Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm nấm Bạch Cương Beauveria bassiana để ứng dụng phòng trừ sâu hại cây trồng

cấy, nếu phù hợp thì nấm sẽ phát triển tốt [5]. e. Ảnh hưởng của hàm lượng nước Nấm côn trùng đòi hỏi hàm lượng nước thích hợp, nếu quá khô hoặc quá ướt thì nấm phát triển không tốt, tỷ lệ thích hợp là 30 – 50% tùy theo điều kiện ẩm độ của không khí môi trường [5]. g. Ảnh hưởng của độ pH Phạm vi nấm côn trùng sống ở độ pH từ 3,5 – 8,0, song nấm côn trùng ưa môi trường axit và nấm phát triển thích hợp nhất ở độ pH từ 5,5 – 6 [5]. III/ Độc tố, cơ chế tác động và triệu chứng của sâu nhiễm nấm Beauveria bassiana 1/ Độc tố Theo PGS.TS Phạm Thị Thùy [8]: Năm 1696 R.L Hamill và cộng sự đã xác định được độc tố diệt côn trùng của nấm bạch cương Beauveria bassiana và đặt tên cho độc tố này là Beauvericin. Năm 1971 Y.A. Ovehinnokov và cộng sự đã tổng hợp lại độc tố này, tác giả Jame và cs đã xác định bản chất của độc tố sinh ra trong quá trình trao đổi chất đó là vòng peptid có các sắc tố màu vàng tenelin và basianin, những sắc tố này có thể do hydroxylat progesteron và những phần nhỏ tách ra từ testosteron (C19H28O2) sinh ra. Về mặt hóa học, độc tố Beauvericin có danh pháp là xyclo (N-metyl L-phenylalanin-D-α-hydroxy-izovaleryl). Đây là một loại depxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng 93-94oC. Từ một lít môi trường nuôi cấy nấm Beauveria bassiana, các nhà khoa học Trung Quốc ở trường Đại học Tổng hợp Nam Khai (Thiên Tân) đã tách được 1,5g độc tố Beauvericin và từ 1 kg môi trường đặc các tác giả đã tách ra được 3,8 g Beauvericin. 2/ Cơ chế tác động Trong tự nhiên, khi bào tử nấm Bb rơi vào cơ thể côn trùng gặp điều kiện thuận lợi, chỉ sau 12-24h thì bào tử nấm nảy mầm. Chúng hình thành sợi nấm đâm xuyên qua lớp vỏ kitin và sau đó phát triển bên trong cơ thể côn trùng hại. Côn trùng hại phải huy động hết các tế bào bạch huyết để chống lại nhưng nấm Bb đã tiết ra độc tố Beauvericin và các chất khác làm phá hủy tế bào bạch huyết. Sợi nấm mọc rất nhiều bên trong cơ thể làm cho cơ thể cứng lại sau đó một thời gian thì nấm mọc ra ngoài, lớp bào tử phủ lên côn trùng hại và lớp bào tử này gặp điều kiện gió đưa vào cơ thể côn trùng khác thì cũng thực hiện cơ chế tác động như trên. 3/ Triệu chứng của sâu nhiễm bệnh Triệu chứng đặc trưng nhất là sự thay đổi các di động của côn trùng, sự di động này tùy theo mức độ phát triển của bệnh. Khi bị bệnh các mô dần dần bị phá hủy từng phần, lúc đầu côn trùng di động yếu sau ngừng hẳn nằm im một chỗ cho đến khi chết. Khi bị bệnh nấm, vận động của côn trùng ngừng từ 2-3 ngày thậm chí một tuần trước khi nấm phát triển đầy trong thân côn trùng. Chỉ những côn trùng bị thương hay bị bệnh nấm, màu sắc toàn thân mới thay đổi và xuất hiện những vết đen. Khi sâu hại bị bệnh do nấm Beauveria bassiana ở chỗ bào tử bám vào, nấm phát triển vào bên trong thân sâu tạo nên một vệt đen không có hình thù nhất định. Côn trùng chết do nấm thường có màu hồng, vàng nhạt, trắng và toàn thân cứng lại. Khi bị bệnh nấm thân côn trùng bị ngắn lại hoặc khô là do hệ thống tiêu hóa bị tổn thương hoặc do thiếu thức ăn. Vi sinh vật gây bệnh trên côn trùng thường tác động đến những mô nhất định, côn trùng bị nấm Beauveria bassiana ký sinh thì tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do enzym lipaza và proteaza của nấm tiết ra, cũng chính nhờ đặc điểm đó mà người ta có thể xác định được côn trùng bị bệnh là do động vật nguyên sinh hay là do nấm bậc thấp (Coelomycidium, Entomophyhora...) gây ra. Hiện tượng chết hoặc gắn liền với hiện tượng tiêu hủy mô là đặc trưng của bệnh nấm, quá trình này tiến triển qua hai giai đoạn: - Hiện tượng chấn thương: Các mô tổn thương bị phá hoại là do nấm từ bên ngoài gây ra, trong trường hợp này các lympho máu đọng lại và mô tái sinh được tạo nên trên bề mặt phần thân côn trùng bị chấn thương. - Hiện tượng nhiễm trùng máu: của côn trùng khi bị bệnh nấm là do lympho máu chứa đầy sợi nấm. IV/ Công nghệ sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana Hiện nay Viện Bảo vệ thực vật đang sản xuất chế phẩm nấm bạch cương Beauveria bassiana theo các công đoạn như sau: 1/ Chọn chủng giống: Theo PGS.TS Phạm Thị Thùy thì chủng nấm (giống nấm) là yếu tố quan trọng quyết định đến chất lượng chế phẩm nấm. Để sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana, Viện Bảo vệ thực vật thường sử dụng chủng nấm Beauveria bassiana đã được phân lập trên sâu róm thông ở Thanh Hóa. Đây là chủng giống mới, nguồn gốc tự nhiên tại địa phương có cây trồng bị sâu hại, nên chủng nấm Beauveria bassiana có hoạt tính rất cao [7]. 2/ Môi trường nhân giống cấp 1 Năm 1992, kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Thùy và cs [8] đã xác định được môi trường nhân giống cấp 1 của nấm Beauveria bassiana chính là môi trường Sabouroud bổ sung thêm khoáng chất (SK), kế thừa từ môi trường Sabouroud. Môi trường Sabouroud: . Agar 20g . Glucoza 40g . Pepton 10g . H20 1000 ml . pH 6,0 Môi trường Sabouroud khoáng chất: . Agar 20g . Glucoza 20g . Pepton 10g . MgSO4.7H20 1g . KH2PO4 0,5g . H20 1000 ml . pH 6,0 Tác giả Phạm Thị Thùy cho biết việc xác định được môi trường nuôi cấy là yếu tố rất quan trọng để nấm Beauveria bassiana nói riêng và nấm côn trùng nói chung sinh trưởng, phát triển tốt, nếu môi trường không tốt thì nấm mọc yếu hoặc thậm chí không mọc, nguyên nhân là do trong quá trình nảy mầm để hình thành bào tử, nấm côn trùng cần có các nguồn Cacbon, Nito. Sự phát triển của nấm phụ thuộc vào các nguyên tố vi lượng như C++, Zn++, K+, Mg++ ... có tác dụng kích thích cho sự phát triển của nấm đồng thời duy trì độ pH. Môi trường SK làm giống cấp 1 đã đáp ứng được yêu cầu cho nấm Beauveria bassiana phát triển. 3/ Môi trường nhân giống cấp 2: Sử dụng phương pháp lên mem xốp Theo PGS.TS Phạm Thị Thùy [8] thì sản xuất sinh khối nấm Beauveria bassiana bằng phương pháp lên men xốp dùng môi trường gồm thành phần chính là cám gạo và bột ngô có bổ sung thêm một số chất phụ gia để tăng khả năng hình thành bào tử của nấm Beauveria bassiana: . Bột cám ngô . Bột ngô . Bột đậu tương ( hoặc đậu xanh) . Trấu ( hoặc bã mía, vỏ lạc) Có thể sản xuất nấm Beauveria bassiana theo phương pháp của Cuba: Môi trường tấm gạo với dung dịch CaCO3 5%, bằng phương pháp luộc tấm gạo rồi sấy khô, sau đó nhân giống với Beauveria bassiana thuần vào môi trường. 