Nghiên cứu chiết tách carrageenan từ rong sụn và ứng dụng cố định tế bào vi sinh vật

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGUYỄN THỊ THU THÙY NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN VÀ ỨNG DỤNG CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT Chuyên ngành: Cơng nghệ thực phẩm và đồ uống Mã số: 60.54.02 TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Đà Nẵng – Năm 2011 2 Cơng trình được hồn thành tại ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Lê Thị Liên Thanh Phản biện 1: TS Đặng Minh Nhật. Phản biện 2: TS. Huỳnh Ngọc Thạch. Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ kỹ thuật họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 26 tháng 07 năm 2011. Cĩ thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thơng tin – Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng 3 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nghiên cứu chiết tách carrageenan từ rong biển và ứng dụng giúp bổ sung những tư liệu về họ thực vật rong biển. Việc chiết tách carrageenan cĩ hiệu suất cao và chất lượng tốt là cơ sở để tiến tới sản xuất polysaccharide này ở quy mơ cơng nghiệp. Từ đĩ nâng cao giá trị kinh tế của rong sụn, thúc đẩy việc mở rộng diện tích trồng rong, cải thiện đời sống cho người dân ven biển. Ngồi ra, sự đầu tư phát triển cây rong cịn làm giảm nguy cơ ơ nhiễm mơi trường biển. Cố định nấm men trong hạt gel để lên men rượu vang giúp cơng đoạn loại bỏ nấm men trong hạt gel cĩ kích thước vài mi-li-mét ra khỏi dịch lên men sẽ rất dễ dàng bằng phương pháp lắng lọc. Nhờ đĩ tạo điều kiện cải thiện chất lượng sản phẩm dạng trong mà khơng phải đầu tư nhiều vào cơng kỹ nghệ lọc. Ngồi ra cố định nấm men cịn tạo sự chủ động về mức độ lên men theo ý muốn và cơ hội tái sử dụng hạt gel là cĩ thể. Đĩ là lý do tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách carrageenan từ rong sụn và ứng dụng cố định tế bào vi sinh vật”. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu và đề xuất quy trình chiết tách carrageenan cĩ hiệu suất thu hồi cao và chất lượng tốt. Từ đĩ, sử dụng nguồn carrageenan chiết tách được để cố định tế bào nấm men lên men rượu vang. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu Cây rong sụn được thu hoạch ở vùng biển Ninh Thuận. 3.2. Phạm vi nghiên cứu - Dùng rong sụn ở tỉnh Ninh Thuận để chiết tách carrageenan. 4 - Cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae nhờ carrageenan chiết tách được để tiến hành lên men rượu vang. 4. Phương pháp nghiên cứu 4.1. Phương pháp vật lý - Đo các thơng số nhiệt độ, khối lượng, độ nhớt … - Xác định hàm lượng ẩm của rong sụn và các sản phẩm carrageenan chiết tách được. - Đo độ hấp thụ quang của mơi trường lên men để đánh giá lượng nấm men trong dịch lên men. - Xác định hàm lượng cồn trong mẫu rượu vang. 4.2. Phương pháp hố học - Xác định hàm lượng glucid của nguyên liệu rong sụn. - Xác định hàm lượng carrageenan của rong sụn và các sản phẩm carrageenan chiết tách được. - Xác định hàm lượng protein của rong sụn. 4.3. Phương pháp vi sinh 4.3.1. Nuơi sinh khối nấm men Nhân giống, phát triển sinh khối để đủ dùng cho nghiên cứu cố định nấm men. 4.3.2. Thu sinh khối và làm sạch. Ly tâm thu nấm men từ mơi trường nhân giống và rửa nhiều lần qua nước cất đã tiệt trùng để cĩ được huyền phù nấm men sạch. 4.3.3. Phương pháp tạo hạt gel cố định nấm men Đây là khâu quan trọng trong nghiên cứu cố định vi sinh vật với chất mang carrageenan. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5.1. Ý nghĩa khoa học - Xác định một số thành phần hĩa học của rong sụn Ninh Thuận. 