Luận văn Xây dựng quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

a động phải trơ với pha tĩnh. Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học ( ví dụ giá trị pH: 2,5 < pH < 8,5). - Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột. Ví dụ: đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên cột. - Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu. - Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích. - Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký. - Phải phù hợp với loại detector: detector UV-Vis thì dung môi không được hấp thụ quang (ví dụ: acid acetic hấp thụ ở bước sóng thấp < 220 nm). Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang. - Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt. Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC), pha động là dung môi phân cực: nước, ACN, MeOH, acid hay base hữu cơ và một vài amin hay acid amin - Ngoài các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều trường hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm để ổn định pH. Chất tạo phức, tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất.  Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa giải E của dung môi theo bảng sau: Bảng 2.3. Lực rửa giải của một số dung môi Dung môi Lực rửa giải E n-Hexan 0,1 Tetrachlorua carbon 1,6 Toluen 2,4 Methanol 5,11 Acetonitril 10,20 Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây dựng chương trình sắc ký. Chỉ khi lựa chọn điều kiên sắc ký tốt, phù hợp thì chúng ta mới có thể định tính, định lượng được các lọai hóa chất một cách nhanh chóng và hiệu 19 quả cao. Tất nhiên phần lý thuyết nói rất nhiều về các phương pháp chọn điều kiện sắc ký, tuy nhiên để chọn được chương trình sắc ký tốt đòi hỏi phải có thời gian, tài liệu và một phần kinh nghiệm của những người làm sắc ký. 2.2.8. Các bước tiến hành sắc ký (Võ Thị Bạch Huệ, 2012) 2.2.8.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt, cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc đô dòng, năng lượng đèn UV đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra. Cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách và rửa đúng quy định sau mỗi lần chạy sắc ký: Ví dụ: Sắc ký pha thường NP-HPLC: Rửa bằng methanol; không rửa bằng nước. Còn sắc ký pha đảo RP-HPLC: khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa nước trước cho sạch.Tỷ lệ ACN hay methanol: Nước là 50%: 50% cho sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu. Tuyệt đối tránh tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đó để cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thể dùng được.  Lưu ý: Nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng được các yêu cầu phân tích. 2.2.8.2. Chuẩn bị dung môi pha động Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết dành cho HPLC. Các hóa chất dùng phải là loại tinh khiết phân tích. Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu 2.2.8.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC  Mẫu thử: Xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận, quy trình theo nguyên tắc sau: - Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu. - Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hay chiết . - Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm. - Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Có thể gây ra nghẽn cột.  Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng 20 nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần. 2.2.8.4. Cách vận hành thiết bị Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm điều khiển hệ thống sắc ký HPLC. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau: - Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột. - Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như:  Cấu hình máy  Tỷ lệ các dung môi pha động  Bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu. 21 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ 3.1.1. Hóa chất 3.1.1.1. Chất chuẩn - Chất chuẩn: imidacloprid và azoxystrobin. - Nhà sản xuất: Sigma Aldrish - Hàm lượng: imidacloprid: 99,82% azoxystrobin: 99,60% 3.1.1.2. Dung môi Bảng 3.1. Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC STT Tên dung môi Nhà sản xuất Tiêu chuẩn 1 Acetonitril Đức Dùng cho HPLC 2 Methanol Đức Dùng cho HPLC 3 Nước cất hai lần ĐH Cần Thơ Dùng cho HPLC 3.1.2. Dụng cụ - Thiết bị 3.1.2.1 Thiết bị Bảng 3.2. Danh mục máy móc - thiết bị phục vụ cho đề tài nghiên cứu STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất 1 Bơm cao áp Pump Germany 2 Bộ loại khí cho dung môi Vacuum Degasser Germany 3 Thiết bị tiêm mẫu Syringe 100µl Hamilton 4 Thiết bị nạp mẫu Injector 20µl USA 5 Cột sắc ký Columns RP-18, 250x4,6 mm, kích thước hạt 5µm Germany 6 Thiết bị ghi tín hiệu UV/Vis Detector Germany 22 STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất 7 Bộ lọc dung môi dùng giấy lọc 0,45µm Glassico India 8 Máy rút chân không Neuburger Germany 9 Máy đánh siêu âm S100H Elmasonic Germany 10 Cân phân tích Balances and Precious Metal scales USA 11 Bộ lọc nước Dùng cho HPLC 3.1.2.2. Dụng cụ - Bình định mức 100 ml, 50 ml, 25 ml, 10 ml. - Pipet chính xác: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 25 ml. - Cốc thủy tinh 50 ml, 100 ml. - Ống nhỏ giọt, bình tia. - Bơm tiêm, vial 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao như sau:  Lựa chọn điều kiện sắc ký - Lựa chọn cột sắc ký - Lựa chọn pha động và các điều kiện pha động - Tốc độ dòng, thể tích tiêm - Lựa chọn bước sóng phát hiện  Đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng bằng cách thẩm định quy trình - Độ thích hợp của hệ thống sắc ký - Độ đặc hiệu - Khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak - Độ lặp lại - Độ đúng 23 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Chuẩn bị dung dịch  Chuẩn bị dung môi pha mẫu - Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu, kết hợp với các tài liệu tham khảo, khảo sát lựa chọn ra dung môi pha mẫu thích hợp. - Tiến hành pha dung môi pha mẫu để phục vụ cho quá trình phân tích  Chuẩn bị dung dịch gốc và dung dịch mẫu chuẩn Để có thể định lượng được imidacloprid và azoxystrobin, việc chuẩn bị dung dịch gốc và các mẫu chuẩn là rất cần thiết. Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu, kết hợp các tài liệu tham khảo lựa chọn ra dung môi pha và bảo quản dung dịch chuẩn gốc. 3.3.2. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc ký (Vũ Thị Quỳnh, 2013) 3.3.2.1. Chọn cột Trên thị trường có rất nhiều hãng sản xuất cột sắc ký pha đảo C8 và C18 . Tuy nhiên cột RP –18 được sử dụng rộng rãi trong ngành kiểm nghiệm dược phẩm nhờ danh tiếng thương hiệu, chất lượng cột cũng như tính kinh tế so với các loại cột khác. Hiện nay, phòng thí nghiệm có trang bị loại cột này và được kỹ thuật viên thường xuyên kiểm tra, đánh giá tình trạng. Vì vậy, ta chọn cột RP – 18, kích thước hạt 5 μm, 250 x 4,6 mm cho phép định lượng này. 3.3.2.2. Chọn bước sóng cho detector Trong phép phân tích đồng thời, việc lựa chọn bước sóng rất quan trọng vì nó quyết định tới độ nhạy của phép phân tích. Do phương pháp phân tích là HPLC sử dụng đầu dò là detector UV-Vis cố định bước sóng, ta cần khảo sát điều kiện nhằm chọn bước sóng tối ưu để phân tích đồng thời các chất. Dựa vào tài liệu tham khảo và cực đại hấp thụ của imidacloprid và azoxystrobin ta chọn các bước sóng tiêu biểu. Sau đó tiến hành khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC lần lượt tại các bước sóng λ bằng 220 nm, 250 nm, 255 nm, 260nm. Bên cạnh đó sử dụng máy UV-VIS SHIMADZU quét phổ khoảng từ 200-400nm để phát hiện ra bước sóng tối ưu nhất cho cả hai chất imidacloprid và azoxystrobin. Căn cứ phổ đồ thu được, kết hợp các tài liệu tham khảo và tiến hành khảo sát để lựa chọn bước sóng phát hiện phù hợp 3.3.2.3. Khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC Dựa vào kết quả thực nghiệm ở mục 3.3.2.3 ta tiến hành tiêm mẫu là hỗn hợp 24 azoxystrobin và imidacloprid nồng độ 50 ppm vào hệ thống HPLC với điều kiện như sau: - Cột tách: RP – 18, 5 μm, 250 x4,6 mm. - Pha động: C: acetonitril (CH3CN); D: Nước - Thời gian: 0 – 20 phút, 55%C: 45%D. - Nồng độ mẫu: 50 ppm. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Detector: UV- Vis đặt tại các bước sóng 220 nm, 250 nm, 255 nm, 260nm. - Thể tích vòng mẫu: 20 µl. 3.3.2.4. Khảo sát thành phần pha động Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột. Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải là đặc trưng cho quá trình sắc kí. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của dung môi pha động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích qua đó làm thay đổi hệ số lưu của chất phân tích đó. Vì vậy để có được tỷ lệ thành phần pha động phù hợp cần tiến hành khảo sát hệ sắc kí với tỷ lệ thành phần pha động khác nhau với các điều kiện sắc kí như nhau: - Cột tách: RP – 18, 5 μm, 250 x 4,6 mm. - Thể tích vòng mẫu: 20 μl - Nồng độ chất phân tích: 50 ppm. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Pha động: C: acetonitril (CH3CN); D: nước - Thời gian: 0 -20 phút - Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 250 nm Khảo sát pha động bằng cách thay đổi thành phần pha động (gradient) lần lượt với tỷ lệ như sau: Bảng 3.3. Tỷ lệ thành phần pha động của acetonitril và nước Acetonitril (%) Nước (%) 95 10 90 5 85 15 80 20 25 Acetonitril (%) Nước (%) 60 40 55 45 50 50 40 60 3.3.2.5. Khảo sát tốc độ dòng Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng đến quá trình thiết lặp cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng quá nhỏ sẽ làm dãn rộng chân peak, thời gian rửa giải lâu hơn. Tuy nhiên nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau. Vì vậy cần phải khảo sát để tìm ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân tích. - Cột tách: RP – 18, 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 μm - Pha động: C: acetonitril (CH3CN); D: nước - Thời gian: 0 – 20 phút, 55%C: 45%D. - Nồng độ chất phân tích: 50 µg/ml. - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; 0,8 ml/phút; 1 ml/phút; 1,2 ml/phút; 1,5ml/phút - Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 250 nm. - Thể tích vòng mẫu: 20 μl 3.3.3. Thẩm định phương pháp (ICH, 1996)  Định nghĩa: Thẩm định quy trình phân tích là quá trình thiết lập bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh quy trình phân tích đó có phù hợp và có đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Khi tiến hành thử nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được (Bộ y tế, 2009)  Mục đích: - Giúp thực hiện các chỉ tiêu kiểm nghiệm trong tiêu chuẩn kiểm nghiệm. - Là công việc bắt buộc có tính chất định kỳ nhằm đảm bảo phương pháp phân tích là phù hợp và kết quả phân tích đạt độ tin cậy trong suốt quá trình phân tích. - Để đưa vào chuyên luận Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở (Bộ y tế, 2009) 3.3.3.1 Tính phù hợp hệ thống Tiến hành sắc ký với hỗn hợp chứa mẫu chuẩn imidacloprid và azoxystrobin với nồng độ khoảng 50 ppm, tiến hành sắc ký 6 lần. 26 Tính phù hợp hệ thống được xác định dựa trên các thông số đặc trưng của sắc ký như: diện tích peak (S), thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ số đối xứng (AS), số đĩa lý thuyết (N) là những thông số thường được dùng để đánh giá độ ổn định của hệ thống khi tiêm lặp lại 6 lần. Yêu cầu: - Số đĩa lý thuyết ≥ 2000. - Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 1,0% và của diện tích peak phải ≤ 2,0% (với phép thử định lượng). Trường hợp giá trị RSD > 2%, phải có sự giải thích phù hợp. - Hệ số đối xứng của peak chính phải trong khoảng 0,8 - 1,5 (0,8 ≤ AS ≤ 1,5). - Độ phân giải giữa peak chính và peak phụ phải lớn hơn 1,5 (RS ≥ 1,5).  Các thông số khác của píc phải đáp ứng yêu cầu chung của phương pháp HPLC quy định trong Dược điển và quy định cụ thể trong quy trình phân tích thẩm định. 3.3.3.2. Tính đặc hiệu  Khảo sát tính đặc hiệu trên mẫu chuẩn Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích:  Mẫu trắng: dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu.  