4/ Công nghệ sản xuất nấm Beauveria bassiana bằng phương pháp lên men xốp Tác giả Phạm Thị Thùy và cs đã nghiên cứu sử dụng môi trường sản xuất bao gồm cám gạo 3 phần, bột ngô 1 phần và phụ gia như đường, trấu... môi trường có tỷ lệ nước trên môi trường là 1/3 đảm bảo độ ẩm vừa phải, tơi xốp, nấm phát triển sau 5 ngày trong các bình tam giác hoặc dụng cụ có thể tích lớn. Chế phẩm được làm khô ở nhiệt độ 45oC trong 8 giờ, kết quả thu được chế phẩm có lượng bào tử trung bình là 5 x 109 bào tử/g. 5/ Tính ổn định của chế phẩm nấm Beauveria bassian - Chất lượng của chế phẩm nấm đạt 109 bt/g - Hàm lượng ẩm trong chế phẩm là 7 -10% - Hiệu quả diệt sâu là trên 70% sau 10 – 15 ngày thí nghiệm - Thời gian bảo quản là từ 1 – 2 năm V. Khái niệm về các loại sâu dùng trong thí nghiệm V.1/ Sâu róm thông ( Dendrolimus punctatus ): Theo PGS.TS Phạm Thị Thùy [4]: Sâu róm thông là loại sâu phá hoại rất nặng nề các cánh rừng thông. Sâu róm thông chích hút nhựa của cây thông gây ra hiện tượng cháy lá và dẫn đến cây thông bị chết. Sâu róm thông phân bố rộng khắp ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Ở Việt Nam sâu róm thông tập trung nhiều ở các tỉnh miền trung như Thanh Hóa, Hà Tĩnh ... + Đặc điểm hình thái: Bướm trưởng thành có màu nâu. Chiều dài thân 17-18mm. Cánh trước có màu sẫm hơn cánh sau. Mép ngoài cánh trước có nhiều chấm màu nâu sẫm. Trưởng thành đẻ trứng thành từng đám hoặc từng hàng dọc theo lá thông, mỗi bướm có thể đẻ 200-300 quả trứng. Trứng hình bầu dục màu xanh nhạt, sau chuyển sang màu hồng sẫm. Sâu non từ 5-6 tuổi, toàn than màu nâu đen ánh bạc xen lẫn các điểm trắng, toàn phân phủ nhiều lông độc. Lớn đẫy sức có thể dài 60mm. Nhộng màu nâu cánh gián hoặc màu hạt dẻ, thuộc loại nhộng màng, có kén màu trắng sang chứa nhiều long của sâu non bao bọc. + Đặc điểm sinh vật và quy luật phát sinh gây hại: Trưởng thành: ngài đực có xu tính ánh sáng mạnh, ngài cái thích đẻ trứng ở trên lá thông trong rừng được trồng 5 năm trở lên. Sau khi vũ hóa 1-2 giờ, ngài bắt đầu giao phối và sau một thời gian thì đẻ trứng. Thường đẻ trứng vào ban đêm. Trung bình trong 1 đêm đẻ hơn 200 quả trứng. Sâu non mới nở di chuyển bằng cách nhả tơ. Sau khi nở khoảng nửa ngày, sâu non bắt đầu ăn lá [4]. V.2/ Sâu khoang (Spodoptera litura) Sâu khoang là loại sâu đa thực, ăn rất nhiều loại cây trồng trong đó bao gồm cả các loại rau bắp cải, su hào, rau muống...Sâu khoang thuộc họ ngài đêm Noctuidae thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera, phân bố rộng ở Việt Nam và các nước trên thế giới. Theo tác giả Phạm Thị Nhất [2] thì sâu khoang có một số đặc điểm sau: + Đặc điểm hình thái: Bướm có thân dài 16 – 21 mm, cánh trước xòe rộng 37 – 42 mm có màu nâu vàng, trên cánh có nhiều đường vân đẹp, hình bầu dục có màu xám, xung quanh màu vàng, cánh sau màu trắng xám loang, phản quanh màu tím. Trứng sâu khoang hình bán cầu, mặt trứng có nhiều đường khía dọc ngang, lúc mới đẻ có màu trắng vàng sau chuyển thành màu vàng tro, sắp nở có màu vàng tối. Trứng đẻ thành từng ổ hình bầu dục, dẹt và được phủ một lớp lông màu nâu vàng bên trên. Sâu non hình ống, màu xanh xám tro, vạch lưng màu vàng, có khoang đen ở đốt bụng thứ nhất, gần đầu có 2 chấm đen, sâu đẫy sức dài 38- 51 mm. Sâu làm nhộng ở trong đất, nhộng dài 18- 20 màu nâu đỏ bóng láng. + Tập tính sinh hoạt : Sau khi nở 1 vài ngày, sâu sống tập trung rồi sau đó mới phân tán. Ở tuổi 1, 2 sâu khoang chỉ gặm chất xanh chừa lại màng và gân lá. Tuổi 3 trở đi sâu phân tán và ăn khuyết lá, sâu phá hoại mạnh vào ban đêm, ngày ẩn nấp dưới mặt đất. Bướm hoạt động về đêm, đẻ trứng ở lá, một bướm cái có thể đẻ 1000 trứng. Hàng năm sâu thường phát sinh gây hại mạnh vào tháng 4 đến tháng 10 [2] 3/ Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae ) Sâu xanh bướm trắng là loại sâu hại chủ yếu trên các loại rau cải, xu hào, sâu xanh bướm trắng thuộc bộ cánh phấn Lepidoptera. Theo tác giả Phạm Thị Nhất [2] thì sâu xanh bướm trắng có một số đặc điểm sau: + Vòng đời của sâu: Ở nhiệt độ 17,4oC và ẩm độ 78,5 % vòng đời sâu kéo dài khoảng 30 ngày, còn ở nhiệt độ 29,3oC và ẩm độ 79,1 % thì vòng đời sâu xanh bướm trắng chỉ kéo dài 19,5 ngày. + Đặc điểm hình thái: Bướm có thân dài từ 15 – 20 mm, cánh trước có màu trắng xòe rộng từ 40 – 50 mm, trứng hình vỏ phích có nhiều khía dọc. Sâu non có nhiều chấm đen, sâu đẫy sức dài 28 – 35 mm. Nhộng màu xanh nhạt hơi vàng dài từ 18 – 20 mm, dính một đầu trên lá rau, hai bên sườn có những chấm đen thưa, giữa lưng nổi hẳn lên một đường như hình xương sống. + Tập tính sinh hoạt: Hàng năm sâu thường xuất hiện nhiều vào tháng 2 đến tháng 5, chúng gây hại chủ yếu trên nhóm rau họ thập tự ( rau cải, su hào, cải bắp, súp lơ...). Bướm cái đẻ trứng rải rác từng quả trên lá rau, một bướm có thể đẻ được 150 trứng. Sau khi nở sâu non bắt đầu gặm nhấm lá xanh và chừa lại màng lá, từ tuổi 2 trở đi sâu cắn thủng lá làm lá bị khuyết [2] 4/ Sâu tơ ( Plutella xylostella ) Sâu tơ là loại sâu hại nguy hiểm trên rau họ thập tự, sâu thuộc họ ngài rau Yponomeutidae, bộ Thysanoptera. Sâu tơ hại tất cả các loại rau họ cải có giá trị kinh tế như bắp cải, su hào, súp lơ... gây thiệt hại về năng suất cũng như chất lượng rau. Ở tất cả các nước có trồng rau họ cải trên thế giới đều có nguy cơ bị sâu tơ tấn công, đặc biệt là các nước trong vùng Nam và Đông Nam Châu Á. Theo tác giả Phạm Thị Nhất [2] thì sâu tơ có một số đặc điểm sau: + Đặc điểm hình thái: Sâu tơ có bướm nhỏ, dài từ 6 – 7 mm, cánh trước xòe rộng 13 – 16 mm màu nâu xám, dọc mép trong có đường sọc màu nhạt hơn, chia thành ba đoạn. Cánh sau có màu xám, có lông nhỏ dài và mịn. Trứng sâu tơ hình bầu dục, hơi tròn và dài khoảng 4 – 5 mm. Sâu non hình ống, màu xanh nhạt có nhiều đốt thân, mỗi đốt thân có nhiều lông tơ, sâu đẫy sức dài khoảng 9 – 12 mm, đầu màu nâu vàng có các phiến cứng trên có những chấm màu nâu nhạt. Nhộng sâu tơ màu xanh nhạt hoặc vàng nhạt, dài 6 – 10 mm được bọc trong kén mỏng màu trắng xốp, dạng lưới. + Vòng đời sâu: Từ 20 – 22 ngày, sâu non có 4 tuổi, thời gian phát triển kéo dài khoảng 11- 15 ngày, nhộng 7 ngày, các lứa sâu tơ nở gối nhau liên tiếp trong suốt vụ rau. + Tập tính sinh hoạt: Bướm hoạt động cả ngày lẫn đêm, ban ngày đậu ở mặt dưới lá, sâu non mới nở đục lá tạo thành các đường rãnh. Từ tuổi 2 sâu sống ngay trên mặt lá và ăn lá, để lại biểu bì lá tạo thành các lỗ trong mờ. Sâu non thường nhả tơ để di chuyển [2]. VI/ Một số kết quả đạt được trong phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm Beauveria bassiana 1/ Trên thế giới Vài chục năm gần đây, các công trình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm Beauveria bassiana trở nên phong phú và phát triển trên thế giới. Tác giả Phạm Thị Thùy (2004) cho biết: Ở Úc, các nhà khoa học đã sử dụng nấm Beauveria bassiana để phòng trừ bọ hung hại mía và bọ hung hại củ cải đường đạt hiệu quả tốt, những loài bọ hung trên rất khó phòng trừ bằng thuốc hóa học. Các nhà khoa học sử dụng nấm Beauveria bassiana ở nồng độ 8 x 107 bào tử/ ml để phòng trừ ruồi hại rễ bắp cải, thí nghiệm ngoài đồng ruộng được tiến hành với 15ml dung dịch nấm trên 1 cây, kết quả cho thấy nấm Beauveria bassiana đạt hiệu quả cao với ruồi hại bắp cải, nấm Beauveria bassiana đã làm giảm mật độ của sâu và nhộng khoảng 70%. Tại Nhật Bản năm 1988 một số nhà khoa học đã phòng trừ ròi hại rễ củ cải bằng nấm Beauveria bassiana. Thí nghiệm được tiến hành như sau: Dùng 1 bó củ cải có 10 trứng ròi hại rễ để trong 1 lọ. Trứng được sắp xếp quanh củ cải với mỗi trứng đặt cách nhau 3cm. Nồng độ bào tử nấm đưa vào thí nghiệm là 1 x 109 bào tử/ml ( nấm phát triển trên môi trường PDA ) với 5 lần nhắc lại, kết quả cho hiệu lực trên 75% ( trong điều kiện nhiệt độ 23oC và ẩm độ không khí trên 70% ) sau 10 ngày thí nghiệm. Ở Mỹ, người ta còn dùng nấm Beauveria bassiana để phòng trừ ruồi trắng hại lá khoai lang. Trường Đại học tổng hợp Florida (USA) phối hợp với liên đoàn Ciba và Geigy sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana để phòng trừ tập đoàn sâu voi hại rễ cây chanh và các côn trùng hại khác. Ở Trung Quốc, các tác giả Am và Wu đã sử dụng chủng nấm Paecilomyces farinosus và Beauveria bassiana để phòng trừ sâu róm thông đạt hiệu quả cao [8]. 2/ Ở Việt Nam Từ năm 1990 thế kỷ XX, với sự giúp đỡ của Cục Bảo vệ thực vật và được sự tài trợ của tổ chức bánh mỳ thế giới, năm 1991 nhờ chương trình Công nghệ sinh học cấp nhà nước, Trung tâm sinh học Viện Bảo vệ thực vật đã nghiên cứu nấm Beauveria bassiana, với mục đích: Xác định nấm Beauveria bassiana có trên một số sâu hại cây trồng, đồng thời tiến hành nghiên cứu để tìm khả năng phát triển của nấm Beauveria bassiana trên một số trường hợp nhân tạo nhằm tiến tới nghiên cứu hoàn thiện quá trình sản xuất tạo chế phẩm trừ sâu sinh học. Kết quả nghiên cứu sản xuất, thử nghiệm và ứng dụng chế phẩm nấm trừ sâu hại cây trồng đến nay đã đạt được nhiều thành công đáng kể. Năm 1992 – 1993, Phạm Thị Thùy và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm chế phẩm nấm Beauveria bassiana trừ sâu đo xanh hại đay tại hợp tác xã Liên Khê (Châu Giang – Hưng Yên). Kết quả đạt 66,4% - 86,4% tỷ lệ sâu chết sau 7 – 10 ngày phun thuốc. Năm 1995-1996 tác giả đã nghiên cứu sản xuất ra chế phẩm Beauveria bassiana trừ sâu hại cây trồng và đã được thử nghiệm trên rầy nâu hại lúa ngoài đồng ruộng ở một số địa phương, kết quả sau 10 ngày phun hiệu lực trừ rầy nâu đạt từ 50 – 60 % và kéo dài đến 15 ngày sau phun thuốc. Năm 1998, Phạm Thị Thùy và cộng sự đã ứng dụng nấm Beauveria bassiana để phòng trừ sâu róm thông Dendrolimus punctatus ở Lâm trường Hà Trung – Thanh Hóa và Lâm trường Phù Bắc Yên – Sơn La, kết quả phun nấm Beauveria bassian với nồng độ 4 x 1013 bào tử/ha, tỷ lệ sâu róm thông chết trung bình sau một tháng là 78,2%, sau 1,5 tháng thì tỷ lệ sâu chết trung bình đạt 93,6% trong điều kiện nhiệt độ trung bình là 29,1 oC và ẩm độ trung bình là 83,7%. [4], [6] Các ứng dụng chế phẩm nấm Beauveria bassiana phòng trừ sâu hại rau của tác giả Phạm Thị Thùy và cs từ năm 2002 đến nay đã đạt được nhiều thành tựu to lớn, điển hình là phòng trừ sâu xanh bông, sâu tơ, sâu xanh bướm trắng hại rau ở An Hải – Hải Phòng năm 2001, ở Đồn Bẩm – Đồng Hỷ – Thái Nguyên năm 2002 – 2004. [8] Tóm lại: Nấm Beauveria bassiana có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại cây trồng, đặc biệt là sâu róm thông, do đó việc nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất để tạo chế phẩm nấm Beauveria bassiana đạt chất lượng là hoàn toàn cần thiết, nhằm cung cấp cho nông dân để phòng trừ sâu hại cây trồng đạt hiệu quả cao theo hướng bảo vệ môi trường. PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I/ THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU: 1. Địa điểm: Tại phòng thí nghiệm nấm côn trùng thuộc Trung tâm Đấu tranh sinh học – Viện Bảo vệ thực vật – Từ Liêm – Hà Nội. 2. Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 1/2010 đến hết tháng 5/2010 II/ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU: 1. Chủng vi sinh vật sử dụng: Chủng vi nấm Beauveria bassiana do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp. 2. Một số côn trùng sử dụng trong thí nghiệm: - Sâu róm thông (Dendrolimus punctatus) thu bắt tại rừng thông Đông Sơn – Thanh Hóa. Lấy sâu tuổi 2 – 3 thử nghiệm - Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) thu bắt và nuôi tại Viện BVTV bằng lá rau để lấy sâu tuổi 2 – 3 làm thử nghiệm. - Sâu khoang (Spodoptera litura) thu bắt và nuôi tại Viện BVTV bằng lá rau để lấy sâu tuổi 2 – 3 làm thử nghiệm. - Sâu tơ (Plutella xylostella) thu bắt và nuôi tại Viện BVTV bằng lá rau lấy sâu tuổi 2- 3 làm thử nghiệm. 3. Dụng cụ và hóa chất dùng trong thí nghiệm : a) Hóa chất gồm: - Agar - Pepton - Glucoza - NaNO3 - FeSO4 - Muối khoáng, cồn, nước cất, chất bám dính agral b) Một số thiết bị và dụng cụ: - Kính hiển vi, - Buồng đếm hồng cầu, - Nồi khử trùng, - Tủ sấy, - Tủ định ôn, - Buồng cấy nấm, - Dụng cụ thủy tinh và một số dụng cụ khác. III/ NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần môi trường sản xuất đến chất lượng chế phẩm nấm Beauveria bassiana. Sử dụng phương pháp lên men bề mặt ( lên men xốp) Môi trường sản xuất ( mt cơ bản) - Cám gạo - Bột ngô - Bột đậu tương ( Phạm Thị Thùy .2004.) - Trấu - Nước 1.1/ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana trên môi trường sản xuất. Bố trí thí nghiệm với 4 công thức: - Công thức 1: 80% cám gạo, 10% bột ngô, 10% trấu, 35 ml nước. - Công thức 2: 70% cám gạo, 20% bột ngô, 10% trấu, 35 ml nước - Công thức 3: 60% cám gạo, 30% bột ngô, 10% trấu, 35 ml nước - Công thức 4: 50% cám gạo, 40% bột ngô, 10% trấu, 35 ml nước 1.2/ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ bột ngô đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana trên môi trường sản xuất: Bố