Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2

Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 1 PHẦ MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CHỌ ĐỀ TÀI Màng sinh học ( Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuNn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến…do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bề chắc.[17] Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phNm hay thay thế thực phNm. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người.[13] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu. Các kết quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm. Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A. xylinum BHN 2 có khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho người. Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 2 Với mục đích tìm hiểu diện tích và thể tích liên quan đến độ thoáng khí trong quá trình tạo màng BC trong điều kiện nuôi tĩnh chúng tôi chọn đề tài: “ ghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khu#n Acetobacter xylinum BH 2 ” 2. Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài - Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuNn A. xylinum BHN 2 phân lập từ nguồn nguyên liệu từ phòng thí nghiệm. - Khảo sát khả năng tạo màng BC của vi khuNn A. xylinum BHN 2 . - Bổ sung thêm các kiến thức về vi khuNn A.xylinum nhằm ứng dụng tạo màng BC được tốt nhất. 3. ội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuNn A. xylinum BHN 2 . - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN 2 . - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN 2 . - Nghiên cứu một số tính chất vật lý của màng BC được tạo ra từ chủng A. xylinum BHN 2 từ đó định hướng cho ứng dụng trong trị bỏng. Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 3 PHẦ ỘI DUG CHƯƠG 1. TỔG QUA TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về vi khuAn A. Xylinum và màng BC 1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. Xylinum Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì A.xylinum thuộc giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Việc phân loại vi khuNn này còn nhiều tranh cãi, có một số tác giả coi A. xylinum như một loài phụ của A. Aceti.[21] A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuNn Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi. Hình 1: Kết quả nhuộm Gram của A. xylinum BHN2 KhuNn lạc của A.xylinum có kích thước lớn (đường kính khuNn lạc đạt 2-5mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuNn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuNn lạc nhẵn.[18] Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 4 1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A. Xylinum Vi khuNn A. xylinum phát triển ở nhiệt độ 25-350C, pH = 4-6. Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu. A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuNn lạ.[12] Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của A. xylinum bao gồm: Oxy hoá ethanol thành acid acetic, CO2, H2O; Phản ứng catalase dương tính; Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid; Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổng hợp cellulose.[12] 1.1.3. Màng BC của vi khuAn A. xylinum Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuNn A. xylinum hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng Bacterial cellulose hay màng BC. * Cấu trúc của màng Bacterial cellulose: Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch thẳng. Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau. Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn- sợi vĩ mô ( microfibril) ( Tonas and Farah, 1998), những sợi này kết Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 5 hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000). Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1-9nm. Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực vandesvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.[15] Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết tinh cao (khoảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học cao, khả năng hấp thụ nước lớn. Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuNn A. xylinum được nghiên cứu đầu tiên bởi Brown năm 1886. Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX, những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc và đặc tính của cellulose.