Một số kỹ thuật chẩn đoán vi khuẩn Leptospira

Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 1 Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ môn Công nghệ sinh học Lớp DH06SH Bài tiểu luận: MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LEPTOSPIRA Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Lý Sơn Tùng MSSV: 06126178 Thành phố Hồ Chí M Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 2 LỜI MỞ ĐẦU Vi sinh vật là tác nhân được rất nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu không chỉ trước đây, hiện tại mà còn trong cả tương lai. Điều này có lẽ là do ba lí do: thứ nhất là sự đa dạng của vi sinh vật, thứ hai là những lợi ích to lớn mà chúng mang lại cho con người trong nhiều lĩnh vực, và cuối cùng chúng cũng là những tác nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm cho con người và vật nuôi. Từ xưa con người đã biết sử dụng vi sinh vật trong việc lên men để tạo ra nhiều món ăn có giá trị dinh dưỡng cao, và sau này còn phát triển chúng trong nhiều lĩnh vực khác như phân vi sinh, probiotic, trong xử lí chất thải,…. Những ứng dụng to lớn của vi sinh vật là không thể phủ nhận, tuy nhiên, khả năng gây bệnh của vi sinh vật cũng là một vấn đề đáng quan tâm. Các tác nhân gây bệnh có thể là vi khuẩn, virus hay kí sinh trùng,…. Virus có lẽ là tác nhân nguy hiểm nhất và các tác nhân đều để lại những hậu quả nhất định trong công tác chăn nuôi và sức khỏe con người. Nhiều kỹ thuật đã ra đời, phát triển và không ngừng hoàn thiện để có thể đáp ứng yêu cầu chẩn đoán phát hiện các nhóm vi sinh vật gây bệnh này. Trong lĩnh vực chăn nuôi, các nhà khoa học đã chú ý đến một loại xoắn khuẩn là Leptospira. Xoắn khuẩn này có khả năng gây bệnh trên động vật và có thể lây sang người. Bệnh do xoắn khuẩn gây ra còn gọi là bệnh vàng da, nó gây ảnh hưởng đến các cơ quan và có thể gây sẩy thai ở thú nuôi. Cách phòng bệnh duy nhất là tiêu hủy ổ dịch để tránh lây nhiễm. Vì vậy, cần có các kỹ thuật để phát hiện nhanh xoắn khuẩn này để tránh lây lan gây thiệt hại lớn. Trước đây, cách phát hiện Leptospira là sử dụng phương pháp nuôi cấy, sau đó kỹ thuật Microscopic agglutination test (MAT) ra đời và được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh. Tiếp theo đó, khi khoa học phát triển, các kỹ thuật mới ra đời và được hy vọng là có thể khắc phục được nhược điểm của MAT và thay thế nó. Hai kỹ thuật được nhắc đến nhiều nhất là ELISA và khuếch đại gene PCR. Bài tiểu luận này sẽ giới thiệu qua về bệnh do xoắn khuẩn Leptospira và các kỹ thuật nuôi cấy, MAT, ELISA và PCR trong việc chẩn đoán Leptospira. Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 3 TỔNG QUAN I. Leptospira 1. Phân loại học Theo Noguchi, 1917: Giới: Monera Ngành: Spirochaetes Họ: Leptospiraceae Giống: Leptospira Các loài gồm có: L. alexanderi, L. biflexa, L. broomii, L. borgpetersenii, L. fainei, L. inadai, L. interrogans, L. kirschneri, L. licerasiae, L. meyeri, L. weilii, L. noguchii, L. santarosai, L. wolbachii, L. kmetyi, L. wolffii, L. genomospecies 1, L. genomospecies 3, L. genomospecies 4, L. genomospecies 5. Trong số đó, người ta phân ra thành các loài gây bệnh, không gây bệnh và loài trung gian. Các loài gây bệnh Leptospira interrogans Leptospira kirschneri Leptospira noguchii Leptospira alexanderi Leptospira weilii Leptospira genomospecies 1 Leptospira borgpetersenii Leptospira santarosai Leptospira kmetyi Các loài trung gian Leptospira inadai Leptospira fainei Leptospira broomii Leptospira licerasiae Leptospira wolffii Các loài không gây bệnh Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachii Leptospira genomospecies 3 Leptospira genomospecies 4 Leptospira genomospecies 5 Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 4 2. Đặc điểm sinh vật học Hình thể: rất mảnh, đường kính 0,1- 0,2µm, dài 5- 25µm, di động mạnh. Thường nhuộm theo phương pháp nhuộm thấm bạc Fontana-Tribondeau mới phát hiện được vi khuẩn, khi đó vi khuẩn nhìn thấy mảnh như sợi tóc, hai đầu cong như móc câu. Dưới kính hiển vi điện tử phóng đại khoảng x 10.000 lần mới thấy các vòng xoắn nhỏ, sát nhau. Tính chất nuôi cấy: đây là xoắn khuẩn duy nhất nuôi cấy được trong điều kiện hiếu khí. Thường nuôi trong môi trường lỏng có thêm huyết thanh động vật (thỏ) tươi (sản xuất theo Terskich hoặc Korthoff); pH 7.2- 7.5; nhiệt độ 28-300C và giàu oxy. Leptospira mọc chậm, sau 6- 10 ngày mới phát triển tốt (đặc điểm nuôi cấy là làm vẩn nhẹ môi trường như khói thuốc lá). Sức đề kháng: nói chung các Leptospira có sức đề kháng yếu, song cao hơn các xoắn khuẩn khác; chết nhanh trong môi trường acid. Leptospira có thể sống tự do ở trong đất, trong nước ngọt và trong môi trường mặn (sống được hàng tháng) nhưng có ánh sáng mặt trời thì nhanh chết. Cấu tạo kháng nguyên: dựa vào cấu trúc kháng nguyên mà phân loại thì Leptospira được chia ra làm 20 nhóm, mỗi nhóm có nhiều type huyết thanh. Ở Việt Nam thường gặp 12 type huyết thanh sau: L. australis L. canicola L. autumnalis L. grippothyphosa L. bataviae L. hebdomalis L. ictero- haemorrhagiae L. ponoma L. mitis L. saxkoebing L. poi L. sejroe 3. Khả năng gây bệnh Leptospira gây bệnh xoắn khuẩn, gọi là Leptospirosis. Xoắn khuẩn có trong các loại động vật (chuột, lợn, chó, sói, nhím). Súc vật thường không có triệu chứng bệnh. Người có thể bị lây trực tiếp qua da bị xây xát, qua niêm mạc mắt mũi miệng, bộ phận sinh dục khi tiếp xúc. Người cũng có thể bị lây gián tiếp qua môi trường (đất cát, nước, rau...) bị nhiễm xoắn khuẩn do nước tiểu súc vật thải ra. Đặc điểm chung của bệnh: có thương tổn ở gan hay thận và có biến chứng ở mắt, có thể gây sẩy thai ở động vật và người. Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 5 Bệnh phổ biến khắp thế giới, nhưng có nhiều hơn ở những vùng khí hậu nóng ẩm, đất kiềm và có nhiều mặt nước. Các bệnh lí: 1) Bệnh lí ở bò thường do L. pomona và L. grippotyphosa. Đã thấy nhiều con vật có kháng thể đặc hiệu và không phát bệnh lâm sàng. 2) Bệnh lí ở chó do L. icterohaemorrhagiae. Chuột là môi giới truyền bệnh; hoặc lây từ chó sang chó. 3) Bệnh lí ở lợn do L. pomona, và cũng do L. mitis và L. icterohaemorrhagiae. Bệnh ở lợn thường tiềm ẩn, hoặc phát dưới thể giảm nhẹ. 4) Bệnh lí ở ngựa do L. grippotyphosa, L. pomona, L. canicola. 5) Bệnh lí ở người do nhiều type như L. icterohaemorrhagiae, L. grippotyphosa, L. canicola, L. pomona gây ra (bệnh do L. pomona là tip Leptospira phổ biến ở lợn gây ra). Ổ chứa bệnh thường xuyên là các loài gậm nhấm (như chuột), chúng luôn đào thải Leptospira. Ổ chứa bệnh không thường xuyên là gia súc, trâu bò, ngựa,…. Về lâm sàng, thấy những biến loạn nặng ở màng não, ở gan, thận, và sốt cao. Leptospira vào cơ thể gây bệnh và diễn biến qua 2 giai đoạn: - Giai đoạn I: sốt cao đột ngột sau thời gian ủ bệnh 1-2 tuần, khi đó trong máu có nhiều vi khuẩn, sốt thường kéo dài từ 3 đến 8 ngày. - Giai đoạn II: sốt trở lại do các cơ quan, nhất là gan và thận bị tổn thương (biểu hiện trên lâm sàng là vàng da, xuất hiện albumin niệu); có thể có hội chứng màng não do thần kinh trung ương bị tổn thương; các mao mạch dãn (có thể xuất huyết) và đau cơ. Xoắn khuẩn nằm lại thận và được đào thải theo nước tiểu ra ngoài. Cơ chế sinh bệnh: Sau khi xâm nhiễm, Leptospira trong máu nhân lên mạnh mẽ và gây bại huyết sau đó chúng đến định vị ở những cơ quan ưa thích, nhất là gan, thận. Leptospira trong giai đoạn bại huyết có thể đến cơ quan sinh dục gây xáo trộn sinh sản. 4. Đặc điểm bệnh Leptospirosis trên động vật và người Chuột là môi giới truyền bệnh chính cho các loài động vật khác và người, đặc biệt là chuột lang. Ngoài ra có thể nhiễm do nguồn nước hoặc thức ăn. a. Bệnh Leptospirose trên chó (thường xảy ra trên chó đực) (21) Dạng cấp tính: Bại huyết phát triển nhanh sau vài giờ nhiễm, sốt cao 40-410C và suy nhược nặng. Có thể chia làm 2 thể: Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 6 - Thể thương hàn: biểu hiện xuất huyết trầm trọng viêm kết mạc mắt với nhũng điểm xuất huyết ở da và niêm mạc, ói ra máu và phân sậm màu có máu, thú bị mất nước rất nhanh và chết trong 24 ngày cùng với giảm thấp thân nhiệt, thường thấp hơn bình thường. - Thể hoàng đản : Chó bệnh có biểu hiện viêm kết mạc mắt, hoàng đản, vàng da khó thở tăng dần cùng với kém ăn, ói mửa, nếu không chữa trị trong giai đoạn cuối chó có sự tăng cao nhiệt độ khó thở, hơi thở hôi. Tiêu chảy đôi khi xuất huyết và những biểu hiện viêm não trước khi hắt hơi, thú chết trong khoảng 5-8 ngày mắc bệnh. Hình 1. Chó bị tiêu chảy ra máu Thể bán cấp tính và mãn tính: - Thể này tương ứng với sự phát triển hội chứng sinh urea huyết hậu quả của viêm thận mà một trong những biểu hiện là chứng tiểu nhiều, chứng khát nước rất nhiều cùng với ói mửa và tiêu chảy. Sau một thời gian hôn mê do urea huyết chó sẽ chết. - Thể thở khó có mùi urea ở miệng và xáo trộn hô hấp –viêm màng móng mắt, viêm cơ…. b. Bệnh lợn nghệ (24) Thể á lâm sàng: biểu hiện triệu chứng lâm sàng ít thấy nhưng khi xét nghiệm huyết thanh học thì phổ biến, có khi bị cả đàn nhất là lợn vỗ béo và lợn hậu bị. Thể cấp tính: lúc đầu lợn bỏ ăn, nằm một chỗ, sốt 40 – 40,5oC, ỉa chảy nhưng không có triệu chứng của vàng da hay đái ra máu. Sau đó xuất hiện triệu chứng điển hình nặng của vàng da, đái ra máu, xuất huyết và triệu chứng thần kinh quỵ nửa thân sau, viêm màng não, phù đầu rất nặng, tỷ lệ chết cao. Thể rối loạn sinh sản cho thấy lợn bị sẩy thai, hay chết lưu thai, tỷ lệ con sơ sinh chết cao cùng với sốt, mất sữa và vàng da ở lợn nái. Sẩy thai sau khi nhiễm vi khuẩn 4 – 7 ngày. c. Bệnh trên bò (20) Thể cấp tính: Bò thường có vẻ yếu và sốt 40 – 410C, uể oải, biếng ăn, sản lượng sữa giảm đột ngột và thường có xuất huyết dưới niêm mạc. Lông thú xù xì không bóng mượt, mắt lờ đờ, mệt. Niêm mạc, da vàng sẩm và tiểu ra huyết sắc tố. Trong vài trường hợp có viêm khớp hoặc viêm da hoại tử có khi viêm não, có thể sảy thai ở bò cái. Thể nhẹ: Sốt khoảng 39 – 400C, giảm sản lượng sữa, biếng ăn, vàng ở da, niêm mạc, nhịp tim tăng, nước tiểu màu. Ở mi mắt, môi, dưới hàm… có hiện tượng phù thủng. Con cái dễ bị xảy thai sau khi nhiễm khoảng 1 tháng. Nếu không được chăm sóc tốt thú có thể chết do hiện tượng thiếu máu. Thể mãn tính: thường xảy ra, ít thấy triệu chứng, triệu chứng hay gặp là ỉa chảy, nước tiểu vàng hay sẫm, gây sẩy thai ở thú cái hoặc đẻ con ra yếu ớt, đẻ non hoặc có thể gây không thụ thai. Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 7 Nơi chứa nhiều vi khuẩn là thận và đường sinh dục (của đực và cái). Thú bệnh thể mãn có thể thành con mang trùng suốt đời, và bài trùng qa nước tiểu, dịch âm đạo. d. Bệnh trên người Thông tư của liên bộ y tế, bộ lao động – thương binh và xã hội, tổng liên đoàn lao động Việt Nam số 29/TT-LB (25/12/1991) đã xếp bệnh do Leptospira nghề nghiệp gây ra được bảo hiểm (18). Những công việc có thể gây bệnh: - Công việc trong các hầm mỏ, hầm hào, hang hố, cống rãnh. - Công việc trong lò sát sinh, đặc biệt là những người giết, mổ súc vật... - Công việc trong các nhà máy sản xuất thịt, cá hộp, chế biến sữa và phomát. - Công việc phải tiếp xúc với súc vật như: chăn nuôi, thú y. - Công việc trong các nhà máy sản xuất bia, rượu. - Công việc trong các hàng thịt, hàng cá. - Công việc ở vùng đầm lầy, suối, ruộng, ao hồ. - Công việc trong ngành lâm nghiệp: đào mương, kênh, làm thuỷ lợi. Các nguồn lây bệnh cho người (19) Về lâm sàng, bệnh có thể chia thành 2 thể (23): Thể vàng da xuất huyết: Đây là thể nặng với các biểu hiện: sốt dao động, da sung huyết, mắt đỏ ngầu, đau cơ nặng (chủ yếu ở cơ bắp khi co bóp). Có ban xuất huyết thưa ở lưng và ngực (vào ngày thứ 6 hay thứ 7), thiếu máu huyết tán. Vàng da và niêm mạc. Một số người bị sưng đau gan. Đa số người tiểu ít hay vô niệu. Có thể có các biến chứng: viêm màng não thanh dịch, suy thận cấp, xuất huyết đường tiêu hóa hoặc hô hấp, viêm cơ tim, rối loạn ý thức , bị sảy thai... Tỷ lệ tử vong thể này cao từ 5 – 10%. Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 8 Thể không vàng da: Là thể nhẹ hơn với các biểu hiện: sốt dao động, da sung huyết, mắt đỏ ngầu, đau cơ nặng (chủ yếu ở cơ bắp chân, khi co bóp). Một số người có hạch sưng, đau, không nóng đỏ. Hội chứng vàng da và hội chứng gan không rõ. Thể này không có tử vong. 5. Phòng và chữa bệnh do Leptospira (19) Phòng bệnh: Phòng bệnh không đặc hiệu bằng cách cắt đứt dây chuyền dịch tễ như diệt chuột, phòng bệnh cho gia súc nhưng chủ yếu là phòng hộ lao động cho những đối tượng thường phải tiếp xúc với nguồn lây, các đối tượng nguy cơ như các công nhân làm việc tại các trại gia súc, công nhân vệ sinh cầu cống, làm việc trong hầm mỏ, ... Nói chung, để có được hiệu quả thì cần triển khai nhiều khâu với sự phối hợp đa ngành chức năng mới được; Phòng bệnh đặc hiệu bằng vaccin chết, song chỉ cho các đối tượng phải tiếp xúc với nguồn lây. Vấn đề phòng bệnh dựa trên nguyên tắc an toàn vệ sinh lao động bằng các biện pháp đơn giản như mang giày cổ cao khi lội ruộng, bùn sình. Mang thêm găng tay khi phải dùng đến tay để thao tác. Diệt chuột, vệ sinh sạch sẽ chất thải của các loại thú nuôi. Không được sử dụng nước hoặc tắm gội tại các vùng nghi ô nhiễm Leptospira. Chữa bệnh: Sử dụng kháng sinh đặc trị để điều trị Leptospira. Kháng sinh cần được điều trị sớm, đúng kháng sinh nhạy cảm với vi khuẩn và đúng liều lượng. II. Các kỹ thuật phát hiện Leptospira 1. Nuôi cấy Leptospira a. Quy trình thực hiện Lấy mẫu: Tuỳ theo từng thời kỳ hoặc giai đoạn bệnh mà có cách lấy bệnh phẩm và chẩn đoán thích hợp: • Giai đoạn I: lấy máu đem nuôi cấy hoặc tiêm truyền vào chuột lang, sau đó xác định và định danh vi khuẩn. • Giai đoạn II: Có thể lấy nước tiểu bệnh nhân, ly tâm, tiêm vào phúc mạc chuột lang non rồi lấy máu tim chuột nuôi cấy tìm vi khuẩn. Nuôi cấy (2, 11): • Môi trường: môi trường Ellinghausen, McCullough, Johnson, and Harris – EMJH có bổ sung 3% huyết thanh thỏ và 0.1% agarose trong một ống 5ml. Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 9 • Tiêm vào 2 ống môi trường nuôi cấy Leptospira: 1 ống nhận 2 giọt whole blood (máu không bị biến đổi ngoại trừ bổ sung chất chống đông tụ anticoagulant), còn ống 2 là 5 giọt. • Một mẫu xét nghiệm huyết thanh cho phép việc khảo sát huyết thanh học chống lại các kháng thể Leptospira. • Chú ý không làm lạnh mẫu xét nghiệm. Mẫu xét nghiệm phải được thực hiện và vận chuyển ở xung quanh nhiệt độ khoảng 130C. Giữ mẫu qua đêm ở 20C sẽ giết chết Leptospira. • Nếu môi trường nuôi cấy đã được giữ lạnh cần ủ môi trường cho tới nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. • Mẫu xét nghiệm tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (tia cực tím có thể phá hủy các mô). b. Kết quả Một thí nghiệm nhằm tối ưu hóa việc nuôi cấy Leptospira đã sử dụng bốn loại phương pháp lấy mẫu khác nhau. Đó là: whole blood, surface plasma (huyết tương bề mặt), deposit from spun plasma và clotted blood (máu ngưng đọng lại) (2). Kết quả thí nghiệm cho bởi bảng sau (2): Kết quả cho thấy sử dụng whole blood vẫn cho tỉ lệ phát hiện cao (81.3%). Tuy nhiên, đối với Leptospira trong máu thường chỉ tồn tại 7-15 ngày nên việc lấy mẫu máu tốt nhất cho nuôi cấy là vào khoảng ngày thứ 5 khi nhiễm bệnh. Kết quả nuôi cấy Leptospira tại Leptospira Research Laboratory (26) Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 10 c. Nhận xét Ưu điểm: thường sử dụng trong công tác nghiên cứu bệnh học phòng thí nghiệm. Nhược điểm: • Mất thời gian (khoảng 20 – 30 ngày để nhận kết quả dương tính). • Độ nhạy thấp, khả năng thành công không cao khi nuôi cấy. Sau ngày nhiễm bệnh thứ 14, hiếm khi thu được khuẩn lạc. • Có thể gây nhiễm cho người thí nghiệm. • Thường không sử dụng trong xét nghiệm bệnh. 2. Kỹ thuật Microscopic agglutination test (MAT) Được mô tả bởi Galton et al. (1965) và được sửa đổi bởi Cole et al. (1973) Kỹ thuật MAT là một phép kiểm tra đã được chứng minh và chấp nhận trong việc chuẩn đoán, phát hiện kháng thể Leptospira trong huyết thanh động vật và người. Hiện nay, đây là kỹ thuật được sử dụng thông dụng nhất trong chuẩn đoán bệnh Leptospirosis. Nguyên tắc chung: Sự ngưng kết được đọc trực tiếp dưới kính hiển vi nền tối (3). a. Quy trình thực hiện (được cho bởi Cole et al – 1973)(4) • Thiết bị chuẩn độ (microtiter equipment) gồm: đĩa vi chuẩn độ (microtitration plate), đĩa truyền (transfer plates), khay đựng đĩa truyền (transfer plate holder), nắp khay đựng (transfer plate lids), đĩa đỡ (base plate), dụng cụ làm loãng mẫu độ chính xác đến 0.025 ml, 2 vật kính. • Kháng nguyên là Leptospira sống (chứa 108 Leptospires/ml) được nuôi cấy trong 4 – 8 ngày ở môi trường nuôi cấy thích hợp . Hình ảnh dụng cụ của kỹ thuật MAT (3) Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 11 Hình ảnh đĩa đỡ chứa đĩa truyền và 2 vật kính kính hiển vi (3) • Mẫu huyết thanh lấy từ gia súc được pha loãng ban đầu (1/25) với phosphate buffer saline (PBS) pH 7.2 trên đĩa vi chuẩn độ tạo thành dịch pha loãng huyết thanh. • Khoảng 25µl PBS được đặt vào từng cái giếng của đĩa và một lượng dịch pha loãng huyết thanh đồng đều nhau được cho vào hàng đầu tiên (qui ước là hàng A) của đĩa. • Dịch pha loãng huyết thanh (1/50) được pha loãng dần (2 lần) từ hàng A đến hàng H của đĩa • Sau đó, 25µl kháng nguyên sống được thêm vào mỗi giếng. • Đĩa được lắc nhẹ 15 – 20s để trộn đều các thành phần, rồi được che lại bằng nắp đậy để tránh các vật lạ và ngăn sự bay hơi. Sau đó ủ đĩa ở nhiệt độ 320C – 370C. • Kết quả đọc từ đĩa truyền một giọt từ mỗi giếng trên vật kính kính hiển vi. − Phương pháp thông dụng (Cole et al – 1973): Dịch pha loãng huyết thanh của hỗn hợp kháng nguyên/ huyết thanh ở đĩa chuẩn độ và truyền được chuyển lên vật kính bằng pipette (3). − Phương pháp cải tiến (Philip L. Carter và Terence J. Ryan – 1975): Đặt các đĩa truyền, đĩa chứa mẫu, vật kính lên đĩa đỡ. Các giọt mẫu chảy xuyên qua đĩa truyền lên 2 vật kính. Sau đó, vật kính sẽ được lấy ra khỏi đĩa đỡ, tránh làm nghiêng khiến các giọt hòa vào nhau (3). • Đọc kết quả dưới kính hiển vi (X200), khô, với tụ sáng là tối (4). b. Kết quả Kết quả dương tính khi 50% kháng nguyên hay hơn có phản ứng ngưng kết. Điểm cuối chuẩn độ xác định bởi giếng cuối cùng mà 50% kháng nguyên hay hơn có phản ứng ngưng kết quan sát thấy (4). Sự ngưng kết ở phương pháp thông thường và phương pháp cải tiến thu được là như nhau (3). Phương pháp cải tiến được đề nghị sử dụng và thay thế phương pháp thông dụng (1975) do khi sử dụng phương pháp này không có sự mất mẫu khi chảy qua các lỗ ở đĩa chuyển. Trong khi đó, sử dụng pipette thường có sự rò rỉ của mẫu vì không hút được toàn bộ dịch mẫu (3). Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 12 c. Nhận xét Đây là kỹ thuật đã được sử dụng từ lâu trong việc chẩn đoán Leptospira. Nó được dụng rộng rãi trong nhiều nước (theo Thiermann và Garrett, 1983; Ellis, 1986), đặc biệt là trong các phòng thí nghiệm. Ưu điểm: • Đơn giản. • Tiết kiệm thời gian hơn so với nuôi cấy tế bào. • Thích hợp cho kiểm tra bệnh ở một nhóm hoặc đàn gia súc (ít nhất là 30 con hoặc 10% số con trong một đàn lớn) với nhiều lứa tuổi khác nhau. Nhược điểm: • Vẫn mất khá nhiều thời gian. • Cần lượng mẫu lớn. • Không phân biệt được độ chuẩn sau khi tiêm vaccin và độ chuẩn sau khi nhiễm trùng tự nhiên khi chuẩn độ là của cùng một lượng giống nhau. • Có thể cảy ra các phản ứng chéo giữa các nhóm huyết thanh giống nhau. Ví dụ: sự nhiễm trùng bởi L. balcanica (Mackintosh et al., 1981) và L. medanensis có thể tạo ra những phản ứng L. hardjo dương tính giả. 3. Kỹ thuật indirect Enzyme-Linked-Immunosorbent Serologic Assay (ELISA gián tiếp) Đây là kỹ thuật được kiến nghị thay thế cho phương pháp MAT. Ngoài chẩn đoán thông thường, nó còn có thể thực hiện các test nhanh để phát hiện Leptospira. Nguyên tắc chung (1): các kháng nguyên đã biết được gắn lên các giá thể, dung dịch mẫu chuẩn và đối chứng được cho vào các giếng, ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian xác định (tùy theo bộ KIT của nhà sản xuất), sau đó mẫu ủ được rửa và cho tác dụng với kháng kháng thể có gắn enzyme, lại ủ mẫu trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định, rửa mẫu và cuối cùng cơ chất tương ứng với enzyme được cho vào mẫu. Phản ứng giữa enzyme và cơ chất tương ứng nếu xảy ra Darkfield microscopy of leptospiral microscopic agglutination test. (This image is in the public domain and thus free of any copyright restrictions. Courtesy of the Centers for Disease Control/Mrs. M. Gatton) (27) Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 13 sẽ tạo màu và cường độ màu tỉ lệ thuận với lượng kháng thể có trong mẫu đặc hiệu với kháng nguyên đã biết. a. Quy trình thực hiện Có nhiều kỹ thuật ELISA khác nhau được sử dụng trong chẩn đoán Leptospira. Đây là quy trình thực hiện được đưa ra bởi WJ Terpstra et al (1980) và El Jalii et al (2002) (4). • Phản ứng ELISA thực hiện trên một đĩa vi chuẩn (đĩa ELISA) thường gồm 96 giếng đồng đều nhau. • Kháng nguyên sử dụng trong ELISA là kháng nguyên đặc trưng cho loài (lipopolysaccharide) thu từ nuôi cấy Leptospira đã đun sôi (đã giết chết Leptospira). • Chuẩn bị đối chứng là mẫu huyết thanh đã biết dương tính (lấy từ gia súc hoặc người bị bệnh) và âm tính (lấy từ ngân hàng máu). • Chuẩn bị mẫu huyết thanh từ động vật hay người nghi nhiễm. • Đầu tiên ta phủ một lớp khoảng 100µl kháng nguyên (đã được pha loãng khoảng 1/1600 trong chất đệm (buffer) carbonate/bicarbonate pH 9.6) vào các giếng, sau đó đem ủ ở 40C qua đêm (cũng có thể tiến hành ở 370C trong 1 giờ). • Sau đó tiến hành rửa 4 lần với buffer rửa có chứa 0.05% Tween 20 trong PBS pH 7.0. • Tiếp theo, thêm vào các giếng 100µl BSA/PBS để ngăn các kết dính không đặc hiệu, rồi tiến hành ủ 2 giờ ở 370C. • Sau khi rửa 4 lần đĩa ELISA, 100µl dung dịch mẫu chẩn đoán và đối chứng đã chuẩn bị được thêm vào các giếng, ủ 370C trong 1 giờ. • Rửa đĩa 4 lần, và thêm vào 100µl kháng kháng thể có gắn enzyme (thường là peroxidase) vào từng giếng. Enzyme có thể gắn với IgG hay IgM trong PBS Tween 20, sau đó ủ 370C trong 1 giờ. • Rửa đĩa 4 lần, thêm vào 100µl dung dịch nền vào mỗi giếng (theo thí nghiệm này là 2,2- azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) và hydrogen peroxide trong chất đệm citrate pH 4.0). • Tiến hành ủ trong tối ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. • Kết quả được đọc nhờ máy đo quang phổ ở bước sóng 405nm. b. Kết quả ELISA cho kết quả dương tính khi mật độ quang (OD) đọc được của mẫu cao hơn mật độ quang đọc được của đối chứng âm cộng với sai số cơ bản (4) Cũng có thể dựa vào tỉ số S/P (Sample value related to Positive Control value) để đọc kết quả: S/P = Kết quả: (10) - Âm tính: huyết thanh ≤ 0.05, sữa ≤ 0.03 - Nghi ngờ: 0.05 < huyết thanh ≤ 0.12, 0.03 < sữa ≤ 0.10 - Dương tính: huyết thanh > 0.12, sữa > 0.10 Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 14 Hiện nay, trong chuẩn đoán bệnh Leptospirosis, người ta thường sử dụng kỹ thuật IgM hay IgG ELISA, kỹ thuật dot – ELISA với bộ KIT (Ví dụ: bộ KIT Panbio của Ustralia có thể sử dụng cho cả kỹ thuật ELISA và Dip – S – TickTM (dot – ELISA)) được thiết kế phù hợp. ELISA sử dụng bộ KIT được ứng dụng trong chẩn đoán nhanh các bệnh Leptospirosis. Sau đây là bảng kết quả so sánh giữa ELISA và dot-ELISA khi sử dụng bộ KIT Panbio (7): c. Nhận xét Ưu điểm: • Phương pháp bán tự động, dễ thực hiện và dễ theo dõi kết quả. • Có thể sử dụng bộ KIT để chuẩn đoán nhanh, cùng lúc có thể thực hiện được nhiều test trên mỗi KIT. • Có khả năng phát hiện sớm hơn các phương pháp đã nêu trước đó. • Độ nhạy, độ đặc hiệu cao (theo bảng trên), độ chính xác cũng tương đối cao. • Sử dụng kháng nguyên đã được giết nên không gây nhiễm cho người trong quá trình thao tác. Nhược điểm: • Cần thời gian để kháng thể xuất hiện. • Có khi cần thực hiện xét nghiệm 2 lần liên tiếp. Sử dụng IgM ELISA chỉ cần xét nghiệm 1 lần (1). • Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hay dương tính giả (1). 4. Kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR) Kỹ thuật khuếch đại gene (PCR) được Kary Mullis (giải Nobel năm 1993) phát minh trong những năm 1980. Kỹ thuật này có thể xem là một kỹ thuật phòng thí nghiệm khá đơn giản (1). Phản ứng xảy ra tạo màu (26) Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 15 Nguyên tắc chung (1): được thực hiện dựa trên cơ sở đặc điểm của sự hồi tính, biến tính và kéo dài chuỗi DNA trong điều kiện nhiệt độ và chất xúc tác thích hợp. • Giai đoạn 1: biến tính chuỗi DNA ở nhiệt độ 950C trong 5 phút. • Giai đoạn 2: nhân bản gene với khoảng 20 – 30 chu kì. • Giai đoạn 3: hoàn thành ở 720C trong 5 – 10 phút. Mỗi chu kì gồm 3 bước: biến tính DNA (950C trong 30 giây đến 1 phút), bắt cặp của đoạn mồi với DNA khuôn mẫu (30 – 650C trong 30 – 45 giây), kéo dài chuỗi DNA (65 – 720C trong 1 – 2 phút). a. Quy trình thực hiện • Tách chiết DNA: thường từ tế bào mô thận, máu hay nước tiểu động vật và người. • PCR thực hiện với cặp primer (mồi) được thiết kế đặc biệt cho việc phát hiện DNA Leptospira. • Hỗn hợp phản ứng bao gồm Tris-HCl, các loại deoxynucleoside triphosphates (dNTP), primers, DNA mẫu với MgCl và DNA polymerase (Taq polymerase). • Thời gian thực hiện PCR đối với Leptospira thường là 35 chu kì. Tổng thời gian chạy PCR thường khoảng 30 phút. • Sản phẩm PCR thu được đem đi diện di trên gel agarose. • Đọc kết quả điện di. b. Kết quả Dưới đây là một số hình ảnh về kết quả điện di sản phẩm PCR: Kết quả PCR từ mẫu nước tiểu của heo (13): 1. L.pomoma 2. L.grippothiphosa 3 . L.ballum 4. E.coli 5. B. melitensis 6. S. aureus 7. L. patoc 8. S. abortus ovis 9. M. bovis 10. L. infantum K-no DNA tamplate M-thang 100bp Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 16 c. Nhận xét Hiện nay, phương pháp PCR được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm, giải mã di truyền, nghiên cứu sự tiến hóa của sinh vật ở mức độ phân tử,…. Kỹ thuật PCR được ứng dụng trong test nhanh bệnh Leptospirosis. Nhiều bộ KIT đã được sản xuất để phục vụ tốt hơn cho kỹ thuật này (Ví dụ: Fast DNA Kit từ Q BIO GENE (13)). Kết quả PCR từ mẫu nước tiểu của người (14): 1. L. interrogans (đối chứng dương) 2 và 14. Markers phân tử đánh dấu DIG 3 đến 10. Mẫu nước tiểu từ người bệnh. 11 đến 13. Mẫu nước tiểu người khỏe mạnh. Kết quả PCR từ tinh dịch bò (15): 1. Marker pGem 2. Đối chứng từ bò không nhiễm 3. Đối chứng từ bò tiền nhiễm 4. Nhiễm ngày thứ 7 5. Nhiễm ngày thứ 10 6. Nhiễm ngày thứ 14 7. Nhiễm ngày thứ 21 8. Nhiễm ngày thứ 28 9. Nhiễm ngày thứ 35 10. Nhiễm ngày thứ 42 Kết quả PCR từ các mẫu từ khỉ (23): 1. Thang DNA 100pb 2. Nước tiểu 3. Thận 4. Thận (1:10) 5. Đối chứng dương 6. Đối chứng âm Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 17 Ưu điểm: • Đơn giản, nhanh, nhạy, đặc hiệu. • Chi phí thấp. Nhược điểm: • Có thể xảy ra hiện tượng dương tính giả. III. So sánh giữa các kỹ thuật Bệnh Leptospirosis có ảnh hưởng nguy hiểm đến người và vật nuôi, vì vậy rất nhiều người quan tâm đến nó. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm tìm phương pháp tốt nhất cho việc chẩn đoán xoắn khuẩn Leptospires. Các kỹ thuật thông dụng hiện nay là kỹ thuật MAT, ELISA và PCR. Kỹ thuật MAT đã được đưa ra, áp dụng từ 1965 và vẫn dùng cho đến ngày nay. Kỹ thuật ELISA và PCR ra đời sau MAT và có những ưu điểm nhất định trong việc chẩn đoán nhanh Leptospira. Hai kỹ thuật này đã ược nghiên cứu nhằm phát triển hoàn chỉnh nhất để thay thế cho MAT. Giữa ELISA và MAT, một thí nghiệm thực hiện bởi I.M. El Jalii (2008) trên 170 mẫu huyết thanh bò đã cho kết quả như sau (4): − 27.7% mẫu dương tính với MAT, trong khi với ELISA là 56.5%. − Tất cả các mẫu dương tính với MAT đều dương tính với ELISA. − Không có mẫu dương tính nào của MAT mà âm tính với ELISA. 28.8% dương tính với ELISA nhưng âm tính với MAT. Như vậy kỹ thuật ELISA nhạy hơn và phát hiện được nhóm huyết thanh Leptospira gây bệnh nhiều hơn kỹ thuật MAT. Thí nghiệm công bố năm 1998 của Eliete C. Romero và ctv (8) (mẫu từ dịch não tủy cerebrospinal fluid (CSF) của 103 bệnh nhân) so sánh ba kỹ thuật với nhau, cho kết quả như sau: Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 18 Như vậy độ nhạy của PCR cao hơn hẳn các kỹ thuật khác, tuy nhiên một số mẫu cho kết quả âm tính trong khi chúng có kết quả dương tính ở hai kỹ thuật còn lại. Cũng trong thí nghiệm này, kỹ thuật PCR được kết hợp thêm với lai phân tử (Hybridization) để làm tăng độ nhạy phát hiện của kỹ thuật PCR (8). Tóm lại, kỹ thuật PCR nhạy hơn nhiều so với kỹ thuật MAT và ELISA, và nó cũng thuận lợi hơn trong việc chẩn đoán nhanh Leptospira, tuy nhiên MAT, ELISA và nuôi cấy tế bào có vai trò quan trọng trong nghiên cứu ở phòng thí nghiệm. Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 19 KẾT LUẬN Như đã trình bày ở trên, Leptospira là một loại xoắn khuẩn gây bệnh gọi là Leptospirosis (hay bệnh vàng da). Nguồn lây bệnh cho người và vật nuôi chủ yếu là chuột, ngoài ra thường do tiếp xúc với đất cát hoặc nguồn nước có xoắn khuẩn. Cách phòng bệnh là tiêu hủy vật nuôi mang bệnh và có thể sử dụng kháng sinh thích hợp để chữa bệnh này. Các kỹ thuật chẩn đoán Leptospira đưa ra trong bài tiểu luận này gồm có nuôi cấy, MAT, ELISA và PCR. Cả bốn kỹ thuật đều có những ưu và nhược điểm của nó. Nhưng nhìn chung, kỹ thuật PCR là có nhiều ưu việt hơn ba kỹ thuật còn lại. Kỹ thuật nuôi cấy mất nhiều thời gian trong việc phát hiện nhưng nó lại có tầm quan trọng trong nghiên cứu bệnh học Leptospira. Kỹ thuật MAT đã được sử dụng rộng rãi từ lâu với độ nhạy khá cao nhưng nó không cho phép việc chẩn đoán nhanh. Kỹ thuật ELISA và PCR cho phép chẩn đoán nhanh bệnh Leptospirosis và có độ nhạy cao hơn hẳn so với MAT. Trong bốn kỹ thuật này thì nuôi cấy, MAT, ELISA hiếm khi xác định được mẫu dương tính khi mẫu lấy từ sau ngày 14 của quá trình nhiễm. Chỉ có kỹ thuật PCR cho kết quả tương đối với các mẫu này. Tuy nhiên, ngoài những ưu điểm vượt trội của mình thì PCR có nhược điểm là hiện tượng dương tính giả. Để khắc phục điều này có thể sử dụng các kỹ thuật PCR cải tiến đã và đang được phát triển hiện nay. Về so sánh các kỹ thuật thì PCR cho kết quả tốt nhất và nhanh nhất. Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Công nghệ sinh học trong thú y – Nguyễn Ngọc Hải, nhà xuất bản nông nghiệp. 2. Optimization of Culture of Leptospira from Humans with Leptospirosis - Vanaporn Wuthiekanun và ctv, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, tháng 4/2007, trang 1363 –1365. 3. New Microtechnique for the Leptospiral Microscopic Agglutination Test - Philip L. Carter và Terence J. Ryan, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, tháng 8/1975, trang 474 – 477. 4. Comparison between ELISA and the Microscopic Agglutination Test for the Diagnosis of Bovine Leptospirosis - I.M. El Jalii, Revue Élev. Méd. vét. Pays trop., 2008, số 61(2) trang 73-75. 5. Bayesian inference for within-herd prevalence of Leptospira interrogans serovar Hardjo using bulk milk antibody testing - FRASER I. LEWIS, GEORGE J. GUNN, Biostatistics Advance Access tháng 7/2009, trang 1 – 10. 6. ELISA for the detection of Human Leptospirosis – Ana Fuentes và ctv, Mem Inst Oswaldo Cruz, tháng 9/1994, số 89, trang 365. 7. Leptospirosis: diagnose with confidence – Panbio diagnostics, www.panbio.com 8. Detection of Leptospira DNA in Patients with Aseptic Meningitis by PCR - ELIETE C. ROMERO, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, tháng 5/1998, trang 1453–1455. 9. Two Test Strategy for the Diagnosis of Leptospirosis - Vaishali B Dohe và ctv, Bombay Hospital Journal, Vol. 51,(2009). 10. Linnodee Leptospira Hardjo ELISA – LINNODEE, www.linnodee.com 11. Handbook for the Collection, Storage and Transport of Pathology Specimens in Rural and Remote Queensland – Queensland Health, tháng 12/2007, mục 9.9 trang 38 – 39. 