Mẫu chuẩn: dung dịch chứa chất chuẩn imidacloprid dung dịch chứa chất chuẩn azoxystrobin dung dịch chứa hỗn hợp hai chất chuẩn. Yêu cầu: - Sắc ký đồ hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin phải cho peak có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu trên sắc ký đồ của riêng tưng chất chuẩn. - Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện píc ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng pic phải ≤ 1,0%, so với đáp ứng của pic mẫu chuẩn. Để quy trình định lượng có ý nghĩa trong ứng dụng thực tế ta nên thực hiện khảo sát độ đặc hiệu trên mẫu giả định.  Khảo sát tính đặc hiệu trên mẫu giả định Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích  Mẫu trắng: dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu.  Mẫu chuẩn: dung dịch chứa chất chuẩn imidacloprid dung dịch chứa chất chuẩn azoxystrobin dung dịch chứa hỗn hợp hai chất chuẩn.  Mẫu giả định: dịch chiết dược liệu (không có chất cần phân tích) đã được cho thêm chất chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin 27  Ghi lại sắc ký đồ. Xác định thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích; độ tinh khiết của peak hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu giả định. Yêu cầu: - Sắc ký đồ trong dung dịch mẫu giả định cho peak có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với peak của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ mẫu giả định: peak của các chất cần phân tích phải tách nhau hoàn toàn. - Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện peak ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng peak phải ≤ 1,0%, so với đáp ứng của peak mẫu chuẩn. - Peak của chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu giả định phải tinh khiết. 3.3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ Trong một quy trình phân tích bất kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng.  Giới hạn phát hiện (LOD) là giá trị nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của đường nền.  Giới hạn định lượng (LOQ) được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có nghĩa định lượng so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: - Pha loãng từ 5 - 7 lần mẫu chuẩn chứa hỗn hợp imdacloprid và azoxystrobin nồng độ 10 ppm và chuẩn bị một mẫu trắng (chứa dung môi pha động). - Tiêm vào thiết bị HPLC và ghi kết quả.  Sắc ký đồ nào thể hiện chiều cao peak khoảng gấp 3 lần đường nền thì nồng độ của mẫu chuẩn đó chính là giới hạn phát hiện LOD của thiết bị.  Giới hạn định lượng được suy ra từ công thức: 10 LOQ = × LOD 3 3.3.3.4. Tính tuyến tính Khoảng nồng độ tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích. Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ của chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính. - Khảo sát khoảng tuyến tính từ 20-160% của nồng độ đo. Tiến hành pha 5 dung dịch (ứng với 5 nồng độ 40%, 80%, 100%, 120%, 160%), thực hiện tiêm 3 lần cho mỗi mẫu. - Tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 3.3.2 28 - Ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích peak trung bình của mỗi mẫu. Dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 vẽ đồ thị biểu diễn và thiết lập phương trình hồi quy của diện tích pic theo nồng độ. Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995). Trường hợp r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp. 3.3.3.5. Độ chính xác Độ chính xác của phương pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác trung gian.  Độ lặp lại của phép đo Đô ̣lăp̣ laị của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp lại 6 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin (có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính) vào hệ thống sắc ký với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 3.3.2. Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký S peak và thời gian lưu tR.  Yêu cầu: Với phép thử định lượng: Giá trị RSD ≤ 2,0%. Các trường hợp giá trị RSD trên 2%, cần phải có sự giải thích phù hợp.  Độ chính xác trung gian Tiến hành như độ lặp lại và làm trong 3 ngày khác nhau cùng với điều kiện và người thực hiện. Yêu cầu: Gía trị RSD từ 6 mẫu chuẩn trong một ngày và 6 mẫu chuẩn trong ngày khác đều có RSD ≤ 2,0%. 3.3.3.6. Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %) Thực hiện ở ba mức nồng độ 80%, 100% và 120% của nồng độ đo. Mỗi mức pha ba dung dịch, mỗi dung dịch tiến hành sắc ký một lần. Tính diện tích peak và dựa vào phương trình hồi quy suy ra nồng độ tìm thấy. So với nồng độ khi pha sẽ tính ra tỷ lệ phục hồi. Xác định độ đúng của phương pháp theo công thức tính tỷ lệ phục hồi: % 100t s M R M   Trong đó: - Ms: Nồng độ khi pha (g/ml) - Mt: Nồng độ tìm thấy (g/ml) từ phương trình hồi quy của đường tuyến tính Yêu cầu: - Tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ: 98,0% – 102% cho quy trình phân tích định lượng. 29 - RSD tỷ lệ phục hồi ở mỗi mức nồng độ phải ≤ 2,0 % ở mỗi mức nồng độ Trường hợp nằm ngoài khoảng này, phải có sự giải thích phù hợp. 3.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả Theo lý thuyết sắc ký lỏng, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất. Còn chiều cao và diện tích peak sắc ký có liên quan chặt chẽ đến nồng độ của chất. Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn, thì chúng ta có mối quan hệ tuyến tính như sau: Hi = k1 . Ci = f(C) (1) Si = k2 . Ci = f(C) (2) Trong đó: Hi và Si là chiều cao và diện tích của peak sắc ký của cấu tử i. Ci là nồng độ của cấu tử i với thời gian lưu tRi. k1, k2 là các hằng số thực nghiệm phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký cũng như bản chất pha tĩnh. Dựa trên (1) và (2) ta có thể xác định nồng độ các chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn. Giá trị trung bình: 1 1 n i i x x n    Độ lệch chuẩn:   2 1 1 1 n i x x SD n      Độ lệch chuẩn tương đối:  % .100 s RSD x  30 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 4.1.1. Chuẩn bị dung dịch  Chuẩn bị dung môi pha mẫu Các chất được khảo sát đều tan tốt trong acetonitril nên tôi lựa chọn dung môi pha mẫu là acetonitril và đây cũng là thành phần chính trong pha động.  