Luận văn Xác định tính nhạy của một sốloại thuốc kháng sinh đối với edwardsiella sp và aeromonassp gây bệnh trên cá tra tại Cần Thơ và An Giang

,8,11,14,19,22-heptaoxo-1,4,7,10,13,18- hexaazacyclotricosan-15-ylamino)butan-2-ylamino)-3-hydroxybutan-2-ylamino)-1- oxobutan-2-yl)-N,5-dimethylheptanamide Colistin thường dùng để điều trị những trường hợp nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là các trường hợp nhiễm khuẩn Pseudomonas aeruginosa (Dược thư, 2002). 2.4.3.4 Nhóm Tetracyclin Là thuốc ức chế vi khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở nồng độ cao. Nó phụ thuộc vào độ mẫn cảm của vi khuẩn đối với thuốc. Đây là nhóm kháng sinh có phổ hoạt rất rộng. Tác dụng cả đối với nhóm vi khuẩn Gram âm và Gram dương nhưng vi khuẩn Gram dương mẫn cảm với thuốc hơn là Gram âm, virus, ký sinh trùng (trích dẫn bởi Trần Duy Phương, 2009). Đại diện của nhóm này thường được dùng trong thủy sản là doxycyclin, tetracylin... Doxycyclin (DO) Tên chung quốc tế: Doxycyclin Công thức hóa học: C22H24N2O8 Tên hóa học: (4S,4aR,5S,5aR,6R,12aS)-4-(dimethylamino)-3,5,10,12,12a- pentahydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydrotetracene-2- carboxamide Doxycyclin là kháng sinh phổ rộng tác động lên nhiều vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Hình 2.9: Công thức cấu tạo doxycyclin Hình 2.10: Mô hình phân tử doxycyclin 23 Tác động kháng khuẩn của doxycyclin ức chế vi khuẩn tổng hợp protein do gắn vào tiểu đơn vị 30S và có thể cả với 50S của ribosom vi khuẩn nhạy cảm, thuốc cũng có thể gây thay đổi ở màng bào tương. Doxycyclin có phạm vi kháng khuẩn rộng với vi khuẩn ưa khí và kỵ khí Gram dương và Gram âm, và cả với một số vi sinh vật kháng thuốc tác dụng với thành tế bào, như: Rickettsia, Coxiella burnetii, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp, Legionella spp, Ureaplasma, một số Mycobarterium không điển hình, và Plasmodium spp (Dược thư, 2002). Tetracyclin (TE) Tên chung quốc tế: Tetracyclin Công thức hóa học: C22H24N2O8 Tên hóa học: 2-(amino-hydroxy-methylidene)-4-dimethylamino - 6, 10, 11,12a- tetrahydroxy-6-methyl-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-1,3,12-trione Tetracyclin có dạng bột màu vàng, ít tan trong nước, dễ bị hỏng bởi ánh sáng, bài xuất qua thận dưới dạng còn hoạt tính, ít gây xáo trộn tiêu hóa hơn chlotetracyclin và oxytetracyclin (trích dẫn bởi Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008). Tetracyclin là nhóm kháng sinh cũ, có nguồn gốc từ Streptomyces aureofaciens. Là thuốc ức chế vi khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở nồng độ cao. Nó phụ thuộc vào độ mẫn cảm của vi khuẩn đối với thuốc. Tetracyclin là kháng sinh có phổ tác dụng rất rộng, tác dụng nhiều vi khuẩn Gram âm và Gram dương, cả ưa khí và kỵ khí, xoắn khuẩn và vi khuẩn nội bào Clamydia, Rickettsia, Mycoplasma, Spirochaete. Nấm, nấm men, virus không nhạy cảm với tetracyclin. Tetracyclin là chất kìm khuẩn, giống như nhiều thuốc chống nhiễm trùng khác, lạm dụng sẽ làm cho một số vi sinh vật kháng thuốc. Cơ chế tác dụng: Tetracyclin có tác dụng kìm khuẩn là do ức chế sự tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn bằng cách gắn vào phần 30S của ribosom nên ức chế gắn aminoacyl-ARNt mới vào vị trí tiếp nhận (Dược thư, 2002). Hình 2.11: Công thức cấo tạo tetracyclin 24 2.4.3.5 Nhóm Quinolon Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn, chúng có tác dụng ức chế tổng hợp ADN do ức chế enzyme DNA gyrase làm mất hoạt tính của enzyme này. Các thuốc thuộc nhóm này được phát triển qua 2 thế hệ với phổ kháng sinh và cơ chế kháng khuẩn khác nhau. Thế hệ thứ nhất có phổ kháng khuẩn hẹp chủ yếu trên vi khuẩn Gram âm, phân bố ở các mô kém. Thế hệ thứ hai có phổ kháng khuẩn vừa nhanh vừa mạnh, phổ kháng sinh được mở rộng trên vi khuẩn Gram âm và Gram dương, phân bố rất tốt ở các mô (trích dẫn bởi Huỳnh Chí Thanh, 2007). Trong nuôi trồng thủy sản các kháng sinh thuộc nhóm quinolon được sử dụng khá phổ biến trong điều trị bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri như: enrofloxacin, norfloxacin rất có hiệu quả (Từ Thanh Dung và csv, 2005). Các loại kháng sinh thuộc nhóm này là: enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin... Enrofloxacin (ENR) Công thức hóa học: C19H22FN3O3 Tên hóa học: 1-Cyclopropyl-7-(4-ethyl-1-piperazinyl)-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-3- quinolonecarboxylic acid Enrofloxacin thuộc nhóm fluoroquinolon là kháng sinh được dùng phổ biến trong nông nghiệp, thủy sản và cả y học, có tác dụng rộng và tổng hợp trên cả 2 nhóm vi khuẩn Gram dương và Gram âm (trích dẫn bởi Trần Minh Phú và csv, 2008). Hình 2.12: Công thức cấu tạo enrofloxacin 25 Ciprofloxacin (CIP) Công thức hóa học: C17H18FN3O3 Tên hóa học: 1-cyclopropyl- 6-fluoro- 4-oxo- 7-piperazin- 1-yl- quinoline- 3- carboxylic acid Ciprofloxacin là thuốc kháng sinh bán tổng hợp, có phổ kháng khuẩn rộng, thuộc nhóm fluoroquinolon, còn được gọi là các chất ức chế DNA girase. Do ức chế enzym DNA girase, nên thuốc ngăn sự sao chép của chromosom khiến cho vi khuẩn không sinh sản được nhanh chóng. Ciprofloxacin có tác dụng tốt với các vi khuẩn kháng lại kháng sinh thuộc các nhóm khác: aminoglycosid, cephalosporin, tetracycline, peniciline… và được coi là một trong những thuốc có tác dụng mạnh nhất trong nhóm fluoroquinolon. Đây là một fluoroquinolone thế hệ thứ hai kháng khuẩn Các vi khuẩn gây bệnh đường ruột như: Salmonella, Shigella, Yersina và Vibrio cholerae thường nhạy cảm cao. Nói chung, các vi khuẩn Gram dương (các chủng Enterococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Listeria monocytogenes…) kém nhạy cảm hơn. Ciprofloxacin không có tác dụng trên phần lớn các vi khuẩn kỵ khí. Do cơ chế tác dụng đặc biệt của thuốc nên ciprofloxacin không có tác dụng chéo với các thuốc kháng sinh khác như: aminoglycosid, cephalosporin, tetracycline, peniciline… (Dược thư, 2002). Hình 2.13: Công thức cấu tạo ciprofloxacin Hình 2.14: Mô hình phân tử ciprofloxacin 26 Norfloxacin (NOR) Tên chung quốc tế: Norfloxacin Công thức hóa học: C16H18FN3O3 Tên hóa học: 1-ethyl-6-fluoro-4-oxo-7-piperazin-1-yl-1H-quinoline-3-carboxylic