Luận văn Xây dựng các phương pháp điện biến nạp cho hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N

me từ 10 – 15 phút tần suất biến nạp cao (2,59 – 2,95)x103/µg DNA plasmid đối với chủng B. subtilis 1012 và (4,67 – 5,99)x103/µg DNA plasmid đối với chủng B. subtilis WB800N. Ủ tế bào với lysozyme trong khoảng 5 phút là quá ngắn không đủ thời gian để lysozyme phân cắt lớp vách tế bào và 20 phút là quá dài làm cho tế bào bị phá vỡ hoặc rất yếu, do đó tần suất biến nạp trong hai khoảng thời gian 5 và 20 phút rất thấp (0,41 – 0,59) x103/µg DNA plasmid đối với chủng B. subtilis 1012 và (1,05 – 0,84)x103/µg DNA plasmid đối với chủng B. subtilis WB800N. Với kết quả trên chúng tôi chọn được khoảng thời gian thích hợp cho xử lý tế bào với nồng độ 1 µg/ml trong 15 phút. Hoạt tính của enzyme sẽ phụ thuộc vào nồng độ enzyme và thời gian phản ứng. Trong thí nghiệm này, nồng độ lysozyme sử dụng là 1 µg/ml thì cần ủ mẫu trong thời gian 10 – 15 phút. Nồng độ và thời gian như vậy là phù hợp cho quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp. Nếu tăng nồng độ enzyme và giảm thời gian xử lý sẽ có nhược điểm như hao tổn enzyme. Thời gian ủ mẫu quá ngắn sẽ dễ dẫn tới sai số trong quá trình thao tác và kết quả biến nạp không ổn định. Nếu giảm nồng độ enzyme và tăng thời gian xử lý thì ảnh hưởng đến chất lượng của tế bào khả nạp vì trong quá trình xử lý với lysozyme, tế bào vẫn tăng trưởng và phát triển, những tế bào mới phân chia có thể không được xử lý với lysozyme. Như vậy, các yếu tố ảnh hưởng đến tần suất biến nạp trong giai đoạn chuẩn bị tế bào khả nạp đã được khảo sát gồm: môi trường tăng trưởng là LB – sorbitol 0,5 M, thời điểm thu mẫu là giai đoạn đầu của pha cân bằng, nồng độ lysozyme 1 µg/ml và thời gian xử lý lysozyme là 10 – 15 phút. Kết quả - Biện luận Trang 46 Biểu đồ 3.5: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được xử lý lysozyme nồng độ từ 1 µg/ml trong 5, 10, 15, 20 phút. 3.1.2.4. Ảnh hưởng của hiệu điện thế đến tần suất biến nạp Hiệu điện thế là một yếu tố quan trọng quyết định tần suất biến nạp. Theo nguyên tắt điện biến nạp là dùng điện trường để tạo các lỗ tạm thời trên màng. Với mỗi chủng vi khuẩn, mỗi phương pháp sử dụng hiệu điện thế khác nhau. Hiệu điện thế quá thấp tần suất biến nạp sẽ thấp nhưng hiệu điện thế quá cao có thể làm tỷ lệ tế bào chết sau biến nạp tăng lên. Khảo sát dãy hiệu điện thế: 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV ảnh hưởng lên tần suất biến nạp của hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N đã được chuẩn bị theo các điều kiện tối ưu đã khảo sát trên. Kết quả biến nạp được tổng kết trong Bảng 3.4. Trên Bảng 3.4 là kết quả số khuẩn lạc trên đĩa biến nạp với dãy hiệu điện thế từ 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV. Với mỗi giá trị hiệu điện thế khảo sát được biến nạp ba lần lặp lại, tính số khuẩn lạc trung bình của ba lần biến nạp. 0,41 2,59 2,95 0,59 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 5 10 15 20 T ần s u ất b iế n n ạp (x 1 0 3 µ g -1 D N A ) Thời gian (phút) B. subtilis 1012 1,05 4,67 5,99 0,84 0 1 2 3 4 5 6 7 5 10 15 20 T ần s u ất b iế n n ạp (x 1 0 3 µ g -1 D N A ) Thời gian (phút) B.subtilis WB800N Kết quả - Biện luận Trang 47 Bảng 3.4: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N xử lý lysozyme biến nạp với dãy hiệu điện thế 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV. Hình 3.4: Kết quả điện biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được biến nạp với dãy hiệu điện thế 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV.(đĩa 2,5 kV mẫu được pha loãng 2 lần trước khi trải) Chủng Thí nghiệm lần 1 Thí nghiệm lần 2 Số khuẩn lạc trên đĩa biến nạp Hiệu điện thế (kV) Số khuẩn lạc trên đĩa biến nạp Hiệu điện thế (kV) 1,9 2,1 2,3 2,5 1,9 2,1 2,3 2,5 B. subtilis 1012 Số khuẩn lạc đĩa 1 84 185 223 235 Số khuẩn lạc đĩa 1 56 230 318 338 Số khuẩn lạc đĩa 2 73 198 235 308 Số khuẩn lạc đĩa 2 73 178 269 293 Số khuẩn lạc đĩa 3 63 156 268 259 Số khuẩn lạc đĩa 3 44 199 278 276 Số khuẩn lạc trung bình 73 179 242 267 Số khuẩn lạc trung bình 57 202 288 302 B. subtilis WB800N Số khuẩn lạc đĩa 1 64 121 231 588 Số khuẩn lạc đĩa 1 60 175 300 546 Số khuẩn lạc đĩa 2 74 150 255 646 Số khuẩn lạc đĩa 2 96 150 246 572 Số khuẩn lạc đĩa 3 83 212 273 576 Số khuẩn lạc đĩa 3 84 137 280 590 Số khuẩn lạc trung bình 73 161 253 603 Số khuẩn lạc trung bình 80 154 275 569 Kết quả - Biện luận Trang 48 Từ kết quả tần suất biến nạp trên Biểu đồ 3.6 cho thấy tần suất biến nạp tăng dần khi hiệu điện thế điện biến nạp tăng dần từ 1,9 đến 2,5 kV. Như vậy, tần suất biến nạp đang có xu thế tăng dần khi hiệu điện thế tăng dần và đạt cực đại khi hiệu điện thế cực đại. Điều này cho thấy cũng có thể tần suất biến nạp có thể tăng cao hơn nữa khi khảo sát thêm hiệu điện thế cao hơn. Nhưng vì thiết bị điện biến nạp chỉ cho phép sử dụng hiệu điện thế cao nhất là 2,5 kV nên không thể khảo sát thêm. Tuy nhiên cũng có thể tăng hiệu điện thế hơn nữa làm cho tần suất biến nạp giảm vì tế bào không thể phục hồi sau khi điện biến nạp. Biểu đồ 3.6: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N xử lý lysozyme điện biến nạp với hiệu điện thế: 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV. Tóm lại, từ tất cả các kết quả khảo sát được, chúng tôi đã xây dựng được quy trình điện biến nạp cho hai chủng B. subtilis 1012 và B.subtilis WB800N sử dụng môi trường áp suất thẩm thấu cao, lysozyme. Plasmid pHT1068 nồng độ cố định 0,1 µg được sử dụng để kiểm tra tính khả nạp của tế bào và tính tần suất biến nạp. Các bước thực hiện của quy trình như sau: Hoạt hóa chủng qua đêm, cấy chuyền sang 200 ml môi trường LB – 0,5 M sorbitol Nuôi cấy lắc 37oC, 250 vòng /phút, đo OD600nm, xây dựng đường cong tăng trưởng ↓ Khi chủng tăng trưởng bắt đầu vào pha cân bằng, thu nhận dịch nuôi cấy tế bào 0,66 1,91 2,65 2,85 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 1,9 2,1 2,3 2,5 T ần s u ất b iế n n ạp (x 1 0 3 µ g -1 D N A ) Hiệu điện thế (kV) B. subtilis 1012 0,77 1,58 2,64 5,86 0 1 2 