra khỏi dịch trích ly bằng phương pháp acid hóa. Acid HCl nồng độ 1 M (hay 9,2 % thể tích HCl đậm đặc so với thể tích dịch trích) là thích hợp nhất để kết tủa thu hồi norbixin tự do. Sau khi sấy kết tủa ở 50 0C đã thu được bột kết tủa với 44,25 % norbixin. – Bột kết tủa norbixin có thể được chế biến thành chế phẩm màu tan được trong nước bằng cách phối trộn với chất trợ tan Na2CO3 theo tỷ lệ 1/1 (w/w). Chế phẩm tạo thành có hàm lượng norbixin là 22,1 %; không chứa kim loại nặng và tan nhanh trong nước nên dễ ứng dụng trong các sản phẩm thực phẩm có chứa hàm lượng nước khá lớn. ĐỀ NGHỊ Để kết quả nghiên cứu có hướng triển khai ứng dụng vào thực tiễn, đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn cho cây điều màu và góp phần tạo ra những sản phẩm thực phẩm an toàn, đề nghị: – nghiên cứu, khảo sát độ bền màu norbixin trong chế phẩm dạng bột và sản phẩm sữa chua; – tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm bột norbixin; và – nghiên cứu, khảo sát khả năng ứng dụng chế phẩm bột norbixin trên các loại thực phẩm khác như bánh, kẹo, mứt, kem, snack, ... 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abramovicˇ H., Jamnik M., Burkan L. and Kac M., 2008. Water activity and water content in Slovenian honeys. Food Control 19: 1086–1090. 2. Amaral L.I.V., Cortelazzo Â.L., Buckeridge M.S., Pereira L.A.R. and Pereira M.F.D.A., 2009. Anatomical and biochemical changes in the composition of developing seed coats of annatto (Bixa orellana L.). Trees 23: 287–293. 3. Angchotipan K., Congkumnert W., Ratanawilai S. and Thongurai C., 2011. Effect of temperatures, potassium hydroxide and potassium metoxide on saponification of biodiesel. The 5th PSU – UNS International Conference on Engineering and Technology (ICET–2011), Phuket, Thailand, 2–3 May 2011. Prince of Songkla University, Faculty of Engineering Hat Yai, Songkhla, Thailand. 4. Aparnathi K.D. and Sharma R.S., 1991. Annatto colour for food: a review. Indian Food Packer 45: 13–27. 5. Balaswamy K., Prabhakara Rao P.G., Prabhavathy M.B. and Satyanarayana A., 2012. Application of annatto (Bixa orellana L.) dye formulations in Indian traditional sweetmeats: Jilebi and jangri. Indian Journal of Traditional Knowledge 11 (1): 103–108. 6. Balaswamy K., Prabhakara Rao P.G., Satyanarayana A. and Rao D.G., 2006. Stability of bixin in annatto oleoresin and dye powder during storage. LWT 39: 952–956. 7. Barbosa M.I.M.J., Borsarelli C.D. and Mercadante A.Z., 2005. Light stability of spray–dried bixin encapsulated with differentedible polysaccharide preparations. Food Research International 38: 989–994. 8. Bareth A., Strohmar W. and Kitzelmann E., 2002. HPLC and spectrophotometric determination of annatto in cheese. Eur. Food. Res. Technol. 215: 359–364. 9. Batista C.L.L.C., 1994. Produção e avaliação da estabilidade de corante hidrossolúvel de urucum. MCi. dissertação, Universidade Federal de Viçosa (UFV), Brasil. 10. Biocon del Peru, 2013. Norbixin water miscible. 24th August 2013. <URL: bixin_water_miscible.html> 75 11. Bộ Khoa học và Công nghệ, 2002. TCVN 7038:2002 (ISO 928:1997) Gia vị – Xác định tro tổng số. 12. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2004. 10TCN 592 – 2004: Ngũ cốc và đậu đỗ – Thóc tẻ – Yêu cầu kỹ thuật và Phương pháp thử. 13. Bộ Y tế, 2010. Phụ lục 24: Quy định kỹ thuật và phương pháp thử đối với cao annatto. Trong QCVN 4–10:2010/BYT – Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm – phẩm màu, trang 78–80. 