Nghiên cứu các quy trình tổng hợp sản xuất axit amin lysine

PAGE  PAGE 19 LỜI MỞ ĐẦU Tại sao phải đặc biệt quan tâm đến lysine ở nước ta? Có 4 acid amin thiết yếu hay bị thiếu hụt trong khẩu phần ăn ở nước ta: đó là lysine, threonine, tryptophan và methionine. Trong đó, lysine được quan tâm hơn cả vì có nhu cầu khá cao nhưng lại thường bị thiếu hụt nhất trong các khẩu phần ăn chủ yếu dựa vào ngũ cốc (chiếm 70-80% năng lượng) như nước ta hiện nay. Mặc khác, lysine dễ bị phá hủy trong quá trình chế biến nấu nướng thức ăn, và cơ thể tuyệt đối không thể tổng hợp được lysine (các acid amin thiết yếu kia có thể được tổng hợp từ các acid amin khác qua quá trình chuyển đổi amin). Do đó, thiếu lysine rất phổ biến, đặc biệt ở trẻ nhỏ. Thiếu lysine dẫn đến giảm tổng hợp protein cơ thể, làm cho trẻ chậm lớn, còi cọc, biếng ăn, hay bệnh, thiếu men tiêu hoá, thiếu nội tiết tố... . Làm thế nào để tránh thiếu lysine? Biện pháp tối ưu vẫn là bữa ăn đa dạng hợp lý, có đủ các chất dinh dưỡng trong đó có lysine. Thức ăn giàu lysine là trứng, sữa, thịt, cá, các loại đậu, nhất là đậu nành. Cũng có thể bổ sung lysine vào thực phẩm. Một cách dễ thực hiện khác là có thể bổ sung thêm bằng thuốc bổ có lysine. Lysine giúp trẻ ăn ngon miệng, gia tăng chuyển hóa, hấp thu tối đa dinh dưỡng và phát triển chiều cao. Việc thiếu hụt chất này có thể khiến trẻ chậm lớn, biếng ăn, dễ thiếu men tiêu hóa và nội tiết tố. Do sự bất hợp lý về khẩu phần nên người Việt dễ bị thiếu lysine. Lysine là một trong 12 axit amin thiết yếu cần có trong bữa ăn hằng ngày. Nó giúp tăng cường hấp thụ và duy trì canxi, ngăn cản sự bài tiết khoáng chất này ra ngoài cơ thể. Vì vậy, lysine có tác dụng tăng trưởng chiều cao, ngăn ngừa bệnh loãng xương. Lysine là thành phần của nhiều loại protein, là yếu tố quan trọng trong việc duy trì hệ miễn dịch, phát triển men tiêu hóa, kích thích ăn ngon. Nó cũng ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh mụn rộp nên thường được bác sĩ kê đơn cho người bị rộp môi hay mụn rộp sinh dục. Theo nhà khoa học Linus Pauling, người từng nhận hai giải Nobel y học, lysine còn có tác dụng ngăn ngừa, chữa trị bệnh tim và đột quỵ. Người bình thường mỗi ngày cần 1g lysine. Tuy nhiên, cơ thể không tự tổng hợp được chất này mà phải được cung cấp qua thực phẩm (như lòng đỏ trứng, cá, thịt, các loại đậu và sữa tươi) hoặc bổ sung dưới dạng thuốc. Trong khẩu phần ăn của người Việt Nam, lượng ngũ cốc chiếm đến 70-80% nên thường bị thiếu lysine, đặc biệt là những người ăn chay (chủ yếu dùng ngũ cốc và một lượng rất nhỏ rau họ đậu), vận động viên, bệnh nhân bỏng, mụn rộp. Để cung cấp đủ vi chất này, cần cân đối lại khẩu phần, ăn đủ các thực phẩm như trứng, cá, sữa tươi. Tuy nhiên, lysine trong thực phẩm rất dễ bị phá huỷ trong quá trình đun nấu. Cung cấp lysine qua thuốc là không cần thiết đối với người bình thường. Hơn nữa, việc dùng thuốc phải có sự chỉ định, hướng dẫn của bác sĩ và tuân thủ đúng các hướng dẫn đó, vì mọi loại dược phẩm khi dùng không đúng đều có thể gây hại. Riêng với lysine, liều lượng quá cao có thể gây chứng căng cơ bụng và bệnh tiêu chảy. Theo các chuyên gia dinh dưỡng, cách cung cấp lysine tiện lợi và hiệu quả nhất là sử dụng các loại thực phẩm chế biến sẵn có bổ sung chất này với một lượng nhỏ, vừa đủ cho nhu cầu của người bình thường, chẳng hạn như sữa tươi. Ở các nước phương Tây, nơi có tốc độ phát triển chiều cao khá lý tưởng, các loại sữa tươi chứa lysine rất phổ biến. Hiện nay, tại Việt Nam cũng đã bắt đầu xuất hiện những sản phẩm sữa tươi chứa vi chất này. Công ty nội địa đầu tiên cung cấp sữa tươi bổ sung lysine là Hanoimilk với nhãn hiệu IZZI. Kể từ khi xuất hiện đầu năm 2003, một lượng lớn sữa IZZI chứa lysine trên thị trường đã được tiêu thụ. PHẦN I :TỔNG QUAN VỀ LYSINE Trong cơ thể mỗi con người đều có các chất cơ bản để giúp cơ thể tồn tại và hoạt động như protein, lipid, glucid…là những chất không thể thiếu. Bên cạnh đó, cũng có một số chất tuy hàm lượng của chúng không cần nhiều nhưng nếu thiếu thì cơ thể khó hoạt động bình thường và khỏe mạnh được như vitamin, các chất khoáng các acid amin… I.1.Giới thiệu chung Acid amin được phân thành một số họ trên cơ sở các phản ứng mở đầu chung trong quá trình sinh tổng hợp. Các họ này là: Họ acid amin thơm : phenylalanin , triptophan , tirozin Họ aspactat : asparagin , acid aspactic , izoloxin , lisine , metionin , treonin Họ glutamat : alanin , loxin , valin Họ xerin : xixtein , glixin , xerin. Aicd amin thường chứa nhóm – NH2 ( nhóm amin ) và – COOH ( nhóm cacboxil ) Các axit amin có cấu trúc đặc trưng như sau : NH2 R – C – COOH H Nhóm NH2 thường liên kết với nguyên tử cacbon ở gần nhóm COOH. Trong trường hợp acid amin có 2 nhóm NH2 thì nhóm NH2 thường liên kết với nguyên tử cacbon cuối cùng. Trong cấu trúc của acid amin, ít nhất có một nguyên tử cacbon bất đối, do đó acid amin tồn tại ở 2 dạng đồng phân quang học : dạng D và dạng L. Cơ thể động vật và thực vật chỉ có thể đồng hóa được acid amin dạng L. Đa số acid amin tồn tại ở dạng rắn và là dạng tinh thể trong điều kiện bình thường. Chúng bị phá hủy ở nhiệt độ cao ( 200 - 3000C ), đa số các acid amin đều cho màu tím xanh khi tương tác với ninhydrin. Các acid amin là thành phần cấu tạo nên protein, enzym, các vitamin, chất kích thích sinh trưởng, hocmon và kháng sinh, kháng thể. Trong các acid amin trên đây có 8 acid amin cần thiết cho cơ thể con người và động vật mà tự cơ thể nó không tổng hợp được bắt buộc phải cung cấp từ thực phẩm bên ngoài , đó là các acid amin: isoleusine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan và valine. Trong đó, lysine là một aicd amin rất quan trọng vì chỉ cần bổ sung đầy đủ lysine thì những acid amin còn lại cũng có thể tăng theo. I.2. Khái niệm Lysine Lysine là một axit amin có chứa 2 nhóm (-NH2) và một nhóm (-COOH). Chúng có công thức hoá học như sau: CH2 – CH2 – CH2 – CH2 – CH – COOH | | NH2 NH2 Tên quốc tế : 2,6-diaminohexanoic acid Công thức hóa học:  HYPERLINK "" \o "Carbon" C6 HYPERLINK "" \o "Hydrogen" H14 HYPERLINK "" \o "Nitrogen" N2 HYPERLINK "" \o "Oxygen" O2  Khối lượng phân tử gam: 146.188 g/mol Lysine là một α- HYPERLINK "" \o "Amino acid" amino acid Lysine là một axit amin thuộc họ aspartat, được tổng hợp qua con đường trao đổi chất phân nhánh. Qua con đường này còn có metionin, treonin, izoloxin cũng được tạo thành. I.3. Đặc tính: Lysine là một axit amin rất cần cho hoạt động sống của người và động vật. Nghĩa là cơ thể không tự tổng hợp được nó, phải lấy từ nguồn cung cấp bên ngoài, hay nói cách khác là lấy từ nguồn thức ăn. (chúng thuộc loại axit amin không thay thế). Lysine giữ vai trò sống còn trong sự tổng hợp protein. Nó là chìa khoá trong việc sản xuất các enzyme, hoocmon và các kháng thể giúp cơ thể tăng cường sức đề kháng và chống trả với bệnh tật, đặc biệt ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh mụn rộp môi hay mụn rộp sinh dục. Lysine giúp trẻ ăn ngon miệng, gia tăng chuyển hoá hấp thu tối đa dinh dưỡng. Nó cũng giúp tăng cường hấp thu calci, ngăn cản sự bài tiết khoáng chất này ra ngoài cơ thể nên nó có tác dụng tăng trưởng chiều cao, ngăn ngừa bệnh còi xương, loãng xương. Lysine có nhiều trong trứng , thịt , sữa, cá, đậu nành… nhưng dễ bị phá huỷ trong quá trình chế biến, nấu nướng thức ăn . Cơ thể người và động vật thiếu lysine cơ thể sẽ khó hoạt động bình thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm lớn , trí tuệ phát triển kém, dễ thiếu men tiêu hoá và nội tiết tố. Chính vì thế lysine là một loại axít amin thường được thêm vào khẩu phần ăn của trẻ em và của gia súc. I.4. Lịch sử phát hiện Trong tự nhiên có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lysine, nhưng số chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp thừa lysine có thể sử dụng để sản xuất theo qui mô công nghiệp không nhiều. Trong sản xuất công nghiệp, người ta thường sử dụng những chủng vi khuẩn đột biến để sản xuất lysine. Các chủng vi khuẩn được sử dụng nhiều trong công nghiệp như: Corynebacterium glutamicum ( trước đây gọi là Micrococcus glutamicus ) Brevibacterium flavum Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium acetophilum Gleocladium sp Ustilago maydis Trong đó, Corynebacterium glutamicum là vi khuẩn gram dương, hình dạng không đồng đều, không di động, không sinh bào tử, là vi khuẩn hiếu khí dạng que. Việc sản xuất lysine qui mô lớn với nguyên liệu là thực vật, lên men nhờ vi khuẩn Corynebacterium glutamicum đã bắt đầu vào đầu năm 1958 bởi Kyowa Hakko ở Nhật Bản. Những công ty khác tham gia việc thương mại và sau đó suốt 4 thập kỉ sản xuất với Corynebacterium glutamicum, công nghệ sinh học chế tạo ra L-lysine đã được cải thiện không ngừng và sự tiến bộ về kỹ thuật tạo ra số lượng lớn lysine đáp ứng nhu cầu ngày nay. Nhu cầu lysine thế giới năm 2006 là 950.000 -1000.000 tấn. Có một vài nhân tố giúp tăng nhanh nhu cầu lysine thế giới như sản lượng thức ăn gia súc, tình hình phát triển gia súc và tỷ lệ sử dụng lysine tăng. Nhu cầu lysine tại Châu Á Thái Bình Dương tăng 8- 10% do ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi phát triển mạnh, mặc dù nhu cầu lysine tại một số quốc gia trì trệ do giá hàng hoá tăng và cúm gia cầm bùng phát. Các nước sử dụng nhiều lysine nhất tại Châu Á- Thái Bình Dương là Thái lan, Hàn Quốc, Việt nam. Đặc biệt nhất là nhu cầu tăng mạnh mẽ tại Việt nam.  