Luận văn Nghiên cứu vai trò của một số polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv.) nuôi cấy in vitro

môi trường bô sung Spd ở các nồng độ 0, 10, 50, 100, 150 và 200 µM; a1, b1, c1, d1, e1, f1: hình chụp soi nổi tương ứng với a, b, c, d, e, f. Trong nghiên cứu này, hiệu quả cao hơn và hai khó khăn trên được khắc phục khi dùng nồng độ cao hơn 150 µM Spd trên đối tượng mô sẹo xốp có nguồn gốc từ lá sâm Ngọc Linh in vitro. Bais và Ravishankar (2002) cho rằng trong số các PA, Spd có mối quan hệ với khả năng phát sinh hình thái in vitro; đồng thời, làm tăng nồng độ Spd được chứng minh là chất chỉ thị năng lực của tế bào trong quá trình phát sinh phôi ở một số loài gồm Solanum melongena, Oryza sativa, Medicago sativa và Panax gingseng [Yadav và Rajam, 1997; Monteiro et al., 2002]. Chỉ bổ sung Spd vào môi trường nuôi cấy bị xử lý với các chất ức chế tổng hợp PA đã làm phục hồi khả năng phát sinh phôi vô tính ở cây cà rốt hoang dại [Hadrami và D’Auzac, 1992]. 3.6.3. Ảnh hưởng của Spermine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh Bổ sung Spm vào môi trường nuôi cấy, kết quả thu được cho thấy số phôi/mẫu và tỉ lệ phát sinh phôi của mẫu cao nhất ở nồng độ 150 µM (đạt 55 phôi/mẫu, 90% mẫu cảm ứng phôi) so sánh với đối chứng thì số phôi/mẫu và tỉ lệ phát sinh phôi gấp 3,93 và 1,29 lần; tương ứng. Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê ở chỉ tiêu khối lượng tươi của mẫu ở hai nghiệm thức bổ sung 150 và 200 µM Spm. Trên các môi trường bổ sung Spm nồng độ thấp (10, 50, 100 µM) hoặc mức cao (200 µM) thì cả ba chỉ tiêu theo dõi đều tăng so với đối chứng nhưng không quá rõ rệt (Hình 3.6.3). Bảng 3.6.3. Ảnh hưởng của Spm lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh Spm (µM) Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%) Số phôi/mẫu Khối lượng tươi (mg) Đặc điểm phôi 0 70,00 14,00d 513,00d Hình cầu, tim,t hủy lôi, hai lá mầm 10 76,67 16,68d 642,33c Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm 50 83,33 23,67c 798,33b Hình cầu, hình tim, hình thủy lôi. 100 86,67 36,33b 820,33a Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm 150 90,00 55,00a 883,67a Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm, cây 200 83,33 39,33b 807,33b Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Ghi chú: Các kí tự khác nhau (a,b,) trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt với  = 0,05 theo phép thử Duncan. Hình thái phôi vô tính sâm Ngọc Linh được ghi nhận gồm tất cả các dạng phôi hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm. Kích thước phôi to hơn, đồng đều, màu sáng hơn, không có phôi biến dị được ghi nhận (Hình 3.6.3). Nghiên cứu này cũng ghi nhận hiện tượng các khối hình cầu trên các mô sẹo sau hai tuần nuôi cấy đã phát triển thành rễ. Điều này được giải thích là có thể do vai trò cytokinine của PA. Gần đây Couée và cộng sự (2004) đã báo cáo rằng PA có tham gia vào việc hình thành rễ phụ và rễ bất định. Ở giai đoạn cảm ứng của rễ bất định ở nhiều loài cây gỗ như là Prunus avium [Biondi et al., 1990], Populus tremula L. x P. tremuloides L. [Hausman et al., 1995], Pyrus communis [Baraldi et al., 1995] và Juglans regia [Heloir et al., 1996] đều có liên quan tới các PA ngoại sinh. Nghiên cứu trên cây Olea europaea L. cho thấy các PA ngoại sinh có hiệu quả tích cực lên sự cảm ứng hình thành rễ của đoạn vi cắt [Rugini, 1992; Grigoriadou et al., 2002], bởi sự có mặt của chúng trong các mô phân sinh và mô phát triển cùng với cytokinine đã được đánh dấu [Benedetta et al., 2006]. Hình 3.6.3. Ảnh hưởng của Spm lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh. a, b, c, d, e, f: mẫu mô sẹo trên môi trường bổ sung Spm ở các nồng độ 0, 10, 50, 100, 150 và 200 µM; a1, b1, c1, d1, e1, f1: hình chụp soi nổi tương ứng với a, b, c, d, e, f. Ảnh hưởng của Spm lên quá trình phát sinh phôi vô tính đã được đề cập trong rất nhiều các nghiên cứu trước đây. PA có thể thay thế hiệu quả của auxin như 2,4-D. Thêm PA gồm Put và Spm vào môi trường nuôi cấy phôi làm tăng nồng độ auxin nội sinh IAA và liên hệ tích cực với tần suất phát sinh phôi. Điểm đáng chú ý là không giống hiệu quả của 2,4-D, PA khắc phục sự phát triển dị thường của phôi vô tính trong suốt quá trình trưởng thành của phôi [Silveir et al., 2004]. Nghiên cứu này không phát hiện ra hình thái phôi dị thường trên môi trường có Spm, Put và cả Spd (Hình 3.6.4). Hình 3.6.4. Một số cây con tái sinh từ mô sẹo xốp trên môi trường đối chứng (a), Spd (b,c), Put (d) và Spm (e); a: cây con biến dị không hình thành lá mầm hoặc toàn cây là bản dẹp trên môi trường đối chứng; b, c, d, e: các cây con với đầy đủ rễ, thân, lá. Nhiều tác giả đã đi sâu nghiên cứu và quan sát sự thay đổi các PA và enzyme tổng hợp nên chúng trong suốt quá trình phát triển phôi vô tính [Minocha et al., 2004] và PA trong tương tác với các con đường khác như tạo NO, trao đổi ABA Từ đó chỉ ra Put là PA chủ yếu trong các mô tiền phát sinh phôi, trong khi Spd biểu hiện mạnh trong suốt quá trình phát triển phôi và có hiệu quả mạnh nhất [Kevers et al., 2000]. Put có liên quan đến sự hình thành phôi vô tính mới, trong khi, Spd và Spm kích thích phát triển và trưởng thành của phôi vô tính ở Ocotea catharinensis [Santa-Catarina et al., 2007]. Sự thay đổi trong tỷ lệ Spd/Put hay Spm/Put cũng được phân tích, so sánh trong mối quan hệ với hoạt động của hai enzyme ADC và ODC. ADC và ODC hoạt động mạnh trong phôi dạng thủy lôi và giữ nguyên hoạt động khi phôi ở dạng hai lá mầm và hoạt động của SAMDC giảm dần trong suốt quá trình phát triển phôi cây Picea rubens Sarg. [Minocha et al., 2004]. Trong quá trình phát triển phôi giai đoạn sớm, hàm lượng PA gồm Put và Spm cao xuất hiện ở các trục phôi; trong khi, ở trạng thái lá mầm mở ra hàm lượng Spd cao, đồng thời Put giảm xuống [Astarita et al., 2003]. Ở cây Araucaria angustifolia, Put nội sinh nhiều nhất, sau đó là Spd và Spm. Các PA hoạt động theo những con đường khác nhau về tăng trưởng, phát triển hình thái và sinh tổng hợp NO. Spd và Spm ngoại sinh làm giảm sự tăng trưởng của tế bào và cho phép tiến hóa hình thái từ các cụm tế bào ở trạng thái tiền phôi. Put làm tăng NO giải phóng ra môi trường nuôi cấy trong khi Spd, Spm lại ức chế quá trình này. Sinh tổng hợp NO có liên quan