acid Cơ chế tác dụng Norfloxacin ức chế DNA-gyrase, một enzym cần thiết cho sự sao chép DNA của vi khuẩn. Norfloxacin có tác dụng diệt khuẩn với cả vi khuẩn ưa khí Gram âm và Gram dương. Norfloxacin còn có tác dụng diệt các chủng tạo penicilinase hoặc không tạo penicilinase. Chlamydia và các vi khuẩn yếm khí như Bacteroides spp không nhạy cảm với norfloxacin. Norfloxacin cũng thường có tác dụng ngay khi vi khuẩn đã kháng với acid nalidixic. Sự đề kháng đối với norfloxacin truyền qua plasmid chưa được xác định (Dược thư, 2002). Ofloxacin (OF) Hình 2.16: Công thức cấu tạo ofloxacin Hình 2.15: Công thức hóa học norfloxacin 27 Công thức hóa học: C18H20FN3O4 Tên hóa học: (RS)-7-fluoro-2-methyl-6-(4-methylpiperazin-1-yl)-10-oxo-4-oxa-1- azatricyclo[7.3.1.05,13]trideca-5(13),6,8,11-tetraene-11-carboxylic acid Ofloxacin là kháng sinh nhóm fluoroquinolon. Ofloxacin có phổ kháng khuẩn rộng bao gồm: Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Neisseria spp, Staphylococcus, Streptococcus pneumoniae và một vài vi khuẩn Gram dương khác. Ofloxacin có tác dụng mạnh hơn ciprofloxacin đối với Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma pneumoniae. Nó cũng có tác dụng đối với Mycobacterium leprae và cả Mycobacterium spp. Ofloxacin có tác dụng diệt khuẩn, cơ chế tác dụng chưa được biết đầy đủ. Giống như các thuốc quinolon kháng khuẩn khác, ofloxacin ức chế DNA-gyrase là enzym cần thiết trong quá trình nhân đôi, phiên mã và tu sửa DNA của vi khuẩn (Dược thư, 2002). 2.4.3.6 Nhóm Phenicol Là nhóm kháng sinh có tác dụng kìm khuẩn nhưng cũng có tác dụng diệt khuẩn trong một số trường hợp bệnh truyền nhiễm với những điều kiện nhất định và nồng độ cao hơn. Thuốc có tác dụng ức chế vi khuẩn với nồng độ thấp, hoạt phổ của nó rất rộng, tác dụng trên nhiều loài vi khuẩn Gram âm và Gram dương, virus có kích thước lớn (trích dẫn bởi Trần Duy Phương, 2009). Florfenicol (FFC) Công thức hóa học: C12H14Cl2FNO4S Tên hóa học: 2,2-dichloro-N-[(1R,2S)-3-fluoro-1-hydroxy-1- (4-methanesulfonylphenyl) propan-2-yl]acetamide FFC là một loại kháng sinh thế hệ mới nhất của phenicol, là dẫn xuất của chloramphenicol – một loại kháng sinh đã bị cấm ở một số nước trên thế giới từ giữa những năm 1990 (Michel, 2003). FFC được sử dụng rộng rãi cho động vật trên cạn và Hình 2.17: Công thức cấu tạo Florfenicol 28 động vật thủy sản, có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương, một số vi khuẩn nội bào (Risketsia, Chlamidia) vi khuẩn kỵ khí (Clostridium spp, Bacteroides spp) (trích dẫn bởi Lê Thị Cẩm Tú, 2009). FFC tan tốt trong nuớc dimethylformamide, methanol, ít tan trong acid acetic và khó tan trong nuớc (trích dẫn bởi Lê Thị Cẩm Tú, 2009). Florfenicol có hoạt tính chống lại sự phát triển của vi khuẩn bằng cách kết dính với tiểu đơn vị 50S của ribosom, ngăn chặn cầu nối peptid giữa các acid amin vì vậy ức chế sự tổng hợp protein làm cho vi khuẩn không còn khả năng phát triển và tồn tại (trích dẫn bởi Lê Thị Cẩm Tú, 2009). 2.4.3.7 Nhóm Aminoglycosid (aminosid) Kanamycin (K) Công thức hóa học: C18H36N4O11 Tên hóa học: 2-(aminomethyl)- 6-[4,6-diamino-3- [4-amino-3,5-dihydroxy-6- (hydroxymethyl) tetrahydropyran-2-yl]oxy- 2-hydroxy- cyclohexoxy]- tetrahydropyran- 3,4,5-triol Tác động kháng khuẩn: Kanamycin có tác động kháng vi khuẩn Gram dương, Gram âm và Mycobacterium tuberculosis. Thuốc cũng được chứng minh hiệu quả đối với Staphylococcus đa kháng thuốc, E.coli và Klebsiella sp. Kanamycin hoạt động bằng cách ảnh hưởng đến các tiểu đơn vị 30S ribosome và gây ra một đột biến missense hoặc nó ngăn cản sự phiên dịch của RNA (Dược thư, 2002). Hình 2.18: Công thức cấu tạo kanamycin 29 Hình 2.19: Công thức cấu tạo rifamycin 2.4.3.8 Rifamycin (RA) Hai kháng sinh của nhóm là: rifamycin SV và rifampicin. Chúng có tác dụng tốt đối với mycobacteria. Rifamycin SV có 1 hoạt phổ giới hạn đối với cầu khuẩn Gram dương và Gram âm, trực khuẩn Gram dương. Rifampicin là kháng sinh bán tổng hợp từ kháng sinh tự nhiên rifamycin B được lấy từ môi trường nuôi cấy Streptomyces mediterian, có hoạt tính kháng sinh yếu. Rifampicin có tác dụng diệt khuẩn. Rifampicine có tác dụng tốt với các chủng vi khuẩn Mycobacterium đặc biệt là Mycobarterium. Rifampicin còn là kháng sinh phổ rộng, có tác dụng tốt với các vi khuẩn Gram dương và Gram âm (trừ cầu khuẩn đường ruột). Cơ chế tác dụng của Rifampicin: thuốc gắn vào tiểu đơn vị beta của ARN- polymerase, làm sai lệch thông tin của enzym này, do đó ức chế sự khởi đầu của quá trình tổng hợp ARN mới (Dược thư, 2002). 2.5 Các nghiên cứu về thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản. Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã được thực hiện để đánh giá khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E. ictaluri. Từ năm 1986, Waltman và Shotts đã kiểm tra sự kháng thuốc trên 118 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá nheo bệnh ở Mỹ với 37 loại kháng sinh. Kết quả cho thấy phần lớn vi khuẩn này nhạy với các thuốc thí nghiệm nhưng hơn 90% lại kháng với colistin và sulfamids. Đến năm 1993, Reger và csv., cũng đã xác định các chủng E. ictaluri phân lập trên cá nheo còn nhạy với enrofloxacin, gentamycin và doxycycline (trích dẫn bởi Từ Thanh Dung và csv, 2009). Đối với vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh gan thận mủ ở Việt Nam được đánh giá là nhạy hoàn toàn với thuốc kháng sinh ampicillin và florfenicol (Crumlish, 2002. Trích dẫn bởi Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan, 2007). Tuy nhiên, trong những năm gần đây do tình hình sử dụng thuốc kháng sinh quá nhiều trong điều 30 trị bệnh trên cá tra nên tính nhạy của các loại thuốc kháng sinh lên nhóm vi khuẩn này giảm rất rõ, như nghiên cứu của Nguyễn Thanh Phương và csv (2005) đã phân lập được 169 dòng vi khuẩn từ các ao nuôi thủy sản ở ĐBSCL và thử với 6 loại kháng sinh và kết quả cho thấy 2% kháng với chloramphenicol, có 59% dòng vi khuẩn kháng với 4 hay 5 loại kháng sinh trong đó có chloramphenicol. Có 34% kháng nhiều loại kháng sinh như: chloramphenicol, ampicillin, tetracyclin, trimethoprim + sulfamchoxazole, nitrofurantion). Sarter et. al (2008) đã