I.5. Ứng dụng của Lysine trong thực tế : Lysine thường được sử dụng để bổ sung vào thức ăn cho gia súc, khẩu phần ăn và phổ biến hơn cả là bổ sung vào các thực phẩm chức năng. I.6. Khái niệm về thực phẩm chức năng : Theo các nước châu Âu, Mỹ, Nhật thì thực phẩm chức năng là một loại thực phẩm ngoài 2 chức năng truyền thống là : cung cấp các chất dinh dưỡng và thỏa mãn nhu cầu cảm quan, còn có chức năng thứ 3 được chứng minh bằng các công trình nghiên cứu khoa học như tác dụng giảm cholesterol, giảm huyết áp, chống táo bón, cải thiện hệ vi khuẩn đường ruột… Theo bộ Y tế Việt Nam: thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hộ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh. Tuy có rất nhiều ý kiến khác nhau, song vẫn thống nhất là : thực phẩm chức năng là loại thực phẩm nằm giới hạn giữa thực phẩm ( truyền thống – Food ) và thuốc ( Drug ). Thực phẩm chức năng thuộc khoảng giao thoa giữa thực phẩm và thuốc. Vì thế người ta còn gọi thực phẩm chức năng là thực phẩm – thuốc ( food – drug ). Một số thực phẩm chức năng trên thị trường: Siro unikids Sữa PediaPlus PHẦN II : TỔNG HỢP LYSINE ******* Acid amin được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và trong y học . Vì nhu cầu về acid amin của 2 ngành này rất lớn nên các nhà khoa học đã đưa ra rất nhiều phương pháp khác nhau để sản xuất axit amin như: II.1.Các phương pháp tổng hợp II.1.1.Phương pháp thủy phân Người ta dùng acid hoặc kiềm để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều protein. Các phương pháp này hiện nay vẫn đang được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là: Cần thiết bị chịu acid hoặc chịu kiềm. Trong trường hợp sử dụng kiềm để thủy phân sẽ tạo ra nhiều acid amin dạng D . Trong trường hợp sử sụng acid để thủy phân sẽ tạo ra ô nhiễm môi trường không khí do lượng acid dư bay hơi trong quá trình thủy phân. Giá thành thường cao. II.1.2.Phương pháp tổng hợp hóa học Đây cũng là phương pháp được áp dụng nhiều trong thực tế. Tuy nhiên, phương pháp này cũng lại cho ra những acid amin raxemic ( hỗn hợp acid amin dạng D và dạng L ). Việc tách 2 loại acid amin này ra rất tốn kém. II.1.3.Phương pháp kết hợp Người ta kết hợp phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. Bằng con đường hóa học, người ta thu nhận hợp chất dạng L – Keto và các tiền chất của acid amin. Sau đó người ta sử dụng vi sinh vật để chuyển hóa những chất này thành acid amin. Ngày nay các nước trên thế giới như Nhật và Mỹ để sản xuất các amino axit như: lysine, valin... một phương pháp sử dụng phổ biến đó là: II.1.4.Phương pháp tổng hợp acid amin bằng công nghệ vi sinh vật Phương pháp này lợi dụng khả năng sinh tổng hợp thừa một số loại acid amin của một số vi sinh vật, người ta nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận các acid amin. Phương pháp này có rất nhiều ưu điểm: Phương pháp này cho phép ta thu nhận acid amin dạng L Nguyên liệu sản xuất rẻ, dễ kiếm. Tốc độ trao đổi chất, tốc độ sinh sản và phát triển mạnh của vi sinh vật cho phép ta được năng suất cao. Giá thành sản phẩm thấp hơn giá thành sản phẩm từ những phương pháp khác. II.2.Giống vi sinh vật và quá trình tạo lysine : Trong đó : AK = aspartokinase ; HSD=homoserine dehydrogenase ; Aspartokinase là một loại enzyme chỉ bị ức chế khi hàm lượng của cà lysine và threonine tiết ra vượt mức . Qua sơ đồ chuyển hóa trên ta rút ra một kết luận là : muốn điều chỉnh sơ đồ trên nhằm mục đích chỉ sản xuất lysine và đạt được hàm lượng cao thì cần ức chế được enzyme aspartokinase và enzyme homoserine dehydrogenase . Vậy vi sinh vật (VSV) mà ta chọn làm giống lên men( tất nhiên là phải có khả năng tổng hợp lysine) phải sống trên môi trường có chứa hàm lượng methionine cao và threonine thấp . Vậy , ta chọn chủng vi khuẩn Corynebacterium glutamicum vì các