tới sự phân cực tế bào ở giai đoạn tiền phôi [Silveira et al., 2006]. Ảnh hưởng của Arg, Spm hoặc sự kết hợp giữa 3 loại PA ở cây thông Hevea brasiliensis được Hadrami và D’Auzac (1992) cho thấy sự tăng cảm ứng các mô sẹo gia tăng trong suốt quá trình thêm vào các chất trên, đặc biệt là sự kết hợp cả 3 PA là tốt nhất. Giữa các PA, Spd có liên hệ nhiều nhất tới khả năng phát sinh hình thái in vitro [Bais và Ravishankar, 2002]. Nồng độ 1 mM Put cho khối lượng tươi và số lượng phôi vô tính lớn nhất trong khi ở nồng độ thấp hơn 0,1 µM Spm và Spd cho hiệu quả cao trên cây Momordica charantia L. có thể là vì các PA đã ức chế hoạt động của ODC bằng enzyme ODC-antizyme [Theiss et al., 2002]. Thêm cả 3 PA ở nồng độ 1 mM/l riêng lẻ đều làm tăng tần suất và số lượng phôi vô tính trên cây ổi, quá ngưỡng 1 mM làm ức chế quá trình này [Nasim, 2013]. Các PA ngoại sinh (đặc biệt là Put) được thêm vào môi trường nuôi cấy cây Araucaria angustifolia đã hoạt động như là tín hiệu phân tử, gây nên tín hiệu stress đáp ứng, kết quả là tích lũy ABA. Sự tổng hợp ABA là con đường quan trọng trong phát triển phôi vô tính ở các cây lá kim [Stasolla và Yeung, 2003] vì ABA liên quan đến sự biểu hiện của gene dự trữ protein và protein trong phôi muộn LEA (Late embryogenesis abundant) bên trong các hạt sau khi phôi biệt hóa [Wise và Tunnacliffe, 2004] đồng thời làm xuất hiện tượng ngả màu vàng bởi sự sinh trưởng chậm và già hóa của phần lớn các cụm mô sẹo [Tautorus et al., 1991]. 3.7. PHÂN TÍCH POLYAMINE NỘI SINH Nghiên cứu các PA nội sinh là tiền đề cho các nghiên cứu về chức năng của PA lên sự sinh trưởng và biệt hóa tế bào; đồng thời có thể là một mục tiêu hữu ích trong việc điều khiển dòng PA nội sinh – có mối liện hệ với năng lực sinh phôi ở nhiều loài thực vật đã được chứng minh [Takeda et al., 2002]. Hàm lượng của các PA nội sinh (Put, Spd, Spm) ở các giai đoạn phát triển mô sẹo và cụm phôi sâm Ngọc Linh khác nhau được phân tích bằng phương pháp HPLC. Kết quả phân tích PA nội sinh trong các mẫu được thể hiện ở Biểu đồ 3.1. Kết quả cho thấy cả 3 loại PA đều xuất hiện trong cụm mẫu ở đối chứng và bổ sung 150 µM Spd với hàm lượng khác nhau, tùy giai đoạn nuôi cấy. Trong đó, Put luôn là PA chứa nồng độ cao nhất, theo sau là Spd và thấp nhất là Spm. Việc bổ sung Spd vào môi trường nuôi cấy khiến nồng độ các PA nội sinh đều tăng cao so với đối chứng ở các thời điểm ngày 7, 14 và 21. Lượng PA tổng đều tăng sau 1 tuần nuôi cấy và giảm ở các tuần sau đó (Biểu đồ 3.1). Môi trường đối chứng MS được bổ sung 1 mg/l 2,4-D, 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin. Tại thời điểm ngày 0, trong suốt quá trình cảm ứng phôi từ mô sẹo có khả năng phát sinh phôi, Spd chiếm tỉ lệ cao nhất trong khi Put nhỏ nhất. Tại thời điểm ngày 7, khi các mô sẹo này tiếp tục tăng sinh thì Put tăng gấp 7,76 lần so với tuần 0. Sau 2 tuần nuôi cấy khi các cấu trúc hình cầu xuất hiện trong đám mô sẹo, Put giảm gần 2 lần. Put tiếp tục giảm sau 4 tuần nuôi cấy song vẫn cao hơn so với thời điểm ngày 0. Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi hàm lượng PA ở các giai đoạn phát triển cụm mô phôi ở sâm Ngọc Linh trên môi trường đối chứng (A) và môi trường bổ sung 150 µM Spd (B) (lấy mẫu tại các thời điểm 0, 7, 14, 21 ngày nuôi cấy trên môi trường tạo phôi). Đối với mẫu có bổ sung 150 µM Spd: Ở thời điểm ngày 0, nồng độ Put nội sinh tăng lên song cả Spd và Spm đều giảm xuống so với đối chứng. Trong đó, Spd chiếm nồng độ cao nhất, tương tự với đối chứng. Song Spm lại có nồng độ nhỏ nhất. Sau một tuần nuôi cấy, Put và Spd nội sinh tăng vượt bậc, trong khi nồng độ Spm tăng không đáng kể. Cả 3 loại PA đều giảm từ cuối tuần nuôi cấy thứ 2 sang tới cuối tuần thứ 3, khi các mầm phôi hình cầu xuất hiện trên đám mô sẹo, nồng độ Put và Spd tiếp tục giảm mạnh trong khi Spm không đổi. Như vậy thêm Spd vào môi trường nuôi cấy thúc đẩy quá trình thành thục của phôi sâm Ngọc Linh. Kết quả này tương tự báo cáo của Kevers (2000) và cộng sự trên đối tượng Panax gingseng. Quan sát thấy sự tăng cao đột biến của hàm lượng Put so với Spd và Spm. Điều này có thể được giải thích là do hoạt động mạnh của enzyme ODC hoặc enzyme ADC sinh tổng hợp nên Put [Slocum et al., 1984; Yadav và Rajam, 1998]. Đồng thời, trong quá trình chuyển hóa Put, một lượng nhỏ Spd được enzyme polyamine oxidase xúc tác cho quá trình tổng hợp ngược Spd thành Put (xem Hình 1.4 – Vật liệu và Phương pháp). Mẫu cấy trên môi trường bổ sung Spd có sự tăng hàm lượng Put rất cao so với đối chứng gấp 18 lần (238,1 µg/kg) ở ngày 7; 26 lần (185,2 µg/kg) ở ngày 14 và 10 lần (44,1 µg/kg) ở ngày 21. Nồng độ Put nội sinh cao có liên quan tới sự giảm tăng trưởng tế bào đã được nghiên cứu trong môi trường huyền phù cây Pinuss taeda [Silvera et al., 2004] và mô sẹo của cây thuốc lá Nicotiana tabacum [Rastogi và Davies, 1991]. PA có vai trò cả như auxin và cytokinine. Put là PA có nồng độ cao nhất trong các cụm mô sẹo có khả năng phát sinh phôi và trong huyền phù tế bào của cây Pinus taeda [Silveira et al., 2004]. Sự phát sinh phôi vô tính của thực vật ví dụ cà rốt thì đi kèm với sự tăng cường trao đổi chất các PA [Minocha và Minocha, 1995]. Nghiên cứu của Bastola và Minocha (1995) cho thấy điều khiển sự trao đổi chất các Put mở đầu cho việc tạo thành phôi vô tính. Hàm lượng PA tổng (đường gấp khúc trên biểu đồ) cũng được ghi nhận là có sự tương quan với hàm lượng Put nội sinh. PA tổng tăng từ tuần đầu nuôi cấy cho tới tuần 2 thì đạt đỉnh và suy giảm vào 2 tuần nuôi cấy sau đó. Bổ sung các PA ngoại sinh dẫn đến giảm lượng PA nội sinh cũng đã được báo cáo bởi Thiruvengadam và cộng sự (2013) ở cây Momordica dioica Roxb. Ex. Willd. Hiện tại ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào đề cập tới vấn đề PA nội sinh ở cây sâm Ngọc Linh. Do đó, hiểu biết về cơ chế tác động của PA giúp chúng ta có thể can thiệp sâu hơn vào quá trình phát sinh phôi vô tính ở loài thực vật quý này. 3.8. GIẢI PHẪU CÁC DẠNG HÌNH THÁI PHÔI KHÁC NHAU CỦA SÂM NGỌC LINH Quá trình nuôi cấy tạo phôi vô tính thông thường được tiến hành trên môi trường có auxin (gồm 2,4-D là chủ yếu), sau đó chuyển sang môi trường có nồng độ auxin thấp hoặc không có auxin để phôi hình thành và trưởng thành. Các phôi có định hướng cực rõ ràng, có lá mầm đầy đủ và trục phôi rõ ràng thì dễ dàng phát triển thành cây con so với các phôi dị hình khác (Lazzeri et al., 1987; Hartweck et al., 1988; Cruz et al., 1990; Wetzstein và Baker, 1993; Rodriguez và Wetzstein, 1994). Tuy nhiên, quá trình kéo dài trên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng thường làm xuất hiện các thể phôi biến dị và hiển nhiên dẫn đến chất lượng phôi vô tính kém, không đảm bảo khả năng sống sót và sinh sản của cây con sau này. Hạn chế được số lượng biến thể phôi vô tính trong quá trình tạo phôi sẽ là tiền đề để tạo ra số lượng lớn cây con khỏe mạnh cung cấp cho nghiên cứu và thực tiễn, đặc biệt là đối với sâm Ngọc Linh. Do đó, chúng tôi đã tiến hành giải phẫu các trạng thái phôi khác nhau trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D; 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kinetine dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét theo các quy trình đã nêu ở Chương 2. Sau tuần nuôi cấy đầu tiên, những thay đổi hình thái được ghi nhận cho thấy hình dạng và kích thước của một số tế bào mô sẹo trong mẫu cấy có nhiều thay đổi (Hình 3.7 a). Trong đó, các tế bào mô sẹo có kích thước lớn, các hình dạng khác nhau, sắp xếp lỏng lẻo và phân chia theo nhiều hướng khác nhau (Hình 3.7 a2). Trên bề mặt mô sẹo có hình thành các cấu trúc nốt hình cầu (Hình 3.7 b1) màu vàng đậm hơn, nổi bật trên đám mô sẹo. Theo các nghiên cứu thì đây là cấu trúc tiền phôi PEM (Proembryogenics mass). Các PEM nằm ở ngoại vi của khối mô sẹo và xen kẽ với các tế bào mô sẹo có không bào lớn (Hình 3.7 b2, f). Hình 3.7. Sự thay đổi hình thái và cấu trúc trong quá trình phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh. a1, a2, e: mô sẹo sau 1 tuần nuôi cấy; b1, b2, f: các khối tiền phôi trên bề mặt mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy; c: tế bào được nhuộm bằng acetocarmine (bắt màu đỏ) và Evan’s blue (bắt màu xanh); d: các tế bào chứa hạt tinh bột bắt màu xanh tím khi nhuộm với thuốc nhuộm IKI; g1., g2: các cấu trúc phôi hình cầu với tầng nguyên bì bao bọc bên ngoài; h1, h2: phôi hình tim sớm với sự xuất hiện của hệ thống mạch dẫn; i1, i2, i3, i4: phôi ở các giai đoạn hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và lá mầm; j1: một số phôi có hình thái bất thường (không có lá mầm, lá mầm hình loa kèn, lá mầm hình cổ áo); j2: phôi vô tính có cấu trúc bình thường tương tự như phôi hữu tính; k: cây con có nguồn gốc từ phôi vô tính. KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã đạt được một số kết quả như sau: Lá tạo mô sẹo có khả năng phát sinh phôi tốt nhất trong 3 nguồn mẫu. SH½ có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 1 mg/l NAA là thích hợp nhất để tạo mô sẹo xốp. Nồng độ 1 mg/l 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kin trong môi trường MS là phù hợp nhất để cảm ứng tạo phôi vô tính từ mô sẹo xốp. Điều kiện nuôi cấy lỏng lắc sử dụng môi trường MS bổ sung 1 mg/l 2,4-D; 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin cho hiệu quả tái sinh phôi cao hơn nuôi cấy đặc có cùng thành phần. Cảm ứng tạo phôi trong điều kiện chiếu sáng có hiệu quả hơn nuôi cấy trong tối. Arg và Orn có hiệu quả thấp lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp. Cả 3 loại PA cho hiệu quả tạo phôi vô tính cao. Nồng độ phù hợp nhất của Put, Spd và Spm lần lượt là 100, 150, 150 µM. Trong đó bổ sung 150 µM Spd vào môi trường MS có chứa 1 mg/l 2,4-D; 0,5 mg/ NAA và 0,2 mg/l Kin cho hiệu quả cao nhất. KIẾN NGHỊ Trong quá trình tiến hành đề tài, chúng tôi chỉ mới dừng lại ở việc nghiên cứu khả năng hình thành và tần suất phát sinh phôi vô tính trong một số điều kiện nhất định.Vì vậy, nhằm hoàn chỉnh quy trình nhân giống vô tính loài sâm Ngọc Linh, chúng tôi đề nghị tiếp tục thực hiện các nghiên cứu sau: Nghiên cứu ảnh hưởng của các PA riêng lẻ hoặc kết hợp trong các hệ thống lỏng lắc khác nhau lên sự hình thành phôi vô tính sâm Ngọc Linh. Phân tích hàm lượng của các PA ở các nồng độ khác nhau trong mối tương quan với sự trưởng thành của phôi vô tính. Đồng thời nghiên cứu hoạt động của các enzyme sinh tổng hợp PA gồm ODC, ADC và SAMDC trong quá trình cảm ứng và hình thành phôi sâm Ngọc Linh. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài Liệu Tiếng Việt [1]. Bùi Văn Thế Vinh, Vũ Thị Thủy, Thái Thương Hiền, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt (2014), “Nghiên cứu hình thái giải phẫu và cấu trúc phôi trong quá trình phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 12(7), 1140-1148. [2]. Dương Tấn Nhựt (2007), Công nghệ sinh học thực vật, tập 1. NXB. Nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh. [3]. Dương Tấn Nhựt, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Trực, Nguyễn Bá Nam, Trần Xuân Tình, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Văn Bình, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Lê Nữ Minh Thùy, Lý Thị Mỹ Nga, Thái Thương Hiền, Nguyễn Thành Hải (2010a), “Nhân giống vô tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3B), 1211- 1219. [4]. Dương Tấn Nhựt, Lâm Thị Mỹ Hằng, Bùi Thế Vinh, Phan Quốc Tâm, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Hoàng Xuân Chiến, Lê Nữ Minh Thùy, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Văn Bình, Vũ Quốc Luận, Trần Công Luận, Đoàn Trọng Đức (2010b), “Xác định hàm lượng saponin và dư lượng một số chất điều hòa sinh trưởng trong callus, chồi và rễ sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(2), 189-202. [5]. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thành Hải, Nguyễn Đức Huy, Lương Ngọc Thuận (2007) “Bài tổng quan: Sự phát sinh phôi của các tế bào sinh dưỡng thực vật”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2), 133-149. [6]. Hà Thị Loan, Dương Hoa Xô, Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Hoàng Quân, Vũ Thị Đào, Nathalie Pawlicki-Jullian, Eric Contier (2014), “Nghiên cứu tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis bằng phương pháp chuyển gen Rol nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes”, Tạp chí Sinh học 36(1se): 293-300. [7]. Hà Thị Mỹ Ngân, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Bá Nam, Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Hồng Hoàng, Ngô Thanh Tài, Nguyễn Đình Trọng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Dương Tấn Nhựt (2013), “Chuyển gen tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 11(3), 479-486. [8]. Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Bá Nam, Hoàng Xuân Chiến, Lê Kim Cương, Ngô Thanh Tài, Nguyễn Việt Cường, Nguyễn Phúc Huy, Dương Tấn Nhựt (2013), “Tối ưu hóa một số yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến quá trình tái sinh rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Báo cáo khoa học Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013. [9]. Hoàng Xuân Chiến, Ngô Thanh Tài, Nguyễn Bá Trực, Trần Xuân Tình, Lâm Bích Thảo, Trần Công Luận, Dương Tấn Nhựt (2011), “Nghiên cứu một số yếu tố tạo củ sâm Ngọc Linh ( Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro và xác định hàm lượng saponin trong cây tạo từ củ trồng thử nghiệm ở núi Ngọc Linh”. Tạp chí Công nghệ sinh học 9(3), 325-339. [10]. Lê Kim Cương, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Trịnh Thị Hương, Dương Tấn Nhựt (2012), “Ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng tăng sinh mô sẹo “xốp” và bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Tạp chí Sinh học 34(3se), 265-276. [11]. Mai Trường, Trần Thị Ngọc Hà, Phan Trường Lộc, Lê Tấn Đức, Trần Trọng Tuấn, Đỗ Đăng Giáp, Bùi Đình Thạch, Phạm Đức Trí, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Kết, Trần Công Luận, Nguyễn Hữu Hổ (2013), “Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo có khả năng sinh phôi và mô phôi soma sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Tạp chí Sinh học, 35(se), 145-157. [12]. Mai Trường, Trần Thị Ngọc Hà, Trần Trọng Tuấn, Phan Trường Lộc, Đỗ Đăng Giáp, Bùi Đình Thạch, Nguyễn Thị Ngọc Hân, Phạm Đức Trí, Lê Tấn Đức, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Kết, Nguyễn Hữu Hổ (2014), “Tạo và nhân nuôi phôi soma sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường lỏng”, Tạp chí Khoa học và phát triển 12(7), 1085-1095. [13]. Nguyễn Bá Nam, Lý Thị Phương Loan, Trịnh Thị Hương, Dương Tấn Nhựt (2012), “Ảnh hưởng của một số nguồn chiếu sáng nhân tạo lên quá trình phát sinh phôi vô tính và tái sinh cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 10(4A), 923-931. [14]. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, NXB Đại học quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh. [15]. Nguyễn Ngọc Dung (1995), Nhân giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng con đường sinh học, NXB Nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh. [16]. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2011), “Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học, ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 27, 30-36. [17]. Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB. Khoa học Kỹ thuật, thành phố Hồ Chí Minh. [18]. Nguyễn Văn Uyển (2006), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh. [19]. Nguyễn Việt Cường, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Bá Nam, Hà Thị Mỹ Ngân, Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Huy, Dương Tấn Nhựt (2013) Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ và bạc nitrate (AgNO3) lên sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro. Báo cáo khoa học Hội nghị Khoa học và công nghệ sinh học toàn quốc 2013. [20]. Trần Công Luận (2003), “Kết quả nghiên cứu về hóa học sâm Việt Nam”. Hội thảo Bảo tồn và phát triển sâm Ngọc Linh tại tỉnh Quảng Nam, 62-75. [21]. Võ Thị Bạch Mai (2004). Sự phát triển của chồi và rễ. NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. [22]. Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Bùi Văn Thế Vinh, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt (2014), “Phát sinh phôi trực tiếp từ lá, cuống lá và thân rễ cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Tạp chí Sinh học 36(1se), 277-282. Tài Liệu Tiếng Anh [23]. Aboshama H.M.S. (2011), “Somatic embryogenesis proliferation, maturation and germination in Cajanus cajan”, World Journal of Agriculture Sciences 7, 86-95. [24]. Addae-Frimpomaah F., Arkorful E., Tengey T.K. (2014), “The effect of 2,4-D on callus induction using leaf lobe of weet potato as a source of explant”. International Journal of Agronomy and Agricultural Research 5(1), 16-22. [25]. Alcantara G.B., Dibax R., de Oliveira R.A., Carlos J., Filho B., Daros E. (2014), “Plant regeneration and histological study of the somatic embryogenesis of sugarcane (Saccharum spp.) cultivars RB855156 and RB72454”, Acta Scientiarum 36(1), 63-72. [26]. Alcázar R., Altabella T., Marco F., Bortolotti C., Reymond M., Koncz C., Carrasco P., Tiburcio A.F. (2010), “Polyamines: molecules with regulatory functions in plant abiotic stress tolerance”. Physiologia Plantarum 231(6), 1237- 1249. [27]. Ananya P., Kalyan M., Sarmistha S.R. (2009), “Effect of polyamine on in vitro somatic embryogenesis in Momordica charantia L.” Plant Cell, Tissue and Organ Culture 97, 303-311. [28]. Arumugam, N., Bhojwani, S.S. (1990), “Somatic embryogenesis in tissue cultures of Podophyllum hexandrum”, Canadian Journal of Botany 68, 487-491. [29]. Arya S., Arya I.D.I., Eriksson T. (1993), “Rapid multiplication of adventitious somatic embryos of Panax ginseng”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 34, 157-162. [30]. Asad S., Arshad M., Mansoor S., Zafar Y. (2009), “Effect of various amino acids on hoot regeneration of sugarcane (Sacchrum officinarum L.)”, African Journal of Biotechnology 8(7), 1214-1218. [31]. Astarita, L.V., Handro, W., Floh, E.I.S. (2003), “Changes in polyamines content associated with zygotic embryogenesis in the Brazilian pine, Araucaria angustifolia (Bert.) O. Ktze”, Brazilian Journal of Botany 26(2), 163-168. [32]. Aurelia S-J., Aleksandra P., Zygmunt K. (2005), “Influence of cultivar, explant source and plant growth regulator on callus induction and plant regeneration of Cannabis sativa L”, Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 47(2), 145- 151. [33]. Bagni, N., Pistocchi, R. (1991), “Uptake and transport of polyamines and inhibitors of polyamine metabolism in plants”, Biochemistry and Physiology of Polyamines in plants, 105-118. [34]. Bais H.P., Ravishankar G.A. (2002), “Role of polyamines