Chuẩn bị dung dịch gốc và dung dịch mẫu chuẩn Dung dịch mẫu chuẩn gốc: - Cân chính xác lượng chất chuẩn tương ứng với 10 mg, cho vào bình định mức 25 ml. - Thêm khoảng 10 ml acetonitril, đánh siêu âm 10 phút, để nguội, thêm acetonitril đến vạch, lắc kĩ. Làm đồng thời với cả hai chất chuẩn imidacloprid và azoxystrobin. Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 400 ppm. - Dung dịch này được pha loãng tới nồng độ thích hợp để khảo sát và xây dựng dãy dung dịch chuẩn. Dung dịch mẫu chuẩn đơn: - Hút chính xác 6 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm acetonitrile tới vạch và lắc kĩ. - Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 µm trước khi đem chạy sắc ký. Dung dịch chuẩn đơn này có nồng độ chất chuẩn 50 ppm. - Làm đồng thời với imidacloprid và azoxystrobin. Dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp: - Hút 1 ml dung dịch chuân gốc imidacloprid và hút 5 ml dung dịch chuẩn gốc azoxystrobin vào bình định mức dung tích 50 ml. - Thêm acetonitril tới vạch và lắc kĩ. - Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi đem chạy sắc ký. Dung dịch thu được là hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin có nồng độ 50 ppm. 4.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký Sau khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát theo mục 3.3.2, ta thu được kết quả như sau: 4.1.2.1. Đặt bước sóng cho detector Bước sóng λ của detector là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp. Vì thế ta phải nghiên cứu, khảo sát sao cho tín hiệu của chất phân tích tại bước sóng λ là tốt nhất. Tiến hành quét phổ ở nồng độ từ 200-400 nm có kết quả như hình sau: 31 Hình 4.1: Phổ hấp thụ của azoxystrobin và imidacloprid trong acetonitrile. Từ hình 4.1 cho thấy azoxystrobin có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 207 nm, imidacloprid có hấp thụ cực đại tại bước sóng 270 nm. Hai phổ này có độ hấp thu giao nhau tại bước sóng 250 nm. Vì vậy tôi chọn bước sóng 250 nm để định lượng đồng thời hai chất này. 4.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động Để khảo sát thành phần pha động, tiến hành chạy chương trình sắc kí như mục 3.3.2 đã trình bày với sự thay đổi thành phần pha động. Dung dịch chất chuẩn hỗn hợp của imidacloprid và azoxystrobin được pha loãng từ dung dịch gốc 400 ppm. Thành phần dung môi pha động được chọn để khảo sát là acetonitril và nước với các tỉ lệ thể tích khác nhau. Tiến hành khảo sát thành phần pha động như mục 3.3.2.4. Kết quả được thể hiện trong các hình như sau: nm. 200.00 250.00 300.00 350.00 400.00 A bs . 1.500 1.000 0.500 0.000 -0.500 imidacloprid azoxystrobin 32 Hình 4.2. Sắc ký đồ ACN/ Nước (90%:10%). Hình 4.3. Sắc ký đồ ACN/ Nước (95%:5%). 33 Hình 4.4. Sắc ký đồ ACN/ Nước (85%:15%) Hình 4.5. Sắc ký đồ ACN/ Nước (60%:40%). 34 Hình 4.6. Sắc ký đồ ACN/ Nước (55%:45%). Hình 4.7. Sắc ký đồ ACN/ Nước (50%:50%). Dựa vào hình 4.2; 3.3; 4.4; 4.5; 4.6; 4.7, ta thấy rằng thành phần pha động ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu, hệ số lưu, hệ số tách và hệ số đối xứng của peak. Tỷ lệ ACN càng lớn (80%-95%) thì hai chất không tách nhau, cả hai peak càng dính nhau, pic không sắc nét, thời gian rửa giải lâu hơn. Ngược lại, tỷ lệ ACN càng thấp, hai peak tách nhau rõ ràng, peak đẹp, cân đối, hiện tượng kéo đuôi giảm dần. Ngoài ra khi tỷ lệ nước càng cao thì peak imidacloprid càng không đẹp, hệ số kéo đuôi tăng. Vì vậy ta chọn thành phần pha động là hỗn hợp dung môi ACN và nước cất có tỷ lệ gần bằng nhau (55%:45%) cho những nghiên cứu tiếp theo. 35 4.1.2.3 Khảo sát tốc độ dòng Sự ảnh hưởng của tốc độ dòng đến quá trình sắc ký được khảo sát bằng cách tiến hành chạy sắc kí hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin với các tốc độ khác nhau: o 0,5 ml/phút. o 0,8 ml/phút. o 1 ml /phút o 1,2 ml/phút o 1,5 ml/phút Các điều kiện còn lại của quá trình sắc kí không đổi, cụ thể như sau: - Cột tách: RP – 18, 5µm, 250 x 4,6 mm. - Thể tích vòng mẫu: 20 µl. - Nồng độ chất phân tích: 50 ppm - Detector UV-Vis: 250 nm. - Pha động: pha động đã khảo sát ở 3.3.2.4. Tiến hành khảo sát theo mục 3.3.2.5. Theo kết quả được khảo sát qua các lần tiêm ta thấy rằng, tốc độ dòng ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu, hệ số tách. - Tốc độ dòng từ 0,6 – 0,8 ml/phút cho thấy thời gian lưu tăng dần, peak chưa đẹp và không có sự cân đối, tách nhau hoàn toàn, hệ số tách giảm dần. - Tốc độ dòng 1 ml/phút cho thấy thời gian lưu giảm dần, peak rõ đẹp, hai peak tách nhau hoàn toàn, hệ số tách giảm dần, áp suất ổn định. - Tốc độ dòng lớn (> 1 ml/phút) sẽ làm hao tốn dung môi và tăng áp suất cột tách, nhưng tốc độ quá nhỏ sẽ kéo dài thời gian phân tích và làm doãng peak gây ra hiện tượng kéo đuôi.  Do đó, ta chọn tốc độ dòng là 1 ml/phút để tiến hành định lượng azoxystrobin và imidacloprid. 4.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI CHẤT IMIDACLOPRID VÀ AZOXYSTROBIN 4.2.1. Thẩm định quy trình 4.2.1.1. Tính phù hơp hệ thống Pha dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid nồng độ 50 ppm. Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần. 36 Hình 4.8: Kết quả sắc kí đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của imidacloprid Số lần tiêm mẫu tR (phút) Speak (µAU x giây) As Rs imi K’ N 1 3,954 626144 1,140 0,941 0,00 39194,789 2 3,949 634100 1,126 0,955 0,00 39100,101 3 3,969 638942 1,138 0,967 0,00 39103,700 4 3,947 642210 1,156 0,942 0,00 38679,280 5 3,974 643648 1,162 0,951 0,00 39004,980 6 3,960 660550 1,128 0,960 0,00 38243,829 Trung bình 3,957 640932 1,142 0,953 0,00 38887,780 %RSD 0,309 1,797 1,282 0,011 0,00 0,933 SD 0,012 11517 0,015 0,0101 0,00 362,722 37 Bảng 4.2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống azoxystrobin Số lần tiêm mẫu tR (phút) Speak (µAU x giây) As Rs azo K’ N 1 12,058 1805578 1,013 2,012 2,056 76407,704 2 12,081 1814130 1,009 2,212 2,059 75540,833 3 12,165 1824734 1,007 2,411 2,065 75960,530 4 12,072 1832351 1,021 2,254 