lý do sau : Có khả năng tổng hợp lysine với mức độ cao ( sản lượng lysine tạo ra ngày càng tăng nhờ các giống đột biến ), ở đây ta chọn chủng Corynebacterium glutamicum ATCC 13287 được đột biến 3 điểm nhờ tia UV so với chủng dại Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Sống được trên môi trường có chứa hàm lượng methionine cao và threonine thấp . Tương đối dễ nuôi và áp dụng vào công nghệ lên men ở quy mô công nghiệp . Chủng Corynebacterium glutamicum ATCC 13287 là một chủng khuyết dưỡng hocmoserine, sản lượng tạo lysine là 55 g/l . Đặc điểm của giống Corynebacterium glutamicum: Hình thái khuẩn lạc :tròn , trơn bóng Màu sắc khuẩn lạc : vàng chanh PHẦN III : QUY TRÌNH SẢN XUẤT AXIT AMIN LYSINE ஊஇஊ Sản xuất lysine có các phương pháp : 1. Trích ly, 2. Tổng hợp, 3. Dùng enzyme, 4.Lên men với phụ gia, 5. Lên men trực tiếp. Phương pháp lên men trực tiếp là sử dụng loại nấm men sản sinh lysine có đặc trưng sinh lý đặc biệt, thực hiện lên men trong điều kiện nhất định, tận dụng nguyên liệu chất đường có chất lượng cao của thiên nhiên, để chất lên men chuyển hóa thành lysine. III.1.Nguyên liệu : Rỉ đường ( mía hoặc củ cải ), hoặc dung dịch đường thu được sau quá trình thủy phân tinh bột sắn, bột ngô có hàm lượng đường khoảng 10 -20 % đồng thời phải bổ sung thêm nguồn Nitơ , các muối khoáng và chất kích thích sinh trưởng . III.1.1Rỉ đường mía Rỉ đường mía là phần còn lại của dung dịch đường sau khi đã tách phần đường kính kết tinh. Số lượng và chất lượng của rỉ đường phụ thuộc vào gióng mía, điều kiện trồng trọt, hoàn cảnh địa lý và trình độ kỹ thuật chế biến của nhà máy đường. Thành phần chính của rỉ đường là : đường 62%; các chất phi đường 10%; nước 20%. +Nước trong rỉ đường gồm phần lớn ở trạng thái tự do và một số ít ở trạng thái liên kết dưới dạng hydrat. +Đường trong rỉ đường bao gồm : 25 ÷ 40% sacaroza; 15÷ 25% đường khử ( glucoza và fructoza ); 3÷ 5% đường không lên men được. Các giống vi khuẩn tham gia tổng hợp lysine đều có khả năng đồng hoá glucose, fructose, maltose, saccharose. Chúng không có khả năng đồng hoá lactose, rafinose, pentose. ** Các chất phi đường trong rỉ đường gồm có các chất hữu cơ và vô cơ . Các chất hữu cơ chứa nitơ của rỉ đường mía chủ yếu là các aminoacid cùng với một lượng rất nhỏ protein và sản phẩm phân giải của nó . Hàm lượng nitơ tổng trong rỉ đường mía chiếm 0,4-1,5% ( 0,7% trọng lượng của rỉ đường ) . Hợp chất phi đường không chứa nitơ bao gồm pectin , araban , galactan hoặc các sản phẩm thuy phân của chúng là arabinoza và galactoza , chất nhầy , chất màu và chất thơm . Pectin bị kết tủa trong quá trình chế biến đường nhưng các chất vừa nói không kết tủa và gần như không toàn vẹn đi vào rỉ đường (1,22-1,56%) . Các chất phi đường vô cơ chủ yếu là các loại muối : muối kali có nhiều trong rỉ đường vì muối kali (phân kali ) được dùng để bón cho mía , ngoài ra còn có muối canxi và gốc sulfat do các chất này được bổ sung vào ở giai đoạn xử lý nước mía và tinh luyện đường . ** Các loại acid hữu cơ trong rỉ đường được tìm thấy gồm : acid aconitic , acid lactic , acid malic , acid succinic , acid glyconic , acid citric và một lượng nhỏ acid fumalic , oxalic và gluconic . Riêng acid aconitic có nồng độ khá cao (1-1,5%) ** Các chất màu của rỉ đường bao gồm các chất caramen , melanoic , melanin , phức phenol-Fe2+ . Cường độ màu của rỉ đường tăng 3 lần khi nhiệt độ trong quá trình sản xuất đường tăng lên 10oC . Độ màu của rỉ đường tăng một phần cũng là do sự biến đổi của saccharose + Chất caramen : xuất hiện do quá trình nhiệt phân saccharose kèm theo loại trừ nước , hoàn toàn không có nitơ . Khi pH không đổi tốc độ tạo chất caramen tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng + Phức chất phenol-Fe2+ : là Fe2+- brenzcatechin có màu vàng xanh không thể loại hết ở giai đoạn làm sạch nước mía và đi vào rỉ đường + Melanodin : đây là sản phẩm ngưng tụ của đường khử và acid amin mà chủ yếu là acid aspartic . Sản phẩm ngưng tụ thường được biết nhiều nhất là acid fuscazinic đóng vai trò quan trọng làm tăng độ màu của rỉ đường + Melanin : được hình thành nhờ phản ứng oxy hóa khử các acid amin thơm nhờ xúc tác của enzym poy phenol oxydaza khi có mặt của O2 và Cu2+ + Ngoài ra rỉ đường còn chứa hợp chất màu nâu có CTPT C17-18H26-28O10N + Chất keo : có trong rỉ đường chủ yếu là pectin, chất sáp và chất nhầy . Các chất này ảnh hưởng rất