14. Bộ Y tế, 2010. Phụ lục 1: Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử đối với natri carbonat. Trong QCVN 4–3:2010/BYT – Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm – chất tạo xốp, trang 15–16. 15. Bùi Thị Mỹ Lệ, 2012. Nghiên cứu chiết tách phẩm nhuộm màu annatto theo độ chín của hạt điều nhuộm ở Gia Lai. Luận văn thạc sĩ khoa học, ĐH Đà Nẵng. 16. Campbell N., Harvey D., Clowes R. and Kowalski A.J., 2009. Calometric Measurement of Saponification Reaction of Sunflower Seed Oil. Atlas Application Note – Atlas 11 – Saponification with Atlas, 7 pages. 17. Cardarelli C.R., Benassi M.T. and Mercadante A.Z., 2008. Characterization of different annatto extracts based on antioxidant and colour properties. LWT – Food Science and Technology 41: 1689–1693. 18. Chengaiah B., Mallikarjuna Rao K., Mahesh Kumar K., Alagusundaram M. and Madhusudhana Chetty C., 2010. Medicinal importance of natural dyes – a review. International Journal of PharmTech Research 2 (1): 144–154. 19. Dendy D.A.V., 1966. Annatto, the pigment of Bixa orellana. East Aft. Agr. Forest J. 32 (2): 126–132. 20. Dinda S.C., Mukherjee B., Damodharan N. and Barik B.B., 2008. Annatto seed color as natural coloring agent in oral dosage forms. Int. J. Pharm. Sci. Tech. 1 (1): 10–14. 21. Downham A. and Collins P., 2000. Colouring our foods in the last and next millennium. International Journal of Food Science and Technology 35: 5– 22. 22. Đào Hùng Cường và Phan Thảo Thơ, 2008. Nghiên cứu chiết tách phẩm màu hạt điều nhuộm bằng dung dịch kiềm. Tạp chí Hóa học và ứng dụng 12 (84). 23. Đỗ Tất Lợi, 2006. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nxb Y học, Hà Nội, trang 203. 24. Emerton V. and Choi E., 2008. Essential guide to food additives. 3rd edition, Leatherhead Publishing, Leatherhead Food International, Ltd., UK., p. 123. 76 25. FAO JECFA, 2006. Compendium of food additive specifications – FAO JECFA Monograph 3. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, 2006., p. 3. 26. FAO JECFA, 2006. Combined compendium of food additive specifications – JECFA monograph 1 – Vol. 4 – Analytical methods, test procedures and laboratory solutions used by and referenced in the food additive specifications. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, 2006., p. 200. 27. Garcia C.E.R., Bolognesi V.J., Dias J.F.G., Miguel O.G. and Costa C.K., 2012. Carotenoids bixin and norbixin from annatto (Bixa orellana L.) as antioxidants in meat products. Ciência Rural, Santa Maria 42 (8): 1510– 1517. 28. Giridhar P. and Parimalan R., 2010. A biotechnological perspective towards improvement of annatto color production for value addition – the influence of biotic elicitors. Asian Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 18 (1): 77–79. 29. Hallagan J.B., Allen D.C. and Borzelleca J.F., 1995. The Safety and Regulatory Status of Food, Drug and Cosmetics Colour Additives Exempt from Certification. Fd. Chem. Toxic. 33 (6): 515–528. 30. Haque M., 2011. Evaluation of Natural Colour from Annatto Seeds for Pharmaceutical Use. MSc. thesis, Rajiv Gandhi University of Health Sciences, Karnataka, Bangalore, India. 