Lý thuyết thực tập chuyên ngành di truyền

Click to edit Master title style Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 26/06/2014 ‹#› Lý thuyết Thực tập Chuyên ngành Di truyền - SHPTNuôi cấy mô thực vật NỘI DUNG Vấn đề 1: Định nghĩa, mục tiêu và ứng dụng Vấn đề 2: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật và trang thiết bị Vấn đề 3: Sự vô trùng Vấn đề 4: Nhu cầu dinh dưỡng của mô cấy Vấn đề 5: Pha dung dịch mẫu – Pha môi trường nuôi cấy Vấn đề 6: Chất điều hòa tăng trưởng thực vật Vấn đề 7: Lựa chọn mẫu cấy và các phản ứng của mẫu cấy Vấn đề 8: Cấy chuyền Vấn đề 9: Các chất ức chế, sự nhiễm trùng và phương pháp xử lí Vấn đề 1: Giới thiệu chung về nuôi cấy mô thực vật Định nghĩa Cơ sở khoa học Mục tiêu Ứng dụng I. Định nghĩa I. Định nghĩa I. Định nghĩa I. Định nghĩa I. Định nghĩa I. Định nghĩa I. Định nghĩa I. Định nghĩa I. Định nghĩa I. Định nghĩa Tử diệp B. Trụ thượng diệp, C. Trụ hạ diệp D. Cuống lá E. Lá F. Đối chứng I. Định nghĩa Nuôi cấy mô thực vật là phương pháp tách rời một bộ phận sạch của cây (mô, tế bào…) đem nuôi cấy trong môi trường thích hợp và cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng tuyệt đối để chúng tiếp tục phân bào rồi biệt hóa thành mô, cơ quan (cụm chồi, chồi…) và phát triển thành cây mới. Mô, tế bào thực vật (rễ, thân, lá…) Nuôi cấy vô trùng Cây hoàn chỉnh I. Định nghĩa II. Cơ sở khoa học Tế bào thực vật có các đặc điểm: Tế bào, mô thực vật là một phần của cơ thể thực vật nhưng chúng vẫn có tính độc lập. Nếu tách 1 tế bào hay 1 số tế bào đem nuôi cấy trong môi trường thích hợp và có đủ chất dinh dưỡng thì chúng có thể biệt hóa thành mô, cơ quan và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Tế bào thực vật có tính toàn năng II. Cơ sở khoa học Tế bào thực vật có khả năng phân hóa để đảm nhận các chức năng khác nhau và phản phân hóa tế bào để trở về dạng phôi sinh tiếp tục phân chia. Tế bào phôi sinh Quá trình phân hóa Tế bào chuyên hóa (rễ, thân, lá) Quá trình phản phân hóa Sơ đồ sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Sơ đồ sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Tế bào hợp tử Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hóa Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hóa Quá trình phân hóa Quá trình phản phân hóa Cây hoàn chỉnh Cây hoàn chỉnh Nuôi cấy mô TB II. Cơ sở khoa học Tạo quần thể lớn và đồng nhất trong thời gian tương đối ngắn Tạo được nhiều cây con từ mô hoặc cơ quan của cây (lóng thân, phiến lá, hoa, hạt phấn, chồi phát hoa…) Làm sạch mầm virus bằng cách cấy mô phân sinh ngọn Cải biến giống cây trồng bằng đa bội hóa mô cấy, gây đột biến nhân tạo, cấy tế bào trần… III. Mục tiêu III. Mục tiêu IV. Ứng dụng Nhân giống vô tính (nhân giống sinh dưỡng, vi nhân giống) Tạo cụm chồi trực tiếp Tạo cụm chồi gián tiếp từ callus Tạo phôi sinh dưỡng Nhân giống hữu tính Vấn đề 2: PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT VÀ TRANG THIẾT BỊ Gồm có 3 phòng: Phòng chuẩn bị mẫu Phòng cấy Phòng nuôi I. Phòng chuẩn bị mẫu I. Phòng chuẩn bị mẫu I. Phòng chuẩn bị mẫu Autoclave xách tay Autoclave phòng thí nghiệm I. Phòng chuẩn bị mẫu I. Phòng chuẩn bị mẫu I. Phòng chuẩn bị mẫu II. Phòng cấy Không cửa sổ Vách không trực tiếp với bên ngoài Có máy điều hòa Đèn huỳnh quang, đèn UV II. Phòng cấy Tủ cấy một cửa Tủ cấy hai cửa III. Phòng nuôi Nhiệt độ: 22 – 25oC Ánh sáng: 2800 – 3000lux, thời gian chiếu sáng: 