3 4 5 6 7 1,9 2,1 2,3 2,5 T ần s u ất b iế n n ạp (x 1 0 3 µ g -1 D N A ) Hiệu điện thế (kV) B. subtilis WB800N Kết quả - Biện luận Trang 49 Xử lý với lysozyme nồng độ 1µg/ml trong 15 phút ở 37oC, 250 vòng /phút ↓ Ủ lạnh dịch tế bào trong đá 5 phút, ly tâm thu sinh khối 6000 vòng/phút trong 5 phút ↓ Rửa tế bào với 3 ml EB (0,5 M sorbitol, 0,5 M manitol, 10% glycerol), huyền phù Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch Lặp lại bước rửa 3 lần ↓ Hòa sinh khối tế bào trong EB với tỷ lệ 1/50 thể tích nuôi cấy ↓ Trộn 100 µl dịch tế bào khả nạp với 0,1 µg plasmid chuyển vào cuvette điện biến nạp đã ủ lạnh, để cuvette trong đá lạnh 5 phút ↓ Xung điện với thông số 200 Ω, 25 µF, 2,5 kV, 5 ms Ngay sau khi xung điện, bổ sung 1 ml môi trường phục hồi (LB – 0,5 M sorbitol, 0,38 M manitol), lắc 2 giờ ở 37oC, 250 vòng /phút ↓ Ly tâm loại bớt dịch, trải trên đĩa môi trường có kháng sinh thích hợp Ủ đĩa ở 37oC qua đêm Tuy nhiên, thực hiện theo quy trình điện biến nạp sử dụng lysozyme phải đảm bảo nghiêm ngặt các điều kiện xử lý tế bào với lysozyme như nhiệt độ, nồng độ, thời gian trong giai đoạn chuẩn bị tế bào khả nạp để đảm bảo được kết quả điện biến nạp thành công. Do đó, quy trình khó đảm bảo tính ổn định của tần suất biến nạp cho tất cả các lần thực hiện. Chúng tôi tiếp tục khảo sát điều kiện khác để đưa ra quy trình điện biến nạp đơn giản dễ thực hiện cho tần suất biến nạp ổn định hơn. Dựa vào tác động của Kết quả - Biện luận Trang 50 nhiệt độ đến màng tế bào chúng tôi tiến hành khảo sát để xây dựng quy trình điện biến nạp bằng cách ủ lạnh tế bào. Các kết quả khảo sát được trình bày ở phần tiếp theo. 3.1.3. Xây dựng quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao kết hợp ủ lạnh tế bào ở 4oC Quy trình được xây dựng dựa trên kết quả các khảo sát những yếu tố tác động đến tần suất biến nạp khi xử lý tế bào bằng phương pháp ủ lạnh 4oC: nồng độ sorbitol trong môi trường tăng trưởng, thời điểm thu mẫu, thời gian ủ lạnh, hiệu điện thế. Plasmid pHT1068 nồng độ cố định 0,1 µg được dùng để khảo sát tần suất biến nạp của tế bào khả nạp. 3.1.3.1. Ảnh hưởng của môi trường tăng trưởng và thời điểm thu mẫu lên tính khả nạp của tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N Nồng độ sorbitol trong môi trường tăng trưởng và thời điểm thu mẫu được khảo sát theo phương pháp tương tự như xử lý tế bào bằng lysozyme. Trên Biểu đồ 3.7 cho thấy giai đoạn tăng trưởng của 7 thời điểm thu mẫu của hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N. Dịch nuôi cấy được ủ lạnh 4oC trong 24 giờ, sau đó tiến hành chuẩn bị tế bào khả nạp. Biểu đồ 3.7: Bảy Thời điểm tăng trưởng từ pha log đến pha cân bằng của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – sorbitol (0; 0,25; 0,5; 0,75 M). 0,0625 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 0 2 4 6 8 10 O D 6 0 0 n m Thời gian (giờ) B. subtilis 1012 0 M 0,25 M 0,5 M 0,75 M 0,0625 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 0 2 4 6 8 10 O D 6 0 0 n m Thời gian (giờ) B. subtilis WB800N 0 M 0,25 M 0,5 M 0,75 M Kết quả - Biện luận Trang 51 Kết quả điện biến nạp tương tự như kết quả xử lý tế bào với lysozyme, tế bào được nuôi trong môi trường LB có 0; 0,75 M sorbitol đều không có khả năng khả nạp, trong môi trường LB có 0,25 M sorbitol cho tần suất biến nạp rất thấp (số liệu không được trình bày). Với tế bào nuôi trong LB có 0,5 M sorbitol, có tính khả nạp, kết quả biến nạp được tổng kết trong Bảng 3.5. Bảng 3.5: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N nuôi trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol ở 7 thời điểm tăng trưởng được xử lý ủ lạnh 4oC. Chủng Số khuẩn lạc trên đĩa biến nạp Thời điểm tăng trưởng 1 2 3 4 5 6 7 B. subtilis 1012 Số khuẩn lạc đĩa 1 0 0 135 209 440 534 115 Số khuẩn lạc đĩa 2 0 0 98 268 538 596 105 Số khuẩn lạc đĩa 3 0 0 150 246 320 500 96 Số khuẩn lạc trung bình 0 0 127 241 432 543 105 B. subtilis WB800N Số khuẩn lạc đĩa 1 0 22 130 374 576 151 121 Số khuẩn lạc đĩa 2 5 30 97 293 454 160 67 Số khuẩn lạc đĩa 3 12 35 87 304 528 130 93 Số khuẩn lạc trung bình 6 29 104 323 519 147 93 Biểu đồ 3.8: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N theo 7 thời điểm tăng trưởng khác nhau dựa trên giá trị OD600nm trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol và ủ lạnh 4oC 24 giờ. 0 0 1,28 2,41 4,33 5,43 1,05 0 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 T ần s u ất b iế n n ạp (x 1 0 3 µ g -1 D N A ) Thời điểm tăng trưởng B. subtilis 1012 0,06 0,29 1,05 3,24 5,19 1,47 0,94 0 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 T ần s u ất b iế n n ạp (x 1 0 3 µ g -1 D N A ) Thời điểm tăng trưởng B. subtilis WB800N Kết quả - Biện luận Trang 52 Từ kết quả trong Bảng 3.5, tính tần suất biến nạp và thể hiện tần suất biến nạp bằng Biểu đồ 3.8 cho thấy: kết quả tương tự như đối với quy trình xử lý tế bào bằng lysozyme. Tần suất biến nạp bắt đầu tăng khi tế bào tăng trưởng vào cuối pha log (thời điểm 4). Tần suất biến nạp đạt giá trị tối ưu khi tế bào tăng trưởng vào pha cân bằng thời điểm 5, 6 đối với B. subtilis 1012 (4,33 – 5,43x103/µg DNA plasmid), thời điểm 5 đối với B. subtilis WB800N (5,19x103/µg DNA plasmid). Như vậy, môi trường LB có 0,5 M sorbitol và thu mẫu vào thời điểm tế bào tăng trưởng vào pha cân bằng là thích hợp cho thu nhận tế bào để chuẩn bị tế bào khả nạp theo phương pháp ủ lạnh 4oC cho các khảo sát tiếp theo. 3.1.3.2. Ảnh hưởng của thời gian ủ lạnh lên tính khả nạp của tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N Quy trình được xây dựng dựa trên cơ sở tác động của nhiệt độ lạnh lên vách và màng tế bào. Nhiệt độ lạnh làm ảnh hưởng đến chức năng, hoạt động sinh lý cũng như hoạt động tổng hợp vách tế bào. Thêm nữa, nhiệt độ lạnh còn tác động đến thành phần lipid trên màng và hình thành các lỗ trên màng. Kết quả là sốc nhiệt lạnh sẽ làm tăng tính thấm của màng tế bào, vì vậy, ảnh hưởng đến tần suất biến nạp. Thời gian ủ lạnh được khảo sát từ: 12; 24; 36; 48 giờ nhằm tìm ra khoảng thời gian tối ưu cho ủ lạnh tế bào để tế bào có