31. Hyman E.L., Chavezt R.J. and Skibiak J., 1990. Reorienting Export Production to Benefit Rural Producers: Annatto Processing in Peru. Journal of Rural Studies 6 (1): 85–101. 32. ITC, 1993. Market brief on Annatto seeds – Overview of the world market. International Trade Centre, UNCTAD/WTO, Geneva. 33. Ito Y., Ishizuki K., Sekiguchi W., Tada A., Akiyama T., Sato K., Yamazaki T. and Akiyama H., 2012. Analysis of Residual Solvents in Annatto Extracts Using a Static Headspace Gas Chromatography Method. American Journal of Analytical Chemistry3: 638–645. 34. Kiokias S. and Gordon M. H., 2003. Antioxidant properties of annatto carotenoids. Food Chemistry 83: 523–529. 35. Levy L.W. and Rivadeneira D.M., 2000. Annatto. In Natural Food Colorants: Science and Technology (Lauro G.J. and Francis F.J., editors). New York: Marcel Dekker Inc., p. 115–152. 77 36. Lê Thị Anh Đào, Đinh Ngọc Thức và Phan Thị Sửu, 2000. Tách chiết chất màu đỏ cho thực phẩm từ hạt điều nhuộm (Bixa orellana L.) Việt Nam. Trong Tuyển tập các công trình Hội nghị khoa học và công nghệ hoá học hữu cơ toàn quốc lần thứ hai, Quy Nhơn, Bình Định, tháng 9/2000. Hội Hoá học Việt Nam, trang 264–268. 37. Lê Thị Anh Đào, Phạm Việt Hùng và Nguyễn Thị Mỹ Dung, 2002. Một số thành phần hóa học của hạt điều nhuộm (Bixa orellana L.) ở Gia Lai. Trong Tuyển tập các công trình Hội nghị khoa học và công nghệ Hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ 3. Hội Hoá học Việt Nam, trang 272–275. 38. Lê Thị Tường Oanh, 2012. Nghiên cứu xác định hàm lượng phẩm màu annatto theo độ chín của quả điều nhuộm bằng dung dịch NaOH 0,5N. Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân khoa học. Trường Đại học sư phạm – Đại học Đà Nẵng. 39. Lưu Đàm Cư, Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thủy, Trương Anh Thư, Phạm Văn Thính, Bùi Văn Thanh và Hà Tuấn Anh, 2005. Nghiên cứu cây nhuộm màu thực phẩm ở Việt Nam. Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống, Nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp, Y học, Huế, 25–26/7/2003. Nxb. Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội, trang 47–51. 40. Magestea A.B., Senraa T.D.A., da Silvaa M.C.H., Bonomob R.C.F., and da Silva L.H.M., 2012. Thermodynamics and optimization of norbixin transfer processes in aqueous biphasic systems formed by polymers and organic salts. Separation and Purification Technology 98: 69–77. 41. Mahendranath G., Venugopalan A., Giridhar P. and Ravishanakar G.A., 2011a. Improvement of Annatto Pigment Yield in Achiote Through Laminarin Spray: An Ecofriendly Approach. Int. Jr. of Agril., Env. and Biotech. 4 (2): 163–166. 42. Mahendranath G., Venugopalan A., Parimalan R., Giridhar P. and Ravishankar G. A., 2011b. Annatto pigment production in root cultures of Achiote. Plant Cell Tiss Organ Cult 106: 517–522. 43. Mala K.S., Rao P.P., Prabhavathy M.B. and Satyanarayana A., 2013. Studies on application of annatto (Bixa orellena L.) dye formulations in dairy products. J Food Sci Technol, published online: 09 June 2013, DOI 10.1007/s13197– 013–1038–3. 44. Mantovani N.C., Grando M.F., Xavier A. and Otoni W.C., 2013. Avaliação de genótipos de urucum (Bixa orellana L.) por meio dacaracterização morfológica de frutos, produtividade de sementes e teor de bixina. Ciência Florestal, Santa Maria 23 (2): 355–362. 78 45. McKeown G.G. and Mark E., 1962. The composition of oil soluble annatto food colors. Journal of the Association of Official Analytical Chemists 45: 761– 766. 