in the ontogeny of plants and their biotechnological applications”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 69, 1-34. [35]. Bais H.P., Sudha G.S., Ravishankar G.A. (2002), “Putrescine and silver nitrate influences shoot multiplication, in vitro flowering and endogenous titers of polyamines in Cichoorium intybus L.”, Journal of Plant Growth Regulation 19, 238-248. [36]. Bais, H.P., Ravishankar, G.A. (2002), “Role of polyamines in the ontogeny of plants and their biotechnological applications”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 69, 1-34. [37]. Baraldi R., Bertazza G., Bregoli A., Fasolo F., Rotondi A., Predieri S., Serafini- Fracassini D., Slovin J., Cohen J. (1995), “Auxins and polyamines in relation to differential in vitro root induction on microcuttings of two pear cultivars”, Journal of Plant Growth Regulation 14, 49-59. [38]. Bastola, D.R., Minocha S.C. (1995), “Increased putrescine biosynthesis through transfer of mouse ornithine decarboxylase cDNA in carrot (Daucus carota L.) promotes somatic embryogenesis”, Plant Physiology 109, 63-71. [39]. Benedetta C., Annalisa T., Nello B., Maria A.G. (2006), “Effect of polyamines on in vitro anther culture of Citrus clementia Hort. ex Tan”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 87(2), 145-153. [40]. Biondi S., Diaz T., Iglesias I., Gamberini G., Bagni N. (1990), “Polyamines and ethylene in relation to adventitious root formation in Prunus avium shoot cultures”, Physiologia Plantarum 78(3), 474-483. [41]. Bögre, L., Stefanov, I., Ábrahám, M., Somogyi, I., Dudits, D. (1990), “Differences in the responses to 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) treatment between embryogenic and nonembryogenic lines of Alfalfa”, Progress in Plant Cellular And Molecular Biology, 427-436. [42]. Bollfill M., Cusido R.M., Palazong J., Canut E., Pinol M.T., Morales C. (2003), “Relationship between peroxidase activity and organogenesis in Panax ginseng calluses”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 73, 37-41. [43]. Borrell, A., Besford, R.T., Altabella, T., Masgrau, C., Tiburcio, A.F. (1996), “Regulation of arginine decarboxylase by spermine in osmotically-stressed oat leaves”, Physiologia Plantarum 98, 105-110. [44]. Borrell, A., Culianez-Macia, F.A., Altabella, T., Besford, R.T., Flores, D., Tiburcio, A.F. (1995), “Arginine decarboxylase is localized in chloroplasts”, Plant Physiology 109, 771-776. [45]. Briskin D., Hanson J.B. (1992), “How does the plant plasma membrane HC- ATPase pump protons?” Journal of Experimental Botany 43, 269-289. [46]. Brown S., Wetherell D.F., Dougall D.K. (1976), “The potassium requirement for growth and embryogenesis in wild carrot suspension cultures”, Physiologia Plantarum 37, 73-79. [47]. Bush D.S. (1995), “Calcium regulation in plant cells and its role in signalling”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 46, 95-122. [48]. Couée I., Hummel I., Sulmon C., Gouesbet G., Amrani A.E. (2004), “Involvement of polyamines in root development”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 76(1), 1-10. [49]. Chengalrayan, K., Mhaske, V.B. and Hazra, S. (1997), “High-frequency conversion of abnormal peanut somatic embryos”. Plant Cell Reports 16(11), 783-786. [50]. Choi Y.E., Woong Y.S. (1997), “Effect of Ammonium ion on morphogenesis from cultured cotyledon explants of Panax ginseng”. Jounal of Plant Biology 40(1): 21-26. [51]. Danso K.E., Acheampong E., Amoatey H.M. (1999), “Selection and in-vitro propagation of five cassava Manihotesculenta Crantz cultivars”, Journal of the Ghana Science Association 1(3), 31-41. [52]. Dougall, D.K., Verma, D. (1978), “Growth and embryo formation in wild carrot suspension cultures with ammonium ion as a sole nitrogen source”, In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 14, 180-188. [53]. Dudits, D., Bögre, L., Gyrögyey, J. (1991), “Molecular and cellular approaches to the analysis of plant embryo development from somatic cells in vitro”, Journal of Cell Science 99, 475-484. [54]. Duncan D.B. (1995), “Multiple range and multiple F test”, Biometrics 11, 1-42. [55]. Dussert S., Verdeil J.L., Buffard-Morel J. (1995), “Specific nutrient uptake during initiation of somatic embryogenesis in coconut calluses”, Plant Science 111, 229- 236. [56]. Duval Y., Engelmann F. và Durand-Gasselin T (1995), “Somatic embryogenesis in oil palm (Elaesis guineensis Jacq)”, Biotechnology in Agriculture and Forestry 30, 235-352. [57]. Evans P.T., Malmberg R.L. (1989), “Do polyamines have roles in plant development?”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 40, 235-269. [58]. Feeney M., Punja Z.K. (2003), “Tissue culture and Agrobacterium-mediated transformation of hemp (Cannabis sativa L.)”, In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 39, 578-585. [59]. Fehér, A., Pasternak, T.P., Dudits, D. (2003), “Transition of somatic plant cells to an embryogenic state”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 74, 201-228. [60]. Feirer R.P. (1995), “The biochemistry of conifer embryo development: amino acids, polyamines, and storage proteins”, Somatic embryogenesis in woody plants, 1, 317-336. [61]. Fisichella M., Silvi E., Morini S. (2000), “Regeneration of somatic embryos and roots from quince leaves cultured on media with different macroelement composition” Plant Cell, Tissue and Organ Culture 63, 101-107. [62]. Fisse J., Braut F., cosson L., Paris M. (1981), “Étude in vitro des capacités organogénétiques de tissus de Cannabis sativa L.; effet de differentes substances de croissance”, Plantes Médicinales et Phytotherapie 15, 217-223 [63]. Galston, A. W. (1991), “On the trail of a new regulatory system in plants”, New Biologist 3, 450-453. [64]. Gao X., Zhu C., Jia W., Gao W., Qiu M., Zhang Y, Xiao P. (2005), “Induction and charaacterization of adventitious roots directly from the explants of Panax notogingseng”, Biotechnology Letters 27(22), 1771-1775. [65]. George E.F., Hall M.A., de Klerk G.J. (2008), “The componets of Plant Tissue culture media I: Macro- and micro- nutrients”, Plant propagation by tissue culture 3rd edition, 65-113. [66]. Gleddie, S., Keller, W., Setterfield, G. (1983), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf explants and cell suspensions of Solanum melongena (egg plant)”, Canadian Journal of Botany 61, 656-666. [67]. Grigoriadou K., Vasilakakis M., Eleftheriou E.P. (2002), “In vitro propagation of the Greek olive cultivar Chondrolia Chalkidikis”. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 71, 47-54. [68]. Grimes H.D., Hodges T.K. (1990), “The inorganic NO3:NH4 ratio influences plant regeneration and auxin sensitivity in primary callus derived from immature embryos of Indica rice (Oryza sativa L.)”, Plant Physiology 136, 362-367. [69]. Hadrami I., D’Auzac J. (1992), “Effects of polyamine biosynthetic inhibitors on somatic embryogenesis and cellular polyamines in Hevea brasiliensis”, Journal of Plant Physiology 140, 33-36. [70]. Hamidou F.S., Peggy O.A., Lloyd M., Peng W.C. (2005), “Putrescine enhances somatic embryogenesis and plant regeneration in upland cotton”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 81, 91-95. [71]. Hartweck, L. M.; Lazzeri, P. A.; Cui, D.; Collins, G. B. and Williams, E. G. (1988), “Auxin-orientation effects on somatic embryogenesis from immature soybean cotyledons”. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 24(8), 821-828. [72]. Hausman J.F., Kevers C., Gaspar T. (1995). “Putrescine control of peroxidase activity in the inductive phase of rooting in poplar shoots in vitro, and the adversary effect of spermidine”, Journal of Plant Physiology 146, 681-685. [73]. Hecht, V., Vielle-Calzada, J.P., Hartog, M.V., Schmidt, E.D., Boutilier, K., Grossniklauss, U., de Vries, S.C. (2001), “The Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinase 1 gene is expressed in developing ovules and embryos and enhances Plant Physiology embryogenic competency in culture”, Plant Physiology 127, 803-816. [74]. Heloir J.F., Kevers C., Hausman J.F., Gaspar T. (1996), “Changes in the concentration of auxins and polyamines during rooting of in vitro propagated walnut shoots”, Tree Physiology 16, 515-519. [75]. Hibi, N., Higashiguchi, S., Hashimoto, T., Yamada, Y. (1994), “Gene expression in tobacco low-nicotine mutants”, Plant and Cell Physiology 6, 723-735. [76]. Huang T., Gao W.Y., Wang J., Cao Y., Zhao Y.X., Huang L.Q., Lui C.X. (2010), “Selection and optimization of a high-producing tissue culture of Panax gingseng C. A. Meyer”, Acta Physiologiae Plantarum 32, 765-772. [77]. Ibraheem Y., Pinker I., Böhme M. (2013), “A comparative study between solid and liquid cultures relative to callus growth and somatic embryo formation in date palm (Phonenix dactylifera L.) cv. Zaghlool”, Emirates Journal of Food and Agriculture 25(11), 883-898. [78]. Jiménez, V.M. (2005), “Involvement of plant hormones and plant growth regulators on in vitro somatic embryogenesis”, Plant Growth Regulation 47, 91- 110. [79]. Joseph T., Yeoh H.H., Loh C.S. (2000), “Somatic embryogenesis, plant regeneration and cyanogenesis in Manihot glaziovii Muell. Arg. (ceara rubber)”. Plant Cell Reports 19(5), 535-538. [80]. Joshi R., Shukla A., Kumar P. (2010), “Interactive effect of GA3 and polyamines on in vitro somatic embryogenesis from immature embryos in Maize (Zea mays L.)”, Maydica 55, 111-119. [81]. Junaid A., Mujib A., Bhat M.A., Ilah A., Sharma M.P. (2006), "Embryogenesis in Catharanthus roseus: roles of some external factors in proliferation, maturation and germination of embryos”, Plant cell monographs 2, 259-270. [82]. Kakarla L., Rama C., Botlagunta M., Krishna M.S.R, Mathi P.S. (2014), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf explants of Rumex vesicarius L.”, African Journal of Biotechnology 13(45), 4268-4274. [83]. Kakkar, R.K., Nagar, P.K., Ahuja, P.S., Rai, V.K. (2000), “Polyamines and plant morphogenesis”, Biologia Plantarum 43, 1-11. [84]. Kaldenhoff, R., Henningsen U., Ricther G. (1994), “Gene activation in suspension-cultured cells of Arabidopsis thaliana during blue light-depended plantlet regeneration”, Planta 195, 182-187. [85]. Kaul T., Ram B., Pandey S., Reddy C.S., Reddy M.K. (2014), “Unravelling the regulation of somatic embryogenesis by extracellular calcium and auxin efflux blockers in hypocotyl explants of Albizzia lebbeck L.: similarity in action”, International Journal of Bioassays 3(11), 3356-3542. [86]. Kevers, C., Le G.N., Monteiro, M., Dommes, J., Gaspar, T. (2000), “Somatic embryogenesis of Panax ginseng in liquid cultures: a role for polyamines and their metabolic pathways”, Plant Growth Regulation 31, 209-214. [87]. Kitamiya, E., Suzuki, S., Sano T., Nagata, T. (2000), “Isolation of two genes that were induced upon the initiation of somatic embryogenesis on carrot hypocotyls by high concentrations of 2,4-D”, Plant Cell Reports 19, 551-557. [88]. Kochba, J., Ben-Hayyim, G., Speigel-Roy, P., Saad, S., Neumann, H. (1982), “Selection of table salt-telerant callus cell lines and embryos in Citrus sinensis and C. auranticum”, Zeitschrift für Pflanzenphysiologie 106, 111-118. [89]. Kumar M., Singh H., Shukla A.K., Verma P.C., Singh P.K. (2013), “Induction and establishment of somatic embryogenesis in elite Indian cotton cultivar (Gossypium hirsutum L. Cv Khandwa-2)”, Plant Signaling and Behavior 8(10), 1-6. [90]. Kumari J.P., Asokan M.P., Sobha S., Sankari A.L., Rekha K., Kala R.G., Jayasree R., Thulaseedharan A. (1999), “Somatic embryogenesis and Plant regeneration from immature anthers of Heveabrasiliens (Muell. Arg)”, Journal of Current Science 76, 1242-1245. [91]. Kusano, T., Berberich, T., Tateda, C., Takahashi, Y. (2008), “Polyamines: essential factors for growth and survival”, Planta 228, 367-381. [92]. Lelkak-Levanic D., Bauer N., Mihaljevic S., Jelaska S. (2004), “Somatic embryogenenic in pumpkin (Cucurbita pepo L.): control of somatic embryo development by nitrogen compounds”, Journal of Plant Physiology 161: 229- 236. [93]. Li, G., Hall, T.C., Holmes-Davis, R. (2002), “Plant chromatin: development and gene control”, Bioessays 24, 234-243. [94]. Mandal A.K.A., Gupta S. D. (2003), “Somatic embryogenesis of safflower: influence of auxin and ontogeny of somatic embryos”, Plant Cell Tissue and Organ Cultrue 72, 27-31. [95]. Manrique S.L., Roca W. (1987), “Effect of photoperiod and culture medium in somatic embryogenesis and the histological analysis of the process in cassava. Manihot esculenta Crantz”, Acta Agrobotanica 37, 7-18. [96]. Mary R.J., Jayabalan N. (1997), “Influence of growth regulators on somatic embryogenesis in sesame”, Plant Cell Tissue and Organ Cultrue 49, 67-70. [97]. Mehrotra S., Goel M.K, Kukreja A.K., Mishra B.N. (2007), “Efficiency of liquid culture systems over conventional micropropagation: A progress towards commercialization”, African Jounal of Biotechnology 6(13), 1484-1492. [98]. Menke-Milczarek I., Zimmy J. (2001), “NH4+ and NO3- requirement for wheat somatic embryogenesis”, Acta Physiolgiae Plantarum 23(1), 37-42. [99]. Minocha R., Minocha S.C., Long (2004), “Polyamines and their biosynthetic enzymes during somatic embryo development in red spruce (Picea rubens Sarg.)”