khả năng khả nạp. Thí nghiệm được lặp lại hai lần, mỗi nghiệm thức thời gian ủ lạnh được biến nạp 3 lần để tính số khuẩn lạc trung bình mọc được trên đĩa. Kết quả ảnh hưởng của thời gian ủ ở nhiệt độ lạnh 4oC trên Hình 3.5 cho thấy tế bào của hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N đều có tính khả nạp. Trong đó kết quả số khuẩn lạc của tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được ủ trong 12 và 24 giờ là số khuẩn lạc đã được pha loãng 2 lần trước khi trải đĩa. Kết quả - Biện luận Trang 53 Hình 3.5: Kết quả điện biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được ủ lạnh 4oC 12, 24, 36, 48 giờ (đĩa 12 và 24 giờ mẫu được pha loãng 2 lần trước khi trải đĩa; đĩa 36 và 48 giờ mẫu được trải với dung dịch gốc). Số khuẩn lạc mọc được trên đĩa biến nạp của các tế bào ủ với thời gian khác nhau được đếm và tổng kết trong Bảng 3. Bảng 3.6: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N bằng phương pháp ủ lạnh 4oC trong 12; 24; 36; 48 giờ. Chủng Thí nghiệm lần 1 Thí nghiệm lần 2 Số khuẩn lạc trên đĩa biến nạp Thời gian (giờ) Số khuẩn lạc trên đĩa biến nạp Thời gian (giờ) 12 24 36 48 12 24 36 48 B. subtilis 1012 Số khuẩn lạc đĩa 1 378 550 248 39 Số khuẩn lạc đĩa 1 300 524 204 78 Số khuẩn lạc đĩa 2 458 630 206 69 Số khuẩn lạc đĩa 2 436 540 220 59 Số khuẩn lạc đĩa 3 440 580 163 42 Số khuẩn lạc đĩa 3 478 534 180 70 Số khuẩn lạc trung bình 425 586 205 50 Số khuẩn lạc trung bình 404 532 201 69 B. subtilis WB800N Số khuẩn lạc đĩa 1 440 566 289 158 Số khuẩn lạc đĩa 1 244 450 275 47 Số khuẩn lạc đĩa 2 424 480 307 223 Số khuẩn lạc đĩa 2 394 630 250 77 Số khuẩn lạc đĩa 3 398 516 332 163 Số khuẩn lạc đĩa 3 262 750 382 126 Số khuẩn lạc trung bình 420 520 309 181 Số khuẩn lạc trung bình 300 610 302 83 Kết quả - Biện luận Trang 54 Từ kết quả số khuẩn lạc trong Bảng 3.6, tính tần suất biến nạp và thể hiện tần suất biến nạp theo thời gian ủ lạnh 4oC bằng Biểu đồ 3.9: Biểu đồ 3.9: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N theo trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol ủ lạnh 4oC 12; 24; 36; 48 giờ. Trên Biểu đồ 3.9 cho thấy tần suất biến nạp tăng khi thời gian ủ tăng từ 12 – 24 giờ, tần suất biến nạp trong khoảng (4,15 – 5,6) x103/µg DNA plasmid đối với chủng B. subtilis 1012 và (3,6 – 5,65) x103/µg DNA plasmid đối với chủng B. subtilis WB800N. Với thời gian ủ dài hơn từ 36 – 48 giờ, tần suất biến nạp bắt đầu giảm có thể là do ủ lạnh trong thời gian dài, sức sống của chủng bị giảm và chủng không có khả năng phục hồi sau khi xung điện. Như vậy, khoảng thời gian ủ lạnh 4oC để chuẩn bị tế bào khả nạp có thể nằm trong khoảng từ 12 – 24 giờ. Thời gian tối ưu là 24 giờ ủ lạnh cho tần suất biến nạp cao nhất. Tóm lại, qua các thí nghiệm khảo sát về môi trường tăng trưởng, thời điểm thu mẫu, thời gian ủ lạnh, chúng tôi đã tìm ra các điều kiện tối ưu cho quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp điện biến nạp theo phương pháp ủ lạnh. Tiếp theo, chúng tôi khảo sát yếu tố hiệu điện thế, một yếu tố ảnh hưởng đến tần suất biến nạp trong giai đoạn xung điện. 3,6 5,65 3,06 1,32 0 1 2 3 4 5 6 7 12 24 36 48 T ần s u ất b iế n n ạp (x 1 0 3 µ g -1 D N A ) Thời gian (giờ) B. subtilis WB800N 4,15 5,6 2,04 0,6 0 1 2 3 4 5 6 7 12 24 36 48 T ần s u ất b iế n n ạp (x 1 0 3 µ g -1 D N A ) Thời gian (giờ) B. subtilis 1012 Kết quả - Biện luận Trang 55 3.1.3.3. Ảnh hưởng của hiệu điện thế lên tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N Tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được chuẩn bị tế bào khả nạp điện biến nạp theo các điều kiện tối ưu đã khảo sát được của quy trình ủ lạnh 4oC. Khảo sát ảnh hưởng của hiệu điện thế bằng phương pháp điện biến nạp với dãy hiệu điện thế tăng dần như sau: 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV. Quan sát trên đĩa ta thấy số khuẩn lạc của cả hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N tăng dần khi hiệu điện thế biến nạp tăng lên từ 1,9 – 2,5 kV. Bảng 3.7 tổng kết số khuẩn lạc mọc được trên đĩa biến nạp. Bảng 3.7: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N với dãy hiệu điện thế 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV bằng phương pháp ủ lạnh. Chủng Thí nghiệm lần 1 Thí nghiệm lần 2 Số khuẩn lạc trên đĩa biến nạp Hiệu điện thế (kV) Số khuẩn lạc trên đĩa biến nạp Hiệu điện thế (kV) 1,9 2,1 2,3 2,5 1,9 2,1 2,3 2,5 B. subtilis 1012 Số khuẩn lạc đĩa 1 156 200 250 558 Số khuẩn lạc đĩa 1 146 170 333 560 Số khuẩn lạc đĩa 2 132 245 280 502 Số khuẩn lạc đĩa 2 90 223 276 458 Số khuẩn lạc đĩa 3 189 265 267 490 Số khuẩn lạc đĩa 3 172 287 250 590 Số khuẩn lạc trung bình 159 236 265 516 Số khuẩn lạc trung bình 136 226 286 536 B. subtilis WB800N Số khuẩn lạc đĩa 1 127 190 283 552 Số khuẩn lạc đĩa 1 85 213 340 568 Số khuẩn lạc đĩa 2 149 212 350 560 Số khuẩn lạc đĩa 2 168 214 484 644 Số khuẩn lạc đĩa 3 93 240 432 570 Số khuẩn lạc đĩa 3 113 207 380 596 Số khuẩn lạc trung bình 123 214 355 561 Số khuẩn lạc trung bình 122 211 401 602 Kết quả - Biện luận Trang 56 Từ kết quả số khuẩn lạc trong Bảng 3.7 chúng tôi tính được tần suất biến nạp theo giá trị hiệu điện thế như trên Biểu đồ 3.10: Biểu đồ 3.10: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol được ủ lạnh 12; 24; 36; 48 giờ. Số liệu cho thấy tần suất biến nạp tăng dần từ (1,48 – 5,58)x103/µg DNA plasmid đối với chủng B. subtilis 1012 và (1,23 – 5,82) x103/µg DNA plasmid đối với chủng B. subtilis WB800N khi hiệu điện thế tăng từ 1,9 – 2,5 kV. Như vậy, với giá trị hiệu điện thế tối đa sẽ cho tần suất biến nạp cao nhất, do đó, quy trình được thiết lập với hiệu điện thế tối đa là 2,5 kV. Tóm lại, chúng tôi đã xây dựng được quy trình điện biến nạp cho hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N bằng phương pháp nuôi cấy trong môi trường có áp suất thẩm thẩu cao kết hợp ủ lạnh tế bào ở 4oC trong 24 giờ. Đây là quy trình điện biến nạp đơn giản dễ thực hiện cho tần suất ổn định hơn quy trình sử dụng lysozyme. Một quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường áp suất thẩm thấu cao kết