[22] 1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC từ vi khuAn A.xylinum 1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose Nguồn cacbon có ảnh hưởng mạnh mẽ tới sinh trưởng cũng như tổng hợp cellulose của Acetobacter xylinum. Theo kết quả nghiên cứu của Thạc sỹ Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng Acetobacter xylinum HN5 thì nguồn cacbon có ảnh hưởng lớn nhất đến sự hình thành màng của Acetobacter xylinum là glucose. Để tạo màng phục vụ mục đích nghiên cứu, Thạc sỹ Trần Như Quỳnh đã quyết định sử dụng hàm lượng glucose 20 g/l cho các nghiên cứu trên chủng A. xylinum BHN 2 .[14] 1.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (H4)2SO4 Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 6 Vi sinh vật và tất cả các cơ thể sống khác đều cần nitơ trong quá trình sống để xây dựng tế bào. Nhân tố (NH4)2SO4 là một trong những nhân tố có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của Acetobacter xylinum, là nhân tố quan trọng cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triển. Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môi trường quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC. Ở nồng độ 2,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất.[14] 1.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O MgSO4 ở nồng độ 2 g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS-TS Đinh Thị Kim Nhung, magie là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, những enzim này xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa các chất trong quá trình hình thành màng BC.[14] 1.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 Phospho ngoài vai trò tham gia cấu trúc các thành phần của tế bào, nó còn có vai trò hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở vi khuNn Acetobacter xylinum ( Ross et.al, 1991). Sử dụng nồng độ 2g/l KH2PO4 sẽ cho sản lượng BC cao nhất.[14] 1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi khuAn A.xylinum 1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống. Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng trong quá trình lên men cellulose vi khuNn. Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 7 Độ dai của màng phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độ kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men thu nhận màng. Vì nếu thu sớm độ polymer hoá và kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng đến tính chất cơ học của màng BC. Ngược lại nếu để lâu trong môi trường nghèo dinh dưỡng màng chìm xuống, vi khuNn sẽ tiến hành phân huỷ thu năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của tế bào. Đối với loài Actobacte xylinum, trong quá trình lên men, phần lơn các tế bào liên kết với phân tử glucose để hình thành lớp màng BC trên bề mặt nuôi cấy. Lớp màng này ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với môi trường dich thể. Vì vậy việc nghiên cứu xác định được lượng giống bổ sung ban đầu cho phù hợp có ý nghĩa quan trọng để thu được màng BC với năng suất cao nhất. Sản lượng cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng theo tỷ lệ giống và thời gian lên men.[14] 1.3.2. Độ thông khí Vi khuNn A. xylinum là vi khuNn hiếu khí bắt buộc. Điều kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong cơ chế của quá trình lên men, lượng oxy cần cung cấp là tương đối lớn. Trong thực tế độ thông khí quyết định năng suất BC. Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxy và sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng BC cao trong lên men chìm. Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng, thoáng và lớp môi trường mỏng.[19] Wanatabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy cũng ảnh hưởng đến khả năng hình thành cellulose vi khuNn. Cellulose hình thành dưới áp suất oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện áp suất Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 8 oxy cao. Do đó ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng và độ chịu lực của lớp màng BC.[20] 1.3.3. hiệt độ Nhiệt độ thích hợp với vi khuNn A. xylinum từ 25-30 0 C. Ở nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm.[21] 1.3.4. Độ PH Vi khuNn A. xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hoá môi trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuNn, giúp ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại.[21] 1.4. Ứng dụng của màng BC 1.4.1. Ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bề dày của vi sợi dưới 100nm, bị phân huỷ sinh học, có tính tương thích sinh học, tính trơ chuyển hoá, không độc và không gây dị ứng. Màng BC có các ứng dụng đa dạng trong nhiều lãnh vực như y học, thực phNm, mỹ phNm, bảo vệ môi trường, công nghiệp.[22] 1.4.2. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng ngày. Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 9 Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn gây rối loạn nội tạng, để lại di chứng nặng đến khả năng vận động, thNm mỹ và sức khỏe của người bệnh. Ở Việt Nam, chỉ riêng Viện Bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhận khoảng hơn 400 ca bỏng. Các tác nhân gây bỏng chủ yếu là bỏng nước sôi. Ngoài ra các tác nhân khác là xăng, dầu, nước canh nóng, acid, vôi tôi nóng.[6] Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặc biệt quan trọng. Đối với vết bỏng nông điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụng làm giảm đau ngăn chặn các biến chứng nhiễm khuNn, tạo điều kiện tốt cho quá trình tái tạo phục hồi. Đối với những trường hợp bỏng sâu, điều trị tại chỗ có tác dụng lớn trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễm khuNn tại chỗ, không để nhiễm khuNn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và dịch trong cơ thể (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức hoại tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình hình thành mô hạt và biểu mô hóa hình thành sẹo, chuNn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật.[6] 1.5. Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt am và trên thế giới 1.5.1. Trên thế giới Nghiên cứu về màng BC từ vi khuNn A.xylinum và những ứng dụng của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, 1989, dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phNm hoặc thay thế thực phNm. Đặc biệt Brown (1989) đã dùng BC làm vải đặc biệt, Nogiet và cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki và cộng sự (2006) Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 10 dùng màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố định protêin hay cho sắc kí.[5] Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là dùng trong ngành dược phNm và mỹ phNm. Các tác giả: Hamlyn và cs (1997), Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004) Wan và Millon (2005), Czaja và cs, (2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã đượng đăng kí bản quyền về làm màng BC từ A.xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ.[5] 1.5.2. Ở Việt am Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng được cải tiến. Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng … Từ năm 2000 nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự đã có một số công trình nghiên cứu về màng BC từ A. xylinum và bước đầu nghiên cứu về các đặc tính màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam.[9] Điều trị bỏng bằng các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên đã được áp dụng từ rất lâu và phổ biến ở tất cả các nước. Các thuốc này có sẵn trong thiên nhiên và có nhiều đặc tính tốt cho điều trị bỏng cũng như chữa các vết thương, vết loét… Màng BC có nhiều ưu điểm để trở thành chất mang các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên sử dụng trong điều trị bỏng.[14] Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 11 1.6. Một số công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài Luận văn thạc sĩ vi sinh học 2009 : “ghiên cứu một số đặc tính vật lý của màng BC từ Acetobacter xylinum, ứng dụng trong trị bỏng” của Trần như Quỳnh- ĐHSP Hà Nội đã làm được một số vấn đề sau: - Nghiên cứu một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuNn A.xylinum BHN2. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men tạo màng BC của chủng A.xylinum BHN2, qua đó lựa chọn được môi trường thích hợp cho chủng A.xylinum BHN2 lên men tĩnh. + Điều kiện nuôi cấy: hàm lượng giống bổ sung ban đầu cho lên men tạo màng là 10% thể tích lên men, với PH ban đầu của môi trường lên men từ 4,5- 5,5. + Môi trường dinh dưỡng: hàm lượng đường glucose 20g/l; (NH4)2SO4: 2 g/l; KH2PO4: 2 g/l; MgSO4.7H2O: 2 g/l. - Nghiên cứu được tỷ lệ diện tích bề mặt và thể tích lên men cho chủng A.xylinum BHN2 tạo màng tốt nhất. - Xử lý màng BC ứng dụng trong điều trị bỏng và khảo sát các đặc tính của màng: khả năng kháng khuNn cao, độ bền cơ học 3,62 kN/m, độ thấu khí 120ml/phút, khả năng hút nước 6,82g/100cm2/24 giờ; màng không có triệu chứng kích ứng. - Màng BC tNm dầu mù u và kem nghệ làm lành vết thương sau 19 ngày điều trị. Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 12 CHƯƠG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠG PHÁP GHIÊ CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu chính Đối tượng nghiên cứu là các chủng A. xylinum BHN 2 được phòng thí nghiệm Thực vật - Vi Sinh Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư pham Hà Nội 2 cung cấp. 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 2.1.2.1. Hoá chất - Nguồn Cacbon: Rượu etylic, Glucose, Sacrose, Manitol, Lactose, Fructose, Dihyroxyaceton, Axit acetic. - Nguồn Nitơ: Cao nấm men, Pepton, (NH4)2SO4 - Các muối khoáng: KH4PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaOH, CuSO4. - Các chất kích thích sinh trưởng: Cao nấm men, cao ngô. - Thuốc thử: Dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromophenol. - Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol. - Ngoài ra còn sử dụng : Các loại bia, nước dừa, các loại nước chiết quả. 2.1.2.2. Thiết bị Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức). Nồi hấp Tommy (Nhật). Máy so màu UV – vis ( Nhật). Máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ). Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh). Máy li tâm Sorvall (Mỹ). Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 20µl – 10ml. Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 13 Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40. Cân (Precisa XT 320M - Thụy sỹ). Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn… 2.1.3. Môi trường 2.1.3.1. Môi trường phân lập giống (MT1) Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g KH2PO4: 2 g MgSO4.7H2O: 2 g CaCO3 : 10g Agar: 20g Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng). Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng). Nước máy: 1000ml. 2.1.3.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2) Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g KH2PO4: 2 g MgSO4.7H2O: 2 g Pepton: 4g Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng). Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng). Nước máy: 1000ml. 2.1.3.3. Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g KH2PO4: 2 g MgSO4.7H2O: 2 g Cao nấm men: 3g Pepton: 4g Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng). Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng). Nước dừa: 1000ml. Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp hoạt hóa giống A.xylinum BH 2 Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh trước khi đem sử dụng phải hoạt hóa giống “làm thức tỉnh giống”, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trường tiêu chuNn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau đó đem xử lí trong đèn tím 15 phút để khử khuNn, sau đó cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ. 2.2.2.Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuAn A.xylinum BH 2 Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100C trong 20 phút để tránh phân dã đường. Sau đó khử khuNn ở đèn cực tím trong 15 phút. Sau đó tiến hành lên men tạo màng BC bằng cách bổ sung vào môi trường lên men 5% giống đã hoạt hóa. Nuôi cấy ở điêu kiện tĩnh trong 7-10 ngày. 2.2.3. Phương pháp bảo quản chủng giống A.xylinum BH 2 trên môi trường thạch nghiêng Các chủng giống sau khi nhận từ phòng thí nghiệm vi sinh sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3), nuôi trong tủ ấm 3 – 4 ngày ở 300C. Sau đó, giữ lạnh ở tủ 40C để bảo quản giống. Cấy truyền giữ giống trên môi trường thạch nghiêng mỗi tháng một lần.[4] 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BH 2 Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 15 2.2.4.1. Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng A. xylinum BH 2 S: diện tích bề mặt lên men tạo màng BC (cm2) V: thể tích dịch lên men tạo màng ( cm3) Với phương pháp cố định diện tích bề mặt lên men tạo màng, thay đổi thể tích dịch lên men để tìm tỷ lệ S/V thích hợp đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng A.xylinum BHN 2 , chúng tôi tiến hành theo các bước sau: - Bước 1: Tính diện tích bề mặt lên men tạo màng BC. Quy đổi thể tích từ đơn vị ml sang đơn vị cm3. Sau đó tính tỷ lệ S/V. + Dụng cụ lên men tạo màng là khay nhựa hình chữ nhật có kích thước 15 x 10 x 4 cm, từ đó ta tính được diện tích bề mặt lên men tạo màng BC là S= 15 x 10= 150 (cm2). + Thể tích dịch lên men được đo bằng ml nhưng để tính được tỷ lệ S/V thì ta phải quy đổi ml sang cm3. Ta đã biết 1ml=1cm3. Ta có bảng sau: Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 16 Bảng 1: Tính quy đổi S/V thí nghiệm nghiên cứu S (cm2) V ( ml =cm3) S/V (cm-1) 150 150 1,0 150 167 0,9 150 187.5 0,8 150 215 0,7 150 250 0,6 150 300 0,5 - Bước 2: Tiến hành lên men bề mặt tạo màng BC từ chủng A.xylinum BHN 2 với các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng, trọng lượng khô để tìm S/V thích hợp tạo màng BC tốt nhất. 2.2.4.2. Phương pháp xác định dai (độ bền cơ học) của màng BC . Độ chịu kéo(độ dai)(tensile strenght): Lực kéo lớn nhất mà mẫu thử chịu được trước khi đứt trong điều kiện xác định của phương pháp thử tiêu chuNn.[14] Độ bền kéo(độ dai) có thể được hiểu như là khi một lực tác động tăng dần đến khi vật liệu dạng sợi hay trụ bị đứt. Ở giá trị lực kéo giới hạn cho sự đứt của vật liệu được ghi lại được ký hiệu σk. Độ bền kéo được ứng dụng rất nhiều cho các vật liệu trong các lĩnh vực như thiết kế chế tạo máy, xây dựng, khoa học vật liệu.[14] Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 17 Để xác định độ dai của màng tôi đã dùng một lực kế(đơn vị là N- Niutơn). Sau khi thu màng tôi tiến hành đo độ dai bằng cách: + Cố định đầu trước của màng + Tiếp đến lấy lực kế lò xo cố định vào đầu sau + Kéo màng xem tối đa màng đó có độ bền kéo đạt được bao nhiêu N. 2.2.4.3. Phương pháp nghiên cứu thời gian đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BH 2 Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thời gian từ 1-7 ngày đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 theo các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng, trọng lượng khô từ đó tìm thời gian thích hợp tạo màng BC tốt nhất. 2.2.4.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BH 2 Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu nhiệt độ từ 20-400C đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 theo các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng, trọng lượng khô từ đó tìm nhiệt độ thích hợp tạo màng BC tốt nhất. Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 18 2.2.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp trong cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học” và “Thống kê và ứng dụng” như: * Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm. 1 1 n i i X X n = = ∑ * Trung bình bình phương các sai lệch 1 )( 1 2 − − = ∑ = n XX n i i δ * Sai số đại diện của trung bình cộng m n δ ± = * Hệ số biến thiên trung bình cộng: X x Cv 100δ = . Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 19 CHƯƠG 3. KẾT QUẢ GHIÊ CỨU VÀ THẢO LUẬ 3.1. Ảnh hưởng của các tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khu#n A. xylinum BH 2 . Sau một thời gian nghiên cứu lên men bề mặt tạo màng BC từ chủng A.xylinum BHN 2 với các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng, trọng lượng khô tuyệt đối để tìm S/V thích hợp tạo màng BC tốt nhất, chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở bảng 3.1 như sau: Bảng 3.1. ghiên cứu tỉ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ vi khu#n A. xylinum BH 2 (Ảnh hưởng tỷ lệ diện tích bề mặt và thể tích lên men) Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 20 Đặc điểm màng Tỷ lệ S/V (cm-1) Thời gian xuất hiện màng Màu sắc, độ nhẵn Độ dày sau khi lên men (mm) Độ dai (độ bền kéo) Đơn vị () Cân nặng sau khi lên men (g) Trọng lượng khô (g) 0,5 4 Trắng đục, sần sùi 0,50 6 4,17 0,10 0,6 4 Trắng đục, sần sùi 1,5 10 8,54 0,14 0,7 4 Trắng đục, sần sùi 1,9 14 8,61 0,15 0,8 3 Màng trắng trong, nhẵn. 3,00 18 22,22 0,51 0,9 3 Màng trắng trong, nhẵn. 2,50 16 18,17 0,35 1,0 3 Màng trắng trong, nhẵn. 2,00 12 13,36 0,30 Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 21 0 5 10 15 20 25 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 S/V Khối lượng màng (g) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Biểu đồ 3.1.1 Thể hiện mối quan hệ giữa S/V với khối lượng màng S/V Độ bền kéo của màng () Biểu đồ 3.1.2. Thể hiện mối quan hệ giữa S/V với độ bền kéo màng Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 22 Từ bảng 3.1 và biểu đồ 3.1.1 và 3.1.2 tôi thấy khả năng hình thành màng tốt nhất ở tỷ lệ S/V = 0,8 với chiều cao môi trường trong dụng cụ lên men h =1,25 cm. Với tỷ lệ S/V thấp hơn hoặc lớn hơn 0,8 độ kết tinh của màng không cao, màng dễ bị rách khả năng chịu lực kéo kém hơn. 3.