2,059 76049,748 5 12,215 1835474 1,014 2,211 2,074 76593,872 6 12,144 1828874 0,999 2,231 2,067 73276,171 Trung bình 12,122 1823524 1,010 1,889 2,063 75638,143 %RSD 0,513 0,631 0,731 21,12 0,315 1,605 SD 0,012 11498 0,0073 0,399 0.0065 1213,992 Kết quả ở hai bảng 4.1 và 4.2 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu (tR), diện tích peak (S), số đĩa lý thuyết đều không quá 2%, hệ số đối xứng (AS) nằm trong khoảng 0,8-1,5, độ phân giải (RS) lớn hơn 1,5, nên khẳng định rằng hệ thống có tính phù hợp, có thể tiếp tục tiến hành những bước đánh giá tiếp theo với điều kiện sắc kí tương tự. 38 4.2.1.2 Tính đặc hiệu Hình 4.9: Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với imidacloprid và azoxystrobin Kết quả khảo sát khảo sát độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn cho thấy: - Sắc ký đồ pha động và dung môi pha mẫu không xuất hiện pic nào tại thời gian lưu của imidacloprid và azoxystrobin trong trong sắc ký đồ của imidacloprid và sắc ký đồ của azoxystrobin. - Trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn của hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin: Xuất hiện hai peak có thời gian lưu tương ứng với thời thời gian lưu của pic sắc ký đồ riêng của imidacloprid và pic azoxystrobin. Ngoài peak imidacloprid và azoxystrobin chỉ có 1 peak lạ có thời gian lưu ở 2,606 phút trong sắc kí đồ hỗn hợp chuẩn và sắc ký đồ riêng từng chất imidacloprid và azoxystrobin giống như peak xuất hiện trong sắc ký đồ mẫu trắng, chứng tỏ peak lạ này là của mẫu trắng. Peak imidacloprid và azoxystrobin tách nhau hoàn toàn. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu trên mẫu tự tạo cho thấy: Đối với dung dịch chuẩn, trên sắc ký đồ xuất hiện hai peak imidacloprid và azoxystrobin rõ rang ở tại thời gian lưu 3,959 phút và 12,210 phút. - Đối với sắc ký đồ trên mẫu trắng, trên sắc ký đồ không có peak nào xuất hiện 39 tương ứng tại thời gian lưu của imidacloprid và azoxystrobin - Đối với mẫu giả định, sắc ký đồ cho hai peak tương ứng với peak của imidacloprid và azoxystrobin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn về thời gian lưu. Từ kết quả trên, có thể khẳng định quy trình phân tích có tính đặc hiệu. 4.2.1.3. Xác định LOD và LOQ của thiết bị Trong một quy trình phân tích bất kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng. Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: pha loãng từ 5 – 7 lần mẫu chuẩn chứa hỗn hợp imdacloprid và azoxystrobin nồng độ 10 ppm và chuẩn bị một mẫu trắng (chứa dung môi pha động) Sau đó tiêm vào thiết bị HPLC. Đến khi nào chiều cao peak = 3 lần chiều cao đường nền thì lấy đó là LOD Hình 4.10: Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,048 ppm Hình 4.11. Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,0048 ppm Kết quả từ hình 4.10 và 4.11 cho thấy khi nồng độ azoxystrobin là 0,048 ppm và imidacloprid là 0,0048 ppm thì chiều cao = 3 lần đường nền. Do đó: - LOD của azoxystrobin là 0,048 ppm 40 - LOD của imidacloprid là 0,0048 ppm. Từ đó suy ra: - LOQ của azoxystrobin = 10 3 LOD = 10 3 x 0,048 = 0,16 ppm. - LOQ của imidacloprid = 10 3 LOD = 10 3 x 0,0048 = 0,016 ppm. 4.2.1.4. Tính tuyến tính Khoảng tuyến tính của imidacloprid và azoxystrobin được khảo sát bằng cách pha một dãy dung dịch chuẩn khoảng từ 0,4-1,6 ppm có nồng độ tăng dần như sau: 0,4 ppm; 0,8 ppm; 1 ppm; 1,2 ppm; 1,6 ppm ứng với 40%, 80%, 100%, 120%, 160%. Tiến hành pha dãy chuẩn như sau: - Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin gốc có nồng độ 2 ppm thành 50 ml có nồng độ 1,6 ppm: hút chính xác 40 ml dung dịch gốc cho vào bình định mức 50 ml, định mức bằng acetonitril cho đến vạch. - Pha dãy chuẩn từ dung dịch 1,6 ppm vừa thu được ở trên: hút chính xác Vx ml cho vào bình định mức 10 ml và định mức bằng acetonitril. Cụ thể như sau: Bảng 4.3: Cách pha loãng dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin trước khi tiêm vào hệ thống HPLC C(ppm) 0,4 0,8 1 1,2 1,6 Vx ml 2,5 5 6,25 7,5 10 Vacetonitrile Định mức đến vạch Sau đó, tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã khảo sát với chương trình sắc kí sau: - Cột tách: RP – 18, 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5µm - Pha động: kênh C: ACN 55%; kênh D: Nước: 45% - Tốc độ pha động: 1 ml/phút. - Detector UV-Vis: λ = 250 nm. - Thể tích vòng mẫu: 20 µl. Từ các giá trị diện tích pic S thu được, xây dựng phương trình hồi quy giữa diện tích pic S và nồng độ C của mỗi dãy chuẩn. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được chỉ ra trong bàng, bảng, hình và hình, ghi giá trị và dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 xây dựng đường hồi quy. 41 Bảng 4.4. Diện tích peak ứng với từng nồng độ imidacloprid trong dãy chuẩn Imidacloprid C (ppm) Speak 0,4 81789 0,8 152152 1 226200 1,2 291980 1,6 368627 Bảng 4.5. Diện tích peak ứng với từng nồng độ azoxystrobin trong dãy chuẩn azoxystrobin C (ppm) Speak 0,4 185609 0,8 357070 1 506195 1,2 670685 1,6 870305 42 Hình 4.12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của imidacloprid Hình 4.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của azoxystrobin Dựa vào kết quả khảo sát, ta có các phương trình hồi quy sau được biểu diễn trong hình 4.12, 4.13 và Bảng 4.4 và 4.5. 43 Bảng 4.6. Phương trình hồi quy của azoxystrobin và imidacloprid Chất phân tích Phương trình hồi quy Hệ số tương quan R2 Khoảng nồng độ tuyến tính (ppm) imidacloprid Y=74105x R2=0,9978 0,4-1,6 azoxystrobin Y=171865x R2=0,997 0,4-1,6 Nhận xét: Qua các kết quả phân tích và thống kê ta thấy, tỷ lệ diện tích peak sắc ký và nồng độ phụ thuộc tuyến tính với nhau một cách chặt chẽ với hệ số tương quan cao đạt yêu cầu ở mục 3.3.3.4. Khoảng nồng độ tuyến tính rộng đối với cả hai chất azoxystrobin và imidacloprid từ 0,4 – 1,6 ppm. Do đó, ta có thể sử dụng các phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn để định lượng azoxystrobin và imidacloprid trong mẫu thử ở khoảng tuyến tính đã khảo sát. 4.2.1.5. Độ chính xác  Độ lặp lại của phép đo Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp 6 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu ở mục 3.3.2. Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký Speak và thời gian lưu tR. Bảng 4.7. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu azoxystrobin TT Thời gian lưu của azoxystrobin Diện tích peak của azoxystrobin Thời gian lưu Các thông số thống kê Diện tích Các thông số thống kê 1 12,081 Gía trị trung bình Xtb=12,162 Độ lệch chuẩn SD=0,088 Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%)=0,72% 6472807 Giá trị trung bình 2 12,077 6535964 Xtb=6495348.67 3 12,132 6475974 Độ lệch chuẩn 4 12,167 6419486 SD=60348.26 5 12,205 6475006 Độ lệch chuẩn tương đối 6 12,311 6592855 RSD(%)=0,92% 44 Bảng 4.8. Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với mẫu imidaclopid TT Thời gian lưu của imidacloprid Diện tích peak của imidacloprid Thời gian lưu Các thông số thống kê Diện tích Các thông số thống kê 1 3,959 Gía trị trung bình Xtb=3,959 Độ lệch chuẩn SD=0,0188 Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%)=0,47% 2375675 Gía trị trung bình 2 3,964 2360311 Xtb=2383429,5 3 3,971 2339617 Độ lệch chuẩn 4 3,966 2375992 SD=34611,11 5 3,973 2419586 Độ lệch chuẩn tương đối 6 3,922 2429396 RSD(%)=1,45% Theo kết quả khảo sát ta thấy hệ thống sắc ký lỏng có độ lặp lại tốt. Đối với phép định lượng, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic là 0,92 % và 1,45 % ứng với azoxystrobin và imidacloprid đạt yêu cầu mục 3.3.3.5. Quy trình phân tích ổn định và có thể áp dụng để phân tích mẫu thử.  Độ chính xác trung gian Bảng 4.9. Độ chính xác trung gian đối với mẫu imidacloprid Số lần đo Diện tích peak (μAU*giây) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Kết quả 1 2367836 2341037 2352453 2 2301897 2401004 2390451 3 2401211 2390312 2385421 4 2315012 2352789 2410207 5 2342202 2321107 2331652 6 2296789 2321775 2314473 Trung bình 2337491 2354671 2364109 2352090 RSD 1,75% 1,44% 1,57% 1,59% 45 Bảng 4.10. Độ chính xác trung gian đối với mẫu azoxystrobin Số lần đo Diện tích peak (μAU*giây) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Kết quả 1 6399178 6417754 6475441 2 6400153 6438765 6390435 3 6403347 6443221 6485421 4 6421182 6432119 6410379 5 6501122 6421277 6478553 6 6467781 6456423 6455763 Trung bình 6432127 6432927 6449332 6438128 RSD 0,66% 0,23% 0,61% 0,5% Kết quả thu được theo bảng 4.9 và bảng 4.10 cho thấy quy trình phân tích có độ chính xác cao (RSD của diện tích peak ≤ 2%). Nhận xét: quy trình định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, miền giá trị rộng và độ chính xác cao, do đó quy trình phân tích ổn định và có thể áp dụng để phân tích mẫu thử. 4.2.1.6. Độ đúng Bảng 4.11. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với mẫu Imidacloprid Mức nồng độ đo (%) Imidacloprid Diện tích pic (µAU x giây) Nồng độ đo ở các mức (µg/ml) Nồng độ (µg/ml) tính từ phương trình hồi quy Tỷ lệ hồi phục % 80% 2050270 200 199,50 101,00 2082793 200 203,46 98,29 2054821 200 200,06 99,97 46 100% 2455806 250 248,79 101,00 2505612 250 254,83 98,12 2502276 250 254,13 98,25 120% 2927766 300 306.12 98,00 2865312 300 298,53 100,30 2887210 300 301,20 99,60 Bảng 4.12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với azoxystrobin Mức nồng độ đo (%) Azoxystrobin Diện tích pic (µAU x giây) Nồng độ đo ở các mức (µg/ml) Nồng độ (µg/ml) tính từ phương trình hồi quy Tỷ lệ hồi phục % 80% 4860132 200 202,03 98,98 4788941 200 201,51 99,25 4888295 200 203,50 98,28 100% 5804669 250 250,52 99,79 5898400 250 259,31 98,41 5870421 250 253,89 98,46 120% 6779319 300 300,51 99,82 6698359 300 296,36 101,22 6700758 300 296,48 101,48 Nhận xét: tỷ lệ phục hồi ở 3 mức nồng độ trong bảng 4.9 và bảng 4.10 của imidacloprid và azoxystrobin nằm trong khoảng 98-102% nên phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng.  Như vậy quy trình định lượng imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, độ chính xác và độ đúng đạt yêu cầu. 47 4.3. THẢO LUẬN  Về phương pháp HPLC: Tuy có một số nhược điểm như trang thiết bị giá thành cao, dung môi hóa chất đắt tiền nhưng phương pháp HPLC có nhiều ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với các phương pháp phân tích khác đặc biệt là khi có nhiều thành phần phân tích trong cùng một mẫu. Một số ưu điểm như: - Tính chọn lọc cao: tách riêng biệt chất cần phân tích khỏi các chất khác có trong cùng một mẫu cho kết quả có độ chính xác cao. - Có thể định tính, định lượng đồng thời nhiều thành phần trong hỗn hợp mà không cần tách riêng biệt các chất. - Tiết kiệm thời gian, dung môi, hóa chất và ít bị sai số. Vì vậy HPLC đã và đang được sử dụng phổ biến trên thế giới và cả ở Việt Nam. Trong dược điển các nước và cả ở Việt Nam phương pháp HPLC ngày càng được sử dụng nhiều. Do đó phương pháp đuợc trình bày ở đây có khả năng áp dụng rộng rãi trong thực tế.  Về quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp HPLC Quy trình đã xây dựng cho phép định lượng được đồng thời được cả hai hoạt chất imidacloprid và azoxystrobin. Bằng việc sử dụng chung một quy trình phân tích có thể định lượng được cả hai hóa chất bảo vệ thực vật trong rất nhiều các chế phẩm tương ứng đang lưu hành trên trị trường. Điều này giúp tiết kiệm được thời gian, công sức, dung môi hóa chất và chi phí. Imidacloprid và azoxystrobin là hai trong số các hóa chất bảo vệ thực vật được sử dụng nhiều trong nông, lâm nghiệp với xu hướng ngày càng tăng. Trong một số tài liệu tham khảo đã có định lượng đơn chất nhưng chưa có phương pháp định lượng đồng thời hỗn hợp hai chất này. Đặc biệt, trong DĐVN IV đã có chuyên luận nhưng còn ít về phương pháp định lượng các hoạt chất cũng như chế phẩm chứa hai hoạt chất này. Do đó quy trình định lượng mà tôi đã xây dựng có tính thực tế và ứng dụng cao, có thể áp dụng rộng rãi. 48 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1. KẾT LUẬN Kết quả đề tài “Định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” cho những kết luận sau: Chọn được điều kiện phù hợp để tách và xác định đồng thời imidacloprid và