hợp ủ lạnh tế bào được thực hiện theo các bước sau: Hoạt hóa chủng qua đêm, cấy chuyền sang 200 ml môi trường LB – 0,5 M sorbitol Nuôi cấy lắc 37oC, 250 vòng /phút, đo OD600nm, xây dựng đường cong tăng trưởng ↓ 1,48 2,32 2,76 5,58 0 1 2 3 4 5 6 7 1,9 2,1 2,3 2,5 T ần s u ất b iế n n ạp (x 1 0 3 µ g -1 D N A ) kV B. subtilis 1012 1,23 2,13 3,78 5,82 0 1 2 3 4 5 6 7 1,9 2,1 2,3 2,5 T ần s u ất b iế n n ạp (x 1 0 3 µ g -1 D N A ) kV B. subtilis WB800N Kết quả - Biện luận Trang 57 Khi chủng tăng trưởng bắt đầu vào pha cân bằng, thu nhận dịch nuôi cấy tế bào Ủ lạnh dịch nuôi cấy ở ở 4oC trong 24 giờ ↓ Ly tâm thu sinh khối 6000 vòng/phút trong 5 phút ↓ Rửa tế bào với 3 ml EB (0,5 M sorbitol, 0,5 M manitol, 10% glycerol), huyền phù Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch , lặp lại bước rửa 3 lần ↓ Hòa sinh khối trong EB với tỷ lệ 1/50 thể tích nuôi cấy ↓ Trộn 100 µl dịch tế bào khả nạp với 0,1 µg plasmid chuyển vào cuvette điện biến nạp đã ủ lạnh, để cuvette trong đá lạnh 5 phút ↓ Xung điện với thông số 200 Ω, 25 µF, 2,5 kV, 5 ms Ngay sau khi xung điện biến nạp bổ sung ngay 1ml môi trường phục hồi (LB – 0,5 M sorbitol, 0,38 M manitol), lắc 2 giờ ở 37oC, 250 vòng /phút ↓ Ly tâm loại bớt dịch, trải trên đĩa môi trường có kháng sinh thích hợp Ủ đĩa ở 37oC, qua đêm 3.2. Khảo sát tần suất biến nạp với các plasmid pHT1068, pHT43 – amyQ. Hai plasmid pHT1068 (8646 bp), pHT43 – amyQ (9491 bp) có kích thước khác nhau được điện biến nạp vào hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N. Tế bào khả nạp của hai chủng được chuẩn bị theo hai quy trình: xử lý với lysozyme và ủ lạnh 4oC và điện biến nạp với hai plasmid trên nồng độ là 0,1 µg. Sau khi điện biến nạp tế bào được trải trên đĩa LB – Agar – Cm, các khuẩn lạc mọc được đếm và tổng kết trong Bảng 3.8. Kết quả - Biện luận Trang 58 Bảng 3.8: Bảng tổng kết kết quả điện biến nạp plasmid pHT1068 và pHT43 –amyQ vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N theo hai quy trình xử lý lysozyme và ủ lạnh. Biểu đồ 3.11: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 và pHT43 – amyQ vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N điện biến nạp theo hai phương pháp xử lý tế bào với lysozyme và ủ lạnh. Chủng Số khuẩn lạc trên đĩa biến nạp Tế bào xử lý lysozyme Tế bào ủ lạnh pHT1068 pHT43- amyQ pHT1068 pHT43- amyQ B. subtilis 1012 Số khuẩn lạc đĩa 1 285 250 560 356 Số khuẩn lạc đĩa 2 308 220 590 368 Số khuẩn lạc đĩa 3 290 193 530 340 Số khuẩn lạc trung bình 294 221 326 354 B. subtilis WB800N Số khuẩn lạc đĩa 1 550 448 480 406 Số khuẩn lạc đĩa 2 580 460 526 480 Số khuẩn lạc đĩa 3 620 490 430 594 Số khuẩn lạc trung bình 583 432 478 493 2,94 5,83 2,21 4,66 0 1 2 3 4 5 6 7 B. subtilis 1012 B. subtilis WB800N T ần s u ất b iế n n ạp (x 1 0 3 µ g -1 D N A ) Chủng Tế bào xử lý lysozyme pHT1068 pHT43-amyQ 5,6 5,79 3,54 4,93 0 1 2 3 4 5 6 7 B. subtilis 1012 B. subtilis WB800N T ần s u ất b iế n n ạp (x 1 0 3 µ g -1 D N A ) Chủng Tế bào ủ lạnh pHT1068 pHT43-amyQ Kết quả - Biện luận Trang 59 Kết quả tần suất biến nạp trên Biểu đồ 3.11 của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được biến nạp với hai plasmid pHT1068 và pHT43 – amyQ có kích thước khác nhau cho thấy kích thước plasmid sử dụng biến nạp ảnh hưởng đến tần suất biến nạp: tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được điện biến nạp với plasmid pHT1068 (8646 bp) cao hơn so với tần suất biến nạp với plasmid pHT43 – amyQ (9491 bp) ở cả hai phương pháp điện biến nạp xử lý lysozyme và ủ lạnh. Như vậy, kích thước plasmid là một yếu tố ảnh hưởng đến tần suất biến nạp, với những plasmid có kích thước nhỏ sẽ đi vào trong tế bào dễ dàng hơn nên cho tần suất biến nạp cao hơn. Tuy nhiên, điện biến nạp là phương pháp ưu tiên được sử dụng cho biến nạp các plasmid có kích thước lớn vì tần suất điện biến nạp cao hơn các phương pháp thông thường, cụ thể với plasmid pHT43 – amyQ kích thước lớn 9491 bp vẫn cho tần suất biến nạp tương đối cao. 3.3. Kiểm tra plasmid sau khi được điện biến nạp vào tế bào B. subtilis Điện biến nạp là phương pháp dùng xung điện để biến nạp plasmid vào trong tế bào, do đó, dòng điện có thể tác động lên cấu trúc của plasmid [30]. Nhằm kiểm tra tính ổn định của plasmid, chúng tôi tiến hành PCR khuẩn lạc B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N đã được điện biến nạp plasmid. Hai plasmid sau được điện biến nạp và kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc: pHT1068, pHT43 – amyQ. Sau khi PCR khuẩn lạc, sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose 1% để xem kết quả. Trên Hình 3.6, ở các giếng 1, 2, 3, 4 là khuẩn lạc của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT1068 được PCR với cặp mồi ON562 và ON314 khuếch đại đoạn DNA bao gồm promoter Pgrac250 trên plasmid và đoạn gen gfp, đoạn khuếch đại có kích thước trên lý thuyết là 896 bp. Quan sát vạch sáng ở các giếng 1, 2, 3, 4 trên Hình 3.6 có kích thước khoảng 896 bp phù hợp với kích thước lý thuyết. Như vậy, có thể kết luận promoter và đoạn gen mã hóa protein tái tổ hợp GFP của plasmid pHT1068 không bị ảnh hưởng bởi xung điện. Kết quả - Biện luận Trang 60 Hình 3.6 : Kết quả PCR khuẩn lạc của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được biến nạp plasmid pHT1068, pHT43 – amyQ, pKTH10 Giếng 1, 2, 5, 6: khuẩn lạc B. subtilis 1012 Giếng 3, 4, 6, 7: khuẩn lạc B. subtilis WB800N Tương tự, B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT43 – amyQ được PCR với cặp mồi ON213 và ON722 khuếch đại đoạn DNA bao gồm trình tự SamyQ trên plasmid và đoạn gen mã hóa cho protein α-amylase có kích thước lý thuyết khoảng 1571 bp. Trên Hình 3.6, ở các giếng 5, 6, 7, 8 có vạch sáng có kích thước khoảng 1571 bp phù hợp với kích thước trên lý thuyết. Như vậy, kết quả PCR khuẩn lạc cho thấy plasmid pHT43 – amyQ không bị tác động xung điện đến cấu trúc. Tóm lại, qua kết quả kiểm tra plasmid sau khi điện biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc, chúng tôi có thể kết luận plasmid không bị tác động bởi xung điện và vẫn đảm bảo sự ổn định của trình tự quan trọng trên plasmid là promoter và đoạn gen mã hóa cho protein tái tổ hợp được chèn vào plasmid. Tuy nhiên, để chứng minh sự biểu hiện protein tái tổ hợp của các plasmid được điện biến nạp không bị tác động của xung điện, chúng tôi tiến hành khảo sát sự biểu hiện protein tái tổ hợp GFP và α-amylase. Kết quả - Biện luận Trang 61 3.4. Khảo sát sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N Hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được điện biến nạp với các plasmid pHT1068 mang gen mã hóa cho protein GFP biểu hiện nội bào, pHT43 – amyQ mang gen mã hóa protein α-amylase biểu hiện tiết ra môi trường. Đồng thời, hai plasmid này cũng được biến nạp theo phương pháp thông thường và khảo sát sự biểu hiện nhằm so sánh với sự biểu hiện protein tái tổ hợp của plasmid được điện biến nạp. Hình 3.7: Sự biểu hiện GFP trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT1068 được điện biến nạp. Hình 3.8: Sự biểu hiện GFP trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT1068 được biến nạp theo phương pháp thông thường. Sự biểu hiện của GFP được khảo sát trên môi trường LB – Agar – Cm và quan sát dưới đèn UV. Sự biểu hiện của α-amylase được khảo sát trên môi trường LB – Agar – Cm – 1% tinh bột. Quan sát vòng phân giải tinh bột bằng dung dịch nhuộm lugol. Kết Kết quả - Biện luận Trang 62 quả biểu hiện protein tái tổ hợp GFP của plasmid pHT1068 được điện biến nạp vào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trên Hình 3.7, so sánh với chứng âm (chủng mang plasmid pHT1068 nhưng không mang gen gfp) ta thấy khuẩn lạc có mang plasmid pHT1068 mang gen gfp cho khuẩn lạc phát huỳnh quang dưới đèn UV. Mức biểu hiện GFP được kiểm soát bởi nồng độ IPTG, ở nồng 0 mM IPTG gần như không biểu hiện và biểu hiện tăng khi tăng nồng độ IPTG lên 0,5 mM. Đồng thời so sánh với mức độ biểu hiện GFP của plasmid pHT1068 được biến nạp theo phương pháp thông thường trên Hình 3.8 cho thấy kết quả như nhau. Trên Hình 3.9 là kết quả vòng phân giải tinh bột của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT43 – amyQ. Đối với chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT43 – amyQ có vòng phân giải tinh bột lớn hơn so với mẫu chứng âm (chủng mang plasmid pHT43 không mang gen amyQ) và biểu hiện α-amylase tăng theo nồng độ IPTG từ 0 – 0,5 mM IPTG. Hình 3.9: Sự biểu hiện α-amylase trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT43 – amyQ được điện biến nạp. Tương tự như với plasmid pHT1068, plasmid pHT43 – amyQ cũng được biến nạp theo phương pháp thông thường và khảo sát sự biểu hiện. Kết quả trên Hình 3.9 (pHT43 – amyQ được điện biến nạp) và Hình 3.10 (pHT43 – amyQ được biến nạp theo phương pháp thông thường) cho thấy mức độ biểu hiện α-amylase của pHT43 – amyQ là như nhau khi được biến nạp với cả hai phương pháp. Kết quả - Biện luận Trang 63 Hình 3.10: Sự biểu hiện α-amylase trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT43 – amyQ được biến nạp theo phương pháp thông thường. Như vậy, qua kết quả khảo sát sự biểu hiện của protein tái tổ hợp GFP và α- amylase cho thấy phương pháp điện biến nạp không làm ảnh hưởng đến sự biểu hiện nội bào hay tiết của protein tái tổ hợp. Phần 4 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ Kết luận – Đề nghị Trang 64 4.1. Kết luận Từ các kết quả nghiên cứu của đề tài, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: Dựa trên quy trình của Xue là phương pháp điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao, chúng tôi tiến hành thêm các khảo sát thời điểm thu mẫu và xử lý vách tế bào bằng lysozyme hoặc ủ lạnh, đã xây dựng thành công phương pháp điện biến nạp cho hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N theo hai quy trình sau:  Sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao kết hợp xử lý tế bào với lysozyme với các điều kiện tối ưu đã khảo sát được là: - Nuôi cấy tế bào trong môi trường LB có bổ sung 0,5 M sorbitol - Thu mẫu khi tế bào tăng trưởng vào giai đoạn sớm của pha cân bằng - Xử lý với lysozyme nồng độ 1µg/ml trong 15 phút ở 37oC, 250 vòng /phút - Điện biến nạp với 0,1 µg plasmid - Các thông số xung điện: 200 Ω, 25 µF, 2,5 kV, 5 ms  Sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu cao kết hợp xử lý tế bào bằng ủ lạnh 4oC với các điều kiện tối ưu đã khảo sát được là: - Nuôi cấy tế bào trong môi trường LB có bổ sung 0,5 M sorbitol - Thu mẫu khi tế bào tăng trưởng vào giai đoạn pha cân bằng - Ủ lạnh dịch nuôi cấy ở ở 4oC trong 24 giờ - Điện biến nạp với 0,1 µg plasmid - Các thông số xung điện: 200 Ω, 25 µF, 2,5 kV, 5 ms Qua kết quả PCR khuẩn lạc và khảo sát sự biểu hiện protein tái tổ hợp cho thấy quy trình điện biến nạp không làm ảnh hưởng đến cấu trúc plasmid cũng như sự biểu hiện của gen mục tiêu đối với cả hai phương pháp điện biến nạp. Kết luận – Đề nghị Trang 65 4.2. Đề nghị Bên cạnh hai chủng chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N còn có các chủng B. subtilis khác được sử dụng rất phổ biến là B. subtilis 168, B. subtilis PY79. Thêm nữa là các chủng Bacillus phân lập trong tự nhiên có nhiều đặc tính quí nhưng thường khó biến nạp. Do đó, chúng tôi xin đề nghị như sau : Dựa trên quy trình điện biến nạp xây dựng được cho hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N để tiếp tục khảo sát xây dựng quy trình điện biến nạp cho: - Các chủng B. subtilis khác như B. subtilis 168, B. subtilis PY79 - Các chủng Bacillus phân lập trong tự nhiên Thêm một đề nghị khác là thử nghiệm điện biến nạp trực tiếp sản phẩm nối vào trong tế bào khả nạp B. subtilis được chuẩn bị theo quy trình đã thiết lập. Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Võ Hoài Bắc, Đỗ Thị Thu Hằng, Lê Trọng Tài and Lê Văn Trường (2013), “Biểu hiện cao gen mã hóa enzyme pectin lyase trong Bacillus subtilis 168”, Tạp Chí Sinh Học, 35 (3), 369 – 375. [2] Nguyễn Thanh Nhàn, Phạm Thị Minh Đức, Lê Thu Ngọc, Lê Văn Trường, Đỗ Thị Huyền, Trần Ngọc Tân, Phạm Thùy Linh and Trương Nam Hải (2010), “Thiết kế plasmid tái tổ hợp từ vector biểu hiện pAC7 mang gen entP dung hợp với các phân đoạn baamylF1 và baamylF2 để tổng hợp enterocin P trong Bacillus subtilis 168”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 35 (3), Tr8. TÀI LIỆU TIẾNG ANH [3] Allen, S.P. and Blaschek, H.P. (1990), “Factors involved in the electroporation- induced transformation of Clostridium perfringens”, FEMS Microbiology Letters, 70(2), 217–220. [4] American Society for Microbiology., Microbiology, A.S. for, Bergey, D.H. and Breed, R.S. (1957), Bergey’s manual of determinative bacteriology, by Robert S. Breed and others, Williams & Wilkins Co., Baltimore,. [5] Augustin, J. and Götz, F. (1990), “Transformation of Staphylococcus epidermidis and other staphylococcal species with plasmid DNA by electroporation”, FEMS microbiology letters, 54(1-3), 203–207. [6] Belliveau, B.H. and Trevors, J.T. (1990), “Mercury resistance determined by a self- transmissible plasmid in Bacillus cereus 5”, Biology of Metals, 3(3-4), 188–196. [7] Belliveau, B.H. and Trevors, J.T. (1989), “Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation.”, Applied and Environmental Microbiology, 55(6), 1649–1652. Tài liệu tham khảo [8] Benz, R. and Zimmermann, U. (1981), “The resealing process of lipid bilayers after reversible electrical breakdown”, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, 640(1), 169–178. [9] Bone, E.J. and Ellar, D.J. (1989), “Transformation of Bacillus thuringiensis by electroporation”, FEMS Microbiology Letters, 58(2–3), 171–177. [10] Brigidi, P., De Rossi, E., Bertarini, M.L., Riccardi, G. and Matteuzzi, D. (1990), “Genetic transformation of intact cells of Bacillus subtilis by electroporation”, FEMS Microbiology Letters, 67(1–2), 135–138. [11] Bron, S., Meijer, W., Holsappel, S. and Haima, P. (1991), “Plasmid instability and molecular cloning in Bacillus subtilis”, Research in Microbiology, 142(7–8), 875– 883. [12] Canosi, U., Morelli, G. and Trautner, T.A. (1978), “The relationship between molecular structure and transformation efficiency of some S. aureus plasmids isolated from B. subtilis”, Molecular and General Genetics MGG, 166(3), 259–267. [13] Chakrabarti, R., Wylie, D.E. and Schuster, S.M. (1989), “Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation.”, Journal of Biological Chemistry, 264(26), 15494–15500. [14] Chang, D.C. (1992), Guide to electroporation and electrofusion, Academic Press. [15] Chang, D.C., Gao, P.Q. and Maxwell, B.L. (1991), “High efficiency gene transfection by electroporation using a radio-frequency electric field”, Biochimica Et Biophysica Acta, 1092(2), 153–160. [16] Chang, S. and Cohen, S.N. (1979), “High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA”, Molecular and General Genetics MGG, 168(1), 111–115. [17] Chassy, B.M. and Flickinger, J.L. (1987), “Transformation of Lactobacillus casei by electroporation”, FEMS Microbiology Letters, 44(2), 173–177. [18] Chassy, B.M. and Flickinger, J.L. (1987), “Transformation of Lactobacillus casei by electroporation”, FEMS Microbiology Letters, 44(2), 173–177. Tài liệu tham khảo [19] Chassy, B.M. and Giuffrida, A. (1980), “Method for the lysis of Gram-positive, asporogenous bacteria with lysozyme.”, Applied and Environmental Microbiology, 39(1), 153–158. [20] Chassy, B.M., Mercenier, A. and Flickinger, J. (1988), “Transformation of bacteria by electroporation”, Trends in Biotechnology, 6(12), 303–309. [21] Chen, I. and Dubnau, D. (2004), “DNA uptake during bacterial transformation”, Nature Reviews Microbiology, 2(3), 241–249. [22] Chu, G., Hayakawa, H. and Berg, P. (1987), “Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.”, Nucleic Acids Research, 15(3), 1311– 1326. [23] Conchas, R.F. and Carniel, E. (1990), “A highly efficient electroporation system for transformation of Yersinia”, Gene, 87(1), 133–137. [24] Contente, S. and Dubnau, D. (1979), “Characterization of plasmid transformation in Bacillus subtilis: Kinetic properties and the effect of DNA conformation”, Molecular and General Genetics MGG, 167(3), 251–258. [25] Csonka, L.N. (1989), “Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress.”, Microbiological Reviews, 53(1), 121–147. [26] F. Tabatabaie, A.M. (2008), “Studying the Effects of Ultrasound Shock on Cell Wall Permeability and Survival of Some LAB in Milk”. [27] Harwood, A.J. (1994), “Transformation of Bacteria by Electroporation”, Humana Press, 31. [28] Hashimoto, K., Tatsumi, N. and Okuda, K. (1989), “Introduction of phalloidin labelled with fluorescein isothiocyanate into living polymorphonuclear leukocytes by electroporation”, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 19(2–3), 143–153. [29] Holo, H. and Nes, I.F. (1989), “High-Frequency Transformation, by Electroporation, of Lactococcus lactis subsp. cremoris Grown with Glycine in Tài liệu tham khảo Osmotically Stabilized Media”, Applied and Environmental Microbiology, 55(12), 3119–3123. [30] Jones, P.G., VanBogelen, R.A. and Neidhardt, F.C. (1987), “Induction of proteins in response to low temperature in Escherichia coli.”, Journal of Bacteriology, 169(5), 2092–2095. [31] Kim, A.Y. and Blaschek, H.P. (1989), “Construction of an Escherichia coli- Clostridium perfringens shuttle vector and plasmid transformation of Clostridium perfringens.”, Applied and Environmental Microbiology, 55(2), 360–365. [32] Kinosita, K. and Tsong, T.T. (1977), “Hemolysis of human erythrocytes by transient electric field.”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74(5), 1923–1927. [33] Luchansky, J.B., Muriana, P.M. and Klaenhammer, T.R. (1988), “Application of electroporation for transfer of plasmid DNA to Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Listeria, Pediococcus, Bacillus, Staphylococcus, Enterococcus and Propionibacterium”, Molecular Microbiology, 2(5), 637–646. [34] Lurquin, P.F. (1997), “Gene transfer by electroporation”, Molecular Biotechnology, 7(1), 5–35. [35] Lu, Y.-P., Zhang, C., Lv, F.X., Bie, X.M. and Lu, Z.