5 - Xác định một số yếu tố cơng nghệ ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu suất chiết tách carrageenan. - Xác định khả năng cải thiện độ trong của rượu vang nho sau lên men bằng hạt gel carrageenan chứa nấm men. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu chiết tách carrageenan gĩp phần nâng cao giá trị sử dụng và hiệu quả kinh tế từ cây rong. Nhờ đĩ, thúc đẩy việc mở rộng diện tích trồng rong, đem lại nguồn lợi mới từ biển và gĩp phần cải thiện đời sống người dân, hỗ trợ cải thiện vấn đề ơ nhiễm mơi trường biển. - Cố định nấm men sản xuất rượu vang giúp đơn giản hĩa khâu lọc trong, nâng cao chất lượng sản phẩm, tiết kiệm chi phí sản xuất. 6. Cấu trúc luận văn Luận văn gồm 66 trang, 4 bảng số liệu, 42 hình, 32 tài liệu tham khảo. Nội dung của luận văn được trình bày theo các phần sau: Mở đầu Chương 1 – Tổng quan tài liệu. Chương 2 – Đối tượng và phương pháp nghiên cứu. Chương 3 – Kết quả và thảo luận. Kết luận và kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục 6 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về rong sụn 1.1.1. Đặc điểm thực vật Rong sụn cĩ tên khoa học là Kappaphycus alvarezii. Rong sụn chỉ sinh trưởng và phát triển tốt ở vùng nước cĩ độ mặn cao (28 – 32‰), phát triển tốt ở vùng nước thường xuyên trao đổi và luân chuyển, nhiệt độ sinh trưởng thích hợp nhất là 25 – 28oC. 1.1.2. Thành phần hĩa học Hàm lượng nước trong rong sụn chiếm từ 77 – 91%. Các thành phần hĩa học khác được trình bày ở bảng 1.1. Bảng 1.1. Thành phần hĩa học của rong sụn ở biển miền Trung: TT Thành phần Hàm lượng (% chất khơ) 1. Carrageenan 40 – 55 2. Cellulose 4,0 3. Protein 2,4 4. Khống 20 – 30 5. Chất béo 1 – 2 1.2. Giới thiệu chung về carrageenan 1.2.1. Cấu tạo của carrageenan Hình 1.2. Cấu tạo của carrageenan với liên kết luân phiên β -1,4 và α -1,3. 7 1.2.2. Phân loại Các loại carrageenan phổ biến trong tự nhiên là: κ-, ι -, λ, µ- và ν-carrageenan. 1.2.3. Tính chất hĩa lý của carrageenan * Khối lượng phân tử Phần lớn các carrageenan cĩ phân tử lượng từ 500 – 1000kDa, nhưng trong đĩ chúng cĩ thể chứa tới 25% polysaccharide với phân tử lượng nhỏ dưới 100kDa. * Độ tan Carrageenan tan trong nước, nhưng độ tan của nĩ phụ thuộc vào dạng, nhiệt độ, pH, nồng độ của ion và các chất tan khác. * Độ nhớt đặc trưng Độ nhớt của dung dịch carrageenan phụ thuộc vào nhiệt độ, dạng, khối lượng phân tử của nĩ và sự cĩ mặt của một số ion khác. * Tính chất tạo gel • Khả năng tạo gel của carrageenan Khả năng tạo gel của carrageenan phụ thuộc: cấu trúc hĩa học và nồng độ của polyme, bản chất và nồng độ của các cation thêm vào, số và vị trí của các nhĩm sulphat cĩ trong mỗi dạng carrageenan. • Cơ chế tạo gel khi hạ nhiệt độ Hình 1.5. Chuyển đổi của carrageenan từ dung dịch sang gel theo nhiệt độ. 8 Gel carrageenan cĩ tính thuận nghịch về nhiệt và cĩ tính trễ nhiệt, nghĩa là nhiệt độ tạo gel và nhiệt độ nĩng chảy gel khác nhau. • Tác dụng của các cation trong quá trình tạo gel Để hình thành gel mạnh các anion của carrageenan cần các cation gây nên tương tác tĩnh điện và liên kết hydro để hình thành mạng lưới cấu trúc khơng gian ba chiều, thí dụ, các cation kali trong trường hợp κ-carrageenan và canxi trong trường hợp ι-carrageenan. 