azoxystrobin trong một số chế phẩm thuốc hóa chất bảo vệ thực vật bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV-Vis. Với điều kiện sắc ký: - Cột tách: RP – 18; 250 x4,6 mm; kích thước hạt 5 µm - Pha động: acetonitril: nước (55%:45%) - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Thể tích vòng mẫu: 20 µl - Bước sóng: 250 nm Với chương trình chạy như trên cho kết quả như sau: Các peak tách tốt, thời gian lưu ổn định và không có hiện tượng kéo đuôi. Qua các bước khảo sát thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp đã xây dựng phuơng pháp có độ lặp lại với RSD diện tích peak của imidacloprid là 1,45% và RSD của diện tích peak của azoxystrobin là 0,92% và có độ chính xác trung gian cao với RSD ≤ 2%. Phương pháp có sự phụ thuộc tuyến tính của đáp ứng với nồng độ chất phân tích với hệ số tương quan hồi quy ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995) đạt yêu cầu định lượng. Độ đúng (độ phục hồi) nằm trong khoảng 98-102% nên quy trình đạt yêu cầu phân tích định lượng. Bảng 5.1: Giá trị LOD, LQD và khoảng tuyến tính cho 2 chất imidacloprid và azoxystrobin Tên chất imidacloprid azoxystrobin LOD (ppm) 0,0048 0,048 LOQ (ppm) 0,0016 0,016 Phương trình hồi quy Y=74105x Y=171865x Hệ số tương quan R2=0,9978 R2=0,997 Khoảng tuyến tính 0,4-1,6 0,4-1,6  Phương pháp có thể áp dụng dễ dàng với các phòng thí nghiệm, các cơ sở có trang bị máy sắc ký lỏng hiệu năng cao và nhân lực đủ trình độ vì các hóa chất, dung 49 môi dễ kiếm, quy trình làm đơn giản, dễ thực hiện. 5.2. ĐỀ XUẤT Như vậy, với kết quả thu được, ta thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao, độ lặp lại tốt, thích hợp cho việc định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp HPLC từ đó có thể xác định dư lượng của imdacloprid và azoxystrobin trong dược liệu. Ngoài ra cần phải thay đổi hai vấn đề sau:  Thay đổi tỷ lệ dung môi để rút ngắn thời gian và tránh làm hao tốn dung môi  Thay đổi một số dung môi khác hoặc kết hợp với hệ đệm để có hệ dung môi tối ưu hơn. Hi vọng những nghiên cứu trên có thể đóng góp phần nào vào việc ứng dụng phương pháp RP - HPLC nói riêng và phương pháp HPLC nói chung để xác định các hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu nhằm hạn chế sự tồn dư những chất này trong lương thực, thực phẩm và trong dược liệu để đảm bảo sức khỏe cho người dân tránh các bệnh do các hóa chất bảo vệ thực vật gây ra. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích, Phụ lục 7 –Thông tư 22/2009/TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc 2. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ (2014). Thẩm định quy trình phân tích. Trường Đại học Y Dược Cần Thơ. 3. Đoàn Hạnh Dung (2014). Xác định dư lượng một số hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu khô. Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ. Trường Đại học Dược Hà Nội. 4. Lê Thị Hường Hoa (2013). Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm. Luận án tiến sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 5. Nguyễn Phước Định (2015). Tổng hợp và thiết lập tạp chất của fluconazol làm chuẩn tạp chất. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học. Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh. 6. Thái Duy Thìn và cộng sự (2003). Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và đo quang phổ UV –VIS để định tính và định lượng. 7. Trần Cao Sơn (2015). Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ. Luận án tiến sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 8. Trần Tử An và cộng sự (2007). Kiểm nghiệm dược phẩm. NXB Y Học, Hà Nội. 9. Trần Tử An và Thái Nguyễn Hùng Thu (2007). Hóa phân tích II, NXB Y Học, 10. Từ Văn Mạc (1995). Phân tích hóa lý. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 11. Võ Thị Bạch Huệ (2016).HPLC-ứng dụng trong phân tích dược liệu. Trường Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 12. Vũ Thị Quỳnh (2013). Định lượng đồng thời Calci Atorvastatin và Simvastatin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu nâng cao. Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ. Trường Đại học Dược Hà Nội. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 13. BP 2010. Validation of Analytical Procedures, Supplementary Chapter III E. Printed in the United Kingdom by The Stationery Office, N5977690 C34 8/2009. 14. ICH Topic Q2B (1996). Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. 15. Ferrer Imma. et al (2005). Multi-residue pestiside analysis in fruits and vegetables by liquid Chromatography- time of-flight mass spectrometry. Pesticide Residue Research Group, University of almera, Spain. 51 16. J.Serb (2009). A rapid spectrophotometric determination of Imidacloprid in selected commercial formulation in the presence of 6- chloronicotinic acid. Journal of the Serbian Chemical Society. 74(12). pp.1455-1465. 17. Mastovka Katerina (2006). Azoxystrobin. Agricultural Research Service. United State Department of Agriculture, USA. 18. M.K. Sprivastava (2004). Analysis of imidacloprid residues in fruits, vegetables, cereals, fruit juices, and baby foods and daily intake estimation in and around lucknow, India. Environmental Toxicology and Chemistry, India. 19. Raihanah. Et al (2016). Ultra hight performance liquid Chromatography technique to determine Imidacloprid residue in rice using QuEChERS method. International Food Research Journal. 23(4), pp.1396-1402. 20. Schonind Ralf and Schmuck Richard (2003). Analytical determination of Imidacloprid and relevant metabolite residues by LC, MS/MS. Bulletin of Insectology. 56(1), pp.41-50. 21. S.R Burket and A Sapiests (1995). Residue analytical method for the analysis of ICIA 5504 and R2 30310 in cereals (grain) and wine (grapes). Center for Analytical Chemistry, USA. 22. Sacramento (2002). HPLC Determination of Total Imidaclopridin Vegetation, Center for Analytical Chemistry, California. 23. Saed Mousa Diab Ali (2012). Evaluation of Imidacloprid and Abamectin Residue in Tomato, Cucumber and Pepper by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). MSc. Thesis, Faculty of graduate Studies, An-Najah National University. 