khảo sát tính kháng thuốc của các hệ vi khuẩn Gram âm trên cá tra nuôi công nghiệp ở ĐBSCL. Kết quả nghiên cứu cũng đã chứng minh các nhóm vi khuẩn: Enterobacteriaceae (49,1%), Pseudomonas (35,2%), Vibrionaceae (15,7%) đã giảm tính nhạy với 6 loại thuốc kháng sinh trong nghiên cứu: oxytetracyline, chloramphenicol, trimethoprim-sulphamethoxazole, nitrofurantoin, nalidixic acid, ampicillin. Đặc biệt tác giả đã tìm thấy hiện tượng đa kháng của các nhóm vi khuẩn trên đối với 6 loại kháng sinh này. Tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra không chỉ xảy ra phổ biến ở các vùng nước ngọt mà còn xuất hiện ở vùng nước lợ như: tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Với nghiên cứu của Trần Duy Phương (2009) khảo sát tính kháng thuốc của hai nhóm vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp ở vùng này cho thấy nhóm vi khuẩn Edwardsille sp kháng với streptomycyline (83%), chloramphenicol (58%), florfenicol (50%) và tetracylin (42%). Đối với vi khuẩn Aeromonas sp còn nhạy cao với 3 loại thuốc chloramphenicol, florfenicol và doxycyclin nhưng chúng đã kháng hoàn toàn với thuốc cefazoline. Qua các nghiên cứu về tính kháng thuốc kháng sinh của các dòng vi khuẩn gây bệnh ở động vật thủy sản trên thế giới nói chung và trên cá tra nuôi ở ĐBSCL nói riêng, cho thấy tính kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng phổ biến, diễn biến phức tạp và có sự khác biệt về tính kháng thuốc của các chủng vi khuẩn cũng như ở các vùng nuôi khác nhau. Do đó luôn cần có những nghiên cứu đánh giá về tính nhạy của thuốc kháng sinh đối với từng vi khuẩn ở từng thời điểm và từng khu vực nuôi, nhằm giúp cho người nuôi có hướng điều trị kịp thời và hiệu quả khi các có bệnh vi khuẩn xảy ra trên cá nuôi. 31 CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện: Từ tháng 03/2010 đến tháng 06/2010 Địa điểm thực hiện: Chi Cục Thủy Sản thành phố Cần Thơ, 168 Hai Bà Trưng, thành phố Cần Thơ. Điện thoại: 07103.751.416. 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu Cá tra bệnh thu từ 2 tỉnh: Cần Thơ và An Giang năm 2010 để phân lập vi khuẩn kiểm tra kháng sinh đồ. 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất Nồi khử trùng bằng áp suất (Autoclauve), tủ ấm, tủ cấy, cân điện tử 4 số lẻ, máy voxtec, tủ sấy… Bộ dao tiểu phẩu, dụng cụ thủy tinh, bộ đèn cồn, que cấy, micropipet 1 mL và 5 mL. Cồn, NaCl, nước cất, test O/F, test oxidase, test 0/129 (Nam Khoa). Môi trường TSA (Hãng Merck), môi trường MHA (Hãng Merck). Thuốc kháng sinh: 13 đĩa kháng sinh thương mại: ampicillin (AM/10 µg); amoxicillin (AMX/25 µg); cefalexin (CN/30 µg); colistin (CS/50 µg); doxycyclin (DO/30 µg); enrofloxacin (ENR/5 µg); kanamycin (K/30 µg); ciprofloxacin (CIP/5 µg); rifamycin (RA/40 µg); tetracyclin (TE/30 µg); norfloxacin (NOR/5 µg); ofloxacin (OF/10 µg) (hãng Bio-rad, ngoại trừ florfenicol (FFC/30 µg) của hãng Oxoid). 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu cá tra bệnh xuất huyết và mủ gan được thu ở 2 tỉnh: Cần Thơ, An Giang năm 2010 (10 chủng mỗi dòng vi khuẩn). Dùng phương pháp làm kháng sinh đồ trên vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp với 13 loại kháng sinh. 3.2.2 Phương pháp thu mẫu Mỗi ao cá tra: thu 5 con cá tra có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng: cá lờ đờ, bơi dạt vào bờ, mắt lồi, phù đầu, xuất huyết… và 2 cá khỏe. Tuổi cá: từ giai đoạn cá giống trở lên. 32 Khi thu mẫu cá có thu kèm theo các thông tin về tuổi cá, kích cỡ cá, dấu hiệu bệnh lý của cá… đều được ghi vào phiếu thu mẫu cá (xem phụ lục A.1). Sau khi thu mẫu xong, cá được vận chuyển bằng túi nylon bơm oxy. Mẫu cá được chuyển vào phòng thí nghiệm Chi Cục Thủy Sản thành phố Cần Thơ, tiến hành mổ cá ngay trong ngày để lấy vi khuẩn phân tích. 3.2.3 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn Giết cá bằng cách hủy tủy, sau đó mổ cá. Cấy mẫu vi sinh từ gan, thận, tỳ tạng của cá tra trên môi trường TSA, trong điều kiện vô trùng. Ủ các đĩa có cấy vi khuẩn trong tủ ấm 30οC. Đọc kết quả sau 24 giờ đối với Aeromonas sp, 48 giờ đối với Edwardsiella sp. Ghi nhận các đặc điểm của khuẩn lạc như hình dạng màu sắc. Chọn khuẩn lạc rời, có hình dạng đặc trưng và chiếm ưu thế để tách ròng, định danh và lưu giữ để làm kháng sinh đồ. Khi vi khuẩn đã thuần thì tiến hành thực hiện các bước sau: Nhuộm Gram (xem phụ lục A.2) Tính di động (xem phụ lục A.3) Phản ứng oxidase (xem phụ lục A.4) Phản ứng catalase (xem phụ lục A.5) Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O/F test) (xem phụ lục A.6) Phản ứng 0/129 (xem phụ lục A.7) Hình 3.1: Quy trình phân lập vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp 33 3.2.4 Phương pháp làm kháng sinh đồ Phương pháp làm kháng sinh đồ trên 2 nhóm vi khuẩn Aeromonas sp và Edwardsiella sp, sử dụng môi trường MHA, chọn 13 loại thuốc kháng sinh: ampicillin (AM/10 µg); amoxicillin (AMX/25 µg); cefalexin (CN/30 µg); colistin (CS/50 µg); doxycyclin (DO/30 µg); enrofloxacin (ENR/5 µg); kanamycin (K/30 µg); ciprofloxacin (CIP/5 µg); rifamycin (RA/40 µg); tetracylin (TE/30 µg); norfloxacin (NOR/5 µg); ofloxacin (OF/10 µg); florfenicol (FFC/30 µg). Đo đường kính vô trùng (mm): nhằm xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình và kháng. Môi trường thạch Hòa tan môi trường TSA, MHA theo hướng dẫn trên nhãn chai, thanh trùng ở 121οC trong 15 phút. Để nguội môi trường khoảng 50οC, đổ môi trường ra đĩa petri thủy tinh dày khoảng 4 mm. Sau 45 phút khi đĩa môi trường khô thì lật đĩa lại cho vào túi nilon (tiệt trùng túi nilon bằng cồn 70ο) và đóng kín miệng túi. Đặt đĩa vào tủ ấm 30οC trong 24 giờ để kiểm tra sự nhiễm khuẩn. Nước muối sinh lý Hòa tan 0,85g NaCl trong 100 mL nước cất, cho 5 mL nước muối sinh lý vào từng ống nghiệm, thanh trùng ở 121οC trong 15 phút. Mật số vi khuẩn được xác định dựa vào phương pháp so màu trên máy quang phổ Vi khuẩn sau khi tách ròng và đã thuần thì tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ. Dùng que cấy tiệt trùng nhặt ít nhất 3 khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 5 mL nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng, trộn đều trên máy voxtec và xác định