trí thí nghiệm với 4 công thức - Công thức 1: 80% cám gạo, 10% bột ngô, 10% trấu, 35 ml nước. - Công thức 2: 70% cám gạo, 20% bột ngô, 10% trấu, 35 ml nước. - Công thức 3: 60% cám gạo, 30% bột ngô, 10% trấu, 35 ml nước. - Công thức 4: 50% cám gạo, 40% bột ngô, 10% trấu, 35 ml nước. 1.3/ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nước (ml) trên môi trường sản xuất đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana: Bố trí 4 công thức thí nghiệm: Công thức Phần tỷ lệ giữa Lượng nước (ml) Môi trường sản xuất (gr) CT1 1 4 CT2 1 3 CT3 1 2 CT4 1 1 * Phương pháp chung cho cả 3 thí nghiệm: - Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại với 100gr nguyên liệu theo các tỉ lệ như trên. - Cân nguyên liệu theo các công thức - Khử trùng môi trường ở 121oC/30 phút/ 1at - Để nguội rồi cấy giống cấp 1: Sử dụng chủng giống nấm Bb thuần đã tuyển chọn. - Đặt thí nghiệm trong điều kiện bình thường trong phòng thí nghiệm. - Chỉ tiêu theo dõi hàng ngày. * Ghi chép sổ theo dõi nhiệt độ, ẩm độ... * Mô tả cách thức mọc của nấm ở mỗi lần nhắc lại trong mỗi công thức * Màu sắc và sự phát triển của nấm trong môi trường sản xuất * Sau 2 – 3 ngày nuôi cấy ( khi lượng bào tử hình thành nhiều, không tăng) đem rải ra, sau đó cân 1gr chế phẩm tươi và 1gr chế phẩm khô ( sau khi đã sấy và nghiền nhỏ) pha loãng bằng nước cất rồi đếm số lượng bào tử khô và tươi. 1.4/ Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, ẩm độ trong thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana. - Bố trí thí nghiệm theo 2 công thức: + Nhiệt độ và ẩm độ trung bình ở ( tháng 3) + Nhiệt độ và ẩm độ trung bình ở ( tháng 4) - Pha loãng bằng nước cất rồi đếm số lượng bào tử. 1.5/ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian sấy tới năng suất và chất lượng của chế phẩm Beauveria bassiana. - Bố trí thí nghiệm theo 4 công thức: Công thức Thời gian sấy ở nhiệt độ 45oC ( giờ) CT1 6 CT2 7 CT3 8 CT4 9 * Phương pháp sấy khô: - Sấy ở 45oC để có thông gió - Rải để trên khay sấy - Cứ sau 30 phút lại đảo chế phẩm 1 lần * Chỉ tiêu theo dõi: - Xác định số lượng bào tử trên 1gr chế phẩm trước khi sấy - Xác định số lượng bào tử trên 1gr chế phẩm sau khi sấy ứng với mỗi công thức. - Pha loãng và đếm bào tử * So sánh và đánh giá kết quả số lượng bào tử trong mỗi thí nghiệm để rút ra được thời gian sấy thích hợp nhất để bảo quản chế phẩm tốt nhất mà không ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của chế phẩm nấm Beauveria bassian. 2/ Phương pháp pha loãng và đếm số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu cho các thí nghiệm 2.1/ Phương pháp pha loãng: Cân 1gr chế phẩm, nghiền nhỏ trong cối sau đó cho thêm 9ml nước cất vào và tiếp tục nghiền, được dịch bào tử có độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm và thêm 9ml nước cất lắc đều ta được dịch bào tử có độ pha loãng 10-2. Làm như vậy đến khi thu được dịch bào tử có độ pha loãng đếm được (10-n). - Cách thức pha loãng bào tử được minh họa như sau: 1 gr 1 ml 1 ml 1 ml đem đếm … 9 ml nước cất 9 ml nước cất 9 ml nước cất 9 ml nước cất 10-1 10-2 10-3 10-n 2.2/ Phương pháp đếm số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu: Sau khi có dịch bào tử ở độ pha loãng đếm được, dùng pipet hút dịch bào tử và nhỏ 1 giọt xuống khoảng giữa lưới đếm của buồng đếm hồng cầu. Đậy lamen lên trên đưa buồng đếm đến kính hiển vi, lấy tiêu cự để đếm. Số lượng bào tử được tính theo công thức. a x 10n x 400 A = x 10000 b Trong đó: A: Số lượng bào tử đếm được trên 1ml a: Số lượng bào tử đếm được trên buồng đếm hồng cầu b: Số ô đếm được ( 16 ô lớn x 25 ô nhỏ = 400 ô nhỏ) n: hệ số pha loãng 10000: hằng số Đếm 3 lần lấy giá trị trung bình. * So sánh và đánh giá kết quả số lượng bào tử tươi và khô giữa các môi trường bổ xung thành phần khác nhau trong mỗi công thức thí nghiệm để rút ra công thức có tỷ lệ tốt nhất. 3/ Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana để phòng trừ sâu hại cây trồng : 3.1/ Đối với sâu róm thông ( Dendrolimus punctatus ): - Bố trí 4 công thức thí nghiệm: + Công thức 1: Đối chứng ( không phun thuốc) + Công thức 2: Phun dịch bào tử nấm Bb ở nồng độ 3 x 108 bt/ml + Công thức 3: Phun dịch bào tử nấm Bb ở nồng độ 6 x 108 bt/ml + Công thức 4: Phun dịch bào tử nấm Bb ở nồng độ 9 x 108 bt/ml 3.2/ Đối với sâu khoang ( Spodoptera litura ): - Bố trí 4 công thức thí nghiệm: + Công thức 1: Đối chứng ( không phun thuốc) + Công thức 2: Phun dịch bào tử nấm Bb ở nồng độ 2 x 108 bt/ml + Công thức 3: Phun dịch bào tử nấm Bb ở nồng độ 4 x 108 bt/ml + Công thức 4: Phun dịch bào tử nấm Bb ở nồng độ 6 x 108 bt/ml 3.3/ Đối với sâu xanh bướm trắng ( Pieris rapae ): - Bố trí 4 công thức thí nghiệm: + Công thức 1: Đối chứng ( không phun thuốc) + Công thức 2: Phun dịch bào tử nấm Bb ở nồng độ 3 x 108 bt/ml + Công thức 3: Phun dịch bào tử nấm Bb ở nồng độ 6 x 108 bt/ml + Công thức 4: Phun dịch bào tử nấm Bb ở nồng độ 9 x 108 bt/ml 3.4/ Đối với sâu tơ ( Plutella xylostella ): - Bố trí 4 công thức thí nghiệm: + Công thức 1: Đối chứng ( không phun thuốc) + Công thức 2: Phun dịch bào tử nấm Bb ở nồng độ 2x108 bt/ml + Công thức 3: Phun dịch bào tử nấm Bb ở nồng độ 4x108 bt/ml + Công thức 4: Phun dịch bào tử nấm Bb ở nồng độ 6x108 bt/ml - Phương pháp thí nghiệm chung cho cả 4 loại sâu: + Bố trí 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại từ 10 – 20 con. + Phương pháp pha và phun chế phẩm: Cân chế phẩm khô, nghiền nhỏ, pha với nước theo nồng độ trên, lắc đều để giải phóng dịch bào tử ra, sau đó cho vài giọt chất bám dính agral lắc đều lọc lấy dịch bào tử và phun lên thức ăn là lá cây rồi thả sâu vào theo từng lần nhắc lại của mỗi công thức. - Chỉ tiêu theo dõi hàng ngày: + Số sâu chết từng công thức cho ra đĩa petri và mẫu thường xuyên để ẩm và theo dõi nấm mọc trên sâu chết + Xác định số sâu chết có mọc lại nấm sau thí nghiệm + Thay thức ăn mới + Ghi chép nhiệt độ, ẩm độ trong phòng thí nghiệm - Phương pháp tính toán: *) Xác định hoạt lực của chế phẩm nấm trong phòng thí nghiệm đối với sâu hại cây trồng theo công thức Abbott (1925) Ca – Ta M(%) = x 100 Ca Trong đó: M % : Tỷ lệ chết của sâu Ca : Số sâu sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm Ta : Số sâu sống ở công thức thí nghiệm sau thí nghiệm *) Tỷ lệ mọc lại nấm: Số sâu chết mọc lại nấm (%) Số sâu mọc lại nấm = x 100 Tổng số sâu chết chung PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU I. TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM BEAUVERIA BASSIANA (Bb). Chủng giống là quan trọng nhất trong công nghệ sản xuất vì có chủng giống tốt thì chế phẩm mới đạt chất lượng cao. Hiện nay các nhà khoa học thường sử dụng chủng nấm Beauveria bassiana được phân lập trên sâu róm thông để sản xuất chế phẩm. Nguồn nấm Beauveria bassiana chúng tôi thu được trên sâu róm thông tại rừng thông Đông Sơn, Thanh Hóa. Qua phân lập, chúng tôi thu được chủng nấm Beauveria bassiana thuần. Đây là chủng giống có hiệu lực cao với sâu róm thông và sâu khoang, sâu xanh bướm trắng, sâu tơ ... hại rau. Dưới đây là hình ảnh chủng giống nấm Beauveria bassiana (Hình 1) Hình 1: Chủng nấm Beauveria bassiana phát triển trên môi trường Sabouraud khoáng chất sau 7 ngày nuôi cấy. II/ NGHIÊN CỨU TỶ LỆ THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG SẢN XUẤT THÍCH HỢP CHO NẤM BEAUVERIA BASSIANA ( Bb) II.1 /Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo trên môi trường sản xuất đến chất lượng chế phẩm nấm Bb Theo tài liệu của PGS.TS Phạm Thị Thùy thì nấm Bb đòi hỏi môi trường có nguồn dinh dưỡng phù hợp để phát triển như hàm lượng Nito, Cacbon, Kali, Photpho, Vitamin... đồng thời môi trường phải độ thoáng khí nhất định. Như phương pháp đã trình bày, dựa vào môi trường cơ bản của Viện Bảo vệ thực vật, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của cám gạo đến sự phát triển của nấm Bb. Kết quả được trình bày ở bảng 1 Bảng 1: Ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo đến chất lượng chế phẩm nấm Beauveria bassiana Đợt thí nghiệm Công thức Môi trường cơ bản (%) Lượng cám gạo (%) Số lượng bào tử (x 109 bt/g) Ttb (oC) Htb (%) Đợt 1 từ 22/3 đến 29/3 1 20 80 4,0 21,0 80,5 2 30 70 5,5 3 40 60 6,0 4 50 50 5,0 Đợt 2 từ 19/4 đến 26/4 1 20 80 4,2 24,5 82,5 2 30 70 5,8 3 40 60 6,5 4 50 50 5,1 Qua bảng 1 chúng tôi rút ra nhận xét: - Trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ khác nhau dẫn đến chất lượng chế phẩm cũng khác nhau. Cụ thể ở điều kiện t0tb là 24,50C và ẩm độ trung bình là 82,5% cho số lượng bào tử cao hơn ở điều kiện nhiệt độ thấp là 21.00C và độ ẩm thấp là 80,5%. Điều này cho thấy t0 và ẩm độ có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát triển của nấm. Ở điều kiện 24,50C và độ ẩm 82,5% nấm phát triển tốt hơn và cho chất lượng cao hơn. Theo chúng tôi thì ở điều kiện 24,50C và độ ẩm 82,5% là thích hợp cho nấm phát triển. - Trong 2 đợt thí nghiệm tỷ lệ cám gạo có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển nấm Bb. Trong 4 công thức thí nghiệm đợt 2 thì ở công thức III với 60% tỷ lệ cám gạo thì lượng bào tử hình thành là lớn nhất và đạt 6,5x 109bt/g chế phẩm . Công thức II với 70% tỷ lệ cám gạo đạt chất lượng 5,8x109bt/g, công thức IV với 70% tỷ lệ cám gạo đạt chất lượng 5,1x109bt/g và thấp nhất là công thức I với 80% tỷ lệ cám gạo chỉ đạt chất lượng 4,6x109bt/g. Từ kết quả trên chúng tôi rút ra kết luận: Tỷ lệ cám trong môi trường sản xuất là 60% thích hợp nhất cho nấm Bb phát triển. ( Hình 2 ) Hình 2: Nấm Bb phát triển trên môi trường có tỷ lệ cám gạo khác nhau Để tiện nhìn nhận về ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo đến chất lượng của chế phẩm nấm Bb trên môi trường sản xuất, chúng tôi thể hiện kết quả ở bảng 1 qua biểu đồ 1: Số lượng bào tử ( x 109bt/g ) %Cám gạo/ môi trường Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo đến chất lượng chê phẩm nấm Bb II.2 /Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ bột ngô trên môi trường sản xuất đến sự phát triển của nấm Bb Nấm Bb rất cần nguồn Cacbon để phát triển, trong bột ngô có hàm lượng Cacbon cao. Bột ngô rất dễ mua nhưng giá thành không rẻ. Dựa vào môi trường cơ bản của Viện Bảo vệ thực vật có cám, ngô, trấu. Sau khi xác định được tỷ lệ cám trong môi trường sản xuất thích hợp cho nấm Beauveria bassiana phát triển là 60%. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu về tỷ lệ của bột ngô. Kết quả trình bày ở bảng 2. Bảng 2: Ảnh hưởng của tỷ lệ bột ngô đến chất lượng chế phẩm nấm Beauveria bassiana Đợt thí nghiệm Công thức Môi trường cơ bản (%) Lượng cám ngô bổ sung (%) Số lượng bào tử( x 109 bt/g) Ttb (oC) Htb (%) Đợt 1 từ 22/3 đến 29/3 1 90 10 4,8 21,0 80,5 2 80 20 5,8 3 70 30 6,1 4 60 40 5,4 Đợt 2 từ 19/4 đến 26/4 1 90 10 5,0 24,5 82,5 2 80 20 5,9 3 70 30 6,5 4 60 40 5,7 Quả bảng 2 chúng tôi rút ra nhận xét: - Nhiệt độ và ẩm độ có ảnh hưởng rất rõ rệt đến sự phát triển của nấm Bb. Ở đợt 2 với 24,5 0C và 82,5% nấm phát triển tốt hơn cho số lượng bào tử đạt 6,5 x109 bt/g. cao hơn so với đợt 1 ở 21,0 oC và 80,5% với số lượng bào tử chỉ đạt 6,1 x109 bt/g. - Trong 4 CT thí nghiệm ở đợt 2 thì ở công thức III tức là môi trường có tỷ lệ bột ngô 30% cho số bào tử nấm của chế phẩm là 6,5 x109 bt/g. So với các công thức khác thì đây là tỷ lệ ngô cho số lượng bào tử cao nhất. Ở công thức I môi trường có tỷ lệ bột ngô là 10% cho số lượng bào tử thấp nhất : 5,0 x109 bt/g . Môi trường có tỷ lệ bột ngô là 20% và 40% (công thức II và IV ) cho số lượng bào tử trung bình, cụ thể số lượng bào tử nấm lần lượt là: 5,9 x109 bt/g và 5,7 x109 bt/g. Ở đợt thí nghiệm 1 cũng cho kết quả tương tự. Từ kết quả trên chúng tôi rút ra kết luận: Môi trường có 30% bột ngô là tốt nhất cho nấm Bb phát triển. ( Hình 3 ) Hình 3: Nấm Bb phát triển trên các môi trường có tỷ lệ cám ngô khác nhau Để nhìn nhận rõ về ảnh hưởng của tỷ lệ bột ngô đến chất lượng chế phẩm nấm Bb, chúng tôi thể hiện kết quả ở bảng 2 qua biểu đồ 2 : Số lương bào tử (x 109bt/g) % Bột ngô/môi trường Biểu đồ 2: Ảnh hưởng của tỷ lệ bột ngô đến chât lượng của chế phẩm nấm Bb II.3/ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nước với môi trường sản xuất đến chất lượng chế phẩm nấm Bb Bên cạnh môi trường sản xuất thì một trong những chỉ tiêu quan trọng cho sự phát triển và hình thành bào tử nấm đó là xác định đúng tỷ lệ giữa hàm lượng nước với môi trường sản xuất vì nước hòa tan các chất dinh dưỡng và tạo độ ẩm. Để xác định tỷ lệ về hàm lượng nước trên môi trường sản xuất phù hợp cho sự hình thành và phát triển của nấm Bb, chúng tôi bố trí thí nghiệm với 4 công thức. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3: Bảng 3: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước với môi trường sản xuất đến chất lượng chế phẩm nấm Bb Đợt thí nghiệm Công thức Phần tỷ lệ giữa Số lượng bào tử( x 109 bt/g) Ttb (oC) Htb (%) Tỷ lệ nước (ml) Môi trường cơ bản (%) TN đợt 1 22/3 đến 29/3 1 1 4 2,8 21,0 80,5 2 1 3 5,95 3 1 2 5,2 4 1 1 3,0 TN đợt 2 19/4 đến 26/4 1 1 4 3,0 24,0 82,5 2 1 3 6,0 3 1 2 5,3 4 1 1 3,2 Kết quả bảng 3 cho thấy: Hàm lượng nước trên môi trường sản xuất có ảnh hưởng rất lớn đến sự hình thành nấm. Trong 4 CT ở cả 2 đợt thí nghiệm thì ở CT2 với tỷ lệ 1/3 cho lượng bào tử cao nhất và đạt 6,0 x109 bt/g. Còn ở các CT khác nấm phát triển kém hơn. CT3 tỷ lệ 1/2 đạt 5,3 x109 bt/g sau đó là CT 4 tỷ lệ 1/1 đạt 3,2 x109 bt/g và cuối cùng là CT1 với tỷ lệ 1/4 chỉ đạt 3,0 x109 bt/g. Điều này được giải thích là do thành phần dinh dưỡng đủ nhưng độ thoáng khí và độ ẩm không phù hợp. Ở CT4 và CT3 độ ẩm cao tạo hiện tượng vón cục trong môi trường làm giảm độ thoáng khí nấm không phát triển được. Ngược lại ở CT1 vì tỷ lệ nước ít nên làm cho môi trường khô, rời rạc nên nấm phát triển chậm và cho lượng bào tử thấp ( Hình 4) Hình 4: Nấm Bb phát triển trên các môi trường có tỷ lệ nước khác nhau Nhiệt độ và ẩm độ cũng ảnh hưởng đến độ ẩm của môi trường và dẫn đến sự phát triển của nấm. Để tiện theo dõi sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Bb trên môi trường sản xuất trong 2 đợt thí nghiệm, chúng tôi thể hiện kết quả ở bảng 3 qua biểu đồ 3: Số lượng bào tử (x 109bt/g) Tỷ lệ nước/ môi trường Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến chất lượng của chế phẩm nấm Bb Kết luận: Từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi rút ra: Môi trường sản xuất có tỷ lệ thành phần nguyên liệu 60% cám, 30% ngô, 10% trấu và tỷ lệ nước/ môi trường là 1/3 cho số lượng bào tử nấm cao nhất và tốc độ phát triển của nấm Bb cũng nhanh nhất. II.4/ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian sấy tới chất lượng của chế phẩm nấm Bb Như chúng ta biết sấy là khâu cuối cùng và quan trọng trong quá trình sản xuất chế phẩm nấm Bb, vì nếu như hàm ẩm trong chế phẩm không đạt yêu cầu sẽ gây hiện tượng bào tử nấm nảy mầm nhanh làm giảm chất lượng của chế phẩm cũng như bảo quản không được lâu. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 4 công thức (như đã trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu) để xác định thời gian sấy thích hợp nhất bằng tủ sấy điện tử của Mỹ ở nhiệt độ 45oC. Kết quả thu được trình bày ở bảng 4. Bảng 4: Ảnh hưởng của thời gian sấy tới chất lượng của chế phẩm nấm Beauveria bassiana. Công thức Thời gian sấy (giờ) Số lương bào tử (x 109 bt/g) T (oC) 1 6 4,5 45,0 2 7 5,5 3 8 6,0 4 9 5,8 Qua bảng 4 chúng tôi rút ra nhận xét: Công thức III sấy 8 giờ cho số lượng bào tử đạt cao nhất là 6.0 x109 bt/g. Công thức IV thời gian sấy 9 giờ số lượng bào tử bị giảm đi một ít, chỉ còn 5,8 x109 bt/g. Công thức II số lượng bào tử đạt 5,5 x109 bt/g. Công thức I số lượng bào tử chỉ đạt 4,5x109 bt/g. Như vậycác công thức II và công thức I chế phẩm chưa đạt được hàm lượng ẩm cho phép, dẫn đến số lượng bào tử ít. Công thức III với 9 giờ sấy thì chế phẩm quá khô, bào tử nấm bị teo lại mặt khác mất thêm chi phí về điện. Như vậy sấy 8 giờ thì chất lượng chế phẩm đạt cao nhất và chi phí là phù hợp. Căn cứ vào kết quả thu được chúng tôi chọn thời gian sấy 8 giờ là thích hợp nhất, đảm bảo chất lượng của chế phẩm nấm Beauveria bassiana cao và độ ẩm phù hợp để bảo quản chế phẩm.( Hình 5 ) Hình 5: Chế phẩm nấm Beauveria bassiana II.5/ Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana Từ những kết quả thu được ở trên về tuyển chọn chủng giống và hoàn thiện môi trường, trên cơ sở nghiên cứu tỷ lệ nước, thời gian sấy phù hợp, chúng tôi rút ra quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm nấm Bb như sau: Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana Vuill. Chủng giống Bb phân lập trên sâu róm thông (nguồn ở Thanh Hóa) Nhân giống cấp 1 trên môi trường SK Hoàn thiện môi trường sản xuất (60% cám, 30% ngô, 10% trấu) Rải ra nia để hình thành tiếp bào tử 2- 3 ngày (25oC, 80%) Sấy ở 45oC có thông gió trong 8 giờ 2- 3 ngày Nghiền bi tạo chế phẩm Thử hiệu lực sinh học Đóng gói, bảo quản III/ THÍ NGHIỆM THỬ HIỆU LỰC CỦA NẤM BEAUVERIA BASSIANA TRỪ SÂU HẠI CÂY TRỒNG TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM Như phần phương pháp đã trình bày, để đánh giá chất lượng của chế phẩm tạo ra chúng tôi tiến hành thử nghiệm đối với một số loại sâu hại cây trồng. III.1/ Đánh giá hiệu lực trừ sâu róm thông của chế phẩm nấm Bb: Sâu róm thông là sâu nguy hiểm với cây thông, chúng hút nhựa gây hiện tượng cháy lá, cây mất nhựa dẫn đến chết. Để khắc phục những hậu quả trên và bảo vệ những rừng thông chúng tôi tiến hành thử hiệu lực diệt sâu tóm thông của chế phẩm nấm Beauveria bassiana. Kết quả được trình bày ở bảng 5: Bảng 5: Hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana trừ sâu róm thông thí nghiệm từ ( 24/2 – 8/3/2010 ) Công thức Nồng độ (x 108 bt/ml) Tỷ lệ sâu chết (%) sau các ngày thí nghiệm T (oC) H (%) 3 6 8 10 13 1 3,0 15,0 45,0 70,0 90,0 95,0 24,0 80,5 2 6,0 20,0 55,0 85,0 90,0 100,0 3 9,0 20,0 70,0 85,0 100,0 Qua bảng 5, chúng tôi nhận thấy thí nghiệm trong điều kiện nhiệt độ 24,0oC và độ ẩm là 80,5% thì: - Nồng độ thí nghiệm càng cao thì tỷ lệ sâu chết càng cao. Trong 3 công thức trên thì CT3 (9,0 x 108bt/ml) cho hiệu lực diệt sâu cao nhất sau 10 ngày tỷ lệ sâu chết đạt 100%. Sau đó là CT2(6,0 x108bt/ml) với hiệu lực đạt 100% sau 13 ngày và cuối cùng là CT1 (3,0 x108bt/ml) hiệu lưc đạt 95% sau 13 ngày. - Từ kết quả trên cho thấy chế phẩm nấm Bb có hiệu quả cao với sâu róm thông. Hiệu lực diệt sâu cao nhất ở nồng độ 9,0 x108bt/ml đạt 100% sau 10 ngày. Nên nấm Bb có khả năng ứng dụng rộng rãi để phòng trừ sâu róm thông ngoài tự nhiên. Trong thí nghiêm phần lớn sâu róm thông chết có mọc nấm trở lại là 70%. Quá trình thử hoạt lực của nấm Bb với sâu róm thông chúng tôi thu được hình ảnh sâu róm thông chết ( Hình 6 ). Hình 5: Sâu róm thông chết do nấm Beauveria bassiana trong PTN III.2/ Đánh giá hiệu lực của nấm Bb trừ sâu khoang Sâu khoang là loại sâu đa thực, chúng phá hoại rất nặng trên các loại rau và cây lương thực. Vì vậy chúng tôi tiến hành thử hiệu lực của nấm Bb trên sâu khoang. Kết quả được chúng tôi trình bày ở bảng 6: Bảng 6: Hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana trừ sâu khoang thí nghiệm từ ngày 13/1 - 25/1/2010 Công thức Nồng độ (x 108 bt/ml) Tỷ lệ sâu chết (%) sau các ngày thí nghiệm T (oC) H (%) 3 5 7 10 13 1 2,0 0,0 5,0 20,0 30,0 40,0 20,5 82,0 2 