16 – 18 giờ sáng/ngày Máy điều hòa Kệ nuôi cấy Độ ẩm không khí 70% III. Phòng nuôi Đảm bảo vô trùng Chịu nhiệt; Cho ánh sáng đi qua Lưu giữ độ ẩm đảm bảo tiểu khí hậu Đảm bảo thông khí với môi trường bên ngoài Bình nuôi Một số dụng cụ, trang thiết bị cho phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật Một số dụng cụ, trang thiết bị cho phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật Bình tam giác Hộp vuông Bình trụ Túi nuôi cấy, ống nghiệm Khác Các loại bình nuôi Đảm bảo vô trùng Sử dụng nhiều lần Rẻ tiền Lưu thông với bên ngoài Thoáng khí Các loại nút bình nuôi Nút màng polyethylen chịu nhiệt Nút bông Cao su chịu nhiệt Nhựa chịu nhiệt Một số dụng cụ, trang thiết bị cho phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật PIPETMAN BÌNH ĐONG, Ống đong CÂN KỸ THUẬT CÂN PHÂN TÍCH MÁY ĐO PH Kính hiển vi Kính LÚP TỦ ẤM TỦ NUÔI MÁY LẮC BỒN Ổn nhiệt DỤNG CỤ THUỶ TINH BẾP TỪ LÒ VI SÓNG DAO VÀ KẸP KIM LOẠI Các muối vô cơ Các chất hữu cơ Chất điều hòa sinh trưởng thực vật Vitamin Cồn Hóa chất khử trùng Đường Agar Một số hóa chất cần cho phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật Vấn đề 3: SỰ VÔ TRÙNG Ý nghĩa của sự vô trùng Các phương pháp vô trùng I. Ý nghĩa của sự vô trùng Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin..rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm,khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi. Sự vô trùng là điều kiện cần thiết để thành công trong việc nuôi cấy mô thực vật Vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn Vô trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave Vô trùng bằng hóa chất Vô trùng bằng đèn UV Vô trùng bằng màng lọc II. Các phương pháp vô trùng 1. Vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn Dùng hơ miệng bình môi trường và dụng cụ cấy (dao, kẹp) Để đèn cồn cháy suốt quá trình thao tác trong tủ cấy II. Các phương pháp vô trùng 2. Vô trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave Điều kiện hấp khử trùng: 1atm và 103oC / 1,3atm và 121oC Thời gian tối ưu: 15 – 20 phút Đối tượng hấp: Môi trường nuôi cấy, nước cất: Thời gian khử trùng thay đổi tùy theo lượng mội trường trong bình Dao, kẹp, đĩa petri, cốc thủy tinh (becher), bông gòn Bình mẫu bị nhiễm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc… II. Các phương pháp vô trùng Một số loại nồi khử trùng thông dụng KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG 2. Vô trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave II. Các phương pháp vô trùng Nắp nồi Ốc vặn Đồng hồ áp suất Van an toàn Buồng hấp Phểu châm nước Mực châm nước Van xả nước Van xả hơi 2. Vô trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave II. Các phương pháp vô trùng - Châm nước - Xếp dụng cụ vào nồi - Đóng nắp - Khĩa van xả hơi, van điều áp, van xả nước - Nâng nhiệt - Xả hơi để đuổi không khí (khi đạt 0,5 atm hay 0,5 kg/cm2) - Tiếp tục nâng nhiệt cho đến nhiệt độ cần khử trùng là 121oC (1 atm hay 1 kg/ cm2) - Giữ ổn định nhiệt độ trên đến khi hết thời gian khử trùng. - Tắt điện hoặc nguồn cung cấp nhiệt. - Để cho áp suất trong nồi trở về không hoặc xả hơi thật chậm - Mở nắp nồi. - Để 10 – 15 phút (cho sấy khô giấy gói hoặc nút bông) 2. Vô trùng bằng nhiệt độ ẩm autoclave II. Các phương pháp vô trùng CÁCH TIẾN HÀNH Cồn 90o, 70o: Làm biến tính protein → Diệt vi khuẩn, nấm nhưng không diệt bào tử NaClO, Ca(ClO)2 → Javel → Oxy hóa của Cl → Phát hủy vách tế bào → Diệt vi khuẩn CuSO4, AgNO3, HgCl2… → Kim loại nặng đều có tính kháng khuẩn mạnh → Cơ chế: Ức chế sự sao chép DNA của vi khuẩn Chất hoạt động bề mặt: Tween 20; 80 → Giảm sức căng bề mặt để các chất dễ dàng xuyên vào bên trong mẫu → Rửa mẫu 3. Vô trùng bằng hóa chất II. Các phương pháp vô trùng 3. Vô trùng bằng hóa chất II. Các phương pháp vô trùng Tùy loại mẫu và kích thước mẫu mà thay đổi nồng độ và thời gian khử mẫu Mở đèn UV trước khi cấy khoảng 15 – 30 phút Khử trùng không khí trong phòng cấy hoặc tủ cấy 4. Vô trùng bằng đèn UV II. Các phương pháp vô trùng Lý do phải khử trùng bằng màng lọc. Nguyên tắc khử trùng bằng màng lọc. Ưu diểm: nhanh, không thay đổi thành phần môi trường Nhược điểm: đắt, rât khó ứng dụng cho các dung dịch có độ nhớt cao... KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG 5. Vô trùng bằng màng lọc II. Các phương pháp vô trùng Vấn đề 4: NHU CẦU DINH DƯỠNG CỦA MẪU CẤY Yếu tố hóa học Yếu tố vật lý I. Yếu tố hóa học Nước Muối khoáng Đường Vitamin Amino acid Chất điều hòa sinh trưởng thực vật Các phức chất tự nhiên Thạch Độ pH của môi trường 1. Nước Nước cất hoặc nước khử ion I. Yếu tố hóa học Vai trò: Vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ Thành phần không thể thiếu của nhiều enzyme Cân bằng áp suất thẩm thấu, duy trì thế điện hoá của thực vật 2. Muối khoáng I. Yếu tố hóa học 2. Muối khoáng I. Yếu tố hóa học Muối khoáng đa lượng: lớn hơn 30 mg/L N; S; P; K; Mg; Ca. Nitơ: NO3-, NH4+.... Lưu huỳnh: SO42-. Phospho: PO43- Các muối khoáng đa lượng Các muối khoáng vi lượng Muối khoáng vi lượng: nhỏ hơn 30 mg/L Fe; B; Mn; Cu; Zn; Co; I; Mo Fe: Thường dùng với NaEDTA Bo: Thiếu → Mô nuôi cấy hoá mô sẹo mạnh, mong nước, khả năng tái sinh kém Mo: Trao đổi nitrogen I. Yếu tố hóa học Vitamin nhóm B – Bổ sung vào phần thiếu hụt của tế bào B1 (Thiamin hydrocloride); B2: Riboflavin B5 (Panthotenic acid); Biotin: Cần thiết cho phân bào. B3 (Panthotenate de calcium), B6 (Pyridoxine HCl) PP (acid nicotinic), Myo-Inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào 4. Vitamin Mô thực vật chủ yếu sống bằng phương pháp dị dưỡng, có thể tổng hợp chất hữu cơ nhờ quang hợp. Thường dùng đường sucrose, có thể dùng glucose Fructose, malnose... kém hiệu quả. Manitol, sorbitol: Dùng để ổn định áp suất thẩm thấu. Các nguồn carbon khác kém hiệu quả 3. Nguồn cacbon Malt extract: Dịch trích từ lúa đại mạch, rỉ đường, mạch nha Bột chuối nghiền; Bột khoai tây nghiền Dich chiết cà rốt, cà chua, khóm; Dịch chiết nấm men Dich thuỷ phân casein, casein hydrolysat. Các phức chất tự nhiện Nước dừa Được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào Thành phần phức tạp, không ổn định tuỳ theo mùa, độ tuổi của cây, nguồn gốc của cây Tuy vậy có tác dụng rất tốt trong nuôi cấy mô tế bào Thành phần hoá học: Kích thích sinh trưởng-kinetin, auxin, acid amin tự do, protein, peptid, đường, axit hữu cơ, myo-inositol … I. Yếu tố hóa học Amino acid Kích thích sự tăng trưởng của tế bào Nguồn cung cấp nitrogen Các acid amin: Glycine… I. Yếu tố hóa học Auxin: Tự nhiên (AIA – Acid Indol Acetic), Nhân tạo (AIB, ANA, 2,4-D) Cytokinin: Adenin, Kinetin, BA, BAP Gibberellin (GA3, GA1, GA4, GA7) Ethylene, Acid Abscisic (ABA)… Chất điều hòa sinh trưởng thực vật Than hoạt tính Kích thích tăng trưởng và biệt hóa: phong lan, hành, cà rốt, cà chua, trường xuân Gây ức chế: thuốc lá, đậu Tác dụng: Giảm độc