mật số dựa vào máy so màu quang phổ, ở bước sóng 625 nm với giá trị OD= 0,08-0,13±0,02 thì mật độ vi khuẩn là 108 CFU/mL. Sau khi đã xác định mật độ vi khuẩn thì tiến hành cho vi khuẩn lên môi trường Dùng tăm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn, quét đều lên môi trường thạch MHA. Sau đó để yên 1 phút rồi dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa petri sao cho khoảng cách giữa 2 tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép rìa của đĩa petri là 10-15 mm. Mỗi đĩa petri (Φ 100 mm) môi trường đặt tối đa 6 đĩa kháng sinh. 34 Sau khi hoàn tất việc dán đĩa kháng sinh, đặt đĩa petri vào ủ trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ 30οC. Sau 24 giờ tiến hành đọc kết quả đối với Aeromonas sp, 48 giờ đối với Edwardsiella sp. Đọc kết quả: sau 24 giờ (vi khuẩn gây bệnh xuất huyết Aeromonas sp), 48 giờ (vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ Edwardsiella sp). Xuất hiện vòng vô trùng (vòng tròn không có vi khuẩn phát triển) ở mỗi đĩa kháng sinh. Đường kính vô trùng xác định tính nhạy cảm của vi khuẩn với thuốc kháng sinh. Đo đường kính vòng vô trùng (mm) dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory (CLSI) (2006) để xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và kháng. 35 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp Cá tra là loài sinh vật sống trong môi trường nước, một môi trường tồn tại rất nhiều loài vi khuẩn. Một số loài vi khuẩn cơ hội có thể xâm nhập vào cơ thể cá mà không gây nên tác hại. Ngoài ra, có một số trường hợp cá chết do các yếu tố gây sốc, mà nguyên nhân không phải do vi khuẩn. Do đó, để xác định nguyên nhân gây chết cá, cần phải tiến hành phân lập và định danh vi khuẩn. Mẫu cá tra được thu từ những ao cá có dấu hiệu bệnh, cấy ở gan, thận và tỳ tạng của các mẫu cá có dấu hiệu bệnh mủ gan, xuất huyết, lên môi trường TSA, những khuẩn lạc chiếm ưu thế, có màu sắc, hình dạng và kích thước đặc trưng của nhóm Aeromonas sp (24 giờ) và Edwardsiella sp (48 giờ) được tách ròng, sau đó kiểm tra một số chỉ tiêu cơ bản gồm: nhuộm Gram, tính di động, oxydase, catalase, phản ứng O/F, 0/129. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu này được thể hiện ở Bảng 4.1 Hình 4.2: Cá tra bị bệnh xuất huyết, mắt bị sưng và lồi, các vi và da có nhiều đốm đỏ Hình 4.3: Nội tạng cá tra bị xuất huyết Hình 4.1: Nội tạng cá tra bị bệnh mủ gan 36 * Cấy vi khuẩn Theo mô tả của Từ Thanh Dung (2004) khuẩn lạc Edwardsiella sp phát triển trên môi trường TSA sau 48 giờ ở điều kiện nhiệt độ 30οC, kích thước li ti có màu trắng đục. Khuẩn lạc Aeromonas sp phát triển trên môi trường TSA sau 24 giờ ở điều kiện nhiệt độ 30οC, kích thước nhỏ, đường kính 1-2 mm, màu trắng đục hay màu kem. Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp STT Chỉ tiêu Edwardsiella sp Aeromonas sp 1 Nhuộm Gram - - 2 Di động + + 3 Oxydase - + 4 Catalase + + 5 O/F +/+ +/+ 6 0/129 Kháng Ghi chú: (+): Dương; (-): Âm * Nhuộm Gram Hình 4.6: Hình nhuộm Gram của vi khuẩn Edwardsiella sp (100X) Hình 4.7: Hình nhuộm Gram của vi khuẩn Aeromonas sp (100X) Hình 4.4: Kết quả tách ròng vi khuẩn Edwardsiella sp Hình 4.5: Kết quả tách ròng vi khuẩn Aeromonas sp 37 Hình 4.8: Vi khuẩn Aeromonas sp mới thực hiện test O/F Hình 4.9: Vi khuẩn Aeromonas sp cho phản ứng lên men sau 24h * Test O/F Qua kết quả kiểm tra ban đầu về hình dạng và các chỉ tiêu sinh hóa của các chủng vi khuẩn Aeromonas sp giống như mô tả của Bùi Quang Tề (2006), đây là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, hai đầu tròn, di động nhờ tiêm mao, oxydase dương tính, catalase dương tính, cho phản ứng lên men, không mẫn cảm với thuốc thử 0/129. Đối với chủng Edwardsiella sp giống như mô tả của Bùi Quang Tề (2006), đây là vi khuẩn Gram âm, hình que mảnh, oxydase âm tính, catalase dương tính, lên men trong môi trường O/F glucose. 4.2 Kết quả kháng sinh đồ Hiện nay, có rất nhiều sự lựa chọn các loại thuốc kháng sinh và hóa chất để điều trị bệnh trên cá tra. Tuy nhiên, do hiểu biết hạn chế của người dân về đặc tính của kháng sinh, cách sử dụng, liều dùng và thời gian sử dụng… đặc biệt là tính độc hại của nó đối với sức khỏe con người ngày càng báo động. Việc sử dụng bừa bãi và lạm dụng kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh đã làm cho khả năng đề kháng của các vi khuẩn ngày càng một tăng và có những chủng vi khuẩn hầu như đã kháng với hầu hết các loại kháng sinh. Vì thế, việc sử dụng thuốc kháng sinh thích hợp sẽ giảm những rủi ro mà bệnh có thể xảy ra. Do đó, để xác định loại kháng sinh hiệu quả và tránh khả năng tạo ra những dòng vi khuẩn kháng thuốc thì phải tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ trước khi sử dụng. 38 4.2.1 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Edwardsiella sp tại Cần Thơ và An Giang Kiểm tra kháng sinh đồ đối với vi khuẩn Edwardsiella sp, sau 48 giờ ở mỗi đĩa kháng sinh xuất hiện vòng vô, đường kính vòng vô trùng xác định tính nhạy của vi khuẩn. Đường kính vòng vô trùng dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory (CLSI) (2006): Nhạy (≥20 mm), nhạy trung bình (15-19 mm), kháng (<14 mm). Hình 4.10: Kết quả kháng sinh đồ chủng Edwardsiella sp sau 48 giờ 39 Bảng 4.2: Tỉ lệ phần trăm tính nhạy của 10 chủng vi khuẩn Edwardsiella sp với 13 loại kháng sinh Theo kết quả Bảng 4.2 các chủng vi khuẩn Edwardsiella sp còn nhạy rất cao với nhóm beta-lactamin cụ thể là: ampicillin (80%), amoxicillin (80%) và theo Trần Duy Phương (2009) các chủng vi khuẩn nhạy 100% với ampicillin. Theo Depaola et. al (1995) nghiên cứu sự kháng thuốc của 22 chủng vi khuẩn Edwardsiella sp trên 2 loại kháng sinh này cũng không tìm thấy chủng nào bị kháng. Vì tính nhạy của nhóm kháng sinh này cao, nên người dân sử dụng rộng rãi và thường xuyên nên tính nhạy của nó có giảm. Tuy nhiên, nhóm kháng sinh này vẫn còn hiệu quả cao đối với vi khuẩn Edwardsiella sp. Trong những trường hợp cá tra bệnh nặng do nhiễm vi khuẩn Edwardsiella sp có thể sử dụng nhóm kháng sinh này để điều trị. Các chủng vi khuẩn Edwardsiella sp cũng nhạy với kháng sinh cefalexin (50%), cũng có thể sử dụng kháng sinh này trong trường hợp cá tra bộc phát bệnh nhưng