. In Virtro Cellular and Developmental Biology Plant 40, 572-580. [100]. Minocha S.C., Minocha R. (1995), “Role of polyamines in somatic embryogenesis”, Biotechnology in Agriculture and Forestry 30, 53-70. [101]. Moltrasio, R., Robredo, C.G., Gomez, M.C., Paleo, A.H.D., Diaz, D.G., Rios, R.D., Franzone, P.M. (2004), “Alfalfa (Medicago sativa) somatic embryogenesis: genetic control and introduction of favourable alleles into elite Argentinean germplasm”. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 77, 119-124. [102]. Monteiro M., Kevers C., Dommes J., Gaspar T. (2002), “A specific role for spermidine in the initiation phase of somatic embryogenesis in Panax ginseng CA Meyer”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 68, 225-232. [103]. Moore T.C. (1989), “Biochemistry and physiology of plant hormones”, Springer, New York. [104]. Mullin, R.H., Schlegel, D.E. (1976), “Cold storage maintenance of strawberry meristem plantlets”, Horticultural Sciences 11, 100-101. [105]. Murashige T., Skoog F. (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture”, Physiology Plantarum 15, 473-497. [106]. Nakagawa N., Ogita S., Kubo T., Funada R. (2006), “Effect of polyamines and L- Ornithine on the development of proembryogenic masses of Cryptomeria japonica”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 85, 229-234. [107]. Nasim A. (2013), “Endogenous polyamines: a temporal cellular modulator of somatic embryogenesis in Guava (Psidium guajava L. cv. Allahabad Safeda)”, Plant Science 1(2), 4-14. [108]. Neumann, K. H. (2000), “Some studies on somatic embryogenesis: A tool in plant biotechnology”, Based on a lecture at the 87th Indian Science congress Jan in Pune, India ( [109]. Neusa S., Claudete S.C., Vanildo S., Eny I.S.F., Miguel P.G. (2007), “Polyamine effects on growth and endogenous hormones levels in Araucaria angustifolia embryogenic cultures”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 89, 55-62. [110]. Nieves N., Sagarra F., González R., Lezcano Y., Cid M., Blanco M.A., Castillo R. (2008), “Effect of exogenous arginine on sugarcane (Saccharum sp.) somatic embryogenesis, free polyamines and the contents of the soluble proteins and proline”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 95, 313-320. [111]. Nhut D.T, Huy N.P., Chien H.X., Luan T.C., Vinh B.T., Thao L.B. (2012b), “In vitro culture of petiole longiditunal thin cell layer explants of Vietnam gingseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) and preliminary analysis of saponin content”, International Journal of Applied Biology and Phamarceutical Technology 3(3), 178-190. [112]. Nhut D.T., Luan V.Q., Binh N.V., Phong P.T., Huy B.N., Ha D.T.N., Tam P.Q., Nam N.B., Hien V.T., Vinh B.T., Hang L.T.M., Ngoc D.T.M., Thao L.B., Luan T.C. (2009), “The effects of some factors on in vitro biomass production of Vietnamese gingseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) and prelimitary analysis of saponin content”, Vietnamese Journal of Biotechnology 7(3), 357- 370. [113]. Nhut D.T., Nga L.T.M., Chien H.X., Huy N.P. (2012c), “Morphogenesis of in vitro main root transverse thin cell layers of Vietnam gingseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), African Journal of Biotechnology 11(23), 6274- 6289. [114]. Nhut, D.T., Vinh, B.V.T., Hien, T.T., Huy N.P., Nam, N.B., Chien, H.X. (2012a), “Effects of spermidine, proline and carbohydrate sources on somatic embryogenesis from main root transverse thin cell layers of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, African Journal of Biotechnology 11(5): 1084-1091. [115]. Onofrio, D.C., Morini S., Bellocchi G. (1998), “Effect of light quality on somatic embriogenesis of quince leaves”. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 53, 91- 98. [116]. Park S.J., Kim S.M., Kim M.H., Kim C.S., Lee C.H. (2000), “Development of a prototype continuous flow dryer using far infrared ray and heated-air for white ginseng”, Journal of the Korean Chemical Society 25(2), 115-122. [117]. Pasternak, T. P., Prinsen, E., Ayaydin, F., Miskolczi, P., Potters, G., Asard ,H., Van Onkelen H. A., Dudits D., Fehér A. (2002), “The role of auxin, pH and stress in the activation of embryogenic cell division in leaf protoplast-derived cells of Alfalfa”, Plant Physiology 129, 1807-1819. [118]. Prakash M.G., Gurumurthi K. (2005), “Somatic embryogenesis and plant regeneration in Eucalyptus tereticornis”. Journal of Current Science 88, 1311- 1316. [119]. Rajam M.V. (1997), “Polyamines”, Plant Ecophysiology, 343-374. [120]. Rampadarath S., Puchooa D., Ranghoo-Sanmukhiya M. (2014), “Optimized in vitro plant regeneration of the biodiesel plant Jatropha curcas L.: the effects of using seeds at different stages of maturity as starting materials”, International Journal of Plant Biology 5, 33-37. [121]. Rastogi R., Davies P.J. (1991), “Effects of light and plant growth regulators on polyamine metabolism in higher plants”, Biochemistry and physiology of polyamines in plants, 187-199. [122]. Ravindra B., Malabadi K., Nataraja K. (2007), “Putrescine influences somatic embryogenesis and plant regeneration in Pinus geradiana Wall”, Journal of Plant Physiology 2, 107-114. [123]. Rugini E., Luppino M., de Agazio M. (1992), “Endogenous polyamine and root morphogenesis variations under different treatments in cuttings and in in vitro explants of