Luận văn Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ phục vụ tạo và nhân giống lợn

%. Tỷ lệ acrosome còn nguyên vẹn ở lợn Landrace, Yorkshire, Duroc tƣơng ứng là: 93,1±4,12; 93,5±3,65; 92,45±3,21. Theo kết quả trên, tinh dịch của 3 giống lợn trên có tỷ lệ acrosome nguyên vẹn tƣơng đối cao đáp ứng đƣợc yêu cầu phẩm chất tinh dịch đƣa vào thí nghiệm. Theo Pursel và cs (1971) [35] nghiên cứu trên lợn Landrace, Yorkshire chỉ tiêu này là trên 90%. Theo một số nghiên cứu và quy trình thụ tinh nhân tạo mới đây cho thấy chỉ tiêu acrosome có ảnh hƣởng quyết định đến số lƣợng tinh trùng trong 1 liều tinh. Công ty Kubus (Tây Ban Nha) đƣa ra tiêu chuẩn liều tinh dịch nhƣ sau: nếu tỷ lệ acrosome 92-100% thì cần 2,5 tỷ tinh trùng/1 liều tinh; tƣơng ứng khi acrosome 82-92% thì cần 3,0 tỷ; 72-81% thì cần 3,5 tỷ; 62-71% cần 4 tỷ; 52- 61% cần 5 tỷ và khi tỷ lệ này từ 0-51% thì tinh dịch bị loại bỏ. Kết quả nghiên cứu áp suất thẩm thấu (mosm) của các giống lợn Landrace là: 322,05±5,96; Yorkshire: 318,80±6,88; Duroc: 320,65±6,12.Có sự sai khác giữa các giống ở chỉ tiêu này (p<0,05); theo các tác giả: Nguyễn Tấn Anh (1984) [1] là từ 290-334 mosm; 344,8±1, Joaquín, Gadea (2003) [29]: 290-300 mosm, Fraser L (2001) [22]: 250-300 mosm. Các chỉ tiêu tỷ lệ kỳ hình, tỷ lệ acrosome còn nguyên vẹn, áp suất thẩm thấu có sự sai khác giữa các giống có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Ngoài những chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng tinh dịch ở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt động của tinh trùng thông qua các chỉ tiêu: khoảng cách của các dạng chuyển động của tinh trùng: DCL (µm); DAP (µm); DSL (µm). Tƣơng ứng với mỗi dạng chuyển động là vận tốc chuyển động của tinh trùng là: VCL (µm/giây); VAP (µm/giây); VSL (µm/giây). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 Bảng 3.2. Khoảng cách và vận tốc của tinh trùng ở các giống lợn Chỉ tiêu Giống lợn Landrace (Mean ±SEmean) Yorkshire (Mean ±SEmean) Duroc (Mean ±SEmean) n= 84 n= 60 n= 68 DCL (µm) 73,09±1,13a 56,89±1,33b 56,33±1,15b DAP (µm) 40,54±0,63c 33,74±0,74d 32,18±0,69d DSL (µm) 23,84±0,41e 22,89±0,49f 20,62±0,46f VCL(µm/giây) 171,23±2,61g 131,29±3,07h 130,47±2,89h VAP(µm/giây) 95,25±1,48j 78,01±1,74k 75,88±1,63k VSL(µm/giây) 56,47±0,94i 53,16±1,11m 49,33±1,04m Ghi chú: Trong cùng một dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có một chữ cái giống nhau là không có ý nghĩa thống kê( p≥0,05); có một chữ cái khác nhau là có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Qua bảng 3.2 hầu hết các chỉ tiêu trên của lợn Landrace cao nhất, sự sai khác giữa các giá trị trung bình của các chỉ tiêu so với các giống còn lại có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Các chỉ tiêu trên ở hai giống lợn Yorkshire, Duroc không có sự sai khác (p≥0,05). Theo P. Thilmant (2001) [48] thì VCL của tinh trùng lợn nằm trong khoảng 128-133 (µm/giây); VAP từ 70,9 -74,7 (µm/giây), VSL từ 50,6-53,8 (µm/giây). Kết quả của chúng tôi không có sự sai khác với các kết qủa của P. Thilmant. Nhƣ vậy, kết quả thu đƣợc từ các chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch, những giống lợn sử dụng trong nghiên cứu này có chất lƣợng tinh dịch tốt, đạt tiêu chuẩn trong kỹ thuật thụ tinh nhân tạo theo tiêu chuẩn TCVN, 1959-76 [17] và đây là nguyên liệu đầu vào đạt tiêu chuẩn tốt trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 3.2. Kết quả nghiên cứu về kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn 3.2.1.Kết quả nghiên cứu kỹ thuật ly tâm Những mẫu tinh dịch đạt tiêu chuẩn, đƣợc pha với môi trƣờng ly tâm (môi trƣờng rửa) và ly tâm nhằm loại bỏ tinh thanh và các thành phần không có lợi, sử dụng phần tinh trùng thu đƣợc phục vụ cho các bƣớc tiếp theo. 3.2.1.1. Kết quả nghiên cứu môi trƣờng ly tâm Môi trƣờng ly tâm là môi trƣờng pha với tinh dịch để ly tâm (môi trƣờng rửa) Bảng 3.3. Đặc điểm của môi trƣờng ly tâm (n=60) Chỉ tiêu Môi trƣờng BTS (Mean ±SEmean) VCN (Mean ±SEmean) pH 7,2±0,23 7,3±0,12 Áp lực thẩm thấu (mosm) 302±12,10 304±13,21 Kết quả bảng 3.3 cho thấy: pH của môi trƣờng BTS là 7,2±0,23; VCN: 7,3±0,12; Áp lực thẩm thấu của 2 môi trƣờng tƣơng ứng là: 302±12,10 và 304±13,21. Theo Joaquín Gadea (2003) [29] tinh trùng có thể chịu đƣợc giới hạn ASTT từ 240 – 380 mosm. Nếu ASTT thấp hơn 200 mosm thì khả năng hoạt động và sức sống của tinh trùng bị suy giảm (Gilmore và cs, 1996 [23]; Fraser và cs, 2001 [22]). pH và áp lực thẩm thấu của 2 môi trƣờng có giá trị tƣơng đƣơng ở tinh dịch lợn ngoại, nhƣ vậy khi pha với tinh dịch không làm ảnh hƣởng đến sức sống tinh trùng 3.2.1.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng. Mẫu tinh thí nghiệm đƣợc phân thành 2 phần và pha trong 2 môi trƣờng ly tâm : VCN, BTS. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của hai môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng n Chỉ tiêu Trạng thái tinh dịch Tinh nguyên (Mean ±SEmean) Tinh pha với môi trƣờng VCN (Mean ±SE mean) Tinh pha với môi trƣờng BTS (Mean ±SE mean) 70 Motility (%) 95,39±0,23 a 95,20±0,32 b 95,28±0,22 b 70 Hoạt lực A (Progressive Motility %) 85,34±0,40 c 85,16±0,34 d 85,14±0,64 d Ghi chú: Trong cùng một dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có một chữ cái giống nhau là không có ý nghĩa thống kê( p≥0,05), có một chữ cái khác nhau là có ý nghĩa thống kê (p <0,05) Kết quả bảng 3.4 cho thấy, tỷ lệ tinh trùng hoạt động (Motility %) ở tinh nguyên là 95,39±0,23; ở môi trƣờng VCN: 95,20±0,32; ở môi trƣờng BTS: 95,28±0,22. Hoạt lực A (Progressive.Motility %) của tinh nguyên, tinh pha trong môi trƣờng VCN và BTS tƣơng ứng là: 85,34±0,40; 85,16±0,34; 85,14±0,64. Sự sai khác về các chỉ tiêu sức sống của tinh trùng ở tinh nguyên và tinh pha có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Nhƣng không có sự sai khác giữa hai môi trƣờng (p≥ 0,05). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 95.39 95.2 95.28 85.34 85.16 85.14 80 82 84 86 88 90 92 94 96 % Motility (%) Hoạt lực A (%) Tinh nguyên VCN BTS Biêủ đồ 3.5: Biêủ đồ so sánh Motility (%), A (Progressive.Motility %) tinh trùng trong 2 môi trƣờng ly tâm Qua biểu đồ ở hình 3.5 chúng tôi thấy không có sự sai khác về chỉ tiêu Motility (%) và A (Progressive.Motility %) của tinh trùng ở các môi trƣờng. Nhƣ vậy, có thể dùng hai môi VCN và BTS làm môi trƣờng ly tâm. Tuy nhiên, căn cứ vào kết quả nghiên cứu trên, trong thí nghiệm này chúng tôi chỉ sử dụng môi trƣờng VCN để làm môi trƣờng ly tâm nhằm đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của các giống lợn. 3.2.1.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm VCN đến sức sống tinh trùng của các giống lợn. Kết quả bảng 3.5 cho thấy, ở lợn Landrace các giá trị trung bình của các chỉ tiêu sức sống tinh trùng Motility (%), A ((Progressive.Motility %) ở tinh pha là 96,03± 0,38; 85,23± 0,64 và tinh nguyên là 96,04±0,38; 85,83±0,64 có sự sai khác (p<0,05), nhƣng ở các chỉ tiêu còn lại có sự sai khác (p<0,01). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của giống lợn Landrace. Chỉ tiêu n Tinh nguyên (Mean ±SEmean) Tinh pha (Mean ±SEmean) Motility (%) 84 96,04±0,38 96,03±0,38 A (Progressive Motility %) 84 85,83±0,64 85,23±0,64 DCL (µm) 84 73,09±1,13 67,36±1,13 DAP (µm) 84 40,54±0,63 37,51±0,63 DSL (µm) 84 23,84±0,41 22,11±0,42 VCL(µm/giây) 84 171,23±2,61 159,48±2,6 VAP(µm/giây) 84 95,25±1,48 89,11±1,47 VSL(µm/giây) 84 56,47±0,94 52,88±0,94 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của giống lợn Yorkshire Chỉ tiêu n Tinh nguyên (Mean±SE mean) Tinh pha (Mean±SE mean) Motility (%) 60 95,25±0,45 94,81±0,45 A (ProgressiveMotility %) 60 86,07±0,76 85,80±0,76 DCL (µm) 60 56,90±1,33 51,19±1,33 DAP (µm) 60 33,74±0,74 28,69±0,74 DSL (µm) 60 22,89±0,49 20,46±0,49 VCL(µm/giây) 60 131,29±3,08 115,32±3,08 VAP(µm/giây) 60 78,01±1,74 64,88±1,74 VSL(µm/giây) 60 53,17±1,11 46,45±1,11 Kết quả bảng 3.6 cho thấy, ở lợn Yorkshire các giá trị trung bình của tinh nguyên ở các chỉ tiêu đánh giá sức sống tinh trùng Motility (%) là Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 95,25±0,45; A (Progressive.Motility %): 86,07±0,76. Ở tinh pha các giá trị tƣơng ứng là 94,81±0,45 và 85,80±0,76. Các giá trị trung bình của các chỉ tiêu trên ở tinh nguyên và tinh pha có sự sai khác (p<0,05), nhƣng ở các chỉ tiêu còn lại có sự sai khác (p<0,01). Bảng 3. 7. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của giống lợn Duroc Chỉ tiêu n Tinh nguyên (Mean±SE mean) Tinh pha (Mean±SE mean) Motility (%) 68 94,88±0,42 94,13±0,42 A (Progressive.Motility %) 68 84,14±0,71 84,0±0,71 DCL (µm) 68 56,33±1,15 55,12±1,25 DAP (µm) 68 32,18±0,70 31,98±0,70 DSL (µm) 68 20,63±0,46 20,05±0,46 VCL(µm/giây) 68 130,47±2,89 128,22±2,89 VAP(µm/giây) 68 75,88±1,64 73,44±1,64 VSL(µm/giây) 68 49,34±1,04 48,74±1,04 Kết quả nghiên cứu ở lợn Duroc cũng cho nhận xét tƣơng tự: các giá trị trung bình của các chỉ tiêu đánh giá sức sống tinh trùng Motility (%), A (Progressive Motility %) ở tinh pha và tinh nguyên có sự sai khác (p<0,05), nhƣng ở các chỉ tiêu còn lại có sự sai khác (p<0,01). Kết quả bảng 3.5; 3.6; 3.7 cho thấy sức sống tinh trùng ở tinh nguyên của lợn Yorkshire cao nhất, sau đó là Landrace và cuối cùng là Duroc. Và ở tinh pha cũng cho kết quả tƣơng tự. Các giá trị trung bình của các chỉ tiêu đánh giá sức sống tinh trùng có sự sai khác (p<0,05). Điều đó chứng tỏ chất lƣợng tinh pha có phụ thuộc vào chất lƣợng tinh nguyên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 85.83 86.07 84.14 85.23 86.8 84 82.5 83 83.5 84 84.5 85 85.5 86 86.5 87 Hoạt lƣc A (%) Tinh nguyên Tinh pha Landrace Yorkshire Duroc Biêủ đồ 3.6: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng ở tinh nguyên và tinh pha trong môi trƣờng ly tâm (VCN). 3.2.1.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chế độ ly tâm đến sức sống tinh trùng của các giống lợn. Kỹ thuật ly tâm là một khâu rất quan trọng trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch. Nếu chế độ ly tâm phù hợp sẽ giúp loại bỏ đƣợc nhiều tinh thanh, thu đƣợc lƣợng tinh trùng tối đa trong tinh dịch, không gây những tổn thƣơng đến cấu trúc của tinh trùng. Sau khi pha tinh dịch với môi trƣờng ly tâm, chúng tôi tiến hành ly tâm tinh pha ở nhiệt độ 220C trong thời gian 15 phút với tốc độ ly tâm 1500 v/phút và 2000 v/phút nhằm tìm ra chế độ ly tâm thích hợp. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của tốc độ ly tâm đến sức sống tinh trùng (n=70) Chỉ tiêu Tinh dịch trƣớc khi ly tâm (Mean ±SEmean) Chế độ ly tâm 1500 v/p (Mean ±SEmean) 2000v/p (Mean ±SEmean) Motility (%) 95,28±0,37*** 94,95±0,48** 92,28± 0,48** A (Progressive.Motility %) 85,12±0,63 *** 82,58± 0,93** 78,19± 0,93** DCL (µm) 67,16±1,13** 52,64± 1,67b 52,47± 1,66c DAP (µm) 37,11±0,64** 28,86± 1,15b 29,07± 1,15c DSL (µm) 21,68±0,42** 17,34± 1,08b 18,20± 0,91c VCL(µm/giây) 158,95±2,60** 122,03±3,71b 118,93±3,68c VAP(µm/giây) 89,11±1,47** 67,12± 2,64b 66,12± 2,62c VSL(µm/giây) 51,90±0,94** 40,44± 2,17b 41,69± 2,16c Ghi chú: Trong cùng một dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có một chữ cái khác nhau là có ý nghĩa thống kê (p<0,05), ** có ý nghĩa thống kê (p< 0,01) ,*** có ý nghĩa thống kê (p<0,001) Kết quả bảng 3.8 cho thấy: tinh dịch trƣớc khi ly tâm các chỉ tiêu Motility (%) là 95,28±0,37; A (Progressive.Motility %): 85,12±0,63 và ở chế độ ly tâm 1500 v/p giá trị trung bình của các chỉ tiêu tƣơng ứng là: 94,95±0,48; 82,58±0,93 và ở chế độ ly tâm 2000 v/p là: 92,28±0,48; 78,19± 0,93. Nhƣ vậy, sau khi ly tâm sức sống tinh trùng giảm rõ rệt, bởi vì trong quá trình ly tâm tinh trùng chịu một tác động cơ học đáng kể. Sự sai khác giữa các giá trị trung bình của các chỉ tiêu trƣớc ly tâm và sau ly tâm là có ý nghĩa thống kê (p<0,001). Các chỉ tiêu DCL, DAP, DSL, VCL, VAP, VSL của tinh trùng trƣớc khi ly tâm so với sau ly tâm cũng giảm rõ rệt (p < 0,01). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 Kết quả bảng 3.8 cũng cho thấy: ở chế độ ly tâm 1500 v/p các chỉ tiêu Motility (%) là 94,95±0,48; A (Progressive.Motility %): 82,58± 0,93 và ở chế độ ly tâm 2000 v/p các chỉ tiêu tƣơng ứng là: 92,28±0,48; 78,19±0,93. Nhƣ vậy, ở chế độ ly tâm 1500 v/p sức sống tinh trùng cao hơn. Sự sai khác giữa các giá trị trung bình của các chỉ tiêu ở chế độ ly tâm 1500 v/p và ly tâm 2000 v/p là có ý nghĩa thống kê (p<0,01). Các chỉ tiêu DCL, DAP, DSL, VCL, VAP, VSL có sự sai khác (p< 0,05). 