1.2.4. Ứng dụng của carrageenan Carrageenan cĩ ứng dụng đa dạng trong thực phẩm và nhiều ngành khác. Đặc biệt do đặc tính cấu trúc rỗng xốp nên carrageenan cĩ khả năng giữ cố định enzyme hoặc tế bào. 1.3. Chiết tách carrageenan 1.3.1. Xử lý rong trước khi nấu chiết * Mục đích chung của xử lý rong trước khi nấu chiết: Khử tạp chất ở cây rong (khống, màu, protein, cellulose, lipid…) khơng cĩ lợi cho sản phẩm carrageenan và làm suy giảm màng liên kết tế bào chứa carrageenan nâng cao hiệu suất và chất lượng sản phẩm. Cĩ hai phương pháp để xử lý rong là xử lý rong trong mơi trường axit và xử lý rong trong mơi trường kiềm. 1.3.2. Nấu chiết carrageenan Trong quá trình nấu chiết carrageenan, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách cao và chất lượng lượng sản phẩm tốt là: bản chất dung mơi, nhiệt độ, thời gian, lượng dung mơi. 1.3.3. Tách nước từ dịch keo Cĩ 2 phương pháp phổ biến để tách nước từ dịch keo sau khi nấu chiết là phương pháp lạnh đơng tan giá và phương pháp kết tủa. Sau khi tách nước carrageenan được sấy khơ đến độ ẩm 20 – 22% để thuận lợi cho việc bảo quản. 9 1.4. Cố định vi sinh vật 1.4.1. Các loại chất mang cĩ thể dùng để cố định vi sinh vật 1.4.2. Yêu cầu chung của chất mang cố định vi sinh vật - Chất mang phải rẻ tiền. - Chất mang cĩ tính chất cơ lý bền vững, ổn định, chịu được các điều kiện sản xuất như khuấy trộn, cĩ áp lực. - Chất mang phải khơng tan trong mơi trường phản ứng. - Chất mang khơng làm mất hay ức chế hoạt tính enzym của vi sinh vật, nhưng phải bền vững với sự tấn cơng của vi sinh vật, cĩ khả năng cố định vi sinh vật dễ dàng, an tồn với vi sinh vật. - Chất mang phải phù hợp với hình dạng thiết bị phản ứng sinh học và cĩ thể sử dụng nhiều lần. - Chất mang phải cĩ diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. 1.4.3. Giới thiệu về cố định vi sinh vật trong carrageenan Cố định tế bào vi sinh vật trong carrageenan là nhốt tế bào trong loại gel này, các tế bào được giữ trong mạng lưới khơng gian ba chiều của carrageenan tạo bởi các liên kết ngang nhờ một số ion kim loại Ca2+, K+… Mạng lưới này cĩ lỗ nhỏ tới mức khơng cho tế bào thốt ra nhưng đủ lớn cho cơ chất và sản phẩm tạo ra cĩ thể ra vào dễ dàng. Vì thế gel carrageenan cĩ tác dụng như một màng bán thấm. Cố định vi sinh vật trong gel carrageenan mang lại nhiều lợi ích: - Tế bào sau khi được cố định cĩ thể tái sử dụng được nhiều lần giảm bớt số lần chuẩn bị nhân giống cho sản xuất. - Vi sinh vật được giữ trong gel carrageenan, khơng lẫn vào sản phẩm nên tách sẽ tách khỏi mơi trường dễ dàng. Từ đĩ tiết kiệm chi phí lọc trong và chủ động ngừng phản ứng theo ý muốn. Việc này cĩ ý nghĩa lớn với sản phẩm địi hỏi độ trong cao như: bia, rượu vang… 10 1.4.4. Tiến hành cố định vi sinh vật Hình 1.10. Các bước cố định vi sinh vật trong carrageenan. 1.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.5.2.Tình hình nghiên cứu trong nước Những cơng bố trong và ngồi nước đã cung cấp một số thơng tin về rong sụn, thành phần carrageenan và kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật. Tuy nhiên ở nước ta vì rong sụn mới được du nhập vào từ năm 1993 nên những kết quả cụ thể về chiết tách carrageenan và ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm chưa cĩ nhiều. Dựa vào những hiểu biết về thực phẩm và tính chất của carrageenan, tơi chọn hướng nghiên cứu cho luận văn là “Nghiên cứu chiết tách carrageenan từ rong sụn và ứng dụng cố định tế bào vi sinh vật”. Với niềm say mê về định hướng đã chọn, tơi nhận thấy đề tài sẽ là cơ hội để tơi tích lũy kiến thức, mở rộng hiểu biết về cơng nghệ chiết tách và phương pháp tạo gel bền để cố định tế bào vi sinh vật mà tơi rất mong đợi thành cơng. 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Đối tượng nghiên cứu là rong sụn (Kappaphycus alvarezii) được thu hoạch tại tỉnh Ninh Thuận. 2.1.2. Hĩa chất 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị dùng trong nghiên cứu 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vật lý
Xác định độ ẩm Phương pháp 1: Dùng tủ sấy để sấy đến khối lượng khơng đổi. Phương pháp 2: Dùng máy đo độ ẩm bằng hồng ngoại.
Xác định độ nhớt Để đánh giá chất lượng của các mẫu sản phẩm carrageenan chiết tách được cần xác định độ nhớt của dung dịch sản phẩm carageenan ở nồng độ và nhiệt độ xác định. Tiến hành đo độ nhớt ở nồng độ dung dịch sản phẩm carrageenan 1%, nhiệt độ 70oC bằng máy đo độ nhớt Brookfield của Mỹ.
Đo mật độ quang (OD) Đo mật độ quang của dịch lên men trên máy quang phổ hấp phụ UV/VIS ở bước sĩng 600nm để đánh giá số lượng tế bào vi sinh vật.
Xác định hàm lượng cồn sau lên men - Nguyên tắc: Chưng cất để tách hết cồn trong rượu vang rồi bổ sung nước cất vào để đạt bằng thể tích rượu vang đem đi chưng cất, điều chỉnh nhiệt độ về 20oC và dùng cồn kế để đo độ cồn. 12 2.2.2. Phương pháp hĩa học
Xác định hàm lượng glucid Hàm lượng glucid của nguyên liệu rong sụn được xác định tại Viện nghiên cứu cơng nghệ sinh học và mơi trường, số 2 Nguyễn Đình Chiểu, thành phố Nha Trang.
Xác định hàm lượng carrrageenan Hàm lượng carrageenan của rong sụn và các mẫu sản phẩm carrageenan được xác định tại Viện nghiên cứu cơng nghệ sinh học và mơi trường, số 2 Nguyễn Đình Chiểu, thành phố Nha Trang.
Xác định hàm lượng protein Hàm lượng protein được xác định tại Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2, số 97 Lý Thái Tổ, thành phố Đà Nẵng. 2.2.3. Phương pháp vi sinh
Nuơi sinh khối nấm men Từ nấm men giống Saccharomyces cerevisiae cần phải hoạt hĩa, nhân giống để phát triển sinh khối, đủ số lượng nấm men dùng cho nghiên cứu ứng dụng cố định vi sinh vật.
Thu sinh khối và làm sạch Sau khi nuơi sinh khối nấm men, tiến hành ly tâm và rửa nhiều lần qua nước cất đã tiệt trùng để cĩ nấm men sạch dùng cho nghiên cứu ứng dụng cố định vi sinh vật.
Phương pháp tạo hạt gel cố định nấm men Tạo hạt gel carrageenan cố định nấm men là một kỹ thuật phức tạp, cần phải trải qua nhiều cơng đoạn. 13 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định một số thành phần hĩa cơ bản của rong sụn Kết quả phân tích thành phần hĩa học của rong sụn như sau: - Nước: 82,2%. - Carrageenan: 39,83% chất khơ - Glucid: 42,8% chất khơ - Protein: 0,59% chất khơ 3.2. Nghiên cứu điều kiện chiết tách carrageenan từ rong sụn Chúng tơi cĩ hai mục tiêu khi chiết tách carrageenan là hiệu suất chiết tách cao và chất lượng sản phẩm tốt. Hiệu suất chiết tách là tỉ lệ phần trăm khối lượng carrageenan thu được trên khối lượng carrageenan trong nguyên liệu. Chất lượng của sản phẩm được đánh giá thơng qua chỉ tiêu độ nhớt của dung dịch sản phẩm carrageenan ở một nồng độ và nhiệt độ xác định. Độ nhớt cao là tiền đề để thu được sản phẩm carrageenan cĩ khả năng tạo gel bền vững. Vì vậy mục tiêu của quá trình chiết tách được cụ thể hĩa là hiệu suất chiết tách carrageenan cao và độ nhớt dung dịch sản phẩm carrageenan lớn. Tiếp theo, chúng tơi khảo sát các điều kiện cơng nghệ của quá trình chiết tách carrageenan để cĩ hiệu suất chiết tách cao, độ nhớt của dung dịch sản phẩm lớn 3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nấu chiết đến hiệu suất chiết tách và độ nhớt của dung dịch sản phẩm carrageenan Tiến hành thí nghiệm: Rửa sạch rong, để ráo, cắt đoạn từ 3 – 5cm, trộn đều. Lấy 5 mẫu, khối lượng 1 mẫu là 20g. Nấu chiết mỗi mẫu theo tỉ lệ khối lượng nước/rong = 5/1 trong 50 phút ở: 90oC, 95oC, 100oC, 105oC, 110oC. Lọc thu qua rây cĩ đường kính lỗ 1mm. Kết tủa dịch lọc với ethanol 80o ở 60oC, tỉ lệ thể tích ethanol 80o/dịch trong = 5/1. Sấy ở 50oC trong thời gian 5 giờ. Để nguội trong bình hút ẩm 30 phút. Cân, đo độ ẩm, xác định hàm lượng carrageenan 14 20 22 24 26 28 30 32 34 85 90 95 100 105 110 115 Nhiệt độ nấu (oC) H iệ u su ất ch iế t t ác h (% ) 50 100 150 200 250 300 350 85 90 95 100 105 110 115 Nhiệt độ nấu (oC) Đ ộ n hớ t ( cP ) trong các sản phẩm, sau đĩ tính hiệu suất chiết tách. Đo độ nhớt của các dung dịch sản phẩm carrageenan ở nồng độ 1%, nhiệt độ 70oC. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2 và 3.3. Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ nấu chiết đến hiệu suất chiết tách carrageenan. Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ nấu chiết đến độ nhớt dung dịch sản phẩm carrageenan. Từ đồ thị 3.2 và 3.3, chúng tơi chọn nhiệt độ nấu chiết là 95oC. 3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian nấu chiết đến hiệu suất chiết tách và độ nhớt của dung dịch sản phẩm carrageenan Các bước tiến hành thí nghiệm tương tự như mục 3.2.1 nhưng nấu chiết 5 mẫu rong đều ở nhiệt độ 95oC, với thời gian khác nhau là 40 phút, 50 phút, 60 phút, 70 phút, 80 phút. 15 20 22 24 26 28 30 32 30 40 50 60 70 80 90 Thời gian nấu (phút) H iệ u su ất ch iế t t ác h (% ) 50 150 250 350 450 550 650 30 40 50 60 70 80 90 Thời gian nấu (phút) Đ ộ n hớ t ( cP ) Kết quả được thể hiện ở hình 3.5 và 3.6. Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian nấu chiết đến hiệu suất chiết tách carrageenan. Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian nấu chiết đến độ nhớt dung dịch sản phẩm carrageenan. Từ kết quả ở hình 3.5 và 3.6, chọn thời gian nấu chiết 60 phút. 3.2.3. Ảnh hưởng của lượng nước nấu chiết đến hiệu suất chiết tách và độ nhớt của dung dịch sản phẩm carrageenan Tiến hành thí nghiệm tương tự như mục 3.2.1 nhưng trong thí nghiệm này 5 mẫu rong đều dùng nhiệt độ nấu là 95oC, thời gian nấu là 60 phút với tỉ lệ khối lượng nước/rong lần lượt là 100/20 =5,0; 150/20 = 7,5; 200/20 = 10; 250/20 = 12,5; 300/20 = 15. Kết quả được thể hiện ở hình 3.8 và 3.9. 16 30 31 32 33 34 35 36 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 Tỉ lệ khối lượng nước nấu/rong H iệ u su ất ch iế t t ác h (% ) 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 Tỉ lệ khối lượng nước nấu/rong Đ ộ n hớ t ( cP ) Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của lượng nước nấu chiết đến hiệu suất chiết tách carrageenan. Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của lượng nước nấu chiết đến độ nhớt dung dịch sản phẩm carrageenan. Tỉ lệ khối lượng nước/rong được chọn là 10. Xử lý rong trước khi nấu chiết carrageenan cĩ tác dụng khử các tạp chất khơng cĩ lợi, làm suy giảm liên kết carrageenan với các phần tử khác thuận lợi cho cơng đoạn nấu chiết giải phĩng carrageenan. Nhờ đĩ nâng cao hiệu suất chiết tách và chất lượng sản phẩm. Tuy nhiên, cĩ những nhận định cho rằng xử lý rong gây ra sự bẻ gãy mạch làm giảm chất lượng và hiệu suất chiết tách carrageenan. Vì vậy, nghiên cứu điều kiện xử lý rong (nồng độ, thời gian) sau khi đã nghiên cứu điều kiện nấu chiết để cĩ sự so sánh từ đĩ đánh giá tính tích cực hay tiêu cực của cơng đoạn này. 17 35 37 39 41 43 45 47 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Nồng độ KOH (%) H iệ u su ất ch iế t t ác h (% ) 3.2.4. Nghiên cứu điều kiện xử lý rong trước khi nấu chiết Chọn mơi trường xử lý rong là dung dịch KOH vì đây là mơi trường kiềm sẽ cĩ nhiều ưu điểm hơn mơi trường axit và sự cĩ mặt của ion K+ cịn làm tăng khả năng tạo đơng của κ-carrageenan. 