46. McMurry J., 2012. Organic Chemistry. 8th edition, Cengage Learning. 47. Mendes L.G., 2012. Microencapsulação do corante natural de urucum: uma análise da eficiência da gome do cajueiro como material de parede. MSc. tese, Universidade Federal do Ceará Cemtro de Ciências agrárias, Fortaleza– CE, Brasil. 48. Mercadante A.Z., Steck A., Rodriguez–amaya D., Pfander H. and Britton G., 1995. Isolation of methyl 9'z–apo–6'–lycopenoate from Bixa orellana. Phytochemistry 41 (4): 1201–1203. 49. Mercadante A.Z., Steck A. and Pfander H., 1999. Three minor carotenoids from annatto (Bixa orellana) seeds. Phytochemistry 52: 135–139. 50. Montgomery D.C., 2001. Design and Analysis of Experiments. 5th editon, John Wiley & Son, Inc., USA. 51. Nachtigall A.M., Silva P.I., Bertoldi M.C. and Stringheta P.C., 2009. Estudo da saponificação em pigmentos de urucum. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas 29 (4): 873–878. 52. Najar S.V., Bobbio F.O. and Bobbio P.A., 1988. Effects of light, air, anti– oxidants and pro–oxidants on annatto extracts (Bixa orellana). Food Chemistry 29: 283–289. 53. Ngô Thị Thuận, 1995. Xây dựng quy trình công nghệ tách chiết tổng hợp các chất màu thực phẩm. Đề tài cấp nhà nước mã số KC–06–08. 54. Nguyễn Hoàng Dũng, 2005. Giáo trình thực hành Đánh giá cảm quan. Trường ĐH Bách Khoa TP. HCM, trang 4. 55. Nobre B.P., Mendes R.L., Queiroz E.M., Pessoa F.L.P., Coelho J.P. and Palavra A.F., 2006. Supercritical carbon dioxide extraction of pigments from Bixa orellana seeds (experiments and modeling). Brazilian Journal of Chemical Engineering 23 (2): 251–258. 56. Orchard valley, 2013. Annatto Colour Single Strength. 24th August 2013. <URL:–dairy.co.uk/item/Colour–_–Annatto/Annatto– Colour–Single–Strength.htm> 57. Oriental super–mart, 2013. Annatto extract (natural food color). 24th August 2013. <URL:– 79 mart.com/ourstore/index.php?main_page=product_info&cPath=26&products _id=846&zenid=0b2d235b3ddab8f002433a44b8ba0366> 58. Parimalan R., Mahendranath G., Giridhar P. and Ravishankar G.A., 2011. Abiotic elicitor mediated augmentation of annatto pigment production in standing crop of Bixa orellana L. Indian Journal of Fundamental and Applied Life Sciences 1 (4): 229–236. 59. Parvin K., Aziz M.G., Yusof Y.A., Sarker M.S.H., and Sill H.P., 2011. Degradation kinetics of water–soluble annatto extract and sensory evaluation of annatto colored yoghurt. Journal of Food, Agriculture & Environment 9 (3&4): 139–142. 60. Phan Thục Uyên, 2012. Xây dựng quy trình chiết tách phẩm màu annatto E của hạt điều nhuộm ở quy mô pilot. Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân khoa học, ĐH Sư phạm – Đại học Đà Nẵng. 61. Pimentel F.A., 1995. Avaliação de métodos de obtenção e de estabilidade de pigmentos de sementes de urucum (Bixa orellna L.). MCi. dissertação, Universidade Federal de Viçosa (UFV), Brasil. 62. Prabhakara Rao P.G., Satyanarayana A. and Rao D.G., 2002. Effect of Storage on the Stability of Water Soluble Annatto Dye Formulation in a Simulated Orange–RTS Beverage Model System. Lebensm.–Wiss. u.–Technol. 35 (7): 617–621. 63. Preston H.D. and Rickard M.D., 1980. Extraction and chemistry of annatto. Food Chemistry 5: 47–56. 