85.12 82.58 78.19 74 76 78 80 82 84 86 Trƣớc ly tâm 1500v/phút 2000v/phút Hoạt lực A(%) Biêủ đồ 3.7: Biểu đồ so sánh hoạt lƣc (A ) tinh trùng ở các chế độ ly tâm 3.2.1.5. Kết quả nhiên cứu sức sống tinh trùng sau ly tâm ở các giống lợn. Căn cứ vào kết quả trên chúng tôi ứng dụng chế độ ly tâm 1500 v/p trong thời gian 15 phút để ly tâm tinh dịch trong kỹ thuật đông lạnh. Kết quả bảng 3.9 cho thấy: ở lợn Landrace các chỉ tiêu sức sống tinh trùng sau ly tâm chỉ tiêu Motility (%) là 95,94±0,48, A(Progressive.Motility %): 83,09±0,93. Ở lợn Yorkshire các chỉ tiêu tƣơng ứng là: 91,56±0,57; 80,87±1,10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 và ở lợn Duroc là 93,35±0,54; 79,28±1,03. Sự sai khác của các giá trị trung bình của các chỉ tiêu trên ở các giống lợn có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Các chỉ tiêu DCL, DAP, DSL, VCL, VAP, VSL có sự sai khác (p< 0,05) giữa các giống. Theo Almlid và Hofmo(1996) [19 ] thì hoạt lực của tinh trùng sau ly tâm phải lớn hơn 50 %. Pursel và Johnson (1975) [36], Westendorf và cs (1975) [50], Paquignon và Courot (1976) [33] cũng cho kết quả tƣơng tự (60-70 %). Kim In Cheul (2007) [30] ly tâm ở tốc độ 1500 v/p hoạt lực tinh trùng từ 60%-75%. Nhƣ vậy kết quả của chúng tôi cũng nằm trong phạm vi của các tác giả trên. Bảng 3.9. Sức sống tinh trùng sau ly tâm của các giống lợn Chỉ tiêu Giống lợn Landrace (n= 84) (Mean±SE mean) Yorkshire ( n=60) (Mean±SE mean) Duroc (n=68) (Mean±SE mean) Motility (%) 95,94±0,48** 91,56±0,57** 93,35±0,54** A (Progressive.Motility %) 83,09±0,93** 80,87±1,10 ** 79,28±1,03 ** DCL (µm) 52,64± 1,67a 49,54± 1,97b 49,11± 1,85c DAP (µm) 28,86± 1,15a 28,54± 1,97a 30,94± 1,28c DSL (µm) 17,34± 1,08a 18,24± 1,08b 19,63±1,02c VCL (µm/giây) 122,03±3,71a 105,55±4,36b 121,07±4,10c VAP (µm/giây) 67,12± 2,64a 62,55± 3,10b 71,56±2,91c VSL (µm/giây) 40,44± 2,17a 45,58± 2,55b 44,14± 2,40c Ghi chú: Trong cùng một dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có một chữ cái giống nhau là không có ý nghĩa thống kê (p ≥0,05).có một chữ cái khác nhau là có ý nghĩa thống kê (p<0,05),** có ý nghĩa thống kê (p< 0,01). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 3.2.2. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật cân bằng tinh dịch Có hai phƣơng pháp cân bằng chính là cân bằng một bƣớc và cân bằng hai bƣớc. Cân bằng một bƣớc là phƣơng pháp pha môi trƣờng với tinh dịch sau ly tâm và cân bằng trong suốt quá trình cân bằng hoặc sau khi pha với môi trƣờng, tinh pha đƣợc đóng gói trong cọng rạ và cân bằng theo quy trình. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là đơn giản, trong quá trình cân bằng không phải tiếp xúc với tinh, phƣơng pháp này thƣờng áp dụng trong đông lạnh tinh bò. Trong đông lạnh tinh dịch lợn, phƣơng pháp cân bằng hai bƣớc có kết quả tốt hơn. Chúng tôi áp dụng quy trình cân bằng hai bƣớc của Kim In Cheul (Viện nghiên cứu chăn nuôi Hàn Quốc). Tinh dịch sau khi ly tâm, phần tinh trùng lắng phía dƣới ống ly tâm đƣợc thu hồi và pha với môi trƣờng L.Y.E 1 đƣợc cân bằng bƣớc 1 và sau đó pha với môi trƣờng L.Y.E 2 cân bằng bƣớc 2. Đặc điểm của môi trƣờng cân bằng đƣợc thể hiện ở bảng 3.10. Bảng 3.10. Đặc điểm môi trƣờng cân bằng (n= 60) Môi trƣờng Thành phần Chỉ tiêu pH (Mean±SE mean) ASTT(mosm) (Mean±SE mean) L.Y.E 1 Nƣớc cất: 100ml; lactose: 11g; lòng đỏ trứng gà: 25ml; penicilin: 0,029g; streptomycin: 0,076gr 6,85±0,12 301±1,14 L.Y.E 2 Dung dịch L.Y.E.1: 91,2%; Glyxerol: 7,5%; OEP: 1,3% 6,88±0,14 301±1,14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 Môi trƣờng L.Y.E 1 và L.Y.E 2 là môi trƣờng quan trọng nhất trong quá trình đông lạnh, các thành phần trong môi trƣờng giúp cho trinh trùng chống đƣợc choáng lạnh, không bị teo hoặc vỡ, đảm bảo cho tinh trùng ở trạng thái tiềm sinh trong quá trình đông lạnh. Theo Graham (1971) [25]; Pursel và cs (1975) [36]; Pursel và cs (1978) [37], Westendorf (1975) [50] đã chỉ ra rằng OEP có ảnh hƣởng tích cực đến quá trình bảo vệ hình thái, cấu trúc màng, khả năng hoạt động và thụ thai của tinh trùng đông lạnh V. G. Pursel, L.L.Schulman và L.A.Johnson (1978) [37] đã chỉ ra rằng nồng độ OEP trong dung dịch đông lạnh tinh dịch từ 1- 1,5% cho tỷ lệ acrosomee nguyên vẹn cao nhất, tinh trùng hoạt động mạnh và có khả năng thụ tinh cao hơn so với sử dụng OEP với nồng độ 0,5% và 2%. 3.2.2.1. Kết quả nghiên cứu sức sống của tinh trùng của các giống sau cân bằng Đánh giá sức sống tinh trùng của các giống lợn ở các lần cân bằng để xem có sự khác nhau giữa các lần cân bằng và ở các giống hay không. Bảng 3.11. Chất lƣợng tinh dịch sau cân bằng của giống Landrace Chỉ tiêu n Chế độ cân bằng Cân bằng bƣớc 1 (Mean±SE mean) Cân bằng bƣớc 2 (Mean±SE mean) Motility (%) 84 93,04± 0,92 a 93,41± 0,92 b A (Progressive.Motility %) 84 79,52± 0,96 a 79,86 ±0,96 b DCL (µm) 84 62,46± 1,43 a 64,04± 1,43 b DAP (µm) 84 35,60± 0,90 a 37,05 ±0,9 b DSL (µm) 84 21,37± 0,78 a 22,51 ±0,78 b VCL(µm/giây) 84 146,88 ±3,34 a 152,54 ±3,34 b VAP(µm/giây) 84 83,92±2,17 a 88,41 ±2,17 b VSL(µm/giây) 84 50,74 ±1,92 a 54,14± 1,92 b Ghi chú: Trong cùng một dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có một chữ cái khác nhau là có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 Bảng 3.12. Chất lƣợng tinh dịch sau cân bằng của giống Yorkshire Chỉ tiêu n Chế độ cân bằng Cân bằng bƣớc 1 (Mean±SE mean) Cân bằng bƣớc 2 (Mean±SE mean) Motility (%) 60 91,03± 1,08a 91,28± 1,08b A (ProgressiveMotility %) 60 80,55± 1,14 a 82,01± 1,14 b DCL (µm) 60 72,08 ±1,69 a 76,22± 1,69 b DAP (µm) 60 43,08± 1,07 a 45,15± 1,07 b DSL (µm) 60 20,31 ±0,92 a 20,44± 0,92 b VCL (µm/giây) 60 108,12± 3,95 a 114,35± 3,95 b VAP (µm/giây) 60 60,85 ±2,57a 63,86± 2,57b VSL (µm/giây) 60 37,87±2,28a 44,27 ±2,28b Ghi chú: trong cùng một dòng,sự sai khác giữa các giá trị trung bình có một chữ cái khác nhau là có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Bảng 3.13. Chất lƣợng tinh dịch sau cân bằng của giống Duroc Chỉ tiêu n Chế độ cân bằng Cân bằng bƣớc 1 (Mean±SE mean) Cân bằng bƣớc 2 (Mean±SE mean) Motility (%) 68 91,78 ±1,02a 92,29±1,02b A (ProgressiveMotility %) 68 74,49±1,07 a 75,74 ±1,07 b DCL (µm) 68 47,46±1,59a 47,93±1,59b DAP (µm) 68 27,15±1,00a 27,96±1,00b DSL (µm) 68 16,78±0,86a 18,30±0,86b VCL (µm/giây) 68 111,03±3,71 a 122,35±3,71 b VAP (µm/giây) 68 63,80±2,42a 65,87 ±2,42b VSL (µm/giây) 68 39,70±2,14a 43,31±2,14b Ghi chú: Trong cùng một dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có một chữ cái khác nhau là có ý nghĩa thống kê(p<0,05). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 Kết quả trên bảng 3.11; 3.12; 3.13 cho thấy: các chỉ tiêu sau cân bằng bƣớc 2 đều cao hơn ở bƣớc 1. Sự sai khác của các giá trị trung bình có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Điều này cũng đƣợc lý giải là: sau khi cân bƣớc 1 tinh dịch đƣợc pha vào môi trƣờng L.Y.E 2 có thêm thành phần OEP. 3.2.3. Kết quả nghiên cứu đông lạnh tinh dịch trong hơi nitơ. Sau khi cân bằng xong bƣớc 2, tinh dịch đƣợc đƣa vào các cọng rạ có thể tích 5 ml (maxi - straw ). Và tiến hành đông lạnh tinh dịch trong hơi nitơ (-79 oC) trong thời gian 10 phút và 20 phút nhằm chọn thời gian đông lạnh thích hợp. Sau đó tinh dịch đƣợc ngâm trong nitơ lỏng (-196oC) và bảo quản lâu dài. Sau khi bảo quản phải đánh giá sức sống tinh trùng ở những thời gian đông lạnh nhằm tìm ra thời gian đông lạnh thích hợp. Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của thời gian đông lạnh đến sức sống của tinh trùng (n= 70) Chỉ tiêu Tinh dịch sau cân bằng bƣớc 2 (Mean±SE mean) Thời gian đông lạnh 10 phút (Mean±SE mean) 20 phút (Mean±SE mean) Motility (%) 91,29±1,02*** 73,16±1,02** 66,23±1,24** A (ProgressiveMotility %) 74,74±1,07*** 43,80±1,07** 38,80±1,17** Ghi chú: Trong cùng 1 dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có ** là có ý nghĩa thống kê (p<0,01);*** có ý nghĩa thống kê (p<0,001). Kết quả bảng 3.14 cho thấy: sức sống tinh trùng ở tinh pha trƣớc đông lạnh chỉ tiêu Motility (%): 91,29±1,02; A (Progressive.Motility %): 74,74±1,07. Ở thời gian đông lạnh 10 phút các chỉ tiêu tƣơng ứng là: 73,16±1,02; 43,80±1,07 và ở thời gian đông lạnh 20 phút là: 66,23±1,24; 38,80±1,17. Sức sống tinh trùng sau khi đông lạnh giảm đi rất rõ rệt. Sự sai khác giữa các giá trị trung bình của các chỉ tiêu có ý nghĩa thống kê (p < 0,001). Kết quả trên đƣợc lý giải là trong quá trình đông lạnh ở nhiệt độ -79oC, tuy trong môi trƣờng đông lạnh có các chất làm giảm các tác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 nhân bất lợi cho tinh trùng, nhƣng ở một điều kiện nhƣ vậy tinh trùng vẫn phải chịu những tác động về vật lý, hóa học làm cho sức sống bị giảm rõ rệt. Tuy nhiên những tinh trùng vƣợt qua đƣợc giai đoạn này và đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng (-196oC) sẽ tồn tại ở dạng tiềm sinh, khi có điều kiện thuận lợi lại hoạt động bình thƣờng trở lại. Kết quả bảng 3.14 cũng cho thấy, với hai thời gian đông lạnh khác nhau thì ở thời gian đông lạnh 10 phút có kết quả cao hơn (p < 0,01). Kết quả nghiên cứu đông lạnh tinh dịch lợn địa phƣơng ở trạm thực nghiệm Ibaragi thuộc Trung tâm giống quốc gia Nhật Bản: sau khi giải đông hoạt lực tinh trùng đạt 30% - 40 %. Johnson và Pursel (1975) [36] hoạt lực tinh trùng đông lạnh phải đạt trên 30 %. Nhƣ vậy kết quả của chúng tôi đạt yêu cầu và phù hợp với các tác giả khác. Căn cứ vào kết quả trên chúng tôi áp dụng thời gian đông lạnh 10 phút để tiến hành đông lạnh tinh dịch của các giống lợn. 74.74 43.8 38.8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Trƣớc đông lạnh 10 phút 20 phút Hoạt lực A(%) Biêủ đồ 3.8: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng trƣớc, và sau đông lạnh ở thời gian đông lạnh 10 phút và 20 phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 73 3.2.4. Kết quả nghiên cứu nhiệt độ và thời gian giải đông tinh dịch đông lạnh 3.2.4.1. Ảnh hƣởng của thời gian giải đông đến sức sống tinh trùng Tinh dịch sau khi đông lạnh và bảo quản cần đƣợc giải đông để đánh giá sức sống tinh trùng. Kỹ thuật giải đông có vai trò quan trọng trong việc đánh giá kết quả đông lạnh. Nếu kỹ thuật đông lạnh và chất lƣợng tinh đông lạnh tốt, nhƣng kỹ thuật giải đông không phù hợp sẽ dẫn đến kết luận sai. Có rất nhiều quy trình giải đông khác nhau, căn cứ vào một số kết quả của các tác giả và ứng dụng kỹ thuật giả đông của Kim In Cheul ( Hàn Quốc) (2007) [30] để nghiên cứu kỹ thuật giải đông ở nhiệt độ 52oC và thời gian 45 giây và 30 giây. Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của thời gian giải đông đến sức sống tinh trùng (n=70) Chỉ tiêu Nhiệt độ giải đông Thời gian giải đông 45 giây (Mean±SE mean) 30 giây (Mean±SE mean) Motility (%) 52oC 72,46 ± 1,08** 65,56 ± 1,18** A (ProgressiveMotility %) 52 o C 44,57 ± 1,14 ** 40,51 ± 1,04 ** Ghi chú: Trong cùng một dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có ** là có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Qua bảng 3.15 chúng tôi thấy, sức sống tinh trùng đƣợc giải đông ở nhiệt độ 52oC trong thời gian 30 giây có Motility (%): 65,56±1,18; A (Progressive.Motility %): 40,51±1,04 và trong thời gian 45 giây tƣơng ứng là: 72,46±1,08; 44,57±1,14. Sự sai khác giữa các giá trị trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Nhƣ vậy tinh dịch đông lạnh đƣợc giải đông ở cùng nhiệt độ 52oC trong thời gian 45 giây tốt hơn. Các tác giả Johnson và Pursel (1975) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 [36] đề xuất giải đông ở 50oC trong thời gian 20 giây; Sellés và cs (2003) [41] nhiệt độ giải đông là 52oC thời gian 12 giây. 38 39 40 41 42 43 44 45 30 s 45 s Hoạt lực A (%) Biêủ đồ 3.5: Biểu đồ so sánh hoạt lƣc (A) tinh trùng ở thời gian giải đông 30 giây và 45 giây 3.2.4.2.Chất lƣợng tinh dịch đông lạnh sau giải đông của các giống lợn. Tinh dịch các giống lợn Landrace, Yorkshire, Duroc đƣợc đông lạnh theo quy trình dựa trên các kết quả nghiên cứu trên: tinh nguyên đƣợc pha với môi trƣờng VCN; ly tâm ở nhiệt độ 220C trong thời gian 15 phút với tốc độ ly tâm 1500 v/phút; cân bằng theo phƣơng pháp 2 bƣớc với môi trƣờng L.Y.E 1 và L.Y.E 2; tinh dịch đƣợc đóng gói trong cọng rạ có thể tích 5ml (maxi - straw), thời gian đông lạnh trên hơi nitơ lỏng là 10 phút; bảo quản trong nitơ lỏng ( -196oC) và đƣợc giải đông ở nhiệt độ 52oC trong thời gian 45giây. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.16. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 Bảng 3.16. Chất lƣợng tinh dịch đông lạnh sau giải đông của các giống lợn Chỉ tiêu Giống Landrace(n=84) (Mean ±SEmean) Yorkshire(n=60) (Mean ±SEmean) Duroc(n=68) (Mean ±SEmean) C (10 9 /ml) 1,05±0,03a 1,02±0,03b 1,09±0,03c Motility (%) 77,66±0,92a 66,46±1,08b 73,16±1,02c A(Progressvie.Motility %) 44,99±0,96a 44,57±1,14b 37,80±1,07c V (ml)/cọng rạ 5,0 5,0 5,0 VAC (10 9 ) /cọng rạ 2,35±0,05a 2,27±0,08b 2,06±0,12c DCL (µm) 23,26±1,43a 35,21±1,69b 33,32±1,59c DAP (µm) 15,72±0,90a 21,35±1,07b 19,72±1,00c DSL (µm) 11,14±0,78a 15,67±0,92b 13,65±0,86c VCL (µm/giây) 55,81±3,34a 80,23±3,95b 78,58±3,71c VAP (µm/giây) 37,77±2,17a 48,78±2,57b 46,79±2,42c VSL (µm/giây) 26,86±1,92a 35,87±2,28b 32,60±2,14c Ghi chú: Trong cùng một dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có các chữ cái khác nhau là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05); Kết quả bảng 3.16 cho thấy: các chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch đông lạnh sau giải đông của giống lợn Landrace: Motility (%): 77,66±0,92, A (Progressvie Motility %): 44,99±0,96; VAC(10 9/cọng rạ): 2,35±0,05; Lợn Yorkshire các chỉ tiêu tƣơng ứng là: 66,46±1,08; 44,57±1,14; 2,27±0,08 và lợn Duroc là 73,16±1,02; 37,80±1,07; 2,06±0,12. Trong các chỉ tiêu trên, A (Progressvie Motile %) là chỉ tiêu quan trọng nhất đánh giá kết quả của kỹ thuật đông lạnh đó chính là chất lƣợng tinh đông lạnh. Sức sống tinh trùng của tinh đông lạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76 sau giải đông của 3 giống lợn trên đều đạt kết quả cao từ 37,8% đến trên 44%. Kết quả trên bằng và cao hơn kết quả của một số tác giả nhƣ: trạm thực nghiệm Ibaragi thuộc Trung tâm giống quốc gia Nhật Bản sau khi giải đông hoạt lực tinh trùng đạt 30% - 40%; Westendorf và cs (1975) [50]; Johnson và Pursel (1975) [36] hoạt lực tinh trùng đông lạnh phải đạt trên 30 %. 44.99 44.57 37.8 34 36 38 40 42 44 46 Landrace Yorkshire Duroc Hoạt lực A (%) Biêủ đồ 3.10: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng sau giải đông ở các giống lợn Qua biểu đồ ở hình 3.10 cho thấy: hoạt lực A (%) ở lợn Landrace cao nhất, tiếp đó là Yorkshire và thấp nhất ở lợn Duroc. Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu đánh giá sự vận động của tinh trùng nhƣ: DCL(µm), DAP (µm), DSL (µm), VCL(µm/giây), VAP(µm/giây), VSL(µm/giây) cũng đạt tiêu chuẩn của tinh đông lạnh. Kết quả này cũng tƣơng tự kết quả của các tác giả: Teresa Cremades và cs (2005) [42] thì VCL là 73,38±0,32µm/giây; VAP: 55,43±0,25µm/giây; VSL: 43,54±0,22µm/giây. Các giá trị trung bình của các chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch đông lạnh của 3 giống lợn sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 77 23.26 35.21 33.32 15.72 21.35 19.72 11.14 15.67 13.65 0 5 10 15 20 25 30 35 40 DCL DAP DSL Landrace Yorkshire Duroc Độ dài (µm) Dạng chuyển động Biêủ đồ 3.11: Biểu đồ so sánh độ dài các chuyển động của tinh trùng 55.8 80.23 78.58 37.77 48.78 46.79 26.86 35.87 32.6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 VCL VAP VSL Dạng vận động Landrace Yorkshire Duroc Vận tốc (µm/s) Biêủ đồ 3.12: Biểu đồ so sánh vận tốc chuyển động của tinh trùng ở các dạng vận động Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 Qua biểu đồ ở hình 3.11; 3.12, các chỉ tiêu vận động của tinh trùng ở Landrace thấp nhất, Yorkshire cao nhất và Duroc ở mức trung bình so với hai giống lợn trên. Để tiếp tục đánh giá chất lƣợng tinh dịch đông lạnh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thử nghiệm sử dụng tinh đông lạnh để tạo phôi trong thụ tinh ống nghiệm, phối giống cho lợn nái để tạo phôi phục vụ kỹ thuật di thực phôi trên lợn và phối giống trực tiếp cho lợn nái trong sản xuất. 3.3. Kết quả nghiên cứu sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh. Trong khuôn khổ của đề tài cấp bộ, nên chúng tôi đã kết hợp với các tác giả TS Đào Đức Thà (chủ nhiệm đề tài), Ths Nguyễn Thị Thoa (chủ trì đề tài nhánh) và các cộng sự thực hiện nội dung này. 3.3.1.Kết quả sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro) Tinh dịch đông lạnh sau khi giải đông đƣợc dùng trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm để tạo phôi. Bảng 3.17. Kết quả tạo phôi trong thụ tinh ống nghiệm. Đợt TN Trứng cho TTON Phôi 2-4 tế bào (Ngày 0-2) Phôi ngày 6 sau thụ tinh (n) (n) % Phôi dâu (n) % Phôi nang (n) % 1 120 55 45,83 12 21,81 0 0 2 82 36 43,90 10 27,77 0 0 3 125 89 71,20 22 17,60 15 16,85 4 165 112 67,87 22 18,03 11 9,82 5 105 75 71,42 21 28,00 9 12.00 6 152 99 65,13 24 24.24 15 15,15 7 166 115 69,27 27 23,47 29 25,21 Tổng 915 581 63,49 138 23,75 79 13,59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 Kết quả bảng 3.17 cho thấy, những tế bào trứng loại 1 dùng cho thụ tinh ống nghiệm sau 7 đợt thí nghiệm, thu đƣợc 581 phôi 2 - 4 tế bào chiếm 63,49% và đến ngày thứ 6 thu đƣợc 138 phôi dâu (23,75%); 79 phôi nang (đạt tỉ lệ 13,59%). Kết quả trên cho thấy tinh dịch lợn đông lạnh có thể sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm. 3.3.2.Kết quả sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh phối giống cho lợn nái để lấy phôi và trong sản xuất. 3.3.2.1.Kết quả sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh phối giống cho lợn nái để lấy phôi và cấy phôi cho lợn nái . Sử dụng tinh dịch đông lạnh phối giống cho lợn nái Móng cái, sau 7 ngày thu phôi để cấy cho lợn ngoại. Bảng 3. 