3.2.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch KOH đến hiệu suất chiết tách carrageenan và độ nhớt dung dịch sản phẩm carrageenan Tiến hành rửa sạch rong, để ráo, cắt đoạn từ 3 – 5cm, trộn đều. Lấy 5 mẫu rong, mỗi mẫu: 20g, ngâm vào 5 dung dịch KOH với tỉ lệ khối lượng dung dịch KOH/rong = 3/2 trong 60 phút, với các nồng độ là 5,5%; 6,0%; 6,5%; 7,0%; 7,5%. Trung hịa bằng acid acetic 10% đến pH bằng 7. Rửa lại bằng nước sạch. Nấu chiết theo tỉ lệ khối lượng nước/rong = 10/1 trong 60 phút ở 95oC. Lọc bỏ bã. Kết tủa dịch bằng ethanol 80o ở 60oC, tỉ lệ ethanol 80o/dịch lọc = 5. Sấy kết tủa ở 50oC trong 5 giờ. Để nguội các sản phẩm carrageenan trong bình hút ẩm 30 phút rồi đem cân, đo độ ẩm, phân tích hàm lượng carrageenan, tính hiệu suất chiết tách carrageenan. Đo độ nhớt của các dung dịch sản phẩm carrageenan ở nồng độ 1%, nhiệt độ 70oC. Kết quả được thể hiện ở hình 3.11 và 3.12. Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất chiết tách carrageenan. 18 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Nồng độ KOH (%) Đ ộ n hớ t ( cP ) Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ KOH đến độ nhớt dung dịch sản phẩm carrageenan. Qua nghiên cứu này cĩ thể chứng minh được tính hiệu quả của việc xử lý rong cả về chất lượng và hiệu suất thu hồi nếu sử dụng chế độ xử lý rong hợp lý. Từ kết quả trên các hình 3.11 và 3.12, chúng tơi chọn nồng độ KOH xử lý rong tốt nhất là 6,5%. Để tìm cách tăng độ nhớt và hiệu suất chiết tách carrageenan hơn nữa, cần tìm ra thời gian ngâm phù hợp nhất khi sử dụng KOH 6,5%. 3.2.4.2. Ảnh hưởng của thời gian ngâm rong trong dung dịch KOH đến hiệu suất chiết tách và độ nhớt dung dịch sản phẩm carrageenan Tiến hành thí nghiệm tương tự như mục 3.2.4.1 nhưng xử lý các mẫu rong ở nồng độ KOH 6,5% với những khoảng thời gian khác nhau là: 50 phút, 60 phút, 70 phút, 80 phút, 90 phút. Kết quả được thể hiện ở hình 3.14 và 3.15. 19 35 37 39 41 43 45 47 49 51 40 50 60 70 80 90 100 Thời gian xử lý KOH (phút) H iệ u su ất ch iế t t ác h (% ) 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 40 50 60 70 80 90 100 Thời gian xử lý KOH (phút) Đ ộ n hớ t ( cP ) Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian xử lý rong với dung dịch KOH đến hiệu suất chiết tách carrageenan. Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian xử lý rong với dung dịch KOH đến độ nhớt dung dịch sản phẩm carrageenan. Từ đồ thị ở hình 3.14 và 3.15 cĩ thể thấy với dung dịch KOH 6,5% chọn thời gian xử lý là 80 phút là phù hợp nhất. Như vậy thơng qua mục 3.2.3, cĩ thể khẳng định trong quy trình chiết tách carrageenan nên cĩ cơng đoạn xử lý rong bằng dung dịch KOH 6,5% trong thời gian 80 phút để tăng hiệu suất chiết tách và độ nhớt của dung dịch sản phẩm carrageenan. 20 3.2.5. Đề xuất quy trình chiết tách carrageenan Hình 3.16. Sơ đồ quy trình chiết tách carrageenan từ rong sụn. - Nồng độ: 6,5% - Thời gian: 80 phút Rong nguyên liệu Ngâm dung dịch KOH Trung hịa bằng acid acetic Rửa lại bằng nước sạch Nấu chiết Lọc lấy dịch Kết tủa bằng cồn 80o Sấy khơ Để nguội, bao gĩi - Nồng độ acid acetic: 10% - Trung hịa đến pH =7 - Tỉ lệ khối lượng nước/rong = 10 - Nhiệt độ nấu: 95oC - Thời gian nấu: 60 phút - Nhiệt độ cồn: 60oC - Vcồn = 5 Vdịch cần kết tủa - Nhiệt độ: 50oC - Thời gian: 5 giờ Rửa sạch, cắt