nhiều đến sự phát triển của vi sinh vật tạo thành màng bao bọc quanh tế bào ngăn cản quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra môi trường . Ngoài các chất keo là nguyên nhân chính tạo ra một lượng bọt lớn trong môi trường cấy vi sinh vật , giảm hiệu suất sử dụng thiết bị. ** Các nguyên tố vi lượng trong rỉ đường : Fe (115mg/kg ) , Zn (34mg/kg ) , Mn (18mg/kg ) , Cu (5mg/kg ) , B (3mg/kg ) , Co (0,59mg/kg ) , Mo (0,2mg/kg ) ** Rỉ đường rất giàu các chất sinh trưởng như acid pantotenic , nicotinic , folic , B1 , B2 , đặc biệt là biotin –chất kích thích sinh trưởng) ** Có rất nhiều vi sinh vật trong rỉ đường mía . Đa số chúng từ nguyên liệu , một số nhỏ từ không khí , nước , đất vào dịch đường . Loại nào chịu được tác dụng nhiệt hay tác dụng của hóa chất thì tồn tại . Có thể phân thành 3 loại : vi khuẩn , nấm men , nấm mốc , trong đó vi khuẩn là nguy hiểm hơn cả vì nó gồm nhiều giống có khả năng sinh bào tử . Người ta phân rỉ đường thành 3 loại tùy thuộc theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm . Loại Số lượng vi sinh vật trong 1g rỉ đườngĐánh giá và xử lýI100.000Rất tốt , không cần xử lýII100000-1000000Trung bình , cần thanh trùngIII1000000-5000000Nhiễm nặng , cần xử lý nghiêm ngặt bằng hóa chất và tác dụng nhiệtLực đệm của rỉ đường : là loại lực có sức tự ngăn cản sự biến đổi phản ứng của rỉ đường khi bổ sung kiềm hoặc acid . Rỉ đường có tính đệm đặc trưng . Bình thường pH của rỉ đường mía khoảng 5,3-6,0 . Trong quá trình bảo quản pH có thể bị giảm do hoạt động của vi sinh vật tạp nhiễm tạo ra các acid hữu cơ . Khi thêm HCl hay H2SO4 vào rỉ đường , acid sẽ tác dụng với các muối kiềm của các acid hữu cơ làm xuất hiện các muối vô cơ ( KCl , NaCl , K2SO4 , Na2SO4 )và các acid hữu cơ tự do . Qua đó pH của rỉ đường bị thay đổi rất ít khi tiếp tục thêm acid HCl hay H2SO4 . Lực đệm của rỉ đường biểu hiện mạnh nhất ở pH=3,0-5,0 , trung bình ở pH=5,0-6,0 , rất yếu ở pH =6,0-7,07 III.1.2.Nguồn nitơ Người ta thường dùng các loại muối chứa NH4+ như NH4Cl, ( NH4)2SO4 , NH4H2PO4 , (NH4)2HPO4 , NH4OH hay khí NH3 hoặc ure làm nguồn cung cấp nito. Trong công nghiệp người ta thường dùng NH3, dưới dạng nước , khí hoặc ure. Khi dùng ure cần quan tâm đến nồng độ ban đầu vì khả năng chịu đựng ure của mỗi giống mỗi khác. III.1.3. Muối khoáng : Được sử dụng nhiều nhất là các dạng muối photpho. Nồng độ photpho thích hợp là: 0,008 – 0,02mg/l. Ngoài muối photpho ra, trong sản xuất, người ta phải bổ sung thêm MgSO4.7H2O với hàm lượng 0,03 – 0,5%. III.1.4. Chất kích thích sinh trưởng : Sử dụng biotin với hàm lượng 0,3mg/l và thiamin với hàm lượng 0,1mg/l III.2.Qui trình tổng hợp Lysine : Qui trình tổng hợp lysine bằng phương pháp lên men cũng giống như một qui trình lên men cổ điển, được tiến hành theo các giai đoạn sau: Bổ sung HCl và 0,4% chất metabisufit Giống vi sinh vật Khử trùng môi trường và thiết bị Chuẩn bị môi trường Nhân giống trên hệ thống lên men 150 lít 24h Acid hóa (pH=5) Nhân giống trong binh tam giác 24h Lên men (trong hệ thống lên men 1500 lít ) 72h Ly tâm liên tục (16000v/p) Cặn Cô đặc chân không đến nồng độ chất khô đạt 25-40% Phối trộn với tinh bột sắn (7:3) Chế phẩm L-lysine thô Chế phẩm L-lysine Ép thành viên Sấy khô đến độ ẩm 12% (to=50-55) Sắc ký trao đổi ion bằng nhựa Dowex 50 Thu dịch nổi Rửa cột trao đổi ion cho đến hết màu Quá trình nhả hấp phụ bằng NH3 Đun nóng dung dịch chứa lysine Chỉnh pH =5 Làm lạnh đến to=10-12oC xuất hiện tinh thể màu vàng nhạt CP L-lysine có độ sạch 97% Tái kết tinh Cô đặc chân không Ly tâm ***Thuyết minh quy trình : III.2.1.Chuẩn bị môi trường : Trong sản xuất Lysine, thường sử dụng các môi trường (ứng với 1000 ml)có các thành phần sau: Rỉ đường (130g), đậu tương thủy phân (10g) , NH4Cl (20g) , ure (5g) , KH2PO4 (1g) , MgSO4.7H2O (0,4g) , FeSO4 .7H2O (10mg) , MnSO4.4H2O (8mg) , biotin (0,3mg) , thiamin (0,1mg) ( duy trì pH = 7.0 bởi NaOH 2M). Sau khi pha chế xong môi trường , ta tiến hành hấp khử trùng môi trường ở áp suất 1atm trong 45 phút III.2.2.Khử trùng môi trường và thiết bị lên men : Trước khi khử trùng , toàn bộ tăng lên men và hệ thống ống dẫn khí , dẫn hơi được làm sạch , sau đó đóng chặt nắp tăng và cho hơi dẫn trực tiếp vào tăng . Ho8i dẫn vào khử trùng tăng phải đảm sạch và áp suất nồi hơi luôn giữ ở 2atm , áp suất trong tăng khi khử trùng là 1,5atm . Khi kim đồng hồ trong tăng chỉ 1,5atm thì