18 .Kết quả nghiên cứu tạo và cấy phôi ở lợn nái. Chỉ tiêu Kết quả Số nái phối giống đẻ lấy phôi( con) 4 Số nái cho phôi (con) 4 Tỷ lệ cho phôi (%) 100 Số phôi /1 con ( phôi) 20-32 Số nái nhận phôi (con) 9 Số nái có chửa (con) 4 Tỷ lệ có chửa (%) 44,44 Số nái đã đẻ (con) 2 Số con trong 1 ổ (con) 9-10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 80 Kết quả bảng 3.18 cho thấy, tỷ lệ cho phôi của lợn nái khi đƣợc phối giống bằng tinh đông lạnh rất cao (100 %), số lƣợng phôi thu đƣợc trên một nái cũng tƣơng đối cao (20-32). Số lƣợng thử nghiệm còn ít do vậy kết quả tuy cao nhƣng mới chỉ là bƣớc đầu chỉ có giá trị tham khảo. Tuy nhiên với kết quả trên bƣớc đầu có thể khẳng định đƣợc kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn đã có kết quả. 3.3.2.2.Kết quả sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh phối giống cho lợn nái trong sản xuất. Chúng tôi tiến hành sử dụng tinh đông lạnh phối giống cho lợn nái tại trại chăn nuôi. Bảng 3.19. Kết quả phối giống trong sản xuất. Chỉ tiêu Kết quả Số nái đƣợc phối giống ( con) 17 Số nái có chửa ( con) 10 Tỷ lệ thụ thai ( %) 58,33 Số con đã đẻ ( con) 8 Số con sơ sinh /1 ổ ( con) 7,37 Kết quả bảng 3.19 cho thấy: Sử dụng tinh đông lạnh phối giống cho lợn nái, tỷ lệ thụ thai đạt 58,33 %, số con sơ sinh trên một ổ 7,37 con. Trong khi đó sử dụng tinh tƣơi trong sản xuất tỷ lệ thụ thai trên 80 %, số con sơ sinh/ổ: 10-14 con. Theo Kim In Cheul (Viện chăn nuôi Hàn Quốc) (2007) [30]: thụ tinh nhân tạo bằng tinh đông lạnh (5 ml/cọng) tỷ lệ thụ thai đạt từ 61,7% đến 74,2%, số con sơ sinh/ ổ từ 8,1-8,7 . Nhƣ vậy kết quả sử dụng tinh đông lạnh phối giống cho lợn nái trong sản xuất cần phải nghiên cứu sâu hơn nhằm nâng cao hiệu quả. Tuy nhiên với kết quả bƣớc đầu nhƣ trên cũng đã khẳng định đƣợc thành công của kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 81 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN - Chất lƣợng tinh dịch 3 giống lợn Landrace, Yorkshire, Duroc nuôi tại Viện chăn nuôi đạt tiêu chuẩn để đông lạnh: Thể tích tinh dịch ở lợn Landrace là 215ml, ở lợn Yorkshire là 275ml và ở lợn Duroc là 285ml.Nồng độ tinh trùng ở lợn Landrace là 259,12 triệu/ml, ở lợn Yorkshire là 274,15 triệu/ml và ở lợn Duroc là 214,24 triệu/ml.VAC ở lợn Landrace là 47,35 tỷ, ở lợn Yorkshire là 64,78 tỷ và ở lợn Duroc là 51,21 tỷ. pH tinh dịch ở lợn Landrace là 7,34, ở lợn Yorkshire là 7,35 và ở lợn Duroc là 7,41. Tỷ lệ kỳ hình ở lợn Landrace là 6,87, ở lợn Yorkshire là 6,4 và ở lợn Duroc là 7,17. ASTT tinh dịch ở lợn Landrace là 312,05, ở l ợn Yorkshire là 308,8 và ở lợn Duroc là 320,65. Acrosome nguyên vẹn ở các giống đều đạt trên 90%. - Sử dụng môi trƣờng VCN (Viện chăn nuôi) làm môi trƣờng ly tâm. Môi trƣờng VCN có pH là: 7,2 và ASTT là 302 - Chế độ ly tâm tinh dịch ở nhiệt độ 220C trong thời gian 15 phút với tốc độ ly tâm 1500 v/phút là thích hợp. - Dùng môi trƣờng đông lạnh L.Y.E 1 và L.Y.E 2; cân bằng ở chế độ 2 bƣớc - Thời gian đông lạnh tinh dịch trong hơi nitơ lỏng (- 79oC) trong thời gian 10 phút tốt hơn ở thời gian 20 phút. Ở thời gian đông lạnh 10 phút Motility(%) là: 73,16; hoạt lực A (Progressive.Motility %): 43,80; ở thời gian đông lạnh 20 phút Motility (%): 66,23; hoạt lực A (Progressive.Motility): 38,80. - Giải đông tinh đông lạnh ở 52oC trong vòng 45 giây tốt hơn ở thời gian 30 giây.Ở thời gian giải đông 45 giây Motility (%): 74,46; hoạt lực A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 82 (Progressive.Motility %): 44,57; ở thời gian giải đông 30 giây Motility (%) là: 65,56; Hoạt lực A (Progressive. Motility): 40,51. - Chất lƣợng tinh dịch đông lạnh đạt tiêu chuẩn: Hoạt lực A (Progressvie Motility %) của các giống lợn Landrace: 44,985; Yorkshire: 44,568; Duroc: 37,801. Các chỉ tiêu vận động của tinh trùng sau giải đông cũng đạt yêu cầu. - Bƣớc đầu sử dụng tinh đông lạnh trong thụ tinh ống nghiệm, tạo phôi, phối giống trong sản xuất có kết quả. 2. ĐỀ NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện và xây dựng quy trình đông lạnh tinh dịch lợn, áp dụng đông lạnh tinh dịch các giống lợn quý hiếm. - Sử dụng tinh dịch đã đông lạnh trong sản xuất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Tấn Anh (1984), Nghiên cứu môi trường tổng hợp để pha loãng bảo tồn tinh dịch 1 số giống lợn ngoại nuôi tại Miền Bắc Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Nông nghiệp, tr. 15-20, 59-65. 2. Nguyễn Tấn Anh (1985), “Một vài đặc điểm sinh vật học của tinh trùng”, Tạp chí Khoa học Kỹ Thuật Nông nghiệp, (278), tr. 376 - 377. 3. Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Quốc Đạt (1996), Thụ tinh nhân tạo gia súc gia cầm, Nxb Nông nghiệp. 4. Nguyễn Tấn Anh (2003), Thụ tinh nhân tạo cho gia súc gia cầm, Nxb Lao động - Xã hội, Hà Nội. tr. 82-88. 5. Lê Xuân Cƣơng (6-1985), “Truyền tinh nhân tạo góp phần tăng nhanh tiến bộ di truyền các giống lợn”, Thông tin Kinh tế Kĩ thuật Hà Nội, tr. 1–23. 6. Lê Xuân Cƣơng, Vũ Đình Hiền (2-1987), “Kết quả theo dõi thụ tinh nhân tạo lợn ở Quận Gò Vấp TP. Hồ Chí Minh”, Tạp Chí Khoa học Kỹ Thuật Nông nghiệp, tr.76-78. 7. Trần Tiến Dũng, Dƣơng Đình Long, Nguyễn Văn Thanh (2002), Giáo trình sinh sản gia súc, Nxb Nông nghiệp. 8. Lƣu Kỷ, Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Thiện (1995), “Một số kết quả nghiên cứu về sinh sản và thụ tinh nhân tạo gia súc, gia cầm”, Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật chăn nuôi - Viện chăn nuôi, Nxb Nông nghiệp. 9. Lê Quang Long (1976), “ Góp phần kiểm tra chất lƣợng tinh dịch giống lợn Nam Hà”, Báo cáo khoa học Viện chăn nuôi. 10. Lƣơng Tất Nhợ ( 1980), “Khảo sát đánh giá chất lƣợng tinh dịch 3 giống lợn Yorkshire, Duroc, Landrace”, Báo cáo khoa học Viện chăn nuôi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 84 11. Nguyễn Thiện, Lƣu Kỷ, Nguyễn Tấn Anh (1976), “Phẩm chất tinh dịch và khả năng truyền giống của lợn F3 ( ĐB-I )”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật nông nghiệp - Bộ NN, tr. 690 – 691. 12. Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh (1993), Thụ Tinh Nhân Tạo cho lợn ở Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, tr: 93; 102 – 103. 13. Nguyễn Thiện, Trần Đình Miên, Võ Trọng Hốt (2005), Con lợn ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, tr. 584-586. 14. Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh, Đỗ Hữu Hoan ( 2006), Kĩ thuật thụ tinh nhân tạo cho lợn ở Việt Nam, Nxb Nông nghiệp. 15. Đỗ Văn Thu (2005), “ Đông lạnh tinh dịch cừu”, Thông tin Khoa học Kỹ thuật Chăn nuôi. Viện Chăn Nuôi, (1- 2005). tr 57- 63. 16. Nguyễn Văn Thƣởng (1998), “Truyền giống và Thụ tinh nhân tạo”, Hội chăn nuôi Việt Nam, tr. 26. 