64. Santos A.B., 2003. Encapsula c¸ão de oleoresina de paprica por atomiza c¸ão em goma arabica e em aglomerados porosos de amido/gelatin: estabilidade e aplicac¸ão. Dr. tese, Universidade Estadual de Campinas, Brazil. 65. Santos J.A.B., 2007. Análise comparativa entre técnicas de processamentos para extração de pigmentos nas sementes de urucum. Dr. tese, Universidade Federal de Campina Grande Centro de Ciências e Tecnologia, Campina Grande–PB, Brasil. 66. Santos D.T., Albuquerque C.L.C., and Meireles M.A.A., 2011. “11th International Congress on Engineering and Food (ICEF11)” Antioxidant dye and pigment extraction using a homemade pressurized solvent extraction system. Procedia Food Science 1: 1581–1588. 67. Satyanarayana A., Rao P.P., Balaswamy K., Velu V. and Rao D.G., 2006. Application of annatto dye formulations in different fruit and vegetable products. Journal of Foodservice 17: 1–5. 80 68. Satyanarayana A., Rao P.P. and Rao D.G., 2010. Influence of source and quality on the color characteristics of annatto dyes and formulations. LWT – Food Science and Technology 43: 1456–1460. 69. Scotter M.J., Wilson L.A., Appleton G.P. and Castle L., 1998. Analysis of Annatto (Bixa orellana) Food Coloring Formulations. 1. Determination of Coloring Components and Colored Thermal Degradation Products by High– Performance Liquid Chromatography with Photodiode Array Detection. J. Agric. Food Chem. 46: 1031−1038. 70. Scotter M., 2009. The chemistry and analysis of annatto food colouring: a review. Food Additives and Contaminants 26 (8): 1123–1145. 71. Shuhama I.K., Aguiar M.L., Oliveira W.P. and Freitas L.A.P., 2003. Experimental production of annatto powders in spouted bed dryer. Journal of Food Engineering 59: 93–97. 72. Silva P.I., 2007. Métodos de extração e caracterização de bixina e norbixina em sementes de urucum (Bixa orellana L.). MSc. tese, Universidade Federal de Vicosa, Viçosa, Minas Gerais, Brasil. 73. Silva P.I., Nachtigall A.M. and Stringheta P.C., 2009. Fatores que influenciam a reação de saponificação dos carotenóides presentes no urucum (Bixa orellana L.). Ciênc. agrotec., Lavras 33 (Edição Especial): 1892–1897. 74. Silva P.I., Nachtigall A.M. and Stringheta P.C., 2010. Eficiência de solventes na obtenção ecaracterização de corantes de urucum (Bixa orellana L.). B. CEPPA, Curitiba 28 (1): 115–124. 75. Sinha K., Chowdhury S., Saha P.D. and Datta S., 2013. Modeling of microwave–assisted extraction of natural dye from seeds of Bixa orellana (annatto) using response surface methodology (RSM) and artificial neural network (ANN). Industrial Crops and Products 41: 165–171. 76. Smiths J. and Wallin H., 2006. Annatto extracts – Chemical and Technical Assessment. 67th FAO JECFA. 77. Srivastava A., Shukla Y.N., Jain S.P. and Kumar S., 1999. Chemistry, pharmacology and uses of Bixa orellana: a review. Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences (India) 21 (4): 1145–1154. 78. TCVN 3215–79, 1979. Sản phẩm thực phẩm – Phân tích cảm quan – Phương pháp cho điểm. Ủy ban Khoa học và Kỹ thuật nhà nước. 79. The Raintree Group, 1997. Database file for annatto (Bixa orellana). August 19th 2013. 81 80. Tống Thị Việt Hà, 2011. Nghiên cứu lựa chọn quy trình chiết tách phẩm màu annatto từ hạt điều nhuộm. Luận văn thạc sĩ khoa học, ĐH Đà Nẵng. 81. Tummala J., Pamidighantam P.R., Babu P.M. and Akula S., 2012. Selection and application of annatto (Bixa orellana L.) dye formulation in some traditional sweetmeat and savoury products. Journal of Scientific & Industrial Research 71: 788–793. 