đoạn Cắt đoạn từ 3 – 5cm Sản phẩm 21 3.3. Ứng dụng carrageenan trong việc cố định tế bào nấm men lên men rượu vang Sử dụng: chủng nấm men là Saccharomyces cerevisiae, mơi trường lên men là nước nho và chất hỗ trợ cho việc cố định nấm men trong carrageenan là KCl. Hiệu quả cố định nấm men được kiểm tra bằng cách đánh giá lượng tế bào rị rỉ ra mơi trường lên men nhờ phương pháp đo độ hấp thụ quang của mơi trường sau lên men. Chỉ số OD càng bé thể hiện hiệu quả cố định nấm men càng tốt. Trong kỹ thuật cố định nấm men, nồng độ carrageenan bé thì hạt gel sẽ kém bền, cịn với nồng độ carrageenan lớn sẽ làm hạt cho gel carrageenan mà nhất là loại κ-carrageenan cĩ đặc tính cứng, giịn và dễ nứt vỡ. Đây chính là những nguy cơ giải phĩng nấm men ra mơi trường lên men. Vì vậy nghiên cứu dưới đây được tiến hành để xác định nồng độ carrageenan cố định nấm men hiệu quả nhất. 3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến hiệu quả cố định nấm men Kết quả được thể hiện ở hình 3.27. Hình 3.27. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến hiệu quả cố định nấm men. Mật độ quang (OD) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 1 1,5 2 2,5 3 Nấm men tự do Nồng độ (%g/ml) 22 Chọn nồng độ carrageenan 2 (%g/ml) để cố định nấm men. Hạt gel canxi aginat sau khi cố định nấm men trải qua cơng đoạn sấy ở 40oC trong 60 phút cĩ cấu trúc ổn định hơn, tăng cường khả năng cố định tế bào vi sinh vật hơn. Tơi tiến hành cùng điều kiện này với carrageenan với mong muốn cải thiện được độ trong của mơi trường lên men hơn nữa. 3.3.2. So sánh hiệu quả cố định nấm men trong điều kiện hạt gel cĩ qua sấy và khơng qua sấy Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị 1 mẫu lên men dùng nấm men tự do để đối chứng, 3 mẫu lên men dùng nấm men cố định trong hạt gel carragenan 2 (%g/ml) khơng trải qua giai đoạn sấy và 3 mẫu lên men dùng hạt gel cố định nấm men trong carrageenan 2 (%g/ml) cĩ qua giai đoạn sấy ở 40oC trong 60 phút. Kết quả được thể hiện trên hình 3.29. Hình 3.29. Đồ thị biểu diễn hiệu quả cố định nấm men trong điều kiện hạt gel được sấy và khơng sấy. Kết luận: Để tăng sự ổn định gel, tăng hiệu quả cố định nấm men trong hạt gel thì trước khi đưa hạt gel vào mơi trường lên men cần phải sấy ở 40oC trong thời gian 60 phút. Mật độ quang (OD) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Mẫu 1 0.29 0.045 0.02 Mẫu 2 0.046 0.023 Mẫu 3 0.042 0.018 Nấm men tự do Hạt gel khơng sấy Hạt gel được sấy 23 Tiếp theo, tơi nghiên cứu khả năng tạo thành cồn của nấm men cố định trong carrageenan cĩ qua cơng đoạn sấy so với nấm men tự do để đánh giá khả năng chuyển hĩa cơ chất của nấm men cố định. 3.3.3. Nghiên cứu khả năng tạo thành cồn của nấm men cố định so với nấm men tự do Kết quả xác định hàm lượng cồn bằng phương pháp chưng cất cho thấy mẫu lên men dùng nấm men tự do và dùng hạt gel cố định nấm men trong carrageenan 2 (%g/ml) đã qua sấy đều cho hàm lượng cồn trong rượu vang là 11o ở 20oC. Như vậy nấm men được cố định trong carrageenan cĩ khả năng lên men tương đương như nấm men tự do. Tiếp theo chúng tơi tiến hành quan sát hạt gel để rút ra một vài nhận xét về quá trình tạo hạt gel của mình. 3.3.4. Quan sát hạt gel Hình 3.31. Các các hạt gel được lấy ra sau khi lên men. Theo hình 3.31 cĩ thể thấy các hạt gel trong nghiên cứu của chúng tơi chưa đạt được đến kích thước nhỏ và đồng đều như trong nghiên cứu ở