hiệu quả sẽ không cao bằng nhóm kháng sinh beta-lactamin. Nghiên cứu cho thấy hầu hết vi khuẩn Edwardsiella sp còn hiệu quả với nhóm kháng sinh quinolon, trong đó có ciprofloxacin nhạy cao nhất (90%), nhưng vi khuẩn Edwardsiella sp lại kháng với enrofloxacin (50%). Nghiên cứu trước đây của Stock và Wiedemann (2001) xác định vi khuẩn Edwardsiella nhạy với các kháng sinh thuộc STT Kháng sinh Số chủng kháng Nhạy (%) Nhạy TB (%) Kháng (%) Beta-lactamin 1 Ampicillin 0 80 20 0 2 Amoxicillin 1 80 10 10 Cefalosporin 3 Cefalexin 1 50 40 10 Polymyxin 4 Colistin 10 0 0 100 Tetracyclin 5 Doxycyclin 6 40 0 60 6 Tetracyclin 7 30 0 70 Quinolon 7 Enrofloxacin 5 10 40 50 8 Ciprofloxacin 1 90 0 10 9 Norfloxacin 3 10 60 30 10 Ofloxacin 2 20 60 20 Phenicol 11 Florfenicol 6 40 0 60 Aminoglycosid 12 Kanamycin 6 10 30 60 Khác 13 Rifamycin 7 0 30 70 40 nhóm quinolon (trích dẫn bởi Từ Thanh Dung và csv, 2009). Nhưng kết quả của Akinbowale et. al (2007); Dung et. al (2008) vi khuẩn Edwardsiella kháng với nhóm kháng sinh này (trích dẫn bởi Từ Thanh Dung và csv, 2009). Hiện nay nhóm quinolon đang được khuyến cáo hạn chế sử dụng, nhưng theo điều tra của Đỗ Tiến Hảo (2009) lại có đến 62,5% số hộ nuôi sử dụng kháng sinh nhóm này. Quinolon là nhóm thuốc kháng sinh được sử dụng rộng rãi chuyên dùng trị các bệnh nhiễm trùng và là nhóm kháng sinh cực kỳ quan trọng trong y học, không nên lạm dụng nhóm kháng sinh này vì có thể sẽ tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc vĩnh viễn. Do đó, việc dùng thuốc nhóm kháng sinh này trong thủy sản cần hết sức thận trọng. Theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan (2007) có đến 72,3% chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhạy với nhóm tetracyclin và theo Châu Hồng Thúy (2008) tính nhạy của các chủng vi khuẩn là 60% với tetracyclin, 66,7% với doxycyclin. Gần đây nghiên cứu của Trần Duy Phương (2009) còn lại 58% chủng vi khuẩn nhạy với nhóm tetracyclin. Nhưng theo kết quả nghiên cứu Từ Thanh Dung và csv (2009) lại cho thấy 64% chủng vi khuẩn kháng với tetracyclin và 56% kháng với doxycyclin và theo kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy các chủng vi khuẩn kháng với nhóm tetracyclin, doxycyclin (60%), tetracyclin (70%). Trong quá trình nuôi do nhóm thuốc này được sử dụng lâu dài nên tính nhạy của thuốc đã giảm dần theo thời gian, vì theo kết quả điều tra của Trần Duy Phương (2009) vẫn còn khá nhiều hộ nuôi (41,94%) sử dụng nhóm thuốc này. Nên trong quá trình nuôi cần cân nhắc lại tình trạng sử dụng nhóm thuốc này. Ngoài ra, kết quả kiểm tra kháng sinh đồ với 13 loại thuốc kháng sinh trên thì các chủng vi khuẩn Edwardsiella sp kháng với kanamycin, colistin, rifamycin , tỉ lệ kháng cao lần lượt là: 60%, 100% và 56,9%. Kanamycin ít được người dân sử dụng rộng rãi, vì tính nhạy của nó không cao, một phần cũng do đặc tính của kháng sinh này có hiệu quả không cao đối với vi khuẩn. Colistin kháng tự nhiên với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, trong công thức pha chế môi trường đặc trưng của Edwardsiella ictaluri, người ta dùng colistin có trong thành phần của môi trường chọn lọc Edwardsiella ictaluri agar (EIA). Do đó, không nên sử dụng các kháng sinh này trong việc điều trị bệnh do vi khuẩn Edwardsiella sp gây ra, vì sẽ gây tốn kém cho người nuôi mà không đem lại hiệu quả. Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng vi khuẩn Edwardsiella sp kháng với florfenicol (60%). Florfenicol được sử dụng phổ biến trong ngành nuôi trồng thủy sản. Trong những năm gần đây kể từ khi cấm sử dụng chloramphenicol, theo kết quả điều tra của Trần Duy Phương (2009) kháng sinh florfenicol được ứng dụng rộng rãi trong điều trị bệnh mủ gan ở cá tra (61,3%). Báo cáo của Từ Thanh Dung và csv (2008) không có chủng Edwardsiella phân lập từ cá tra bệnh mủ gan kháng với florfenicol, cho thấy kháng sinh này có tính nhạy rất cao. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của Từ Thanh 41 Dung và csv (2009) có đến 73,5% chủng vi khuẩn Edwardsiella kháng với florfenicol. Theo trích dẫn của Từ Thanh Dung và csv (2009) tính kháng của vi khuẩn với thuốc florfenicol tăng nhanh do thông qua cơ chế đào thải protein, mã hóa gen liên quan đến integron (Arcangioli et. al, 1999; Cloeckaert et. al, 2000) và qua plasmid (Keys et. al, 2000). Vì thế nên cẩn trọng khi dùng loại kháng sinh này, tránh tình trạng lạm dụng. 21 13.6 30 32.4 16 19.4 16.4 25.6 18.8 19.2 23 13.4 22 24.4 10 13.4 9.4 10.8 21.2 11.6 14.4 11.8 11.4 18.6 8.2 9.6 5 10 15 20 25 30 35 AM AMX CN CS DO TE ENR CIP NOR OF FFC K RA Kháng sinh Đ ư ờn g kí n h v ô tr ùn g (m m ) Cần Thơ An Giang Từ Hình 4.11 cho thấy: trong 13 loại kháng sinh được dùng làm kháng sinh đồ thì chỉ có 4 loại: ampicillin, amoxicillin, cefalexin, ciprofloxacin đều nhạy với vi khuẩn Edwardsiella sp ở cả 2 tỉnh Cần Thơ và An Giang. Đường kính vòng vô trùng dao động là từ 18,6-32,4 mm. Ciprofloxacin thuộc nhóm quinolon, là nhóm thuốc có hoạt tính kháng khuẩn vừa nhanh vừa mạnh và có tác dụng diệt khuẩn trên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Aeromonas, Edwardsiella, Pseudomonas). Theo kết quả nghiên cứu của Hồ Thị Kiều Nga (2009), cho thấy ciprofloxacin đều nhạy với các vi khuẩn kiểm tra, cho đường kính vòng vô trùng dao động (19-47 mm), amoxicillin (16- 50 mm). Từ kết quả Hình 4.11 cũng cho thấy: ciprofloxacin, amoxicillin nhạy với Edwardsiella sp ở cả 2 tỉnh Cần Thơ và An Giang. Có thể sử dụng loại kháng sinh này để điều trị trong các trường hợp đa nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, ciprofloxacin nằm trong danh mục cấm sử dụng đối với thị trường EU và nằm trong danh mục hạn chế sử dụng ở nước ta. Vì thế, khi sử dụng kháng sinh này ta cần lưu ý khi sử dụng hoặc khuyến cáo người dân trong điều trị bệnh. Ở Cần Thơ và An Giang 4 loại kháng sinh ampicillin, amoxicillin, cefalexin, ciprofloxacin được ứng dụng rộng rãi trong thủy sản và hiệu quả của nó khá cao, trong trường hợp cá tra bộc phát bệnh có thể sử dụng các loại kháng sinh này để điều trị. Nhưng trong quá trình nuôi, nếu sử dụng các loại kháng sinh này thường xuyên trong việc phòng bệnh cho cá, thì về lâu dài