bắt đầu tính giờ và áp suất này được giữ trong suốt thời gian khử trùng là 1 giờ. III.2.3.Nhân giống : Giống được mua ở cơ sở sản xuất giống có uy tín để đảm bảo chất lượng giống tốt là điều rất quan trong vì giống không tốt tức đáp ứng được yêu cầu của một giống VSV công nghiệp thì sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng sản phẩm . Quá trình nhân giống Corynebacterium glutamicum trước khi tiến hành len men để tạo sản phẩm là L-lysin gồm 2 giai đoạn : + Giai đoạn 1 : Nhân giống trong Erlen dung tích 500ml . Dùng Erlen 500ml cho vào 150ml môi trường đã chuẩn bị sẵn trước đó , cấy giống với tỷ lệ giống là 10% vào . Nuôi cấy trên thiết bị lắc (vận tốc 200v/p ) trong 24h , giữ ở nhiệt độ 30oC và pH=7 + Giai đoạn 2 : Nhân giống trên hệ thống lên men 150 lít /mẻ trong 24h , thiết bị nhân giống này là một thiết bị lên men cỡ nhỏ , thiết bị có trang bị cánh khuấy (với vận tốc 200v/p) và hệ thống sục khí oxy . Ở giai đoạn này giống cũng được cấy vào với tỷ lệ 10% so với thể tích môi trường , lượng oxy cần cung cấp là 100% vì giống Corynebacterium glutamicum là VSV hiếu khí cao , vẫn phải duy trì nhiệt độ là 30oC và pH=7 . III.2.4. Lên men : Tiến hành lên men trên hệ thống lên men 1500 l/mẻ trong 72h ở 30oC và luôn giữ pH=7 . Thiết bị lên men cũng được trang bị cánh khuấy và hệ thống sục khí tự động III.2.5. Thu nhận và tinh sạch lysine : Sau khi lên men, nồng độ chất khô trong dung dịch lên men vào khoảng 10 – 13%. Dung dịch sau khi lên men rất dễ bị hỏng do quá trình tự phân của vi khuẩn và do quá trình dễ bị nhiễm bỡi các vi sinh vật khác. Do đó, người ta thường giải quyết theo hai cách sau: III.2.5.1.Đem dịch sau lên men đi thu nhận và tinh chế lysine ngay. Dùng HCl axit hoá dung dịch lên men ( đưa về pH=5). Đồng thời, người ta bổ sung metabisulfit natri với liều lượng 0,4% so với dịch lên men để bảo quản dung dịch lên men. Quá trình thu nhận lysine tiếp tục đựơc thực hiện như sau: Dung dịch lên men đựơc bơm vào nồi cô đặc chân không (RP2- do Anh sản xuất), tiến hành cô đặc cho đến khi nồng độ chất khô trong dịch đạt tới 35 – 40%. Ta thu chế phẩm thô đầu tiên. Chế phẩm này có chứa khoảng từ 15 – 20% lysine ở dạng monochlohydrat, 15 – 17% Protein,4% axit amin, 10 -13% betain, 20 – 25 % tro và các thành phần dinh dưỡng khác. Ta có thể sử dụng ngay chế phẩm này cho chăn nuôi gia súc. Dạng chế phẩm này chỉ có thể bảo quản để sử dụng dần trong thời gian khoảng 4 tháng. Do đó, muốn bảo quản lâu hơn, ngừơi ta phải tạo ra những sản phẩm có độ ẩm thấp. Cách làm dễ nhất là dùng một loại chất độn nào đó ( phổ biến hiện nay là dùng tinh bột sắn với tỷ lệ 7:3 ) trộn vào dung dịch đã cô đặc trên, sau đó đem sấy khô ( ở nhiệt độ 50-55oC đến khi độ ẩm đạt khoảng 12%) để được dạng bột hoặc ép thành viên sau đó mới sấy, ta sẽ được sản phẩm dạng viên. Các chất độn thường được sử dụng là bột xương, bột ngũ cốc. III.2.5.2.Một cách khác được nhiều nhà máy hiện đại đang thực hiện là đưa dịch đã cô đặc đem sấy phun. Cách làm này cho ta hàm lượng lysin rất cao và độ ẩm giảm rất nhanh. Độ ẩm cuối cùng của loại sản phẩm này khoảng 5 – 6 %. Để thu nhận được L- lysin tinh khiết ở dạng kết tinh người ta thực hiện các bước sau: Dịch sau khi lên men được ly tâm trên hệ thống ly tâm liên tục với vận tốc 16000v/p để loại các tế bào VSV và các thành phần không tan. Dịch sau khi ly tâm sẽ được đưa qua hệ thống trao đổi ion cation bằng nhựa Dowex 50 . Sau đó cột được rửa nhiều lần cho hết màu và tiến hành quá trình nhả hấp phụ bằng 0,5 – 5 % dung dịch amoniac. Đun nóng dung dịch chứa lysine để loại amoniac. Sau đó dùng HCl hạ pH của dung dịch xuống đế 4,9 – 5. Tiến hành cô đặc chân không để nồng độ chất khô trong dung dịch đạt được 30 – 50% . Dưới tác dụng của HCl ( dùng trong khi hạ pH của dung dịch ), lysine sẽ chuyển sang dạng monochlohydrat lysine. Tiến hành làm lạnh toàn bộ đến nhiệt độ 10 – 120C. Khi đó thấy xuất hiện những tinh thể có màu vàng nhạt. Người ta tiến hành ly tâm để thu nhận tinh thể. Dịch sau khi ly tâm sẽ tái kết tinh để thu nhận triệt để lysine có trong dịch lên men. Muốn tinh thể sạch hơn, ngừoi ta hoà tan tinh thể trong cồn và lại kết tinh lại. Làm đi làm lại nhiều lần như vậy ta sẽ có tinh thể sạch. Lysine tinh khiết có độ sạch 97%, độ ẩm 0,5%, tro 0,3% được dùng trong thực phẩm và trong y học. . ***Quá trình sinh tổng hợp L-lysine ở quy mô phòng thí nghiệm xác định