82. Vasu S., Palaniyappan V., Kothandam H. P., and Badami S., 2010. Microwave facilitated extraction of Bixin from Bixa orellana and it’s in–vitro antioxidant activity. Der Pharmacia Lettre 2 (2): 479–485. 83. Venugopalan A., Giridhar P., and Ravishankar G.A., 2011. Food, ethanobotanical and diversified applications of Bixa orellana L.: a scope for its improvement through biotechnological mediation. Indian Journal of Fundamental and Applied Life Sciences 1 (4): 9–31. 84. Veríssimo S.A., 2003. Extração, caracterização e aplicação do corante de urucum (Bixa orellana L.). no tingimento de fibras naturais. MSc. tese, Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Tecnologia, Brasil. 85. Võ Văn Chi và Vũ Văn Chuyên, 1998. Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam. Tập 1, NXB Khoa học Hà Nội, trang 145. 82 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Kết quả so sánh độ ẩm trung bình của hạt điều màu nguyên liệu đo bằng hai phương pháp khác nhau 83 Phụ lục 2. So sánh hiệu quả của các loại hỗn hợp dung môi 84 Phụ lục 3. So sánh hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin ở các nồng độ NaOH khác nhau 85 Phụ lục 4. So sánh hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin ở các nồng độ ethanol khác nhau 86 Phụ lục 5. So sánh hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin ở các tỷ lệ dung môi / nguyên liệu khác nhau 87 Phụ lục 6. So sánh hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin ở các nhiệt độ ủ khác nhau 88 Phụ lục 7. So sánh hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin ở các thời gian ủ khác nhau 89 Phụ lục 8. So sánh hiệu suất thu hồi norbixin khi sử dụng các thể tích acid HCl khác nhau 90 Phụ lục 9. So sánh tỷ lệ norbixin tan ở pH khác nhau 91 Phụ lục 10. So sánh tỷ lệ hòa tan của bột tủa norbixin tương ứng với tỷ lệ phối chất trợ tan Na2CO3 khác nhau 92 Phụ lục 11. Kết quả kiểm nghiệm hàm lượng kim loại nặng 93 Phụ lục 12. So sánh điểm cảm quan của các mẫu sữa chua được phối nồng độ màu norbixin khác nhau 94 Phụ lục 13. Tiến độ thực hiện đề tài TT Các nội dung, công việc Thực hiện chủ yếu Sản phẩm phải đạt Thời gian (bắt đầu – kết thúc) Địa điểm thực hiện 1 2 3 4 5 1 Viết đề cương Đề cương T4/2013 – T6/2013 Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM 2 Nộp đề cương Báo cáo T8/2013 Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM 3 Báo cáo đề cương Báo cáo T9/2013 Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM 4 Chuẩn bị và đánh giá vật liệu nghiên cứu Mẫu, báo cáo T5/2013 ĐH Công nghệ Đồng Nai 5 Khảo sát và tối ưu hóa dung môi Báo cáo T5/2013 – T6/2013 ĐH Công nghệ Đồng Nai 6 Khảo sát và tối ưu hóa tỷ lệ dung môi / hạt và chế độ xà phòng hóa Báo cáo T6/2013 – T7/2013 ĐH Công nghệ Đồng Nai 7 Khảo sát acid và nồng độ Báo cáo T7/2013 – T8/2013 ĐH Công nghệ Đồng Nai 8 Khảo sát khả năng hòa tan và tỷ lệ chất trợ tan Báo cáo T9/2013 ĐH Công nghệ Đồng Nai 9 Đánh giá và ứng dụng chế phẩm bột norbixin Báo cáo T9/2013 – T10/2013 ĐH Công nghệ Đồng Nai 10 Báo cáo kết quả đề tài Báo cáo T10/2013 Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM 11 Bảo vệ luận văn tốt nghiệp Báo cáo T6/2014 Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM