Muôi cấy mô, tế bào thực vật, nuôi cấy tế bào trần

TIỂU LUẬN NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬTĐề tài: Nuôi cấy tế bào trần G/V hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh Nhóm thực hiện : Trần Thị Chiên Lê Thị Cẩm Lê Phan Thị Thanh Phạm Thu Trang Nguyễn Thị Tuyết Mở đầu Các tế bào thực vật có tính toàn năng,có thể nuôi cấy, điều khiển sự phát sinh hình thái của chúng cho tới thành một cây hoàn chỉnh. Có thể nói, nội dung bên trong vỏ tế bào trong đó vật chất chính là các thông tin di truyền chứa trong nhân của tế bào đã quyết định mọi đường hướng của quá trình thực hiện tính toàn năng của tế bào. Vì thế,hoàn toàn có thể nuôi cấy tạo cây hoàn chỉnh từ khối nguyên sinh chất chứa nhân của tế bào. Từ đấy đưa đến khái niệm nuôi cấy tế bào trần thực vật. Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm từ nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử, các bào quan và vi sinh vật. Protoplast 1.Khái niệm về Protoplast Protoplast là các tế bào trong đó có thành tế bào được loại bỏ và màng tế bào chất là lớp ngoài cùng nhất trong tế bào. Protoplast có thể thu được bằng enzyme lytic cụ thể để loại bỏ vách dung hợp. Tế bào trần có thể được tạo ra bằng nhiều cách: từ dịch huyền phù tế bào, tế bào mô sẹo hoặc từ mô tươi nguyên trạng như lá qua tác động của các enzym; Pectinase phân hủy pectin, cellulas phân hủy hemicellulose. Các tế bào trần nếu để trên môi trường dinh dưỡng thì sau 5-10 ngày sẽ tạo vách tế bào và phân chia.Các tế bào trần, thậm chí khác loài,có thể kết hợp với nhau tạo tế bào lai và quan trình này gọi là sự dung hợp tế bào trần. 2. Tại sao cần phải nuôi cấy tế bào trần ? Nuôi cấy tế bào trần sẽ mở ra 1 mô hình hấp dẫn để theo dõi quá trình sinh phôi từ 1 tế bào cô lập. Đặc biệt biết được sự sắp xếp các sợi Xenluloz để xác định hướng kéo dài tế bào, vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia. So với các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào khác, nuôi cấy dung hợp tế bào trần giúp tạo ra các cơ thể lai mang các đặc điểm di truyền của các bố mẹ có nguồn gen khác xa nhau mà lai hữu tính không thể thực hiện được. 3.So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy các tế bào vẫn còn thành tế bào: So với quy trình nuôi cấy mô tế bào bình thường thì nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu 1 số thay đổi do bản chất của tế bào trần. Các thay đổi thường liên quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào. Nuôi cấy tế bào trần có nhiều ưu thế hơn so với nuôi cấy các tế bào vẫn còn thành tế bào Ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy và tách tế bào trần là tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên một một đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 106 tế bào/ 1ml môi trường). Tế bào trần ở một số cây trồng có khả năng tái sinh rất mạnh, ví dụ tế bào mô thịt lá ở thuốc lá, cải dầu… Bằng thao tác di truyền ở tế bào trần có thể dễ dàng tạo ra các tế bào biến đổi gen. Tế bào với kiểu gen biến đổi sẽ được bảo tồn khi tái sinh tế bào thành cây hoàn chỉnh. Điều này rất khó thực hiện ở các tế bào vẫn còn thành tế bào. Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà trước kia thường bị vỏ tế bào ngăn cản. Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng dung hợp tế bào – gắn hai tế bào trần lại thành một tế bào với hai bộ thông tin di truyền của hai tế bào tạo nên một thể lai vô tính mà không cần hiểu biết chính xác về sự liên hệ giữa các gen, ít tốn kém, nhanh,trực tiếp và áp dụng các kĩ thuật chuyển gen( bơm AND, hóa thẩm, điện thẩm…)giúp loại trừ tính bất thụ hữu tính, tạo cây lai hữu thụ; Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện phức tạp. Tế bào lai thu được từ việc dung hợp hai tế bào trần được tái sinh và thành một cây lai. Quá trình này xảy ra ở tế bào nên gọi là lai tế bào và thông qua tế bào soma nên gọi là lai soma hay lai vô tính tế bào. Từ phương pháp này đẻ ra phương pháp lai xa giữa các loài- điều không thể thực hiện bằng phương pháp lai hữu tính thông thường. Tuy nhiên quá trình nuôi cấy protoplast còn tồn tại một số trở ngại đó là: Quá trình cô lập nuôi cấy phải hoàn thiện. Chưa có phương pháp hiệu quả để tuyển chọn các sản phẩm phù hợp. 4. Kĩ thuật tách tế bào trần: 4.1. Phương pháp cơ học: Phương pháp này dựa trên cơ sở phá các mối liên kết của mô bằng các dao sắc nhọn ( sharp-edged knife) và giải phóng các protoplast riêng rẽ. Phương pháp này cho hiệu suất thấp. 4.2. Phương pháp enzyme: Để phá vỡ thành tế bào người ta thường sử dụng các enzyme chiết xuất từ các sinh vật chứa nhiều enzyme phân giải thành vách tế bào như: nấm, ốc và mối. Các enzyme này đã được thương mại hóa theo các phương pháp khác nhau với mức độ tinh khiết khác nhau Hỗn hợp enzyme thường dùng là enzyme celluloza và macerozim được chiết xuất từ nấm Trichdearina virde và Aspergillus niger và đã được sản xuất công nghiệp. Nồng độ dung dịch enzyme sử dụng tùy thuộc đối tượng. Các hỗn hợp enzyme thường được sử dụng ở pH 5,5 – 5,8 trong 3-8h. Ngoài ra để protoplast không bị vỡ sau khi thành cellulose bị phân hủy người ta phải bổ sung những chất tăng áp lực thẩm thấu vào dung dịch enzyme để duy trì cân bằng thẩm thấu giữa nội bào và môi trường bên ngoài. Các dung dịch thường dùng là dung dịch đường manitol, sorbitol. Nồng độ sử dụng khoảng 0,3 – 0,7M tùy theo đối tượng thực vật. So với phương pháp cơ học thì phương pháp này có hiệu quả cao hơn rất nhiều. Phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast. Có thể thu được từ 1 gam lá cỏ luzec hoặc khoai tây là 6-12 triệu tế bào trần. Vì protoplast thực chất là tế bào trần không có thành cho nên có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây ( rễ, lá, hạt phấn), callus, tế bào đơn… Xác định chất lượng tế bào trần Sau khi phá vỏ tế bào vẫn có những mảnh thành tế bào còn xót lại làm ảnh hưởng đến những nghiên cứu sau này Cách tốt nhất để phát hiện thành tế bào là dùng calcofluor, một hóa chất sẽ bám vào phân tử xenlulozo và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang với màu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím. Nếu các tế bào trần đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào hiển vi trường có màu tối thẫm các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của các lạp thể Còn một phương pháp khác là dùng kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh Evan để xác định sức sống của tế bào trần. Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất ngược lại các tế bào có màng sinh chất bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được 5. Nuôi cấy tế bào trần Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy - Thành phần của môi trường nuôi cấy lỏng hay đặc tùy thuộc vào vật liệu thực vật.Môi trường này có thêm Auxin và Xitokinin để giúp sự tái tạo vách và các lần phân chia đầu tiên. - Đảm bảo đủ các yếu tố dinh dưỡng: axit amin, polyamin, Hydrolysat Cazein, nước dừa, mạch nha… - Đảm bảo điều kiện nhiệt độ, PH, ánh sáng,áp suát thẩm thấu…. - Trong lần tự nhân đôi đầu tiên, môi trường phải có áp suất thẩm thấu cao, Auxin, Xitikinin thích hợp, ánh sáng yếu. Sau đó cần giảm áp suất thẩm thấu bắng cách pha loãng môi trường để giúp cho sự tăng trưởng tế bào. Khi mô sẹo được hình thành cần chuyển chúng vào trong môi trường rắn chứa Auxin ở nồng độ thấp hơn và Xitokinin cao hơn. Sau cùng kích thích ra rễ cần loại Xitokinin, tăng nồng độ Auxin. Nuôi cấy tế bào trần chia làm 2 giai đoạn Giai đoạn 1 Từ tế bào trần tao thành tế bào, phân chia tạo thành microcallus. Sau một thời gian nuôi cấy một đến hai tuần các tế bào trần tái tạo vỏ và phân chia tạo nên các microcallus. Điều kiện nuôi cấy Nuôi trong môi trường lỏng lắc Lớp nuôi trợ dưỡng: tế bào trần, lớp xốp có khả năng thấm từ dưới lên, callus từ mô tế bào mà từ đó tách tế bào trần,agar. Nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu, nuôi tối. Ánh sáng thẩm thấu đẳng trương.Thời gian nuôi từ 1 đến 2 tuần. Giai đoạn 2 Microcallus thành callus ổn định hình thành phát sinh cơ quan. Chuyển các microcallus lên môi trường cứng, chúng sẽ tạo thành các mô sẹo. Từ đó chuyển sang môi trường tái sinh chồi và cây hoàn chỉnh. Điều kiện nuôi cấy. Nuôi cấy trên môi trường đặc Chú ý tới ánh sáng và quang chu kì Có chất điều tiết sinh trưởng cho qua trình tái sinh cây Loại bỏ chất gây ánh sáng thẩm thấu Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của tế bào trần Nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu 1 số thay đổi so với quy trình nuôi cấy mô bình thường do bản chất của tế bào trần. Các thay đổi thường liên quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào. 6. Dung hợp tế bào trần Dung hợp là hiện tượng cắt đứt màng sinh chất nơi tiếp xúc giữa 2 tế bào trần khác loài do tác động của các nhân tố bên ngoài. Sau đó là sự tái tổ chức các màng ban đầu thành 1 và bao lấy tế bào chất và 2 nhân cha mẹ.  Có thể nói việc dung hợp tế bào trần và tái sinh thành cây lai từ tế bào trần là 1 trong những thành tựu tuyệt vời của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào. Bằng phương pháp này đẻ ra phương pháp lai xa giữa các loài điều mà không thể thực hiện bằng các phương pháp lai hữu tính thông thường.Tế bào trần là những tế bào không có thành tế bào. Chính vì thế chúng có thể hòa lẫn vào nhau (dung hợp) và thành 1 tế bào lai mang trong mình vật chất di truyền của cả 2 tế bào. Tế bào lai này được tái sinh và thành 1 cây lai. Quá trình này xảy ra ở tế bào nên gọi là lai tế bào và thông qua tế bào soma nên gọi là lai soma hay lai vô tính tế bào Sơ đồ chọn lọc các thể lai soma bằng cách ứng dụng sự mẫn cảm khác nhau của các protoplast thịt lá đối với actinomycin D Có 2 phương pháp dung hợp tế bào trần:  + Dung hợp bằng hóa chất + Dung hợp bằng điện Dung hợp bằng hóa chất Xử lý bằng NaNO3 Năm 1970, Power và cộng sự đã dùng NaNO3 (0,25 M) kích thích dung hợp hai protoplast. Carlson và cộng sự (1972) cũng dùng phương pháp này để sản xuất cây lai soma đầu tiên (Nicotiana glauca × N. langsdorffii). Tuy nhiên, phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO3 không thích hợp với tế bào bị không bào hóa mạnh như protoplast từ nhu mô lá. Xử lý bằng PEG Thường sử dụng poly ethylenglycol(PEG 5-25%) là chất có tác dụng dính kết tế bào trần dể dung hợp chúng. Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm dung hợp. PEG có trọng lượng phân tử thấp (~ 100) không thể tạo ra một sự dính chặt chắc chắn, trong khi PEG trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu quả dung hợp cao hơn. Xử lý PEG cùng với pH/Ca2+ có hiệu quả tăng tần số dung hợp và khả năng sống của các protoplast. Quá trình dung hợp sẽ được cải thiện hơn nếu xảy ra trong môi trường kiềm (pH từ 8- 10) và khi có bổ sung CaCl2 (50-250 mM). Sau khi xử lý bằng tác nhân dung hợp, các protoplast được nuôi cấy theo phương thức chuẩn. PEG có 2 tác dụng: + Cung cấp một câu nối để Ca2+ có thể liên kết các bề mặt màng với nhau + Dẫn đến sự rối loạn tích điện bề mặt màng trong suốt quá trình rửa giải. Dung hợp tế bào trần bằng xử lí PEG Dung hợp bằng điện Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp bằng hóa chất. Điều quan trọng hơn cả là dung hợp bằng điện (electrofusion) không gây độc đối với tế bào như thường thấy ở các protoplast hoặc các thể dị nhân được xử lý bằng PEG. Người ta đã dùng các xung điện (electric pulses) để đưa trực tiếp DNA ngoại lai vào trong tế bào thực vật, kỹ thuật này đã làm tăng sự quan tâm về việc ứng dụng dung hợp bằng điện vào lĩnh vực di truyền tế bào soma. Cách tiến hành Đưa dung dịch hỗn hợp tế bào trần(2 bản cực được thiết kế trong các hộp dung hợp), các tế bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi nằm giữa 2 bản cực. Khi có 1 xung điện cao (750-1000V) trong 1 thời gian rất ngắn(1-200 mili giây) vùng tiếp xúc giữa 2 màng tế bào sẽ bị vỡ, 2 tế bào trần hòa nhập vào nhau-quá trình dung hợp sẽ xảy ra. 7. Triển vọng ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần và lai tế bào soma Mặc dù những khó khăn về mặt kĩ thuật đã làm hạn chế tiềm năng sử dụng tế bào trần tuy nhiên tế bào trần vẫn được ứng dụng trong một số lĩnh vực nghiên cứu: Sau khi loại bỏ thành tế bào và được nuôi cấy trên môi trường thích hợp những tế bào trần được tái tạo nhanh chóng thành tế bào mới và quá trình phát triển này đã đưa ra một hệ thông lý tưởng cho nghiên cứu sinh tổng hợp thành tế bào (Willison và Cocking, Grout 1973) Các tế bào trần có khả năng tiếp nhận các vật liệu từ bên ngoài đưa vào trong tế bào do đó tế bào trần là đối tượng thích hợp cho các nghiên cứu đưa nhân lạp thể, ti thể,DNA, Plasmit vào tế bào (Dodds và Bengochea 1985) Quần thể tế bào trần có thể được xem như một hệ thống tế bào đơn và bởi vậy các thao tác tương tự như đối với các vi sinh vật qua đó có thể lựa chọn dòng đột biến và tách dòng quần thể tế bào thực vật (Evans và Cocking 1977) Một số ứng dụng khác : Sản xuất các dòng bố mẹ phục vụ sản xuất hạt lai. Sản xuất các hợp chất thứ cấp qua nhân sinh khối tế bào trong môi trường lỏng (nuôi lắc, nuôi trong bioreactor). Công nghệ nuôi cấy tế bào trần ứng dụng cho những cây có giá trị kinh tế cao,nhưng khó nhân giống bằng phương pháp thông thường. Công nhệ này làm nhân nhanh giống và kết hợp làm sạch virus. Nghiên cứu tạo giống khoai tây kháng bệnh virus của GS.TS Nguyễn Quang Thạch trường ĐHNN Hà Nội. Bảo quản nguồn gen. . Nhờ kỹ thuật dung hợp người ta có thể lai tạo giữa hai loài thực vật khác nhau, thậm chí cả các loài thuộc những chi khác nhau. Điển hình nhất là việc dung hợp tế bào cây khoai tây với tế bào cây cà chua. Kết quả là tạo ra được cây lai Pô-ma-tô mà trên mặt đất cho quả cà chua còn dưới mặt đất cho củ khoai tây (!). Đây là sự dung hợp 2 tế bào trần khác loài tạo tế bào lai chứa bộ NST của 2 tế bào gốc. Tạo được cây lai từ tế bào khoai tây & cà chua.  Nuôi 2 dòng tế bào sinh dưỡng khác loài trong cùng 1 môi trường, có sự kết dính ngẫu nhiên của 2 hay 1 số tế bào khác loài của tế bào lai chứa bộ NST của 2 tế bào gốc Để tăng tỉ lệ kết dính; keo hữu cơ; xung điện cao áp.Dùng hócmôn kích thích tế bào lai phát triển thành cây lai. Với phương pháp này có thể tạo ra những cơ thể có nguồn gen khác xa nhau mà lai hữu tính không thực hiện được. Kỹ thuật dung hợp tế bào trần cho phép mở rộng nguồn gen của các loài thực vật tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt của cả bố và mẹ Nhiều cây lai được tạo ra bằng phương pháp dung hợp tế bào đã có được năng lực chống cỏ dại hoặc chống nấm bệnh. Tạo điều kiện thuận lợi cho sự nghiên cứu về sinh lí tế bào: tính thấm của màng, vận chuyển các chất hòa tan, ion, cơ chế hoạt động của hoocmon thực vật…Một ứng dụng đầy triển vọng khác của nuôi cấy tế bào trần là vi nhân giống thực vật. Sau khi phân chia protoplast, thành tế bào được tái sinh để tăng sự phát triển callus và tiếp theo là cây hoàn chỉnh nhờ đó thực vật có thể được nhân lên nhiều lần.  Nuôi cấy tế bào trần đòi hỏi sự sinh trưởng của protoplast trên môi trường đặc hoặc lỏng. Từ đó các protoplast được phân lập có thể được sự dụng để: Biến đổi thông tin di truyền của tế bào thực vật Tạo ra cây lai vô tính thông qua dung hợp tế bào trần Nghiên cứu sự xâm nhiễm của virus ở thực vật và những vấn đề khác. 8. Tồn tại của kỹ thuật protoplast Kỹ thuật protoplast đã thu được thành công ở các loài thuộc họ cà (Solanaceae) và một số họ khác, nhưng thành công ở họ hòa thảo (Poaceae) là họ của các cây trồng ngũ cốc chính còn rất hạn chế. Potrykus (1980) đã thảo luận rất kỹ về vấn đề này. Theo Potrykus có những chỉ tiêu sau liên quan đến kết quả nuôi cấy và tái sinh từ protoplast tiềm lực in vitro. 1. Phân lập - Cơ sở di truyền của tế bào (khả năng tiềm tàng của tế bào trong nuôi cấy in vitro). - Tương tác tế bào trong cây. - Sự phân hóa trong quá trình phát triển cơ thể. - Nguồn gốc cơ quan và cây hoàn chỉnh. - Trạng thái sinh lý của tế bào. - Tác động của quá trình phân lập. Tác động của trạng thái phân lập. 2. Điều kiện nuôi cấy - Nhu cầu dinh dưỡng. - Nhu cầu về phytohormone. - Điều kiện vật lý của nuôi cấy. - Các yếu tố ức chế có thể xuất hiện. - Tác động của mật độ quần thể tế bào 3. Sự phân bào - Sinh tổng hợp thành tế bào. - Điều khiển sinh tổng hợp thành tế bào. - Chức năng của thành tế bào đối với phân bào. - Điều khiển sự phản phân bào. - Điều khiển sự phân chia nhân. Điều khiển phân bào. 4. Sự phân hoá - Điều khiển phân hóa tế bào. - Tương tác tế bào trong nuôi cấy. - Điều khiển và cơ chế tạo kiểu mô. - Điều khiển quá trình tạo cơ quan, phôi. 9. Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy và dung hợp tế bào trần Quy trình nuôi cấy Protolast từ lá của cây thuốc lá. 9.1. Nguyên liệu thực vật Lá cây: Lá là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kĩ thuật protoplast thực vật do nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất. Phương pháp cơ bản để tách protoplast từ lá cây: Khử trùng mẫu lá. Ngâm mẫu lá trong dung dịch thẩm thấu để tế bào co nguyên sinh chất. Tách lớp mặt dưới lá. Ngâm mẫu trong hỗn hợp enzyme. Tinh sạch tế bào trần. Nuôi cấy tế bào trần trong môi trường thích hợp hoặc dung hợp hay chuyển nạp gene. Lá của cây thuốc lá in vitro được chọn dùng làm nguyên liệu tách protoplast. Sử dụng các lá được tách trong ngày. Các bước phân lập protoplast từ lá cây 9.2. Chuẩn bị môi trường Dung dịch enzyme tách protoplast: + Onozuka cellulase R10 0,5 % + Onozuka macerozyme R10 0,1 % + Mannitol 13,0 % + pH môi trường ~ 5,8 Dung dịch này được khử trùng bằng màng lọc Millipore loại có đường kính lỗ lọc 0,2-0,25 µm. 9.3. Tiến hành Ngày thứ nhất Các mẫu lá thuốc lá in vitro được loại bỏ hết gân lá và đặt lên đĩa petri thủy tinh vô trùng. Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá. Cho các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 ml bổ sung 10 ml dung dịch enzyme tách protoplast. Bọc cốc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn và đặt trong tối qua đêm trên máy lắc ở tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút). Ngày thứ hai Dùng micropipette chuyển dịch protoplast lên lưới lọc vô trùng (Φ = 65µm) đặt trong cốc loại 50 ml. Bổ sung thêm 3 ml dung dịch rửa (PI + 10% mannitol) vào cốc chứa các mảnh lá vụn, lắc mạnh, và lọc tiếp trên lưới lọc rồi chuyển vào hỗn hợp protoplast-enzyme của bước trên. Bổ sung thêm 2 ml dung dịch rửa để rửa proptoplast hết khỏi lưới lọc l. Chuyển hỗn hợp protoplast-enzyme (tổng cộng 15 ml) vào tube ly tâm loại 15 ml và ly tâm 50×g trong 10 phút. Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, tái huyền phù tiểu thể bằng 10ml dung dịch tách (PI + 20% sucrose), thêm 1ml dung dịch rửa lên trên bề mặt dung dịch tách và protoplast sao cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt nhất là tạo thành hai pha (nhỏ từ từ dung dịch rửa bên thành tube tránh bắn tung toé lên dịch rửa bên dưới), ly tâm 50×g trong 10 phút. Các protoplast sống sót sẽ nằm ở trên bề mặt dung dịch . Dùng micropipette hút lớp protplast màu xanh lục nổi trên tube ly tâm và chuyển nó sang một tube ly tâm sạch, thêm 10 ml dung dịch rửa và ly tâm lại. Protoplast sẽ lắng xuống đáy tube và có dạng viên. Rửa protoplast thêm một lần nữa trong 10 ml dung dịch rửa. Loại bỏ phần nổi trên mặt và tái huyền phù protoplast trong khoảng chừng 1 ml môi trường nuôi cấy protoplast (PC). Đặt một giọt protoplast trên buồng đếm hồng cầu và ước lượng mật độ protoplast (số lượng tế bào/số ô đếm ×10.000). Nuôi cấy protoplast bằng cách pha loãng 50.000 tế bào/ml môi trường nuôi cấy protoplast và chuyển sang một đĩa petri vô trùng. Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 28oC. Ngày thứ ba Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sáng yếu (10-20 µmol.sec/m2 hoặc bọc một lớp vải thưa dưới đèn hùynh quang ánh sáng trắng, với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ, nuôi trong 2 ngày. Ngày thứ năm Chuyển sang nuôi cấy ở cường độ ánh sáng cao hơn (50-75 µmol/sec/m2) trong 2 ngày bằng cách bỏ lớp vải thưa ra. Ngày thứ bảy Ta có được kết quả của việc nuôi cấy protoplast, số tế bào phân chia từ tổng số tế bào nuôi cấy ban đầu, trong một mẫu có 100-200 protoplast nuôi cấy. Có dấu hiệu của sự nhiễm bẩn không. KẾT LUẬN Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần đã bắt đầu được ứng dụng rộng rãi để tạo ra các cây trồng mới hoặc có sản lượng hay chất lượng cao hơn, hoặc là có thêm khả năng kháng bệnh. Việc giới thiệu về quy trình sử dụng enzyme để cô lập tế bào trần thực vật (Cooking 1960) đã đưa ra một bộ mặt mới đầy hứa hẹn cho tế bào thực vật và nuôi cấy mô, mở ra một lĩnh vực mới trong sinh học tế bào thực vật. Điều  làm cho tế bào trần có tác động mạnh như một hệ thống thí nghiệm đó là hệ enzyme phân hủy vách tế bào làm lộ ra bề mặt màng tế bào như là một rào cản giữa môi trường bên ngoài và thành phần bên trong tế bào. Sự tiếp cận đến màng sinh chất có ý nghĩa là thí nghiệm có thể được thiết lập để nghiên cứu và thao tác trên các thuộc tính của màng tế bào điều mà không thể thực hiện được khi bị bao phủ bởi vách tế bào. Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm từ nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất (Ruesink 1973) đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử (Willison et al. 1971), các bào quan (Potrykus 1975) và vi sinh vật (Davey và Power 1975).