tố bằng cách đào thải các hợp chất độc, cho phép tế bào sinh trưởng bình thường Hút các hợp chất cản, chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đen môi trường Giá thể Thạch (Agar) là giá thể phổ biến Là một loại polysacharide chiết xuất từ tảo. Hoà tan ở trong 80oC. ở 40oC trở về trạng thái gel- nửa cứng Ngoài ra còn có một số chất giá thể khác như phytagel, agarose... Nồng độ: 0.6 – 1% pH MÔI TRƯỜNG Là yếu tố cực kỳ quan trọng trong môi trường. pH ảnh hưởng đến các yếu tố sau: Sự tương tác giữa các chất, đặc biệt là trong quá trình khử trùng. Rất quan trọng đối vơi việc thuỷ phân agar. pH càng thấp thì môi trường càng lỏng. Ảnh hưởng đến các vitamin và các chất hữu cơ. Trước khử trùng: pH = 5.5 – 5,7 (trừ các thí nghiệm đặc biệt). Sử dụng KOH, NaOH để điều chỉnh độ pH. Trong quá trình nuôi cây pH giảm dần (môi trường chua hoá) I. Yếu tố hóa học Ánh sáng Đòi hỏi đối với nguồn sáng Phát sinh cơ quan, hình thành cây Cường độ 2800 - 3000 lux Chu kỳ chiếu sáng 16/24; hoặc 18/24 Chất lượng quang phổ: dải tần 230-780 nm Bóng tối đối với một số trường hợp như tạo củ, tạo callus I. Yếu tố vật lý Vai trò của ánh sáng Kớch thớch tạo diệp lục Cung cấp chất dinh dưỡng cho cây Ảnh hưởng đến phát sinh hình thái Khi tạo callus, tạo củ, lưu giữ quỹ gen- cần cường độ ánh sáng thấp I. Yếu tố vật lý Có cường độ chiếu sáng tương đối đồng đều cho một mục đích sử dụng. Dùng ánh sáng lạnh để chống tăng nhiệt độ – thông dụng là đèn huỳnh quang. - Sử dụng thiết bị tắt mở tự động để tắt bật ánh sáng theo chu kỳ định trước, thường là 16 giờ chiếu sáng/8 giờ tối. Phương pháp bố trí ánh sáng trong phòng thí nghiệm I. Yếu tố vật lý 73 Vai trò của nhiệt độ: Duy trì sự phát triển bình thường của thực vật. Tuỳ theo mục đích người ta sử dụng các chế độ nhiệt độ khác nhau để sự sinh trưởng và phát triển của thực vật được tối ưu Nhiệt độ Nhiệt độ tối ưu thường dùng 22 – 25oC Lưu giữ quỹ gen dùng nhiệt độ thấp từ 4-20oC Khi chuẩn bị cho cây ra ngoài có thể tăng dần nhiệt độ I. Yếu tố vật lý Phương pháp duy trì nhiệt độ phòng nuôi Ở Xứ lạnh – chủ yếu phải tăng nhiệt độ bằng sưởi, Ở Việt Nam – phải giảm nhiệt độ bằng điều hoà Ưu điểm: diện tích sử dụng lớn, giá thành rẻ. Thường dùng cho các mục đích chung, sản xuất đại trà. I. Yếu tố vật lý 75 Ưu điểm: Gọn nhẹ, có thể điều chỉnh các chế độ đặc biệt bổ sung cho buồng nuôi. Nhược điểm: Giá thành cao Phương pháp duy trì nhiệt độ sử dụng tủ nuôi I. Yếu tố vật lý Được duy trì nhờ bình nuôi. Thường là độ ẩm bão hoà Độ ẩm Trước khi đưa ra ngoài, giảm dần độ ẩm bằng cách: Thay nút bằng nút giấy. Nút giấy cho phép độ ẩm thoát ra ngoài nhưng vẫn chống được nhiễm trong thời gian ngắn. Mở hẳn nút 2-3 ngày trước khi đưa cây ra ngoài để độ ẩm gần với độ ẩm tự nhiên. I. Yếu tố vật lý Độ ẩm khoảng 70% I. Yếu tố vật lý Sự thoáng khí Cây trong bình cấy cần một lượng oxygen để hô hấp. Môi trường lỏng: Lắc hoặc quay cung câp oxygen. Nuôi cấy tế bào rời (100 – 150 vòng / phút). Nuôi cây chồi (1 vòng/phút). Môi trường đặc: đặt sát mặt môi trường hoặc cắm vào thạch 1/3 mẫu vật. Vấn đề 5: PHA DUNG DỊCH MẪU – PHA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Pha dung dịch mẫu Pha môi trường nuôi cấy I. Pha dung dịch mẫu (Pha dung dịch mẹ) Dung dịch mẫu là dung dịch pha sẵn và bảo quản trong tủ lạnh. Có nồng độ cao gấp 10 – 100 lần. Thuận tiện khi pha môi trường. Đảm bảo độ chính xác các thành phần hóa chất đủ với nồng độ thấp. Tại sao phải pha dung dịch mẫu? I. Pha dung dịch mẫu (Pha dung dịch mẹ) Pha dung dịch mẫu của MÔI TRƯỜNG MURASHIGE & SKOOG (1962) (MS) Skoog IA, Skoog IB: Dung dịch chứa muối khoáng đa lượng Skoog II, Skoog III: Dung dịch chứa muối khoáng vi lượng CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi truờng White, Knop và Knudson C, Blaydes… Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: điển hình là môi trường B5 của Gamborg … Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962)… Khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, nên thăm dò so sánh 3 loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu phù hợp với loại môi trường nào nhất, sau đó điều chỉnh các thành phần dinh dưỡng. II. Pha môi trường nuôi cấy II. Pha môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường cấy đã được các nhà khoa học nghiên cứu. Tùy đối tượng nghiên cứu có một môi trường nuôi cấy thích hợp Môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào: Đối tượng nuôi cấy Giai đoạn nuôi cấy Mục đích nuôi cấy Cân hóa chất chính xác. Mỗi loại hóa chất phải dùng muỗng mút riêng. Cho nước cất vào bình → Cho hóa chất vào tuần tự và khuấy đều → Thêm nước cất cho đủ thể tích. pH chính xác (hiệu chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N) Bổ sung agar → Đun → Cho vào erlen, ống nghiệm… Hấp khử trùng II. Pha môi trường nuôi cấy CÁCH TIẾN HÀNH Vấn đề 6: CHẤT ĐIỀU HÒA TĂNG TRƯỞNG THỰC VẬT(GROWTH REGULATOR) Vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng I. Vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật Bên cạnh các chất dinh dưỡng cần cho mô nuôi cấy, việc bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật cũng cần thiết để: Kích thích sự tăng trưởng, phát triển mẫu cấy. Phân hóa cơ quan. Cung cấp sức sống cho mô và các tổ chức. Yêu cầu đối với chất điều hòa tăng trưởng thực vật tùy từng loại thực vật, loại mô và sự hiện diện chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh ở từng giai đoạn phát triển của mẫu cấy. II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng Auxin Cytokinin Giberellin Ethylen Acid abscisic (ABA) 1. Auxin Auxin được sản xuất ở đỉnh sinh trưởng chồi (chủ yếu), đỉnh sinh trưởng rễ… Nồng độ thường dùng: 0,01 – 5mg/l Auxin được sản xuất ở chồi ngọn → Di chuyển xuống chồi bên → Kích thích kéo dài thân → “Ưu thế ngọn” Các dạng auxin: Auxin tự nhiên: AIA (Acid Indol Acetic) Auxin tổng hợp: AIB (Acid Indol Butyric); ANA (Acid α-Naphtyl Acetic); 2,4-D II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng Phân chia tế bào Tế bào phân chia chiều dọc Ức chế tạo chồi bên Liên quan đế sự phân hóa mô dẫn, tạo phôi soma Nồng độ thấp: Kéo dài lóng thân, rễ, kích thích chồi bất định 1. Auxin II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng Tác dụng của Auxin Nồng độ cao: Kích thích sự tạo sẹo tại vùng bị tổn thương Nhân nhanh sinh khối mô sẹo Kích thích sự tạo rễ bất định nhưng ức chế sự kéo dài rễ Ức chế sự kéo dài lóng thân 1. Auxin II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng Tác dụng của Auxin Được tổng hợp từ rễ, di chuyển lên ngọn và tích tụ ở ngọn→ Trên đường di chuyển, nó phá vỡ “Ưu thế ngọn” và kích thích sự tạo chồi bên Nồng độ sử dụng: 0,1 – 10 mg/l Các dạng cytokinin: Trong tự nhiên: Zeatin Tổng hợp: BAP (BA – Benzyl Aminopurine), Kinetine, Adenine, TDZ (vừa có tính chất của auxin, vừa có tính chất của cytokinin) 2. Cytokinin II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng Kích thích mau sự phân chia tế bào Tế bào tăng trưởng theo đường kính Ức chế sự tạo rễ Phá ưu thế ngọn, kích thích tạo chồi bên → Ứng dụng nhân cụm chồi 2. Cytokinin II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng Tác dụng của Cytokinin Nồng độ thấp: Cảm ứng sẹo, tái sinh chồi Nồng độ cao: Tạo chồi bất định Ức chế sự tổng hợp diệp lục tố 2. Cytokinin II. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường dùng Tác dụng của Cytokinin Tương tác giữa các nhóm Cytokinin và Auxin Trong cơ thể thực vật các auxin và cytokinin không bao giờ tác dụng riêng rẽ mà luôn luôn tác dụng phối hợp. Tác dụng phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát sinh, phát triển của tế bào. Tỷ lệ A/C > 1 → Hình thành rễ Tỷ lệ A/C < 1 → Phân hoá chồi Tỷ lệ A/C = 1 → Mô sẹo. Trao đổi chất của auxin ảnh hưởng đến trao đổi chất cytokinin và ngược lại Vấn đề 7: LỰA CHỌN MẪU CẤY VÀ CÁC PHẢN ỨNG CỦA MẪU CẤY Quy trình nuôi cấy mô thực vật Yêu cầu của mẫu cấy Khử trùng mẫu cấy Cấy mẫu Phản ứng của mẫu cấy I. Quy trình nuôi cấy mô thực vật I. Quy trình nuôi cấy mô thực vật Gồm 4 bước chính: Trích mẫu cấy vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo để mẫu cấy sống. Kích thích mẫu cấy phát triển tạo mô sẹo hay tạo chồi. Kích thích chồi tạo rễ. Trồng cây con ra chậu I. Quy trình nuôi cấy mô thực vật Cây khỏe mạnh, phát triển tốt, không sâu bệnh. Lấy các bộ phận non. Mẫu được chọn có thể là: đốt thân, lá non, trái, cọng phát hoa, đỉnh sinh trưởng… Kích thước không quá nhỏ, không quá lớn II. Yêu cầu của mẫu cấy II. Yêu cầu của mẫu cấy III. Khử trùng mẫu Loại bỏ những phần không cần thiết, mẫu càng nhỏ càng ít nhiễm Rửa sạch dưới vòi nước Rửa bằng xà phòng/savon Rửa lại bằng nước cất Lắc nhẹ qua Alcol 70o Ngâm mẫu vào Hypo-Ca hoặc Javel (nồng độ, thời gian tùy mẫu cấy). Rửa sạch Hypo-Ca hoặc Javel bằng nước cất Loại bỏ phần mô bị chết IV. Cấy mẫu Môi trường Ưu điểm Nhược điểm Môi trường đặc Thao tác cấy tương đối đơn giản Chỉ có phần tiếp xúc với môi trường là hấp thu chất dinh dưỡng Chất thải do mô tập trung quanh mô cấy Chất dinh dưỡng lắng → Gây độ lệch về chất dinh dưỡng trong môi trường Môi trường lỏng Cung cấp chất dinh dưỡng toàn bộ bề mặt mô. Sự trao đổi khí, sự khuếch tán chất tiết của mô dễ dàng hơn Loại bỏ tính hữu cực của mô và không có độ lệch về chất dinh dưỡng trong môi trường Thao tác phức tạp V. Phản ứng của mẫu cấy Mỗi mẫu cấy có phản ứng khác nhau tùy thuộc: Loại mô: Mô có tổ chức, mô không có tổ chức Thành phần môi trường nuôi cấy 1. Mẫu cấy có tổ chức Chồi ngọn, chồi bên (chồi ngủ, chồi bất định), đỉnh sinh trưởng Có sự phát triển chồi, cụm chồi Cây hoàn chỉnh Tạo thể chồi (Protocrom) Tạo phôi vô tính (phôi soma) V. Phản ứng của mẫu cấy Giúp mẫu cấy sống và tăng trưởng chồi → Kích thích chồi tạo rễ cây con → Cần auxin và gibberelin. Nhân nhanh cụm chồi → Tách rồi các chồi → Cấy sang môi trường tăng trưởng → Tạo rễ → Cần 3 loại môi trường: Môi trường nhân chồi (cytokinin: số chồi tỉ lệ thuận với nồng độ cytokintin và tỉ lệ nghịch với chiều cao chồi), tăng trưởng (auxin, gibberelin), tạo rễ (auxin hoặc môi trường căn bản). 