24. Ahmad Baig Sajad. Et al (2012). Imidacloprid residues in vegetables, soil and water in the southern Punjab, Pakistan. Journal of Agricultural Technology. 8(3), pp.903-916. 25. Sh.A.Ashorkr. et al (2006). Persistence and fate of Carbosulfan and Imidacloprid residue in potato plants. Central Agricultural Pesticides Laboratory. Agricultural Research Centre, Egypt. 26. T. Nageswara Rao. Et al (2012). Development and Validation of HPLC- UV method for Simultanous determination of Strobilurin fungicide residues in tomato fruits followed by matrix solid phase Disperision (MSPD). Department of Analytical Chemistry International Insitiuate of Biotechnology and Toxicology. 3(11). pp, 113-118. 27. USP 34/ NF 29 (2011). Validation of Compendial. Printed in the United States by United Book, Inc., Baltimore, MD. 52 28. Vojislava Bursic and Sanja Lazic (2012). Dissipation of Fungicide Azoxystrobin from Cucumber. Faculty of Agriculture. Universit of Novi Sad, Serbia. TÀI LIỆU TRÊN WEBSITE 29. National pesticide information center. Imidacloprid (10.11.2016). Truy cập ngày 10 tháng 03 năm 2017. 30. Nông học (2005). Danh mục thuốc bảo vệ thực vật (04.12.2005) https://nonghoc.com/thuoc-bao-ve-thuc-vat/1/thuocbvtv1.aspx. Truy cập ngày 19 tháng 04 năm 2017. 31. Pubchem open chemistry database. Azoxystrobin (5.2010) https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Azoxystrobin. Truy cập ngày 12 tháng 6 năm 2017 32. Pubchem open chemistry database. Imidacloprid (5.2010) https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Imidacloprid. Truy cập ngày 12 tháng 6 năm 2017 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Một số sắc ký đồ của chất chuẩn Imidacloprid Hình 1.1. Sắc ký đồ của chất chuẩn imidacloprid với tỷ lệ ACN/Nước (60%:40%), C= 80ppm, λ= 255nm Các thông số sắc ký tương ứng với hình 1.1 như sau: tR (phút) Speak (µAU x giây) As Rs K’ N 5,425 226144 1,100 0 0 19094 Hình 1.2. Sắc ký đồ của chất chuẩn imidacloprid với tỷ lệ ACN/Nước (55%:45%), λ=260 nm Các thông số sắc ký tương ứng với hình 1.2 như sau: tR (phút) Speak (µAU x giây) As Rs K’ N 3,959 386504 1,208 0 0 26076 Hình 1.3. Sắc ký đồ của chất chuẩn imidacloprid với tỷ lệ ACN/Nước (50%:50%), λ=250 nm Các thông số sắc ký tương ứng với hình 1.3 như sau: tR (phút) Speak (µAU x giây) As Rs K’ N 4,683 3702019 0,652 0 0 29705 PHỤ LỤC 2. Một số sắc ký đồ của chất chuẩn Azoxystrobin Hình 2.1. Sắc ký đồ của chất chuẩn Azoxystrobin với tỷ lệ ACN/Nước (55%:45%), λ=260 nm Các thông số sắc ký tương ứng với hình 2.1 như sau: tR (phút) Speak ( µAU x giây) As Rs K’ N 12,164 1805578 1,013 0 0 66407,502 Hình 2.2. Sắc ký đồ của chất chuẩn Azoxystrobin với tỷ lệ ACN/Nước (80%:20%), λ=255 nm Các thông số sắc ký tương ứng với hình 2.2 như sau: tR (phút) Speak (µAU x giây) As Rs K’ N 5,179 1705578 0,813 2,011 2,043 46709 Hình 2.3. Sắc ký đồ của chất chuẩn Azoxystrobin với tỷ lệ ACN/Nước (60%:40%), λ=255 nm Các thông số sắc ký tương ứng với hình 2.3 như sau: tR (phút) Speak (µAU x giây) As Rs K’ N 5,179 1705578 0,813 0 0 46709 PHỤ LỤC 3. Một số sắc ký đồ của hỗn hợp chất chuẩn azoxystrobin và imidacloprid Hình 3.1. Sắc ký đồ của hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid với tỷ lệ ACN/Nước (55%:45%), λ=250 nm Các thông số tương ứng với hình 3.1 như sau: Mẫu chuẩn tR (phút) Speak(µAU x giây) As Rs K’ N imidacloprid 3,949 616204 1,140 0,941 0,00 39194,789 azoxystrobin 12,081 1814130 1,005 2,231 2,05 75530,733 Hình 3.2. Sắc ký đồ của hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid với tỷ lệ ACN/Nước (55%:45%), λ=255 nm Các thông số tương ứng với hình 3.2 như sau: Mẫu chuẩn tR (phút) Speak(µAU x giây) As Rs K’ N imidacloprid 3,963 529831 1,140 0,941 0,00 37634,532 azoxystrobin 12,143 1795231 1,315 2,511 2,12 75820,611 Hình 3.3. Sắc ký đồ của hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid với tỷ lệ ACN/Nước (60%:40%), λ=255 nm Các thông số tương ứng với hình 3.3 như sau: mẫu chuẩn tR (phút) Speak(µAU x giây) As Rs K’ N imidacloprid 3,953 629732 1,140 0,941 0,00 39600,411 azoxystrobin 12,103 1895321 1,315 2,471 2,33 69947,623 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC-ĐIỀU DƯỠNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập - Tự do - Hạnh phúc BẢN GIẢI TRÌNH CHỈNH SỬA KHÓA LUẬN THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC HỌC Họ tên sinh viên: Lê Hữu Bảo Trân Lớp: Đại học Dược 7B MSSV: 12D720401175 Tên khóa luận: “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời chuẩn imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”. Cán bộ hướng dẫn: ThS. Nguyễn Phước Định Căn cứ theo góp ý của hội đồng đánh giá khóa luận tốt nghiệp đại học, khóa luận đã được chỉnh sửa như sau: 1. Về hình thức: Đề tài đã chỉnh sửa nhũng lỗi cơ bản như: lỗi chính tả, viết thường một cách đồng nhất sau dấu hai chấm, khoảng cách “ml”, tài liệu tham khảo bổ sung thêm năm, viết lại tài liệu tham khảo trên website theo đúng quy định nhà trường đưa ra, trích dẫn tài liệu tham khảo trong phần thẩm định phương pháp, chỉnh sửa lại hãng sản xuất tên các thiết bị 2. Về nội dung Tên khóa luận: “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” được đổi thành “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời chuẩn imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”. Chỉnh sửa phần kết luận và phần kiến nghị bổ sung thêm và chuyên sâu để phù hợp hơn với nội dung đề tài. Bổ sung thêm thẩm định độ đặc hiệu trên mẫu giả định, độ chính xác trung gian. Làm lại độ tuyến tính với nồng độ thấp hơn để phù hợp với nồng độ imidacloprid và azoxystrobin trong cây đinh lăng. Làm rõ hơn cách pha mẫu và nồng độ các dung dịch mẫu. Bổ sung thông số sắc ký ở phần sắc ký đồ trong phần phụ lục. Thêm trích dẫn tài liệu tham khảo trong phần thẩm định phương pháp XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ KHÓA LUẬN CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS.TS Trần Công Luận