sẽ tạo ra Hình 4.11: Đường kính trung bình vô trùng của thuốc kháng sinh đối với Edwardsiella sp tại Cần Thơ và An Giang 42 những dòng vi khuẩn kháng thuốc, rất có thể không lâu các loại kháng sinh sẽ kháng với vi khuẩn, chỉ nên sử dụng trong việc điều trị bệnh. Với mỗi loại kháng sinh thì đường kính vô trùng trung bình của kháng sinh đối với Edwardsiella sp ở An Giang lớn hơn ở Cần Thơ. Ba loại kháng sinh: enrofloxacin, norfloxacin, ofloxacin thuộc nhóm quinolon và doxycyclin, tetracyclin thuộc nhóm tetracyclin được sử dụng ở Cần Thơ đã có hiện tượng kháng với vi khuẩn Edwardsiella sp (<15 mm), nhưng ở An Giang lại sử dụng có hiệu quả ở mức trung bình đường kính vòng vô trùng dao động từ 16-19,4 mm. Kanamycin, rifamycin kháng hoàn toàn với vi khuẩn làm kháng sinh đồ ở 2 tỉnh. Theo Đặng Thị Hoàng Oanh và csv (2005) trong quá trình nuôi việc sử dụng kháng sinh thường xuyên, thay đổi nhiều loại kháng sinh, phối hợp nhiều loại kháng sinh, thêm vào đó người nuôi chỉ sử dụng theo kinh nghiệm, mà không nắm rõ nguyên nhân gây bệnh cũng như cơ chế tác dụng của kháng sinh. Sử dụng lâu dài nên kháng sinh đã không còn hiệu quả khi điều trị. 4.2.2 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Aeromonas sp tại Cần Thơ và An Giang Kiểm tra kháng sinh đồ đối với vi khuẩn Aeromonas sp, sau 24 giờ ở mỗi đĩa kháng sinh xuất hiện vòng vô, đường kính vòng vô trùng xác định tính nhạy của vi khuẩn. Đường kính vòng vô trùng dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory (CLSI) (2006): Nhạy (≥20 mm), nhạy trung bình (15-19 mm), kháng (<14 mm) Hình 4.12: Kết quả kháng sinh đồ của chủng Aeromonas sp sau 24 giờ 43 Bảng 4.3: Tỉ lệ tính nhạy của 10 chủng vi khuẩn Aeromonas sp với 13 loại kháng sinh STT Kháng sinh Số chủng kháng Nhạy (%) Nhạy TB (%) Kháng (%) Beta-lactamin 1 Ampicillin 10 0 0 100 2 Amoxicillin 10 0 0 100 Cefalosporin 3 Cefalexin 10 0 0 100 Polymyxin 4 Colistin 7 0 30 70 Tetracyclin 5 Doxycyclin 2 40 40 20 6 Tetracyclin 5 50 0 50 Quinolon 7 Enrofloxacin 0 90 10 0 8 Ciprofloxacin 0 100 0 0 9 Norfloxacin 0 90 10 0 10 Ofloxacin 1 90 0 10 Phenicol 11 Florfenicol 4 60 0 40 Aminoglycosid 12 Kanamycin 6 10 30 60 Khác 13 Rifamycin 9 0 10 90 Qua kết quả Bảng 4.3 cho thấy có 7 loại kháng sinh còn nhạy với vi khuẩn và phần trăm nhạy của các chủng vi khuẩn Aeromonas sp đối với các loại kháng sinh là khá cao. Đặc biệt, các chủng vi khuẩn này rất nhạy với nhóm quinolon. Theo Sarter et. al (2007) thì các dòng vi khuẩn Gram âm phân lập từ môi trường nuôi cá tra đã kháng với tetracyclin. Mohamed Nawaz (2006) vi khuẩn Aeromonas kháng 25% với tetracyclin. Huỳnh Thị Thúy Hằng (2008) lại cho thấy vi khuẩn Aeromonas kháng với doxycyclin. Tuy nhiên, kết quả Bảng 4.3 lại cho thấy các chủng vi khuẩn nhạy với nhóm tetracyclin, tetracyclin (50%), doxycyclin (40%). Tỉ lệ phầm trăm nhạy của tetracyclin (50%) và kháng là (50%), do đó kháng sinh này rất dễ xảy ra hiện tượng kháng thuốc trong trường hợp sử dụng lâu dài. Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của vi khuẩn Aeromonas sp cho thấy nhạy với doxycyclin (Cao Anh Tuấn, 2005). Đồng thời theo Từ Thanh Dung (2005) cho rằng nên sử dụng doxycyclin để điều trị bệnh do vi khuẩn Aeromonas sp gây ra. Do vi khuẩn Aeromonas sp gây bệnh trên nhiều đối tượng cá nước ngọt, nên việc sử dụng thuốc kháng sinh trong môi trường nuôi ngày càng nhiều và tăng theo thời gian, nên khả năng kháng thuốc cũng tăng theo. Từ các nguyên nhân trên dẫn đến sai khác kết quả kháng sinh đồ cũng là hợp lý. 44 19.6 25.6 15.4 8 27.6 23.2 12 8 8 8.6 10.6 18.6 23.8 23.6 20.6 20.2 8 8.6 9 11 18.2 15.4 25 25.6 17.6 12 5 10 15 20 25 30 AM AMX CN CS DO TE ENR CIP NOR OF FFC K RA Kháng sinh Đ ư ờn g kí n h v ô tr ùn g (m m ) Cần Thơ An Giang Nhiều nghiên cứu trước đây thì vi khuẩn Aeromonas sp kháng tự nhiên với ampicillin, amoxicillin, cefalexin. Kết quả nghiên cứu trên cho thấy 100% vi khuẩn Aeromonas sp được phân lập ở Cần Thơ và An Giang kháng với 3 loại kháng sinh này. Ngoài ra, kết quả lập kháng sinh đồ của 10 chủng vi khuẩn Aeromonas sp được phân lập từ mẫu nước vùng nước ngọt ở Bangladesh cũng ghi nhận rằng vi khuẩn Aeromonas sp kháng với amoxicillin (Bazlur and Valerie, 1994). Kết quả nghiên cứu của Cao Anh Tuấn (2005) cũng cho thấy vi khuẩn Aeromonas sp kháng với amoxicillin. Huỳnh Thị Thúy Hằng (2008) cho thấy vi khuẩn Aeromonas sp đều kháng với amoxicillin và cefalexin. Biết được tính kháng tự nhiên của 3 loại kháng sinh này, sẽ giúp cho người nuôi giảm được chi phí trong việc lựa chọn và sử dụng thuốc kháng sinh. Theo Hình 4.13 cho thấy: hiệu quả của các loại kháng sinh đối với vi khuẩn Aeromonas sp ở Cần Thơ và An Giang không chênh lệch có ý nghĩa, kết quả làm kháng sinh đồ với 13 loại kháng sinh ở Cần Thơ và An Giang thì chỉ 8 loại kháng sinh cho hiệu quả với vi khuẩn Aeromonas sp là ciprofloxacin (23,6 và 27,7 mm) có tính nhạy cao nhất, kế tiếp là enrofloxacin, ofloxacin, norfloxacin, doxycyclin, tetracylin đường kính trung bình vô trùng dao động từ 15,4-27,6 mm. Kết quả này phù hợp với đặc tính sinh hóa của Aeromonas sp, vì các kháng sinh ampicillin, amoxicillin, cefalexin kháng mặc định với Aeromonas sp. Tuy nhiên, đối với kháng sinh florfenicol có sự trên lệch cao, ở Cần Thơ thì florfenicol nhạy với vi khuẩn Aeromonas sp (25,6 mm), khi sử dụng florfenicol sẽ cho hiệu quả cao, còn ở An Giang thì florfenicol có hiệu quả với vi khuẩn Aeromonas sp nhưng với mức trung bình (17,6 mm). Đối với kháng sinh kanamycin thì còn cho hiệu Hình 4.13: Đường kính trung bình vô trùng của thuốc kháng sinh đối với Aeromonas sp tại Cần Thơ và An Giang 45 80 0 80 0 50 0 0 0 4040 30 50 10 90 90 100 10 90 20 90 40 60 10 10 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tỉ lệ % AM AMX CN CS DO TE ENR CIP NOR OF FFC K RA Kháng sinh Edwardsiella sp Aeromonas sp quả ở mức trung bình với vi khuẩn Aeromonas sp ở Cần Thơ và đường kính vòng vô trùng: 15,4 mm, còn ở An Giang vi khuẩn Aeromonas sp đã kháng với kanamycin và đường kính vòng vô trùng 12 mm. Florfenicol và kanamycin có sự khác biệt ở hai tỉnh này là do hai địa phương khác nhau nên tình hình sử dụng kháng sinh giữa 2 vùng cũng khác