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC tốt nhất của chủng A. xylinum BH 2 với tỷ lệ S/V=0,8 Sau một thời gian tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thời gian từ 1-7 ngày với tỷ lệ S/V=0,8 đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 theo các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng, trọng lượng khô tuyệt đối từ đó tìm thời gian để độ kết tinh của màng đạt trạng thái tốt nhất và thu nhận màng tốt nhất, chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở bảng 3.2 như sau: Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 23 Bảng 3.2. ghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng A. xylinum BH 2 với tỷ lệ S/V=0,8 Thời gian (ngày) 1 2 3 4 5 6 7 Xuất hiện màng - - + + + + + Màu sắc, độ nhẵn - - Màng trắng trong, nhẵn Màng trắng trong, nhẵn Màng trắng trong, nhẵn Màng trắng trong, nhẵn Màng trắng trong, nhẵn Độ dày sau khi lên men (mm) - - 1,0 2,0 2,0 3,0 3,2 Độ dai(độ bền kéo) () - - 6 10 14 18 15 Cân nặng sau khi lên men(g) - - 8,61 13,36 16,47 22,22 23,36 Trọng lượng khô (g) - - 0,12 0,30 0,35 0,51 0,45 Chú thích: + có -: Không Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 24 0 5 10 15 20 25 1 2 3 4 5 6 7 Khối lượng màng (g) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian (ngày) Biểu đồ 3.2.1.Thể hiện mối quan hệ giữa thời gian với khối lượng màng Biểu đồ 3.2.2.Thể hiện mối quan hệ giữa thời gian với độ bền kéo màng Độ bền kéo của màng () Thời gian (ngày) Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 25 Qua bảng 3.2 và hai biểu đồ 3.2.1 và 3.2.2, tôi thấy sản lượng cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng theo thời gian lên men kể từ khi xuất hiện màng. Sau 6 ngày lên men tôi nhận thấy màng bắt đầu có dấu hiệu chìm xuống trong môi trường lên men và khả năng sản xuất màng BC bắt đầu giảm dần. Các kết quả trên là trung bình của nhiều lần lặp lại, tôi nhận thấy: Sau thời gian 6 ngày độ kết tinh của màng đạt trạng thái tốt nhất. Với S/V= 0,8 tôi thấy thu nhận màng sau 6 ngày lên men là tốt nhất. 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC tốt nhất của chủng A. xylinum BH 2 với tỷ lệ S/V=0,8 Nhiệt độ là một trong những yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tạo màng BC từ vi khuNn A. xylinum BHN 2 . Với sự khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy với tỷ lệ S/V=0,8 đến khả năng tạo màng BC tốt nhất của chủng A.xylinum BHN 2 chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở bảng 3.3: Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 26 Bảng 3.3. ghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy với tỷ lệ S/V=0,8 đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng A. xylinum BH 2 hiệt độ (0C) 20 25 30 35 40 Thời gian xuất hiện màng(ngày) 5 3 3 3 - Màu sắc, độ nhẵn Màng trắng trong, nhẵn Màng trắng trong, nhẵn Màng trắng trong, nhẵn Màng trắng trong, nhẵn - Độ dày sau khi lên men (mm) 1 2,5 3,0 2,0 - Độ dai(độ bền kéo) () 10 14 18 15 - Cân nặng sau khi lên men (g) 8,61 16,47 22,22 21 - Trọng lượng khô(g) 0,12 0,35 0,51 0,30 - Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 27 0 5 10 15 20 25 20 25 30 35 40 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 25 30 35 40 hiệt độ (0C) Biểu đồ 3.3.1.Thể hiện mối quan hệ giữa nhiệt độ với khối lượng màng Biểu đồ 3.3.2.Thể hiện mối quan hệ giữa nhiệt độ với độ bền kéo màng hiệt độ (0C) Độ bền kéo của màng () Khối lượng của màng (g) Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 28 Qua bảng 3.3 và hai biểu đồ 3.3.1 và 3.3.2 trên, tôi nhận thấy nhiệt độ thích hợp với vi khuNn A.xylinum BHN 2 từ 25-30 0 C và nhiệt độ thích hợp nhất là 30 0 C . Ở nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm. Với S/V= 0,8, tôi thấy lên men tạo màng BC từ vi khuNn A.xylinum BHN 2 ở nhiệt độ 300C là tốt nhất. Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 29 PHẦ KẾT LUẬ VÀ ĐỀ GHN 1. Kết luận - Nghiên cứu được tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích dịch lên men từ chủng A. xylinum BHN 2 tạo màng BC tốt nhất là S/V= 0,8. - Nghiên cứu được ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy với tỷ lệ S/V=0,8 đến khả năng tạo màng BC tốt nhất của chủng A. xylinum BHN 2 là 6 ngày. - Nghiên cứu được ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy với tỷ lệ S/V=0,8 đến khả năng tạo màng BC tốt nhất của chủng A. xylinum BHN 2 là 30 0C. - Nghiên cứu được một số tính chất vật lý của màng BC được tạo ra từ chủng A. xylinum BHN 2 là màng có độ dày 2-3mm với màu trắng trong, bề mặt nhẵn mịn, dai đáp ứng yêu cầu về độ chịu lực của màng trị bỏng. Từ đó định hướng cho ứng dụng trong trị bỏng. 2. Đề nghị Trên đây là những kết quả nghiên cứu bước đầu trong tuyển chọn và khảo sát sơ bộ về chủng A.xylinum BHN 2 có khả năng tổng hợp cellulose. Để sản phNm có thể ứng dụng vào thực tiễn chúng tôi đề nghị: - Khi lên men tạo màng BC cần lên men ở nhiệt độ 300C, thời gian thu nhận màng tốt nhất là 6 ngày với tỷ lệ S/V=0,8. - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy khác đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC. Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: 1. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Đình Quyết, Phạm Văn Ty. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học. Nxb khoa học kĩ thuật, 1978 2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, 1998. . 3. Nguyễn Thành Đạt. Cơ sở sinh học vi sinh vật. Nxb Giáo dục, 1999. 4. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào. Thực hành vi sinh vật học. Nxb Giáo dục, 1990. 5. Đặng Thị Hồng. Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuNn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học (BC). Luận án thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội, 2007. 6. Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh. Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuNn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng. Tạp chí Dược học số 361/ 2006. tr 18 – 20. 7. Chu Văn Mẫn. Ứng dụng tin học trong sinh học. Nxb ĐHQG Hà Nội, 2003. 8. Đinh Thị Kim Nhung. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuNn Acetobacter và ứng dụng chúng trong lên men axêtic theo phương pháp chìm. Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học, 1996. 9. Nguyễn Thị Nguyệt. Nghiên cứu vi khuNn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial Cellulose làm mặt nạ dưỡng da. Luận án thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội, 2008 . 10. Trần Thị Thanh (2003), Công nghệ Vi sinh, Nhà xuất bản Giáo dục. Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 31 11. Trịnh Hữu Hằng, Đỗ Công Quỳnh, Sinh lý học người và động vật, Nxb Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 2001, tr. 173, 184 -187. 12. Nguyễn Đức Lượng (2000), Công nghệ Vi sinh vật tập 1-2-3, Nhà Xuất bản Đại học Quốc Gia TP.HCM. 13. Nguyễn Thúy Hương(2006). Chọn lọc dòng A.xylinum thích hợp cho các loại môi trường dung trong sản xuất cellulose vi khuNn với quy mô lớn. 14. Trần như Quỳnh.Nghiên cứu một số đặc tính vật lý của màng BC từ Acetobacter xylinum, ứng dụng trong trị bỏng. Luận văn thạc sĩ vi sinh học ĐHSP Hà Nội, 2009. Tài liệu tiếng anh: 15. Alina Krystynowicz, Maria Koziołkiewicz, Agnieszka Wiktorowska- Jezierska, Stanisław Bielecki, Emilia Klemenska, Aleksander Masny, Andrzej Płucienniczak. Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum. Vol. 52, . 3, 2005, p. 691–698 16. Bergey. H, John. G. Holt. Bergey’s manual of dererminativa bacteriology. Wolters Kluwer health, 1992, p.71-84. 17. Cazfa, W., Young, D.J. Kawechi, M & Brown, R. M. Tr (2007). The future Prospects of microbial cellulose in bio medical application, Biomacromolecules, 8, 1 – 12. 18. Thesis Homles. Bacterial cellulose. Department of chemical and process Engineering University of Canterbury Christchurch, New Zealand, 2004, p. 1-65. 19. Cheng H.P., Wang P.M., Chen J.W., Wu W.T. (2002), Cultivation of Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Vi sinh vật SV: guyễn Duy Khanh 32 Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in a modified airlift reactor, Biotechnol. Appl. Biochem. 35, p. 125-132. 20. Walker. K. T, Toidi.J. The ' Catalase test', with special reference to Acetobacter species. Vol 37, The College of Technology, The University of Manchester, 1942, p 10-12. 21. Dieter Klemm, Dieter Schumann ,Ulrike Udhardt, Silvia Marsch. Bacterial synthesized cellulose-artificial blood vessels for microsurgery. Vol. 26, Inssue 9, Progress in polymer science, 2001, p. 1561-1603. 22. Brown. E. Bacterial cellulose/ Themoplastic polymer nanocomposites. Master of sience in chemical engineering, Washington state university, 2007.