được rằng : Sinh khối phát triển cực đại ở 24h , pha cân bằng :24-78h , hàm lượng lysine tăng mạnh từ 18-72h , hàm lượng lysine đạt cao nhất 30g/l . ***Từ đó ta có thể so sánh để kết luận quá trình sinh tổng hợp L-lysine trên quy mô công nghiêp có hoàn thiện chưa , đồng thời xem xét các yếu tố ảnh hưởng đến nó . + Môi trường lên men + Điều kiện lên men Nhiệt độ trong quá trình lên men duy trì ở 28 – 300C. pH trong quá trình lên men duy trì ở 7,0 – 7,6. Lượng không khí đưa vào bằng dung dịch lên men/1 phút. Quá trình lên men là lên men chìm được thực hiện trong các thiết bị lên men có cánh khuấy và thổi khí liên tục. Lên men chìm: vi sinh vật được nuôi cấy ở môi trường dịch thể, chúng sẽ phát triển theo chiều đứng của cột môi trường. Trong quá trình lên men chìm này, cần liên tục theo dõi và thực hiện một số công việc sau: + Thực hiện quá trình khuấy đảo Cánh khuấy làm tăng khả năng tiếp xúc giữa chất dinh dưỡng và tế bào vi sinh vật. Có tiếp xúc giữa chất dinh dưỡng với tế bào vi sinh vật mới có sự trao đổi chất. Khả năng tiếp xúc càng nhiều, khả năng trao đổi chất càng mạnh. Do đó, hai phương pháp lên men hiếu khí và kỵ khí đều cần có cánh khuấy. Sự tiếp xúc này có thể được thực hiện từ những vị trí xa nhau giữa chất dinh dưỡng và VSV . Ví dụ, tế bào VSV ở vị trí rất xa chất dinh dưỡng, nhưng do cánh khuấy hoạt động, cả tế bào và chất dinh dưỡng sẽ chuyển động và có cơ hội gặp nhau. Sự tiếp xúc này còn biểu hiện ở chỗ, trong khi tiến hành các quá trình trao đổi chất, các chất sau đồng hóa và dị hóa sẽ tạo ra một lớp bao quanh tế bào . Lớp bao quanh tế bào này sẽ làm cản trở sự vận chuyển các chất vào tế bào. Khi cánh khuấy hoạt động, lớp bao quanh này sẽ bị phá bỏ, như vậy mức độ xâm nhập của các chất dinh dưỡng sẽ mạnh hơn. Trong trường hợp lên men trong điều kiện hiếu khí cánh khuấy làm tăng khả năng hòa tan của oxy. Các khí sẽ ở lại lâu hơn do dòng chuyển động của môi trường, và như vậy, khả năng hòa tan của oxy từ bọt khí sẽ cao hơn. Cánh khuấy làm tăng khả năng tách các khí CO2 , H2S , NH3… từ quá trình trao đổi chất, và như vậy, sẽ làm giảm ảnh hưởng xấu của các loại khí này đến sinh lý của VSV. Cánh khuấy làm tăng nhanh các quá trình sinh sản của vi khuẩn, nấm men và nấm sợi : do tác động cơ học mà các tế bào dễ dàng tách ra và sống độc lập. + Thực hiện quá trình sục khí Cung cấp oxy trong các trường hợp lên men hiếu khí. Khuấy đảo môi trường làm tăng quá trình trao đổi chất , quá trình phát triển và quá trình sinh sản. Giải phóng các chất khí được tạo ra từ quá trình trao đổi chất, làm giảm ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men. Trong không khí, ngoài các thành phần của không khí còn chứa rất nhiều VSV, do đó, không khí cung cấp cho quá trình lên men đòi hỏi phải được sạch sẽ về vi sinh vật và các tạp chất khác. Theo dõi sự tạo bọt khi lên men và có biện pháp phá bọt Khi tiến hành khuấy đảo và sục khí mạnh liên tục, trong các nồi lên men sẽ tạo ra rất nhiều bọt. Nó có khuynh hướng trào ra khỏi nồi lên men và gây nhiễm tạp môi trường lên men. Ngoài ra bọt khí cũng cản trở sự tiếp xúc giữa tế bào với môi trường dinh dưỡng . Do vậy, trong quá trình lên men, người ta cần kiểm soát lượng bọt tạo thành và tìm cách phá hủy chúng. Muốn phá bọt , người ta dùng các chất phá bọt với nhiều loại bao gồm các chất tự nhiên như các loại dầu thực vật ( dầu phộng), mỡ cá heo… và các chất được tổng hợp bằng con đường hóa học. + Điều chỉnh pH của môi trường lên men Mỗi loại VSV thích hợp với một giá trị pH nhất định của môi trường nuôi cấy như trong trường hợp này pH là từ 7,0 – 7,6 . Trong quá trình lên men, VSV lại tạo ra những sản phẩm trao đổi chất có tính acid hay kiềm, khiến pH của môi trường không còn thích hợp cho hoạt động sống của mình. Vì vậy, việc chủ động điều chỉnh pH của môi trường luôn ở giá trị thích hợp trong suốt quá trình lên men là điều rất cần thiết. Người ta có thể điều chỉnh độ pH của dịch lên men bằng các dung dịch NaOH, HCl, NH4OH, ure… hay bổ sung dung dịch đệm ( thường dùng hệ đệm phosphate) để ổn định pH của môi trường mà vẫn đảm bảo điều kiện vô trùng. + Theo dõi và điều chỉnh nhiệt độ của môi trường Cũng như pH của môi trường, nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của VSV và hiệu quả của việc lên men. Mỗi loại VSV đều thích ứng với nhiệt độ nhất định để sinh trưởng hoặc để tạo sản phẩm như trường hợp này