nhau. An Giang có lịch sử nuôi cá tra sớm hơn Cần Thơ nên đã sử dụng kháng sinh thời gian dài dẫn đến hiệu quả sử dụng kháng sinh giảm xuống. Đặc biệt, kết quả kanamycin cũng cho thấy khi sử dụng kanamycin không còn hiệu quả đối với Aeromonas sp ở An Giang, vì kanamycin là loại kháng sinh thế hệ cũ và được sử dụng nhiều ở thời gian trước đây. 4.2.3 Khảo sát tính nhạy của vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp ở Cần Thơ và An Giang Các kháng sinh có tỉ lệ % nhạy với vi khuẩn Edwardsiella sp trên 75% là ampicillin, amoxicillin, ciprofloxacin. Những kháng sinh này ta có thể dùng để điều trị bệnh mủ gan nếu không có điều kiện làm kháng sinh đồ. Các kháng sinh có tỉ lệ % nhạy với vi khuẩn Aeromonas sp có tỉ lệ >75% là: enrofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin, ofloxacin. Khi dùng nhóm quinolon chúng ta phải cẩn thận khi sử dụng, vì nhóm kháng sinh này đang nằm trong danh mục hạn chế sử dụng. Riêng ciprofloxacin là kháng sinh nhạy cả Edwardsiella sp và Aeromonas sp, cho nên có thể dùng kháng sinh này để trị cá nhiễm 2 bệnh cùng xuất hiện. Tuy nhiên, cũng Hình 4.14: Phần trăm nhạy của vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp 46 hạn chế sử dụng kháng sinh này và phải xác định được thời gian xuất cá để có thể đủ thời gian đào thải ciprofloxacin. 18.2 16 15.4 19.4 25 16.4 27.6 25.6 23.2 18.8 25.6 19.2 17.6 23 5 10 15 20 25 30 Đ ư ờ n g kí n h v ô tr ùn g (m m ) DO TE ENR CIP NOR OF FFC Kháng sinh Aeromonas sp Edwardsiella sp Qua Hình 4.15 có thể thấy rằng: trong 13 loại thuốc kháng sinh được dùng để làm kháng sinh đồ ở An Giang, thì có 7 loại kháng sinh cho kết quả nhạy với cả 2 loại vi khuẩn Aeromonas sp và Edwardsiella sp, đó là: doxycyclin, tetracyclin, enrofloxacin, ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, florfenicol. Điều đó cũng cho thấy khi sử dụng các loại kháng sinh này sẽ cho hiệu quả với cả 2 loại bệnh: bệnh xuất huyết và bệnh mủ gan, như vậy trong trường hợp cá tra xuất hiện 1 trong 2 loại bệnh khi sử dụng các loại kháng sinh trên thì việc điều trị sẽ cho hiệu quả ngay đối với bệnh đó, đồng thời cũng sẽ ngăn chặn được bệnh còn lại khi cá vừa chớm bệnh, sẽ giảm được chi phí cho người nuôi. Qua khảo sát vùng nuôi cá tra ở An Giang cho thấy 100% người nuôi xác nhận có sử dụng kháng sinh trong phòng trị bệnh cho cá, trong đó các loại kháng sinh thuộc nhóm quinolon được sử dụng nhiều nhất (Nguyễn Chính, 2005). Còn đối với Cần Thơ thì chỉ có ciprofloxacin cho kết quả nhạy với cả 2 vi khuẩn Aeromonas sp (23,6 mm) và Edwardsiella sp (21,2 mm). Do việc sử dụng thuốc kháng sinh để phòng và trị bệnh cho cá nuôi. Kết quả điều tra của Nguyễn Quốc Thịnh (2006) việc sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản gia tăng hàng năm trong việc điều trị bệnh, trong khi sự hiểu biết của người nuôi về thuốc kháng sinh còn hạn chế, đa phần người dân sử dụng theo kinh nghiệm, việc lạm dụng kháng sinh của Hình 4.15: Đường kính trung bình vô trùng của thuốc kháng sinh đối với Aeromonas sp và Edwardsiella sp tại An Giang 47 người nuôi còn rất phổ biến, khi cá có dấu hiệu bệnh tương tự bệnh trước đây thì sẽ sử dụng lại loại kháng sinh đã điều trị trước đó, nếu không có hiệu quả sẽ chuyển sang kháng sinh khác. Theo kết quả nghiên cứu Huỳnh Chí Thanh (2007) nhận thấy rằng tình hình dịch bệnh trên cá tra chưa thấy phát hiện bệnh mới, nhưng cường độ nhiễm bệnh ngày càng tăng, lượng thuốc kháng sinh sử dụng ngày càng cao hơn, nhưng tỉ lệ sống lại thấp hơn. Điều đó cho thấy phần nào hậu quả của việc sử dụng kháng sinh bừa bãi, sử dụng không đúng liều, dẫn đến hình thành các dòng vi khuẩn kháng thuốc. Tình trạng sử dụng thuốc kháng sinh bừa bãi và thiếu kiểm soát như vậy có thể dẫn tới nhiều loại kháng sinh thông dụng được phép sử dụng trong nuôi trồng thủy sản sẽ bị kháng với nhiều loại vi khuẩn. Theo nghiên cứu này thì chỉ có ciprofloxacin cho kết quả nhạy với cả 2 vi khuẩn, nhưng ciprofloxacin đang là kháng sinh nằm trong danh mục hạn chế sử dụng ở Việt Nam, nên việc sử dụng kháng sinh này càng nên thận trọng. Do đó, nếu không có biện pháp khắc phục nhiều khả năng việc kháng thuốc sẽ còn gia tăng theo thời gian. 48 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Kết quả đã phân lập được 10 chủng vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp ở 2 tỉnh Cần Thơ và An Giang. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy các loại kháng sinh nhạy với các chủng Edwardsiella sp: cefalexin (50%), ampicillin (80%), amoxicillin (80%), ciprofloxacin (90%). Các loại kháng sinh nhạy với các chủng Aeromonas sp: florfenicol (60%), ofloxacin (90%), norfloxacin (90%), enrofloxacin (90%), ciprofloxacin (100%). Kết quả kháng sinh đồ ở Cần Thơ cho thấy: ampicillin, amoxicillin, cefalexin, ciprofloxacin nhạy với Edwardsiella sp. Enrofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin, ofloxacin và florfenicol nhạy với Aeromonas sp. Kết quả kháng sinh đồ ở An Giang cho thấy: ampicillin, amoxicillin, ciprofloxacin và florfenicol nhạy với Edwardsiella sp. Enrofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin và ofloxacin nhạy với Aeromonas sp. Các loại kháng hiệu quả với cả vi khuẩn Edwardsiella sp và Aeromonas sp, ở An Giang đó là: doxycyclin, tetracyclin, enrofloxacin, ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin và florfenicol. Ở Cần Thơ thì chỉ có ciprofloxacin cho kết quả nhạy với cả 2 vi khuẩn. 5.2 Đề xuất Mở rộng đề tài ở quy mô lớn hơn như: số lượng mẫu và nhiều địa phương hơn. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh đối với vi khuẩn gây bệnh trên cá tra nuôi của vùng nước ngọt và nước lợ ở ĐBSCL. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình phòng trị bệnh trên cá tra. Tập huấn và hướng dẫn kỹ thuật phòng trị bệnh trên cá tra cho người nuôi. Khuyến cáo đến người nuôi các kháng sinh cho hiệu quả cao trong việc điều trị bệnh. Đề tài điều tra và phân tích thực trạng chất lượng kháng sinh nguyên liệu trên thị trường dùng điều trị bệnh thuỷ sản. 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Quang Tề, 2006. Bệnh học Thủy Sản. Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I. NXB nông nghiệp. 