-X. (2012), “Study on the electro-transformation conditions of improving transformation efficiency for Bacillus subtilis”, Letters in Applied Microbiology, 55(1), 9–14. [36] Mack, M., van Loon, A.P. and Hohmann, H.P. (1998), “Regulation of riboflavin biosynthesis in Bacillus subtilis is affected by the activity of the flavokinase/flavin adenine dinucleotide synthetase encoded by ribC”, Journal of Bacteriology, 180(4), 950–955. [37] Morikawa, M. (2006), “Beneficial biofilm formation by industrial bacteria Bacillus subtilis and related species”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 101(1), 1– 8. Tài liệu tham khảo [38] Nguyen, H.D., Nguyen, Q.A., Ferreira, R.C., Ferreira, L.C.S., Tran, L.T. and Schumann, W. (2005), “Construction of plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis exhibiting full structural stability”, Plasmid, 54(3), 241–248. [39] Olubajo, B. and Bacon, C.W. (2008), “Electrotransformation of Bacillus mojavensis with fluorescent protein markers”, Journal of Microbiological Methods, 74(2–3), 102–105. [40] Park, S.F. and Stewart, G.S.A.B. (1990), “High-efficiency transformation of Listeria monocytogenes by electroporation of penicillin-treated cells”, Gene, 94(1), 129–132. [41] Phadtare, S. (2004), “Recent developments in bacterial cold-shock response”, Current Issues in Molecular Biology, 6(2), 125–136. [42] Phan, T.T.P., Nguyen, H.D. and Schumann, W. (2006), “Novel plasmid-based expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis”, Protein Expression and Purification, 46(2), 189–195. [43] Potter, H. (1988), “Electroporation in biology: Methods, applications, and instrumentation”, Analytical Biochemistry, 174(2), 361–373. [44] Powell, I.B., Achen, M.G., Hillier, A.J. and Davidson, B.E. (1988), “A Simple and Rapid Method for Genetic Transformation of Lactic Streptococci by Electroporation”, Applied and Environmental Microbiology, 54(3), 655–660. [45] Powell, I.B., Achen, M.G., Hillier, A.J. and Davidson, B.E. (1988), “A Simple and Rapid Method for Genetic Transformation of Lactic Streptococci by Electroporation”, Applied and Environmental Microbiology, 54(3), 655–660. [46] Rhodes, D. and Hanson, A.D. (1993), “Quaternary Ammonium and Tertiary Sulfonium Compounds in Higher Plants”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 44(1), 357–384. [47] Rittich, B. and Španová, A. (1996), “Electrotransformation of bacteria by plasmid DNAs: statistical evaluation of a model quantitatively describing the relationship Tài liệu tham khảo between the number of electrotransformants and DNA concentration”, Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 40(2), 233–238. [48] Schumann, W. (2007), “Production of recombinant proteins in Bacillus subtilis.”, Advances in applied microbiology, 62, 137–89. [49] Schumann, W., Inouye, M. and Phadtare, S. (2008), Encyclopedia of Life Sciences, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, UK. [50] Schurter, W., Geiser, M. and Mathé, D. (1989), “Efficient transformation of Bacillus thuringiensis and B. cereus via electroporation: Transformation of acrystalliferous strains with a cloned delta-endotoxin gene”, Molecular and General Genetics MGG, 218(1), 177–181. [51] Shark, K.B., Smith, F.D., Harpending, P.R., Rasmussen, J.L. and Sanford, J.C. (1991), “Biolistic transformation of a procaryote, Bacillus megaterium.”, Applied and Environmental Microbiology, 57(2), 480–485. [52] Sokoloski, J.A., Jastreboff, M.M., Bertino, J.R., Sartorelli, A.C. and Narayanan, R. (1986), “Introduction of deoxyribonucleoside triphosphates into intact cells by electroporation”, Analytical Biochemistry, 158(2), 272–277. [53] Stenger, D.A. and Hui, S.W. (1986), “Kinetics of ultrastructural changes during electrically induced fusion of human erythrocytes”, The Journal of Membrane Biology, 93(1), 43–53. [54] Swezey, R.R. and Epel, D. (1988), “Enzyme Stimulation upon Fertilization is Revealed in Electrically Permeabilized Sea Urchin Eggs”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 85(3), 812–816. [55] Tavares, G.A., Béguin, P. and Alzari, P.M. (1997), “The crystal structure of a type I cohesin domain at 1.7 Å resolution1”, Journal of Molecular Biology, 273(3), 701– 713. [56] Tsongalis, G.J., Lambert, W.C. and Lambert, M.W. (1990), “Electroporation of normal human DNA endonucleases into xeroderma pigmentosum cells corrects their DNA repair defect”, Carcinogenesis, 11(3), 499–503. Tài liệu tham khảo [57] Vehmaanperä, J. (1989), “Transformation of Bacillus amyloliquefaciens by electroporation”, FEMS Microbiology Letters, 61(1–2), 165–169. [58] Whatmore, A.M., Chudek, J.A. and Reed, R.H. (1990), “The effects of osmotic upshock on the intracellular solute pools of Bacillus subtilis”, Journal of General Microbiology, 136(12), 2527–2535. [59] Wong, T.-K. and Neumann, E. (1982), “Electric field mediated gene transfer”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 107(2), 584–587. [60] Xue, G.-P., Johnson, J.S. and Dalrymple, B.P. (1999), “High osmolarity improves the electro-transformation efficiency of the gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis”, Journal of Microbiological Methods, 34(3), 183–191. [61] Zeigler, D.R., Prágai, Z., Rodriguez, S., Chevreux, B., Muffler, A., Albert, T., Bai, R., Wyss, M. and Perkins, J.B. (2008), “The Origins of 168, W23, and Other Bacillus subtilis Legacy Strains”, Journal of Bacteriology, 190(21), 6983–6995. [62] Zimmermann, U., Vienken, J. and Pilwat, G. (1980), “Development of drug carrier systems: Electrical field induced effects in cell membranes”, Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry, 116, 553–574. TÀI LIỆU TRÊN WEBSITE [63] [64] [65] [66] [67] protopaslt Phần 5 PHỤ LỤC Phụ lục 5.1. Giá trị OD600 nm của chủng B. subtilis 1012 trong môi trường LB có nồng độ sorbitol: 0; 0,25; 0,5; 0,75 M (Biểu đồ 3.1) Thời gian(giờ) OD600nm 0 M 0,25 M 0,5 M 0,75 M 0 0,1 0,1 0,1 0,1 1 1,3 1,49 1,07 0,65 2 2 2,6 2 1,6 3 2,26 3,4 2,8 2,3 4 2,8 3,8 3,2 3 5 3,25 4,7 4 3,3 6 3,5 5,1 4,3 3,6 7 4 5,4 4,3 4,1 8 4,2 6,4 