1. Mẫu cấy có tổ chức V. Phản ứng của mẫu cấy Mục đích 1. Mẫu cấy có tổ chức V. Phản ứng của mẫu cấy Cấy đỉnh sinh trưởng (Đỉnh sinh trưởng gồm vùng tận ngọn là sinh mô chờ đợi, vùng phân mô này phân cắt khi cấy bắt đầu trổ hoa) Mảnh cấy tốt nhất có hai phác thể lá. Cấy đỉnh chồi: Cắt ngang phần ngọn thân, cấy vào môi trường → Giâm cành vi mô Cấy mầm bên (mầm ngủ): Tạo một chồi hoặc cụm chồi không đều nhau 1. Mẫu cấy có tổ chức V. Phản ứng của mẫu cấy Dễ khử trùng Môi trường cấy đơn giản và dễ thành công Các cây con thường giữ đặc tính di truyền của cây mẹ Lóng, lá, rễ, biêu bì, lá đài, cánh hoa, nhị đực… Có thể phát triển chồi, cụm chồi trực tiếp Qua trung gian: Tạo mô sẹo Mô sẹo đặc: Tiếp tục tái sinh chồi, thể chồi, rễ… Mô sẽo xốp: Sẽ bị thoái hóa dần (hóa nâu) rồi chết Đặc biệt, hiện nay, nuôi cấy rễ được phát triển mạnh nhằm mục đích nhân sinh khối rễ, sau đó li trích thu nhận các hợp chất tinh dầu có giá trị 2. Mẫu cấy không có tổ chức III. Phản ứng của mẫu cấy 2. Mẫu cấy không có tổ chức III. Phản ứng của mẫu cấy Mẫu cấy không có tổ chức Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ trực tiếp trên mẫu cấy Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ qua trung gian mô sẹo Tạo chồi: Các tế bào ngoài mẫu cấy (tế bào biểu bì, tế bào nhu mô…) → Phản phân hóa → Phân cắt tạo khối sinh mô → Phân hóa chồi → Chồi bất định 2. Mẫu cấy không có tổ chức a) Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ trực tiếp trên mẫu cấy III. Phản ứng của mẫu cấy Tạo phôi sinh dưỡng 2. Mẫu cấy không có tổ chức a) Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ trực tiếp trên mẫu cấy III. Phản ứng của mẫu cấy Tạo phôi sinh dưỡng Phôi sinh dưỡng là một khối tế bào giống sinh mô được bao bọc bởi một biểu bì riêng biệt không liên quan đến mảnh cấy hoặc mô sẹo, độc lập về mô học và sinh lý. Phôi sinh dưỡng tạo ra từ tế bào dinh dưỡng có cơ cấu và hình thái giống phôi sinh dục. Phôi sinh dưỡng có cơ cấu lưỡng cực (một đầu là sinh mô ngọn, đầu kia là sinh mô rễ) và hai cực tăng rtưởng đồng thời. Sự thành lập phôi sinh dưỡng trải qua 3 giai đoạn liên tiếp: hình cầu → hình tim → hình thoi. Tạo phôi sinh dưỡng Tạo phôi sinh dưỡng Cách thành lập phôi sinh dưỡng A, B: Sư thành lập phôi sinh dưỡng trực tiếp từ mẫu cấy C,D: Sự thành lập phôi sinh dưỡng gián tiếp từ mặt ngoài của mô sẹo Tạo tiền củ (Protocroms) Tạo tiền củ (Protocroms) Tiền củ là một khối sinh mô hình cầu có lớp tế bào bao bọc, một tiền củ có thể nảy chồi tạo thành cụm tiền củ. Một tiền củ → Cắt thành nhiều mảnh → Cấy chuyền → Mỗi mảnh tạo một tiền củ mới có nhiều đỉnh sinh trưởng trên bề mặt tiền củ Có thể tạo trực tiếp trên mô cấy hoặc gián tiếp trên mô sẹo. Tạo tiền củ (Protocroms) Nơi vết cắt của mẫu cấy sẽ tạo sẹo khi hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nôi sinh cao. Mô sẹo là khối tế bào không định hình gồm các tế bào gần giống nhau liên kết một cách lỏng lẻo mềm, bở rời, dễ tách và chưa biệt hóa, có cơ cấu không hoàn toàn đồng nhất, trên mặt ngoài hoặc trong có những khối sơ khởi. Khối sơ khởi gồm các tế bào sinh mô kích thước nhỏ hơn tế bào mô sẹo → Sinh mô sơ lập → Tạo chồi, rễ. Trong mô sẹo: Nhiều tế bào sinh mô xếp thành tượng tầng → Sinh mô hậu lập → Tạo mô libe – mộc. 2. Mẫu cấy không có tổ chức a) Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ qua trung gian mô sẹo III. Phản ứng của mẫu cấy 2. Mẫu cấy không có tổ chức a) Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ qua trung gian mô sẹo III. Phản ứng của mẫu cấy 2. Mẫu cấy không có tổ chức a) Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ qua trung gian