thích hợp ở nhiệt độ 28 – 300C. Quá trình lên men luôn có sự tỏa nhiệt rất mạnh nên nhiệt độ trong các thiết bị lên men thường có xu hướng gia tăng vượt quá ngưỡng nhiệt độ thích hợp đối với hoạt động sống của VSV đó. Vì vậy phải thường xuyên giám sát và điều chỉnh nhiệt độ theo yêu cầu của quá trình lên men. Muốn đạt được nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men, người ta trang bị hệ thống làm nóng và làm nguội bằng nước chảy quanh nồi dưới dạng các ống ruột gà làm nguội. + Các yếu tố điều hoà quá trình lên men Trong quá trình nuôi cấy, biotin và homoserin có vai tró rất quan trọng. a). Lượng homoxerin (hay hỗn hợp metionin và trionin) rất cần thiết cho các chủng vi khuẩn tổng hợp lysine. Nên cho một lượng rất nhỏ. Nếu cho quá dư thừa sẽ xuất hiện ức chế, làm giảm rất nhiều lysine. Homoserin với nồng độ thấp, sự hình thành enzyme sẽ không bị cản trở, hoạt tính của chúng không bị ức chế, axit aspactic biến đổi thành aspartyl – β – andehyt với số lượng lớn, nó sẽ ngăn cản tạo thành homoserin và hướng tạo thành lysine. Lượng treonin tối ưu được bổ sung là 40mg/l. b). Biotin: có tác dụng kích thích vi khuẩn sinh trưởng và tích luỹ L-lysine, khi đủ biotin vi khuẩn sinh trưởng vừa phải, diển biến lên men êm dịu và L-lysine tạo được nhiều. khi thừa biotin vi khuẩn sinh trưởng rất mạnh mẽ, tiêu hao đường và sinh rất ít L-lysine. Lượng biotin bổ sung vào để thích hợp cho sự tạo thành Lysine là:7,5µg/l. Điều cuối cùng và cũng là điều hết sức quan trọng là xác định thời gan của một qui trình lên men. Thời gian này sẽ rất khác nhau ở các qui trình lên men khác nhau. Điểm mấu chốt là người sản xuất phải biết dừng quá trình lên men đúng lúc để đảm bảo thu sản phẩm với hiệu suất cao nhất. + Ưu và nhược điểm của lên men chìm Ưu điểm của lên men chìm là: Do có hệ thống khuấy đảo nên toàn bộ môi trường nuôi cấy là một thể đồng nhất , vì vậy, người ta có thể kiểm soát qui trình lên men một cách dể dàng . So với phương pháp lên men bề mặt, phương pháp lên men chìm ít chiếm mặt bằng , dễ cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình theo dõi. Tỷ lệ nhiễm khuẩn từ bên ngoài thấp hơn Nhược điểm Đầu tư nhiều kinh phí cho trang thiết bị Nếu mẻ lên men vì một lý do nào đó bị hỏng thì không thể xử lý cục bộ như lên men bề mặt mà quá trình xử lý sẽ rất phức tạp, và thường là phải hủy bỏ toàn bộ đợt lên men . + Trong suốt quá trình lên men xảy ra hai pha rất rõ rệt: Pha tạo thành sinh khối Sự tạo thành sinh khối ở pha đầu tiên, thường xảy ra rất mạnh trong thời gian từ 12 – 18 giờ sau khi bắt đầu nuôi cấy. Sau đó tốc độ tạo thành sinh khối sẽ chậm lại. Pha tạo thành lysine Trong thời gian tốc độ tạo thành sinh khối bắt đầu giảm, hàm lượng lysine được tổng hợp bắt đầu tăng dần. Pha tạo thành Lysine kéo dài khoảng 40 – 60 giờ. Năng suất Lysine sau khi lên men đạt từ 50 – 60 g/l Lên men(Giai đoạn này thì vi khuẩn tạo ra lysine) ***Cơ chế tổng hợp lysine Điểm quan trọng trong cơ chế sinh tổng hợp lysine của vi khuẩn là lysine tổng hợp cùng với methionin, treonin đều xuất phát từ một chất chung, đó là chất Aspactat – β – semialdehyd. Qúa trình tổng hợp xảy ra sơ đồ sau : Glucose Piruvat Oxalaxetat β– Asparty – photphat Aspactat – β – sinialdehyd 3 Homogerin Lysine Methionin Treonin izoloxin Từ sơ đồ trên cho ta thấy rằng: muốn vi khuẩn tạo ra nhiều Lysine thì sự tiến hoá phải theo nhánh 3. Ở đây, các chủng đột biến mất enzyme homoserin dehydrogenase, do đó sẽ không tạo ra tronin và methionin. Mặt khác, enzyme dihydropicolinatsyntetase không mẫn cảm dị lập thể nên sự ức chế không còn. Kết quả là Lysine sẽ được tổng hợp thừa. Tài liệu tham khảo Nguyễn Đức Lượng, Vi Sinh Vật Học Công Nghiệp, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM, 2006 Nguyễn Đức Lượng, Công Nghệ Sinh Học, NXB ĐH Quốc Gia TP.HCM, 2001 Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Đình Quyến cùng Phạm Văn Ty, Vi Sinh Vật Học, NXB Giáo Dục, 2003 GS.TS.Nguyễn Thị Hiền, Công Nghệ Sản Xuất Mì Chính Và Các Sản Phẩm Lên Men Cổ Truyền, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, 2006 Trần Thị Thanh, Công Nghệ Vi Sinh, NXB Giáo Dục, 2007. A.M.Bezborodov, Nguyễn Văn Uyển và Các Cộng Sự, Công Nghệ Sinh Học và một số ứng dụng tại Việt Nam, NXB Nông Nghiệp, 1994 Sinh hóa ứng dụng – Đồng Thị Thanh Thu – NXB ĐH Quốc Gia TP.HCM Tài liệu trên Web  HYPERLINK "" .  HYPERLINK ""   HYPERLINK ""