nước ngồi. Mặc dù vậy, thơng qua mục 3.2.2 và 3.2.3 cĩ thể thấy hạt gel cố định nấm men trong nghiên cứu của chúng tơi đã chứng minh được khả năng lên men tạo thành cồn và cải thiện độ trong là rất khả quan. 24 3.3.5. Đề xuất quy trình cố định nấm men trong carrageenan lên men rượu vang Hình 3.32. Sơ đồ quy trình cố định nấm men lên men rượu vang. - Chỉ số OD=0,018–0,023 - Nồng độ cồn = 11o - Nhiệt độ: 40oC - Thời gian: 60 phút Vhuyềnphùnấmmen/Vddcarrageenan là 1/1 - m hạt gel/m dịch lên men=1/10 - Nhiệt độ: 30oC - Thời gian: 7 ngày Số lần rửa: 3 – 5 lần - todung dịch < 10oC - Thời gian ngâm: 60 phút - Tạo nồng độ carrageenan là 4(%g/ml) - Nhiệt độ: 80oC Rửa sạch bằng nước cất vơ trùng Làm nguội đến 50oC Bổ sung nước cất vơ trùng, nâng nhiệt hịa tan carrageenan Carrageenan Lên men Phối trộn Sấy Tách hạt gel bằng lắng lọc Bán thành phẩm Ly tâm tách nước Giống nấm men Nuơi sinh khối Rửa sạch 3–5 lần với nước cất vơ trùng Thu hoạch gel Nước nho Bx = 20 pH = 3 Tạo hạt gel vào dung dịch KCl 3M 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ * Kết luận: 1. Đã phân tích được một số thành phần hĩa học cơ bản, đặc biệt là hàm lượng carrageenan trong cây rong sụn ở Ninh Thuận như sau: - Nước: 82,2%. - Carrageenan: 39,83 % chất khơ. - Glucid: 43,7 % chất khơ. - Protein: 0,59 % chất khơ. 2. Đã tìm được các thơng số phù hợp cho giai đoạn nấu chiết rong thu được carrageenan cĩ hiệu suất chiết tách cao, chất lượng tốt. Các thơng số của cơng đoạn nấu chiết là: - Tỉ lệ khối lượng nước/rong = 10. - Nhiệt độ nấu: 95oC. - Thời gian nấu: 60 phút. 3. Đã khẳng định được tính hiệu quả của việc cĩ xử lý rong bằng dung dịch KOH so với khơng xử lý, với các thơng số của cơng đoạn xử lý rong như sau: - Nồng độ KOH: 6,5%. - Thời gian ngâm KOH: 80 phút. Từ đĩ đề xuất quy trình chiết tách carrageenan từ rong sụn. 4. Đã nghiên cứu tạo được hạt gel chứa tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae từ carrageenan cho hiệu quả cố định cao với các thơng số kỹ thuật: - Chỉ số OD của huyền phù nấm men trước khi cố định là 6,27. - Nồng độ carrageenan trước khi trộn huyền phù nấm men là 4 (%g/ml). - Tỉ lệ thể tích huyền phù nấm men/dung dịch carrageenan khi cố định = 1/1 để tạo hạt gel cố định nấm men cĩ nồng độ carrageenan 2 (%g/ml). 26 Đồng thời đã sử dụng chế độ sấy hạt gel để cải thiện độ trong của dịch lên men như sau: - Nhiệt độ sấy: 40oC. - Thời gian sấy: 60 phút. 5. So sánh khả năng tạo thành cồn giữa tế bào cố định trong hạt gel cĩ qua cơng đoạn sấy và nấm men tự do với kết quả năng lực lên men tương đồng. Từ đĩ, đề xuất quy trình cố định nấm men trong carrageenan để lên men rượu vang với các thơng số kỹ thuật quan trọng: - Tỉ lệ khối lượng hạt gel cố định nấm men/dịch lên men = 1/10. - Nhiệt độ lên men: 30oC. - Thời gian lên men: 7 ngày. - Độ cồn sau khi lên men: 11o. - Mật độ quang của rượu vang sau lên men: 0,018 – 0,023 OD. * Kiến nghị: Do điều kiện thời gian cĩ hạn, chúng tơi khơng thể nghiên cứu hết các vấn đề cần quan tâm nên đề xuất hướng phát triển đề tài là: 1. Tinh sạch carrageenan thơ. 2. Nghiên cứu hướng tái sử dụng dung dịch KOH đã dùng trong giai đoạn xử lý rong và ethanol đã sử dụng trong giai đoạn kết tủa. 3. Xác định tỷ lệ sống sĩt của nấm men sau sấy hạt gel để kiểm định cơng nghệ tạo gel, cơng nghệ sấy nhằm hồn thiện ứng dụng. 4. Xác định khả năng tái sử dụng hạt gel sau lên men rượu vang.