12. Pcr detection of Leptospira DNA in rodents and insectivores from Tanzania - G.F. Mgode và ctv, Belg. J. Zool, tháng 12/2005, 135 (phần bổ sung) : 17-19. 13. Polymerase chain reaction method for leptospirosis, analysis on samples from an autochthon swine population in Sicily, Italy - Dr. Maria Vitale và ctv, REV CUBANA MED TROP (2005), số 57(1): 25-27. 14. Detection of Leptospires in Urine by PCR for Early Diagnosis of Leptospirosis - A.E.Bal và ctv, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, tháng 8/1994, trang 1894-1898. 15. A Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Leptospira spp. in Bovine Semen - Saad A. Masri và ctv, Can J Vet Res (1997), số 61, trang 15-20. 16. Application of Polymerase Chain Reaction Assay in detection of Leptospira icterohaemorrhagiae in experimentally infected mice – O. Sharina và ctv, Journal of animal and veterinary Advances (2007), trang 1197 – 1198. 17. The development of a real-time PCR to detect pathogenic Leptospira species in kidney tissue - C. Fearnley và ctv, Research in Veterinary Science 85 (2008), trang 8–16. www.sciencedirect.com 18. THÔNG TƯ CỦA LIÊN BỘ Y TẾ , BỘ LAO ĐỘNG - THƯƠNG BINH VÀ X Ã HỘ I , TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM SỐ 29 /TT-LB NGÀY 25 THÁNG 12 NĂM 1991 BỔ SUNG MỘT SỐ BỆNH NGHỀ NGHIỆP. 19. CN. Nguyễn Thị Liên Hạnh, Ths.Bs. Huỳnh Hồng Quang (Tổng hợp) - qn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1066&ID=2240 tháng 12/2008. Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 21 20. 21. 22. Leptospira spp. detection by Polymerase Chain Reaction (PCR) in clinical samples of captive black-capped Capuchin monkey (Cebus apella) - Eliana Scarcelli, Brazilian Journal of Microbiology, tháng 6/2003. 23. thuc.html 24. Báo NNVN - Số ra ngày 12/3/2009 25. Two Methods for Rapid Serological Diagnosis of Acute Leptospirosis - Paul N. Levett và ctv, Clin Diagn Lab Immunol, tháng 3/2001, số 8(2), trang 349–351. 26. Leptospira Research Laboratory 27. Trang web www.google.com.vn với từ khóa: Leptospira, Leptospirosis, ELISA Leptospira, PCR Leptospira, Microscopic agglutination test, Leptospira blood culture để tìm một số hình ảnh và bài báo có liên quan Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 22 PHỤ LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU..................................................................................................................................... 3 TỔNG QUAN I. Leptospira ....................................................................................................................................... 4 1. Phân loại học .............................................................................................................................. 4 2. Đặc điểm sinh vật học ................................................................................................................ 5 3. Khả năng gây bệnh .................................................................................................................... 5 4. Đặc điểm bệnh Leptospira trên động vật và người ................................................................ 6 5. Phòng và chữa bệnh do Leptospira.......................................................................................... 9 II. Các kỹ thuật phát hiện Leptospira............................................................................................. 9 1. Nuôi cấy....................................................................................................................................... 9 2. Kỹ thuật Microscopic agglutination test (MAT)................................................................... 11 3. Kỹ thuật indirect Enzyme-Linked-Immunosorbent Serologic Assay (ELISA gián tiếp).. 13 4. Kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR) ........................................................................... 15 III. So sánh giữa các kỹ thuật ........................................................................................................ 18 KẾT LUẬN....................................................................................................................................... 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................................... 21 Chú thích: tài liệu tham khảo được đánh số và chú thích ngay sau mỗi phần trích dẫn.