17. Uỷ ban khoa học kỹ thuật nhà nƣớc, Tiêu chuẩn nhà nước về tinh dịch lợn, TCVN (1959 – 76) (Nhóm N). II. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 18. AI and free semen in goat. The new technique in Viet Nam. www.mekarn.org/procsr/tha.pdf 19. Almlid T, Hofmo P.O. (1996), A brief review of frozen semen applications under Norwegian AI swine conditions, Reprod Domest Anim 31, pp.169-173. 20. Crabo, B.G. and S. Einarsson. (1971), Fertility of deep frozen boar spermatozoa. Acta vet. Scand 12, pp. 125-127. 21. Ditto (1992), Theory of spermatozoa freezing - artifial insemination for cattle-association of livestock technology, Tokyo. 22. Fraser L., Gorszczaruk K., Strzezek J.( 2001), Relationship between motility and membrane integrity of boar spermatozoa in media varying in osmolality, Reprod Domest Anim 36, pp. 325-329. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 85 23. Gilmore J.A., Du J., Tao J., Peter A.T., Critser J.K.( 1996), Osmotic properties of boar spermatozoa and their relevance to cryopreservation, J Reprod Fertil 107, pp. 87-95. 24. Gottardi .L.L., Brend and l. Zanelli.(1980), Proceedings of congress on animal reproduction and artificial insemination,Vol.(5-1980), pp. 53. 25. Graham, E.F., A.H.J. Rajamannan, M.K.L. Schmehl. M. Maki-Laurila, and R.E. Bower.( 1971), Preliminary report on procedure and rationale for freezing boar semen. A.I. Digest 19,pp. 12. 26. Hirosi Masuda. (1994), Artificial insemination for Swine, manual of feeding management for pigs, National institute of animal husbandry, pp. 4-8. 27. Iritani A.( 1989), “Problems of freezing spermatozoal different species”. 9 th international congress on animal reproduction and artificial insemination, Madrrid. 28. Ito, Niwa, Kudo. ( 1984), Artificial insemination. 29. Joaquín Gadea. (2003), Semen extenders used in theartificial insemination of swine, Spanish Journal of Agricultural Research, 1(2), pp. 17-27 30. Kim In Cheul (2007), Artificial insemination of swine, National livestock research institute, Korea,. 31. Majur (1989), Fundamental aspects of the freezing of cells with emphasis on mammalian ova and embryos, 9 th international congress on animal reproduction and artificial insemination, Madrrid. 32. Milovanov V.K.(1962), Biology Vosporoizvedenija. Iskustvennoe Osemenenie Zhivotnykh. Izdatel'stvo Sel'skokhozjzjstvennoj. Literatury, Zhurnalov I Plakatov. Moskva, Russian. 33. Paquignon M, Courot M (1976), Fertilizing capacity of frozen boar spermatozoa, 8 th International Congress on Animal Reproductive Artificial Insemination, Cracow, Poland 4, pp. 1041- 1044. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 86 34. Polge, C. Salamon, S. and I. Wilmut (1970), Fertilizing capacity of frozen boar semen following surgical insemination,Vet. Rec 87, pp. 424-428. 35. Pursel, V.G. and L.A. Johnson (1971), Fertility with frozen boar semen. J. Anim. Sci 33, pp. 265. 36. Pursel, V.G. and L.A. Johnson (1975). Freezing of boar spermatozoa: Fertilizing capacity with concentrated semen and a new thawing procedure. J. Anim. Sci 40, pp. 99-102. 37. Pursel, Schulman and Johnson, Effect of Orvus ES Paste on Acrosomee Morphology, Motility and Fertilizing Capacity of Frozen-Thawed Boar Sperm. J. Anim Sci 47, pp. 198-202. 38. Pursel and Johnson (2004), Boar semen cryopreservation protocol, J Anim Sci, 40(1), pp. 99-102. 39. Rigau T., Piedrafita J., Reverter J., Canal M., Rodríguez-Gil J.E (1996). The rate of L-lactate production: a feasible parameter for the fresh diluted boar semen quality analysis. Anim Reprod Sci 43, pp. 161-172. 40. Sanada and saito (1978), Artificial insemination of livestock. The fourth edition, Niwa et al, Tokyo, pp. 154. 41. Sellés E, Gadea J, Romar R, Mators C, Ruiz S (2003). Analysis of in vitro fertilizing capacity to evaluate the freezing procedures of boar semen and to predict the subsequent fertility. Reprod Domest Anim 38, pp. 66 -72. 42. Teresa Cremades, Jordi Roca, Heriberto Rodriguez-Martinez, Teresa Abaigar, Juan M. Vazquez and Emilio A. Martinez.( 2005), Kinematic changes during the cryopreservation of boar spermatozoa. J Androl 26, pp. 610-618. 43. Torahiko IIDA (1994), Artificial insemination, pp. 153 - 162. 44. Tsutsui, Hori, Komoriya, Shimizu, Nagakubo, Kawakami (2000), Effect of Addition of Orvus ES Paste to Frozen Canine Semen Extender on Sperm Acrosomees. J Vet Med Sci,; Vol.62; No.5, pp. 537-538. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 87 45. Wagner, H.G., and M. Thibier (2000), World statistics for artificial insemination in small ruminants and swine, Proc. 14th ICAR, 2(15), pp. 3. 46. Weize. K.F.( 1991), Cryobiological aspect of sperm conservation, Gusta ficher, Verlag, Jena. 47. Zimmerman. DR (1986), Role of subtherapentic antimicrobial in big production, J.Anim.Sci.62, (supple 3) : 6. III. TÀI LIỆU TIẾNG PHÁP 48. P. Thilmant (2001), Congélation du sperme de verrat en paillettes fines de 0,25 ml. Porcine en France 33, pp. 151-156. IV. TÀI LIỆU TIẾNG ĐỨC 49. Telesforo Bonadonna (1967), Fisiopatologia de la reproduccion y de la fecundacion artificial de los animales domesticos, Redicion revolucionaria, La Habana 8, pp. 249. 50. Westendorf. P, Ritcher.L, Treu H, (1975). Zur Tiefgefrierung von Ebersperma. Labor-und Besamungsergebnisse mit dem Hỹlsenberger Paillettenverfahren. DtschTierojrztl Wschr 82, pp. 261–267. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 88 PHỤ LỤC Phƣơng pháp nghiên cứu một số chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng của tinh dịch lợn trƣớc khi đông lạnh Các chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch lợn đƣợc nghiên cứu theo phƣơng pháp thƣờng quy và phần mềm Spermvision 3.0. 