olive. Acta Horticulturae 300, 225-232. [124]. Šamaj, J., Baluska, F., Pretová, A., Volkmann, D. (2003), “Auxin surge following fertilization in carrots: a mechanism for regulating plant totipotency”, Planta 214, 505-509. [125]. Santa-Catarina C., Silveira V., Scherer G.F.E., Floh E.I.S. (2007), “Polyamines and nitric oxide levels relate with morphogenetic evolution in somatic embryogenesis of Ocotea catharinensis”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 90, 93-101. [126]. Santos M., Claparols I., Torné J.M. (1993), “Effect of exogenous arginine, ornithine, methionine and γ-amino butyric acid on maize (Zea mays L.) embryogenesis and polyamine content”. Journal of Plant Physiology 142(1), 74- 80. [127]. Savita, V., Virk G.S., Nagpal A. (2010), “Effect of explant type and different plant growth regulators on callus induction and plantlet regeneration in Citrus jambhiri Lush”, International Journal of Science and Technology 5, 97-106. [128]. Schmidt, E. D., Guzzo, F., Toonen, M. A., de Vries, S. C. (1997), “A leucine-rich repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form embryos”, Development 124, 2049-2062. [129]. Shahana S., Gupta S.C. (2002), “Somatic embryogenesis in Sesbania sesban var. bicolor: a multipurpose fabaceous woody species”. Plant Cell Tissue and Organ Cultrue 69, 289-292. [130]. Shasthree T., Chandrashekar C., Savitha R., Imran M., A. (2014), “Adventitious shoot organogenesis and plant regeneration from leaf and cotyledon explants of Citrullus colocynthis”, Journal of Herbs, Spices and Medicinal Plant 20(3), 235- 244. [131]. Silva P., Ricardo C.P.P. (1992), “Beta-fructosidases and in vitro dedifferentiation- rediffferentiation of carrot cells”, Phytochemical Analysis 31, 1507-1511. [132]. Silveira, V., Balbuena, T. S., Santa-Catarina, C., Floh, E. I. S., Guerra, M. P., Handro W. (2004a), “Biochemical changes during seed development in Pinus taeda L.”, Plant Growth Regulation 44, 147-156. [133]. Silveira, V., Floh, E. I. S., Handro, W., Guerra, M. P. (2004b), “Effect of plant growth regulators on the cellular growth and levels of intracellular protein, starch and polyamines in embryogenic suspension cultures of Pinus taeda”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 76, 53-60. [134]. Silvera V., Santacatarina C., Tun N.N., Scherer G.E.F., Handro W., Guerra M.P., Floh E.I.S. (2006), “Polyamine effects on the endogenous polyamine contents, nitric oxide release, growth and differentiation of embryogenic suspension cultures of Araucaria angustifolia (Bert.) O Ktze”, Plant Science 171, 91-98. [135]. Siong P., Taha R.M., Rahiman F.A. (2011), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from hypocotyls and leaf explants of Brassica oleracea var. Botrytis (Cauliflower)”, Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 53, 26-31. [136]. Slocum R.D., Kaur-Sawhney R., Galston A.W. (1984), “The physiology and biochemistry of polyamines in plants”, Archives of Biochem and Biophysics 235, 283-303. [137]. Slocum, R. D. (1991), “Tissue and subcellular localisation of polyamines and enzymes of polyamine metabolism”, Biochemistry and Physiology of Polyamines in plants, 93-105. [138]. Stasolla C., Yeung E.C. (2003), “Recent advances in conifer somatic embryogenesis: improving somatic embryo quality”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74, 15-35. [139]. Tautorus T.E., Dunstan D.I. (1991), “Somaticembryogenesis in conifers”, Canadian Journal of Botany, 69, 1873-1899. [140]. Taylor, R.L. (1967). The foliar embryos of Malaxis paludosa. Canadian Journal of Botany, 45, 1553-1556. [141]. Tiburcio, A. F., Altabella, T., Borrell, A., Masgraw, C. (1997), “Polyamine metabolism and its regulation”, Physiologia Plantarum 100, 664-674. [142]. Tiburcio, A. F., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W. (1990), “Polyamine metabolism”, The Biochemistry of Plants, Intermediary Nitrogen Fixation, 283- 325. [143]. Timmers A.C.J., Schel J.H.N. (1991), “Localization of cytosolic Ca2+ during carrot somatic embryogenesis using confocal scanning laser microscopy”, Progress in Plant Growth Regulation, 347-353. [144]. Theiss C., Bohley P., Voigt J. (2002), “Regulation by polyamines of ornithine decarboxylase activity and cell division in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii”, Plant Physiology 128, 1470-1479. [145]. Verdeil, J.L., Hocher, V., Huet, C., Rosdemange, F., Escoute, J, Ferriere, N., Nicole, M. (2001), “Ultrastructural changes in coconut calli associated with the acquisition of embryogenic competence”, Annals of Botany 88, 9-18. [146]. Verhagen, S. A., Wann, S. R. (1989) “Norway spruce somatic embryogenesis: high frequency from light-culture matured embryo”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 16, 103-111. [147]. Verma D., Joshi R., Shukla A., Kumar P. (2011), “Protocol for in vitro somatic embryogenesis and regeneration of rice (Oryza sativa L.)”, Indian Journal of Experimental Biology 49, 958-963. [148]. Wang Y., Ruemmele B., Chandlee J., Sullivan M., Knapp J., Kausch A. (2002), “Embryogenic callus induction and plant regeneration media for bent grasses and annual bluegrass”. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 38, 460- 467. [149]. Wise M.J, Tunnacliffe A. (2004), “POPP the question: what do LEA proteins do?” Trends in Plant Science 9, 13-17. [150]. Xiang L.Y., Jung Y.H., Young E.C. (2007), “Plant regeneration via direct somatic embryogenesis in Panax japonicus”, Plant Biotechnology Reports 1:5-9. [151]. Xie D.Y., Hong Y. (2001), “Regeneration of Acacia mangium through somatic embryogenesis”, Plant Cell Reports 20, 34-40. [152]. Yadav J.S., Rajam M.V. (1997), “Spatial distribution of free and conjugated polyamines in leaves of Solanum melongena L. associated with differential morphogenetic potential: efficient somatic embryogenesis with putrescine, Journal of Experimental Botany 48, 1537-1545. [153]. Yamasaki K. (2000), “Bioactive saponins in Vietnamese gingseng, Panax vietnamensis”, Pharmaceutical Biology 28, 16-24. [154]. Yamasaki H., Cohen, M. F. (2006), “NO signal at the crossroads: polyamine- induced nitric oxide synthesis in plants”. Trends in Plant Science 11, 522-524. [155].