4,0 5,0 20,0 30,0 45,0 55,0 3 6,0 10,0 30,0 40,0 55,0 65,0 Qua bảng 6 chúng tôi nhận thấy sau 13 ngày trong điều kiện nhiệt độ 20,5oC và ẩm độ 82% thì chế phẩm có hiệu lực cao với sâu khoang: Nồng độ 6,0 x108bt/ml cho tỷ lệ sâu chết đạt 65.0%. Nồng độ 4,0 x108bt/ml cho tỷ lệ sâu chết đạt 55.0 % Nồng độ 2,0 x108bt/ml thì hiệu lực thấp nhất chỉ đạt 40,0 % Từ kết quả trên cho thấy chế phẩm nấm Bb có hiệu quả diệt sâu khoang Hiệu lực diệt sâu cao nhất ở nồng độ 6 x108bt/ml đạt 65 % sau 13 ngày thí nghiệm, kết quả này có thể ứng dụng để phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng. Mẫu sâu chết để ẩm, tỷ lệ nấm Bb mọc lại trên sâu là 20%. Quá trình thử hoạt lực của nấm Bb với sâu khoang chúng tôi thu được hình ảnh sâu khoang chết: ( Hình 7 ) Hình 7: Sâu khoang chêt do nấm Beauveria bassiana III.3/ Đánh giá hiệu lực của nấm Bb trừ sâu xanh bướm trắng Sâu xanh bướm trắng chủ yếu hại bắp cải và su hào, chúng sinh sản nhanh, và khả nang gây hại cao. Nhằm hạn chế tác hại của sâu trên rau. Chúng tôi tiến hành thử hiệu lực của nấm Bb phòng trừ sâu xanh bướm trắng. Kết quả đươc trình bày ở bảng 7: Bảng 7: Hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana trừ sâu xanh bướm trắng thí nghiệm từ ngày 18/1 - 29/1/2010 Công thức Nồng độ (x 108 bt/ml) Tỷ lệ sâu chết (%) sau các ngày thí nghiệm T (oC) H (%) 3 5 8 10 12 1 3,0 5,0 15,0 35,0 50,0 65,0 21,0 82,5 2 6,0 5,0 20,0 45,0 60,0 70.0 3 9,0 10,0 30,0 50,0 65,0 75,0 Qua bảng 7 cho thấy: Trong 2 lần thí nghiệm ở điều kiện nhiệt độ 21,0oC, ẩm độ 82,5% thì ở nồng độ càng cao thì tỷ lệ sâu chết càng cao và thời gian chết càng nhanh, sau 12 ngày hiệu lực đạt cao nhất là 75,0% ở nồng độ 9,0 x108 bt/ml. Ở nồng độ 6,0 x108 bt/ml hiệu lực diệt sâu chỉ đạt 70,0%, còn nồng độ 3,0 x 108 bt/ml hiệu lực thấp nhất là 65,0%. Tất cả các công thức thí nghiệm trên chúng tôi theo dõi và thấy rằng triệu trứng bệnh và chết của sâu đều giống nhau, chủ yếu là chết cứng giữ nguyên hình dạng. Như vậy ở nhiệt độ và ẩm độ thích hợp thì hiệu quả diệt sâu xanh bướm trắng của nấm Bb càng cao. Vì vậy cần chú ý nhiệt độ và ẩm độ khi phòng trừ để đạt hiệu quả. Quá trình thử hoạt lực của nấm Bb với sâu xanh bướm trắng chúng tôi thu được hình ảnh sâu xanh bướm trắng chết : ( Hinh 8 ) Hình 8: Sâu xanh bướm trắng chết do nấm Beauveria bassiana III.4/ Đánh giá hiệu lực trừ sâu tơ của nấm Bb Sâu tơ là loại sâu nguy hiểm nhất trên các loại rau họ thập tự và có tính kháng thuốc cao với nhiều loại thuốc hóa học. Chính vì thế chúng tôi thử nghiệm diệt sâu tơ của nấm Bb. Vì thuốc trừ sâu vi sinh không gây đôc cho môi trường, con người và không có hiện tương kháng thuốc. Kết quả được chúng tôi trình bày ở bảng 8 : Bảng 8: Hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana trừ sâu tơ thí nghiệm từ ngày 20/1 - 1/2/2010 Công thức Nồng độ (x 108 bt/ml) Tỷ lệ sâu chết (%) sau các ngày thí nghiệm T (oC) H (%) 3 6 8 10 13 1 2,0 3,0 5,0 8,2 16,7 37,0 21,5 82,5 2 4,0 13,3 23,2 30,0 40,0 50,0 3 6,0 6,7 16,7 36,7 43,3 56,7 Qua bảng 8 chúng tôi rút ra một số nhận xét: Chế phẩm nấm Beauveria bassiana có hiệu quả diệt trừ với sâu tơ trong điều kiện nhiệt độ trung bình là 21,5oC và ẩm độ là 82,5% sau 13 ngày Nồng độ thấp 2,0 x108bt/ml cho hiệu quả diệt sâu là 37,0%. Nồng trung bình 4,00x108bt/ml cho hiệu quả diệt sâu là 50,0% Cao hơn ở nồng độ 6,00x108bt/ml cho hiệu quả diệt sâu là 56,7%. Mẫu sâu chết để ẩm, tỷ lệ nấm Bb mọc lại trên sâu là 14%. Quá trình thử hoạt lực của nấm Bb với sâu tơ chúng tôi thu được hình ảnh sâu tơ chết (Hinh 9): Hình 9: Sâu tơ chết do nấm Beauveria bassiana PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận: Sau thời gian nghiên cứu tại Viện Bảo vệ thực vật từ những kết quả đã đạt được chúng tôi rút ra một số kết luận: 1/ Nghiên cứu sản xuất nấm Beauveria bassiana trong điều kiện nhiệt độ là 24,5oC và ẩm độ là 82,5% với thành phần môi trường : 1.1/ Tỷ lệ 80% cám gạo trong môi trường sản xuất cho năng suất và chất lượng chế phẩm nấm Beauveria bassiana đạt cao nhất là 6,5 x109 bt/g. 1.2/ Tỷ lệ 30% bột ngô trong môi trường sản xuất cho chất lượng chế phẩm nấm Bb đạt cao nhất là 6,5 x109 bt/g. 1.3/ Tỷ lệ nước thích hợp trong môi trường sản xuất là 1/3 cho chất lượng bào tử đạt cao nhất là 6,0 x109 bt/g. 2/ Khi sấy ở thời gian thích hợp là 8 giờ thì chất lượng của chế phẩm nấm Beauveria bassiana đạt cao nhất là 6,0 x109 bt/g 3. Hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana phòng trừ một số sâu hại cây trồng trong điều kiện phòng thí nghiệm: 3.1/ Với sâu róm thông hại cây thông: Hiệu lực của nấm Bb đạt cao nhất 100,0% ở nồng độ 9,0 x108 bt/ml sau 10 ngày phun, tỷ lệ sâu róm thông mọc lại nấm Bb là 70%. 3.2/ Với sâu khoang hại rau: Hiệu lực của nấm Bb đạt cao nhất 65,0 % ở nồng độ 6,0 x108 bt/ml sau 13 ngày phun, tỷ lệ sâu khoang mọc lại nấm Bb là 20%. 3.3/ Với sâu xanh bướm trắng hại rau: Hiệu lực của nấm Bb đạt cao nhất là 75,0% ở nồng độ 9,0 x108 bt/ml sau 12 ngày phun, tỷ lệ sâu xanh bướm trắng mọc lại nấm Bb là 20%. 3.4 Với sâu tơ hại rau: Hiệu lực của nấm Bb đạt cao nhất là 56,7 % ở nồng độ 6,0 x108 bt/ml sau 13 ngày phun, tỷ lệ sâu tơ mọc lại nấm Bb là 14%. Đề nghị Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên đề nghị cần tiếp tục nghiên cứu một số thí nghiệm đánh giá hiệu lực của chế phẩm trên nhiều loại sâu hại cũng như thí nghiệm thêm về các yếu tố ảnh hưởng của to, ẩm độ, vi sinh vật tạp nhiễm... để nâng cao năng suất và chất lượng trong việc phòng trừ các loại sâu hại cây trồng. TÀI LIỆU THAM KHẢO I/ Tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt 1/ Nguyễn Lân Dũng (1981). Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại cây trồng, NXB – Khoa học – Kỹ thuật 2/ Phạm Thị Nhất (1995). Sâu bệnh hại rau và phương pháp phòng trừ. NXB Nông nghiệp. 3/ Lê Thùy Quyên. Đề cương khóa luận tốt nghiệp ngành công nghệ sinh học. (2006) 4/ Phạm Thị Thùy (1996). Khảo nghiệm chế phẩm nấm Beauveria bassiana Vuill. Để phòng trừ sâu róm thông ở lâm trường Hà Trung – Thanh Hóa. Tạp chí Nông nghiệp – Công nghiệp – Thực phẩm (trang 501 – 502). 5/ Phạm Thị Thùy (1996). Sản xuất sinh khối nấm Beauveria bassiana Vuill. Tuyển tập công trình nghiên cứu biện pháp sinh học phòng trừ dịch hại cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp (trang 57- 65) 6/ Phạm Thị Thùy (1998). Kết quả ứng dụng chế phẩm nấm Beauveria bassian để phòng trừ sâu róm thông tại lâm trường Phù Bắc Yên – Sơn La. Tạp chí Nông nghiệp – Công nghiệp – Thực phẩm (trang 119-121). 