mô sẹo III. Phản ứng của mẫu cấy Mô sẹo nuôi cấy càng lâu hoặc cấy chuyền nhiều lần thì tế bào mô sẹo có khả năng biến dị do: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Mô sẹo phải tăng sinh → Vài tế bào lệch lạc phân cắt, nhất là ở giai đoạn anaphase → Tạo lệch bội, đa bội → Không giữ nguyên giống ban đầu 2. Mẫu cấy không có tổ chức a) Tạo chồi, phôi sinh dưỡng và tiền củ qua trung gian mô sẹo III. Phản ứng của mẫu cấy Tỉ số biến dị tăng theo tần số cấy chuyền và tuổi của mô sẹo Hai mục đích lưu ý khi nuôi cấy mô Phải sử dụng mẫu cấy có tổ chức Cấy trong môi trường thích hợp để tránh giai đoạn trung gian của mô sẹo Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng trong mô cấy không quá cao Không nên cấy chuền nhiều lần 1. Tạo cây con hoàn toàn giống cây mẹ Đưa nhanh các loài cây hiếm, có giá trị ra thị trường Cứu vãn các loài co nguy cơ tuyệt chủng Lập ngân hàng giống Sử dụng mẫu cấy nhỏ không có tổ chức (đã phân hóa) Phân cắt tạo mô sẹo hay phôi sinh dưỡng Ưu điểm: Nhân số lượng cây nhiều hơn Tỉ lệ biến dị nhiều → Tạo nhiều cây con không giống nhau → Tạo được giống mới Hai mục đích lưu ý khi nuôi cấy mô 2. Tạo cây con không giống cây mẹ Vấn đề 8: CẤY CHUYỀN Lý do cấy chuyền Phương pháp I. Lý do cấy chuyền Sau một thời gian cấy dài ngày: Mẫu cấy tăng kích thước chồi, tăng sinh khối (sẹo) → Chiếm ưu thế thể tích bình nuôi cấy. Sự thoát hơi nước → Môi trường khô → Tăng nồng độ muối môi trường. Thiếu Oxygen cho mô. Giảm pH môi trường. Sự biến dưỡng của mô bị biến đổi → Thành lập các chất độc → Ức chế sự tăng trưởng và phân chia tế bào. II. Phương pháp 6 – 8 tuần cấy chuyền 1 lần. Với mục đích giữ giống: Không được cấy chuyền nhiều lần trong thời gian dài (vì số lần cấy chuyền tỉ lệ thuận với sự biến dị). Tạo mô sẹo, có sự thay đổi bộ NST tạo cây đột biến. Mẫu cấy có biểu hiện không mong muốn phải lập tức cấy sang môi trường khác. Vấn đề 9: CÁC CHẤT ỨC CHẾ, SỰ NHIỄM TRÙNG VÀ PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ Sư hóa nâu, hóa đen Sự hóa thủy tinh thể Sự nhiễm trùng I. Sự hóa nâu, hóa đen Nguyên nhân: Do vài loại mô tiết vào môi trường các chất tự ức chế sự biến dưỡng của tế bào như phenol… → Ngoài ánh sáng, oxid hóa → Nâu, đen Chất chống oxid hóa như PVP, acid scorbic, acid citric, cystein… Giảm muối khoáng môi trường Cấy chuyền liên tục đến khi môi trường không còn nâu Cho than hoạt tính vào môi trường để hấp thu các chất độc… I. Sự hóa nâu, hóa đen Biện pháp xử lý II. Sự hóa thủy tinh thể Hiện tượng: Mẫu cấy mọng nước, trong suốt, mềm Nguyên nhân: Môi trường: Hàm lượng cytokinin quá cao → Ức chế sự tổng hợp lignin và cellulose → Vách tế bào mềm. Môi trường lỏng hoặc nồng độ agar thấp, độ ẩm cao và NO3-/NH4+ thấp Nội tại: Sự sản xuất ra ethylen trong nuôi cấy → Giảm sự phân hóa mô mộc và tổng hợp cellulose Tăng nồng độ agar Giữ nước Giảm cytokinin hoặc cho thêm than hoạt tính → Hấp thu cytokinin Thay đổi thành phần muối vô cơ trong môi trường II. Sự hóa thủy tinh thể Biện pháp xử lý III. Sự nhiễm trùng Nguyên nhân: Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối. Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử vi khuẩn. Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên môi trường. Chọn mẫu cấy khỏe mạnh, phát triển tốt, không sâu bệnh Thao tác khử trùng mẫu Hệ thống lọc khí của tủ cấy Người cấy Môi trường cấy Dụng cụ cấy III. Sự nhiễm trùng Biện pháp xử lý Thank You !