1. Phƣơng pháp nghiên cứu hoạt lực tinh trùng (A, %) Hoạt lực tinh trùng đƣợc nghiên cứu dựa trên việc sử dụng phần mềm Sperm Vision 3.0. - Phần mềm Sperm Vision giúp phân tích các chỉ tiêu về tinh dịch trực tiếp và chính xác. Hệ thống Sperm Vision có cấu tạo gồm: + Kính hiển vi phản pha + Camera kỹ thuật số tốc độ cao + Máy tính có hệ thống Graphics PC card chuyên dụng + Bộ phận sƣởi ấm tự động + Phiến kính chuyên dụng dùng một lần + Micro pipet 10 – 100µl + Phần mềm chạy trên chƣơng trình Window XP Cách tiến hành : Bật máy. Nhấn chuột vào biểu tƣợng Sperm Vision Màn hình hiển thị trang Sample ( mẫu ). Khai báo các yêu cầu: + Time ( Thời gian : ngày, tháng, giờ ) tự động hiển thị. + Donor ID ( Đặc điểm của gia súc lấy mẫu ). + Donor name ( Tên của gia súc lấy mẫu ). + Breed ( Giống ). + Tech ( Kỹ thuật viên ). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 89 + Evat. Tech ( Kỹ thuật đánh giá ). + Extender ( MôI trƣờng sử dụng để pha loãng ). Bấm chuột vào ô New sample ( Mẫu mới ). Màn hình hiển thị lên trang: New sample entry ( Khai báo các yêu cầu của mẫu mới ). Phải khai báo các mục: + Ngày kiểm tra ( tự động ). + Giờ kiểm tra ( tự động ). + Donor ID : số hiệu gia súc kiểm tra. + Tech : kỹ thuật viên + Eval. Tech : kỹ thuật đánh giá + Đơn vị lƣợng tinh kiểm tra + Extender use : môi trƣờng pha loãng khi kiểm tra Nếu không khai báo đầy đủ phần mềm sẽ không chạy và có câu hỏi đƣợc đƣa ra. Bấm vào ô “ OK” Màn hình hiển thị trang : Mobility Analysis ( phân tích hoạt lực ). + Nhấn chuột vào cửa sổ giống ( Breed ). Chọn mục con giống nào sẽ kiểm tra ( phần này đã đƣợc cài đặt sẵn trong trƣơng trình từng con giống ). + Nhấn chuột vào ô Dilution radio để chọn tỉ lệ pha loãng phù hợp với tỉ lệ đã pha mẫu kiểm tra. Màn hình hiển thị hình ảnh sẽ hiện khi kiểm tra và một bảng các chỉ tiêu kiểm tra. Chuẩn bị tiêu bản : Nhỏ một lƣợng 20 microlit mẫu vào phiến kính đã có sẵn. Đƣa phiến kính đã chuẩn bị sẵn lên kính hiển vi. Điều chỉnh độ nét Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 90 Nháy chuột vào ô cửa sổ Analyze kết quả sẽ đƣợc tự động hiển thị trên màn hình cả về hình ảnh và số liệu. Di chuyển sang vị trí khác để kiểm tra bằng cách nhấn chuột vào ô field và tiếp tục nhấn chuột vào ô Analyze để phân tích tiếp. Đối với lợn mỗi mẫu làm 3 lần ( 3 field ). Các số liệu sẽ đƣợc tự động tính toán theo từng field và trung bình. Các số liệu và hình ảnh sẽ đƣợc lƣu giữ lại và chuyển về một field dữ liệu. Field này có thể chuyển sang phần Exel để tính toán . Hết 3 Field thì tự động hiển thị lên phần kiểm tra kì hình trực tiếp trên một Field và cho kết quả. Những số liệu và những vấn đề liên quan đến gia súc kiểm tra đƣợc khai báo vào thƣ mục tƣơng ứng. Các chỉ tiêu kì hình và tỉ lệ tinh trùng sống, chết kỹ thuật viên phải trực tiếp quan sát trên màn hình và nhấn chuột vào vị trí của từng tinh trùng và máy tính sẽ tự động ghi lại và tính toán. Những tinh trùng chết đƣợc đánh dấu một chấm đỏ ở đầu, những tinh trùng kỳ hình kỹ thuật viên phải phân loại và nhận biết chính xác. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu nồng độ tinh trùng (C, triệu/ml) Nồng độ tinh trùng đƣợc đánh giá bằng máy so màu SDM-S của hãng Minitub (Đức). Cách đánh giá nhƣ sau: - Bƣớc 1: đặt phƣơng pháp đo Sử dụng phƣơng pháp 3 để đo nồng độ tinh trùng của lợn - Bƣớc 2: đo mật độ quang của nƣớc muối sinh lý Cho vào cuvet 3,5ml nƣớc muối sinh lý để đo - Bƣớc 3: so màu để tìm nồng độ tinh trùng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 91 Lấy một cuvet sạch khác, cho vào đó 3,5ml nƣớc muối sinh lý và 70μl tinh dịch. Lắc nhẹ cho đều mẫu rồi đƣa vào máy để so màu. - Bƣớc 4: đọc kết quả trên màn hình 3. Phƣơng pháp nghiên cứu áp suất thẩm thấu Đo ASTT của tinh dịch lợn trên máy đo tự động Osmometer Type 5 của hãng Minitub (Đức). Cách tiến hành: bật máy lên, máy khởi động 3 – 5 phút, trên màn hình hiển thị dãy số 9999, cho 0,1ml tinh dịch cần khảo sát vào tuýp nhựa chuyên dụng của máy, sau đó lắp vào đầu đo và đặt vào vị trí đo, lúc này máy tự hoạt động theo chƣơng trình, trên màn hình của máy hiển thị các dãy số giảm dần từ số (+) đến số (-). Khi dãy số chỉ – 800 máy tự động phát tín hiệu tút…tút…tút…liên tục báo hiệu cho kỹ thuật viên chuẩn bị thao tác nâng kim kích đông lên vị trí quy định. Khi màn hình hiện số – 1000 nhanh chóng thao tác đƣa kim kích đông vào vị trí và sau đó nhấc kim ra vị trí ban đầu, thời gian kích đông là 0,5 giây. Sau thời gian kích đông, màn hình sẽ hiển thị các dãy số, các dãy số này có giá trị (+) và giảm dần, khi dãy số dừng hoặc dao động xung quanh một giá trị nào đó, ta xác định đƣợc kết quả. Dãy số trên màn hình lúc này chính là giá trị áp lực thẩm thấu của dung dịch. Chú ý: trƣớc mỗi lần đo cần chỉnh máy bằng cách đo áp suất thẩm thấu của nƣớc cất. Nƣớc cất có ( ASTT ) là 0 và chỉnh về vị trí 0 trên máy. 1miniosmol = 0,00186 0 C = 0,0224 atm. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu tỷ lệ tinh trùng kỳ hình - Phƣơng pháp: làm tiêu bản cố định và quan sát trực tiếp trên màn hình vi tính của phần mềm Sperm Vision. Lấy hai phiến kính rửa sạch, sấy khô, nhỏ một giọt tinh dịch lên một phiến kính, dùng phiến kính kia gạt cho tinh dịch dàn đều và mỏng. Để hong khô ngoài không khí khoảng 5 phút. Sau đó đƣa lên kính hiển vi của hệ thống Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 92 máy Sperm Vision. Quan sát và đếm tổng số tinh trùng, số tinh trùng kỳ hình trên mỗi vi trƣờng. Sau đó xử lý thống kê để đánh giá tỷ lệ tinh trùng kỳ hình. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 93 Bình nitơ dùng trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Tủ bảo ôn dùng trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 94 Máy đo áp suất thẩm thấu tinh dịch lợn Máy ly tâm tinh dịch lợn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 95 Hệ thống phần mềm Spermvision dùng đánh giá các chỉ tiêu của tinh trùng Một số hóa chất dùng trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 96 Môi trƣờng đông lạnh dùng trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 97 Kiểm tra chất lƣợng tinh dịch trƣớc và sau đông lạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 98 Tinh dịch sau cân bằng đƣợc đóng vào cọng rạ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 99 Tinh dịch sau khi đã đƣợc đóng vào cọng rạ Đông lạnh tinh dịch trong Nitơ lỏng (- 1960C) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 100 Giải đông tinh cọng rạ Đàn lợn con đƣợc sinh ra bằng TTNT tinh cọng rạ đông lạnh