7/ Phạm Thị Thùy (1999). Kết quả khảo nghiệm chế phẩm nấm Beauveria bassiana Vuill. và Metarhizium anisopliae để phòng trừ rầy nâu hại lúa từ năm 1991-1995. Tạp chí Nông nghiệp – Công nghiệp – Thực phẩm (trang 31-33) 8/ Phạm Thị Thùy (2004) Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. 9/ Phạm Thị Thùy, TS. Trần Quang Tấn, Ths. Hoàng Thị Việt (2004). Nghiên cứu công nghệ sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu sinh học (Bt, NPV.Sl, NPV.Ha, nấm Beauveria và Metarhizium) thế hệ mới trong sản xuất rau an toàn. Tuyển tập công trình nghiên cứu biện pháp sinh học phòng trừ dịch hại cây trồng, NXB – Nông nghiệp. 10/ Phạm Thị Thùy (2009). Nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliea để phòng trừ sâu hại cây trồng nông lâm nghiệp ở Việt Nam. Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 12 năm 2009. Trang 18-21. II/ Tài liệu tham khảo bằng tiếng anh 11/ Aguda R.M.Saxena R.C.Litsinger and Roberts D.S.(1994) Inhibitory effect of insecticides on entomogenous fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana. Rice Res. New 9(6). 16-17 12/ Feng. M. G. Poprawski. T. J & Khachatourians. G. G (1994) Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control: Current status. Biocontrol Sci. Technol. 4,3 - 43 13/ Phạm Thị Thùy (1994) Research on multipcation of Beauveria bassiana fungus and preliminary utilisation of Beauveria bassiana bioproduct for pets management in Stored product in Viet Nam. Proceedings of 6th International Working Conference on Stored – product protection, 17-23 April 1994 Cenberra Australia, page 1123-1133. 14/ Rombach M.C (1989) Production of Beauveria basssiana (Deuteromycotina. Hyphomycetes) sympoduloconidia in submerged culture. Entomophaga 34, 45 - 52 15/ Samsináková. A. Kálalová. S. Vlăek. V & Kybal. J (1981), Mass production of Beauveria bassiana for regulation of Leptinotarsa decemlineata population. J. Invertebr. Pathol. 38, 169 – 174. 16/ Watson. D. W. Geden. C. J. Long. S. J & Ruts. D. A (1995), Efficacy of Beauveria bassiana for controlling the house fly and stable fly (Diptera: Muscidae), Biol. Control 5, 405 – 411. MỤC LỤC Trang PHẦN I: MỞ ĐẦU 1 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 I/ Sơ lược lịch sử nghiên cứu nấm diệt côn trùng 3 II/ Những nghiên cứu cơ bản về nấm Beauveria bassiana 3 II.1/ Đặc điểm hình thái 3 II.2/ Một số yếu tố cơ bản ảnh hưởng đên sinh trưởng và phát triển của nấm Beauveria bassiana 6 a/ Ảnh hưởng của môi trường và phương pháp nuôi cấy 6 b/ Ảnh hưởng của nhiệt độ và ẩm độ 6 c/ Ảnh hưởng của ánh sáng 6 d/ Ảnh hưởng của độ thoáng khí 7 e/ Ảnh hưởng của hàm lượng nước 8 g/ Ảnh hưởng của độ pH 8 III/ Độc tố, cơ chế tác động và triệu chứng của sâu nhiễm nấm Beauveria bassiana 9 1/ Độc tố 11 2/ Cơ chế tác động 11 3/ Triệu chứng của sâu nhiễm nấm 12 IV/ Công nghệ sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana 13 1/ Chọn chủng giống 13 2/ Môi trường nhân giống cấp 1 16 3/ Môi trường nhân giống cấp 2 16 4/ Công nghệ sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana bằng phương pháp lên men xốp 17 5/ Tính ổn định của chế phẩm nấm Beauveria bassiana V/ Khái niệm về các loại sâu dùng trong thí nghiệm V.1/ Sâu róm thông ( Dendrolimus punctatus ) V.2/ Sâu khoang ( Spodoptera litura ) V.3/ Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) V.4/ Sâu tơ (Plutella xylostella) VI/ Một số kết quả đạt được trong phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm Beauveria bassiana 1/ Trên thê giới 2/ Ở Việt Nam PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I/ Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18 II/ Vật liệu nghiên cứu 18 1/ Chủng vi sinh vật sử dụng 18 2/ Một số côn trùng sử dụng trong thí nghiệm 18 3/ Dụng cụ và hóa chất dùng trong thí nghiệm 18 III/ Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19 1/ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần môi trường sản xuất đến chất lượng chế phẩm nấm Beauveria bassiana 19 1.1/ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana trên môi trường sản xuất 20 1.2/ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ bột ngô đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana trên môi trường sản xuất 1.2/ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nước (ml) trên môi trường sản xuất (gr) đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana 20 1.3/ Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và ẩm độ trong thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana 20 1.4/ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian sấy tới năng suất và chất lượng của chế phẩm nấm Beauveria bassiana 21 2/ Phương pháp pha loãng và đếm số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu cho các thí nghiệm 2.1/ Phương pháp pha loãng 18 2.2/ Phương pháp đếm số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu 18 3/ Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana để phòng trừ các loại sâu hại cây trồng 23 PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU I/ Tuyển chọn chủng nấm Beauveria bassiana 25 II/ Nghiên cứu tỷ lệ thành phần môi trường sản xuất thích hợp cho nấm Beauveria bassiana (Bb) 31 II.1/ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo trên môi trường sản xuất đến chất lượng chế phẩm nấm Beauveria bassiana 32 II.2/ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ bột ngô trên môi trường sản xuất đến chất lượng chế phẩm nấm Beauveria bassiana 32 II.3/ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nước với môi trường sản xuất đến chất lượng chế phẩm nấm Beauveria bassiana 36 II.4/ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian sấy đến chất lượng của chế phẩm nấm Beauveria bassiana 38 II.5/ Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana III/ Thí nghiệm thử hiệu của chế phẩm nấm Beauveria bassiana trừ sâu hại cây trồng trong điều kiện phòng thí nghiệm 41 III.1/ Đánh giá hiệu lực trừ sâu róm thông của chế phẩm nấm Beauveria bassiana III.2/ Đánh giá hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm nấm Beauveria bassiana III.3/ Đánh giá hiệu lực trừ sâu xanh bướm trắng của chế phẩm nấm Beauveria bassiana III.4/ Đánh giá hiệu lực trừ sâu tơ của chế phẩm nấm Beauveria bassiana PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48