4,8 4,2 9 4,3 6,4 5,5 3,86 10 4,4 7,2 5,8 4,5 11 4,4 7,2 5,94 4,7 12 4,46 7,4 6 4,8 13 4,68 7,4 6 5,2 15 4,74 7,7 6,6 6,1 16 4,76 7,5 6,9 6,36 17 4,8 7,56 7,28 6,6 18 5 8 7,36 6,72 19 5,44 7,8 7,2 6,62 20 5,6 7,84 6,8 6,78 21 5,3 7,4 6,8 6,8 22 4,98 7 7 7,4 23 4,92 7 7,4 7 24 5,36 7 6,8 7,2 Phụ lục 5.2.Giá trị OD600 nm của chủng B. subtilis WB800N trong môi trường LB có nồng độ sorbitol: 0; 0,25; 0,5; 0,75 M (Biểu đồ 3.1) Thời gian(giờ) OD600nm 0 M 0,25 M 0,5 M 0,75 M 0 0,05 0,05 0,05 0,05 1 1,12 1,13 1 0,5 2 1,64 1,96 1,99 1,2 3 2,3 2,35 2,04 1,82 4 2,54 2,9 2,37 2,1 5 2,61 3,3 2,4 2,2 6 2,87 3,9 2,55 2,34 7 3,46 4,1 2,9 2,47 8 3,9 4,8 3,3 2,8 9 4 5,1 3,5 3,1 10 4,3 5,6 3,8 3,5 11 4,4 6 4 3,7 12 4,4 6,2 4,1 3,65 13 4,5 6,6 4,4 3,78 15 4,55 6,8 4,49 3,77 16 4,56 6,92 4,55 3,82 17 4,4 7 4,83 4,3 18 4,6 7 5 4,5 19 4,8 7,2 5 4,7 20 4,7 6,8 5,2 4,9 21 5 7 5,2 5 22 5 6,8 5 6 23 5,2 5,8 5,14 6 24 5 5,4 5 6 Phụ lục 5.3.Gía trị OD600nm của 7 giai đoạn thu mẫu dịch nuôi cấy tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB có nồng độ sorbitol: 0; 0,25; 0,5; 0,75 M xử lý lysozyme (Biểu đồ 3.2) B. subtilis 1012 Giai đoạn thu mẫu 1 2 3 4 5 6 7 0 M 1,38 1,9 2,7 3,9 4,29 4,5 5 0,25 M 1,45 2 2,74 4,12 5 5,5 6 0,5 M 1,06 1,76 2,36 3,3 3,6 4 4,5 0,75 M 0,6 0,9 1,76 3,53 4,18 4,5 5,2 B. subtilis WB800N Giai đoạn thu mẫu 1 2 3 4 5 6 7 0 M 1,22 1,79 2,45 2,56 2,7 3 3,5 0,25 M 1,88 2,5 3 3,5 4 4,4 4,7 0,5 M 1,4 1,8 1,98 2,5 3 3,5 4,1 0,75 M 0,5 1 1,6 2,3 2,89 3,1 3,2 5.1.Gía trị OD600nm của 7 giai đoạn thu mẫu dịch nuôi cấy tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB có nồng độ sorbitol: 0; 0,25; 0,5; 0,75 M, ủ lạnh 4oC (Biểu đồ 3.7) B. subtilis 1012 Giai đoạn thu mẫu 1 2 3 4 5 6 7 0 M 1,46 2,12 3 3,3 3,8 4,3 4,5 0,25 M 1,88 2,8 3,7 4,6 4,9 5,5 5,9 0,5 M 1,23 2,13 2,68 2,9 3,6 4 4,6 0,75 M 0,8 1,35 2,35 2,6 3 3,3 3,6 B. subtilis WB800N Giai đoạn thu mẫu 1 2 3 4 5 6 7 0 M 1,12 1,64 2,3 2,54 2,61 2,87 3,46 0,25 M 1,13 1,96 2,35 2,9 3,3 3,9 4,1 0,5 M 1 1,99 2,04 2,37 2,4 2,55 2,9 0,75 M 0,5 1,2 1,82 2,1 2,2 2,34 2,47 Phụ lục 5.2.Tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol xử lý lysozyme theo 7 giai đoạn tăng trưởng (Biểu đồ 3.3). B. subtilis 1012 Giai đoạn thu mẫu 1 2 3 4 5 6 7 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 0 0,27 0,42 1,83 2,6 2,13 1,68 Sai số 0 0,09 0,27 0,2 0,19 0,26 0,18 B. subtilis WB800N Giai đoạn thu mẫu 1 2 3 4 5 6 7 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 0 0,28 0,26 2,47 4,38 3,09 1,86 Sai số 0 0,06 0,06 0,42 0,62 0,41 0,31 5.3.Tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol xử lý với 4 nồng độ lysozyme (Biểu đồ 3.4). B. subtilis 1012 Nồng độ lysozyme (µg/ml) 0,5 1 2 4 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 1,15 2,51 0,86 0,39 Sai số 0,05 0,01 0,16 0,01 B. subtilis WB800N Nồng độ lysozyme (µg/ml) 0,5 1 2 4 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 2,97 4,41 1,88 0,62 Sai số 0,09 0,27 0,02 0,2 Phụ lục 5.4.Tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol xử lý lysozyme 1µg/ml trong 5, 10, 15, 20 phút (Biểu đồ 3.5). B. subtilis 1012 Thời gian (phút) 5 10 15 20 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 0,41 2,59 2,95 0,59 Sai số 0,26 0,24 0,18 0,04 B. subtilis WB800N Thời gian (phút) 5 10 15 20 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 1,05 4,67 5,99 0,84 Sai số 0,01 0,29 0,51 0,23 5.5.Tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol xử lý lysozyme điện biến nạp với dãy hiệu điện thế: 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV (Biểu đồ 3.6). B. subtilis 1012 Hiệu điện thế (kV) 1,9 2,1 2,3 2,5 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 0,66 1,91 2,65 2,85 Sai số 0,1108 0,1603 0,3276 0,2475 B. subtilis WB800N Hiệu điện thế (kV) 1,9 2,1 2,3 2,5 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 0,77 1,58 2,56 5,86 Sai số 0,0448 0,0495 0,0401 0,2404 Phụ lục 5.6. Tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol ủ lạnh 4oC theo 7 giai đoạn tăng trưởng (Biểu đồ 3.8). B. subtilis 1012 Giai đoạn thu mẫu 1 2 3 4 5 6 7 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 0 0 1,28 2,41 4,33 5,43 1,05 Sai sô 0 0 0,2676 0,2982 1,0918 0,4868 0,095 B. subtilis WB800N Giai đoạn thu mẫu 1 2 3 4 5 6 7 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 0,06 0,29 1,05 3,24 5,19 1,47 0,94 Sai số 0,0603 0,0656 0,225 0,4394 0,6146 0,1539 0,2701 5.7.Tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol ủ lạnh 4oC 12; 24; 36; 48 giờ (Biểu đồ 3.9). B. subtilis 1012 Thời gian (giờ) 12 24 36 48 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 4,15 5,6 2,04 0,6 Sai số 0,1461 0,3818 0,0306 0,1344 B. subtilis WB800N Thời gian (giờ) 12 24 36 48 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 3,6 5,65 3,06 1,32 Sai số 0,8532 0,6317 0,0495 0,693 Phụ lục 5.8.Tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol xử lý lysozyme điện biến nạp với dãy hiệu điện thế: 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV (Biểu đồ 3.10). B. subtilis 1012 Hiệu điện thế (kV) 1,9 2,1 2,3 2,5 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 1,48 2,32 2,76 5,26 Sai số 0,1626 0,0707 0,1461 0,1367 B. subtilis WB800N Hiệu điện thế (kV) 1,9 2,1 2,3 2,5 Tần suất biến nạp (x103/µg DNA) 1,23 2,13 3,78 5,82 Sai số 0,0071 0,0189 0,3276 0,2946 5.9.Tần suất biến nạp B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N điện biến nạp với pHT1068 và pHT43 – amyQ (Biểu đồ 3.11) Tế bào xử lý lysozyme Plasmid pHT1068 pHT43 – amyQ Tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 2,94 2,21 Tần suất biến nạp của B. subtilis WB800N 5,83 4,66 Sai số tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 0,0988 0,2328 Sai số tần suất biến nạp của B. subtilis WB800N 0,2867 0,1766 Tế bào ủ lạnh Plasmid pHT1068 pHT43 – amyQ Tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 5,6 3,54 Tần suất biến nạp của B. subtilis WB800N 5,79 4,93 Sai số tần suất biến nạp của B. subtilis 1012 0,2449 0,1144 Sai số tần suất biến nạp của B. subtilis WB800N 0,4247 0,7733