439 trang. Cao Anh Tuấn, 2005. Thành phần giống loài vi khuẩn và ký sinh trùng trên cá tra giống (Pangasius hypophthalmus) huyện Tân Châu, tỉnh An Giang. Luận văn đại học, khoa thủy sản, trường Đại Học Cần Thơ. 42 trang. Châu Hồng Thúy, 2008. Khảo sát tình hình xuất hiện bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra nuôi thâm canh ở tỉnh Trà Vinh. Luận văn cao học 2008, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ, 75 trang Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Minh Hậu và Nguyễn Thanh Phương. Thiết lập bộ sưu tập vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh chloramphenicol tại khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. Tạp chí nghiên cứu Khoa Học 2004: 2 76-81. Đặng Thị Hoàng Oanh. Xác định tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Việt Nam. Tạp chí nghiên cứu khoa học 2005: 136-144. Đỗ Tiến Hảo, 2009.Tình hình xuất hiện bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận văn đại học. Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. Hồ Thị Kiều Nga, 2009. Nghiên cứu kiểu Plasmid và tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Luận văn đại học. Hội Đồng dược điển Việt Nam, 2002.Dược điển Việt Nam. Lần xuất bản thứ ba. Huỳnh Chí Thanh, 2007. Xác định đặc điểm sinh hóa và bước đầu thử nghiệm điều trị bệnh Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng kháng sinh. Luận văn đại học. Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008. Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila tại khoa thủy sản. Luận văn đại học. Huỳnh Thị Thúy Hằng, 2008. Tiêu chuẩn hóa phương pháp lập kháng sinh đồ trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila tại khoa thủy sản. Luận văn đại học. 50 Lê Thị Cẩm Tú, 2009. Khảo sát ảnh hưởng của Florfenicol lên một số chỉ tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống nuôi trên bể. Luận văn đại học. Ngô Minh Dung, 2007. Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Luận văn đại học. Nguyễn Chính, 2005. Đánh giá tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở An Giang và Cần Thơ. Luận văn đại học. Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan, 2007. Phân lập và khảo sát đặc điểm kháng sinh của Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi thâm canh. Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Nông Lâm Nghiệp số 1&2/2007. Trang 175-179. Nguyễn Quốc Thịnh, 2006. Điều tra đánh giá ảnh hưởng việc sử dụng thuốc và hóa chất trong quá trình nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) bè. Đề tài cấp trường. Khoa thủy sản đại học Cần Thơ. Nguyễn Văn Kiểm, 2004. Cơ sở khoa học và kỹ thuật sản xuất cá giống, NXB nông nghiệp, 21-38. Nguyễn Văn Thường. Tổng quan dẫn liệu về định loại cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) phân bố ở vùng hạ lưu sông Mekong. Tạp chí Khoa Học 2008:1 82-90 . Phạm Văn Khánh, 1996. Sinh sản nhân tạo và nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) (Sauvage, 1878). Luận án phó tiến sĩ khoa nông nghiệp. Trường Đại Học Thủy Sản Nha Trang. Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng bệnh vi khuẩn do Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ở ĐBSCL. Luận văn đại học. Trần Anh Dũng, 2005. Khảo sát các tác nhân gây bệnh trong nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh ở tỉnh An Giang. LVCH. Khoa Thủy Sản. ĐHCT. Trần Duy Phương, 2009. Đánh giá sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh – Bến Tre. Luận văn đại học. Trần Minh Phú, Đào Thị Hồng Sen, Đỗ Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền. Xác định thời gian tồn lưu Enrofloxacin trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Tạp chí Khoa Học 2008: 2 215-218. 51 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa. Bệnh học Thủy Sản, 2005, trang 50-69 . Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh, Đặng Thị Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Tạp chí khoa học, Đại Học Cần Thơ, 2004. Từ Thanh Dung, Phạm Thanh Hương, Nguyễn Anh Tuấn, 2009. Hiện tượng đa kháng trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản Toàn Quốc, trang 219-225. Tiếng Anh Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006. Methods for broth dilution susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals; informational supplement, M49-A, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne. Depaola, A., Jame T. Peeler and Gary E. Rodrick., 1995. Effect of Oxytetraxycline- Medicated Feed on Antibiotic Resistance of Gram-Negative Bacteria in Catfish Ponds. Applied and Environmentl Microbiology, June 1995, p. 2335-2340. Bazlur Rashid Chowdhury &Vlerie Inglis, 1994. Selection of resistant Aeromonas to certain antibacteria agent in the aquaculture sites of Bangladesh. The aquatic animal health research institute. Department of fisheries Kasetsart University Campus, 639. 94-W927a/C1. Mohamed Nawaz, Kindon Sung, Saeed A. Khan, Ashraf A. Khan, and Roger Steele, 2006. Biochemical and Molecular Characterization of Tetracycline-Resistance Aeromonas veronii Isolates from Catfish. Applied and Environmental Microbiology, Oct 2006, p. 6461-6466. Phuong, N. T., Oanh, Đ. T. H., Dung, T. T and Sinh, L. X 2005. Bacterial Resistance to Antimicrobials Use in Shrimp and Fish Farm in the Mekong delta, Vietnam. Journal: Proceeding of the international workshop on: Antibiotic Resistance in Asian Aquaculture Environments. Samira Sarter, Hoang Nam Kha Nguyen, Le Thanh Hung, Jerome Lazard, and Didier montet., 2007. Antibiotic Resistace in Gram-negative bacteria isolated from farmed catfish. Food Control 18 (2007) p. 1391-1396. Tangtrongpiros,. J 2005. Antibiotic Resistance Problem in Thailand. Antibiotic Resistance in Asian Aquaculture Environments Prooceedings Index (ISBN N° 88- 901344-3-7). 52 Tu Thanh Dung, Freddy Haesebrouck, Nguyen Anh Tuan, Patrick sorgeloos, Margo Baele, and Annemie Decostere, 2008. Antimicrobial sasceptibility pattern of Edwardsiella ictaluri isolate from natural outbreaks of bacillary necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in Viet Nam. Microbial Drug Resistance. December 2008, 14(4) p: 311-316.