Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne (Ananas comosus) bằng phương pháp RAPD

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas comosus) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHONG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas comosus) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN HỒNG PHONG CN. LƢU PHÚC LỢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - TS. Trần Thị Dung và CN. Lƣu Phúc Lợi đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - TS. Lê Đình Đôn đã hƣớng dẫn và góp ý cho tôi khi tiến hành chủng rệp tại nhà lƣới. - CN. Hồ Việt Thế và các anh chị phụ trách phòng CNSH thực vật thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Hóa Sinh - Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ trong suốt thời gian ở phòng thí nghiệm. - Chị Tôn Bảo Linh, chị Biện Thị Lan Thanh đã góp ý và giúp đỡ tôi trong quá trình làm đề tài. - Toàn thể lớp CNSH29 đã hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. - Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên để con đạt đƣợc thành quả nhƣ ngày hôm nay. Tháng 9 năm 2007 Nguyễn Hồng Phong iv TÓM TẮT NGUYỄN HỒNG PHONG – Lớp DH03SH, Đại học Nông Lâm Tp. HCM. Đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne (Ananas comosus) bằng phƣơng pháp RAPD” dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Trần Thị Dung và CN. Lƣu Phúc Lợi đƣợc thực hiện tại Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh và khu nhà lƣới bảo vệ thực vật khoa Nông học Đại học Nông Lâm Tp. HCM. Nội dung nghiên cứu gồm: Đánh giá đa dạng di truyền các giống dứa Cayenne tại Tp. HCM bằng kỹ thuật RAPD. Nuôi rệp sáp và tiến hành lây nhiễm virus PMWaV thông qua vector là rệp sáp. Xác định marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa Cayenne. Các kết quả thu đƣợc: Kết quả cây phân nhóm di truyền cho thấy giữa nhóm Cayenne và đối chứng Queen có hệ số tƣơng đồng là 0,9. Nhóm dứa Cayenne phân thành 2 nhóm nhỏ: nhóm 1 gồm 2 giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan, nhóm 2 là giống Lâm Đồng. Mức tƣơng đồng giữa 2 nhóm khoảng 0,92. Kết quả kiểm tra độ tin cậy bằng phần mềm winboot cho thấy cây phân nhóm di truyền tạo ra là có độ tin cậy cao nhất. Kết quả nuôi rệp sáp cho thấy rệp có thể phát triển tốt trên bí đỏ và trong điều kiện 25-26oC rệp phát triển tốt hơn trong điều kiện 33-34oC. Đã lây nhiễm đƣợc bệnh héo đỏ đầu lá lên dứa Cayenne với tỷ lệ 35,66% cây có biểu hiện bệnh. Chƣa phát hiện đƣợc marker liên kết rõ ràng với kiểu hình kháng bệnh héo đỏ đầu lá. v SUMMARY Studying genetic diversity and detect markers associated with resistance to wilt disease in cayenne pineapple by RAPD-PCR Supervisor: Tran Thi Dung 1 ; Luu Phuc Loi 1 , BSc Student: Nguyễn Hồng Phong1 1 Department of Biotechnology, Nong Lam university, Ho Chi Minh city Cayenne pineapple is an important crop in Ho Chi Minh city for domestic consumption and export. But today most varietys have been plant is imports and have many pests, especially wilt disease. To develop pineapple industry of this area, its need to research genetic variation of varietys in this area and find the type of wilt resistance. In this study, we analysed genetic variation of 3 varietys of Cayenne pineapple in Ho Chi Minh city and found markers associated with wilt resistant trait by using 32 primer RAPD and received these results: - 6 primers gave DNA polymorphisms in 3 Cayenne varietys and 2 controls. OPAC10 have hightest allen number in Cayenne. UPGMA and bootstrap analysis on the basis of RAPD data clearly showed that 3 Cayenne varietys belong to two major clusters with 92% similarity. The first cluster includes Thailand and China varietys with 98% similarity. The Second cluster is Lam Dong variety. - The results of rearing mealybug show that mealybug can grow on pumpkin and the development of mealybug at 25 – 26oC is better than 33 – 34oC. - Two primers gave most DNA polymorphisms in pineapple when analysed genetic variation were used to detect marker associated with wilt resistant trait in Cayenne pineapple. But non marker was detected. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Summary ................................................................................................................ v Mục lục .................................................................................................................. vi Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... x Danh sách các hình và biểu đồ .............................................................................. xi Danh sách các bảng ............................................................................................ xiii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu, nội dung và yêu cầu của đề tài ........................................................ 2 1.2.1. Mục tiêu ....................................................................................................... 2 1.2.2. Nội dung ....................................................................................................... 2 1.2.3. Yêu cầu ......................................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 2.1. Giới thiệu chung về cây dứa ........................................................................... 3 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc ................................................................................ 3 2.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa ............................................................... 3 2.1.2.1. Việt Nam .................................................................................................. 3 2.1.2.2. Thế giới ..................................................................................................... 4 2.1.3. Các nhóm dứa chính ..................................................................................... 5 2.1.3.1. Nhóm Queen ............................................................................................. 5 2.1.3.2. Nhóm Tây Ban Nha .................................................................................. 6 2.1.3.3. Nhóm Cayenne .......................................................................................... 7 2.2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị .................. 7 2.2.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị .................................. 7 2.2.2. Chỉ thị hình thái ........................................................................................... 8 vii 2.2.3. Chỉ thị isozyme ............................................................................................ 8 2.2.4. Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA ...................................................................... 9 2.2.5. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................ 10 2.3. Các phƣơng pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài ......................................... 11 2.4. Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di truyền dứa trên Thế Giới và Việt Nam ............................................................... 12 2.4.1. Nghiên cứu trên Thế Giới .......................................................................... 12 2.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................................. 13 2.5. Bệnh héo do virus .......................................................................................... 14 2.5.1. Lịch sử phát hiện virus PMWaV ................................................................ 14 2.5.2. Tác nhân lây truyền bệnh ........................................................................... 16 2.5.3. Triệu chứng ................................................................................................ 18 2.5.4. Cách phòng trị ............................................................................................ 19 2.6. Marker liên kết tính kháng bệnh trên thực vật. ............................................. 20 2.6.1. Tính kháng bệnh trên thực vật ................................................................... 20 2.6.1.1. Kháng bệnh đơn gene (monogenic resistance) ....................................... 21 2.6.1.2. Kháng bệnh đa gene (polygenic resistance) hay QTL kháng ................. 21 2.6.2. Xác định marker phân tử liên kết gen kháng bệnh ở thực vật .................. 21 2.6.3. Một số nghiên cứu phát hiện marker phân tử cho tính kháng bệnh trên thực vật bằng kỹ thuật RAPD ...................................................................... 22 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 23 3.1. Đánh giá đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne tại Tp. Hồ Chí Minh .................................................................................................. 23 3.1.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 23 3.1.2. Đối tƣợng ................................................................................................... 23 3.1.3. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................... 23 3.1.4. Hóa chất ..................................................................................................... 24 3.1.5. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 24 3.1.5.1. Ly trích DNA tổng số từ lá dứa .............................................................. 24 viii 3.1.5.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD .................................................................... 26 3.1.5.3. Thực hiện phản ứng RAPD .................................................................... 28 3.1.5.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot ........ 28 3.2. Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne ......................................... 30 3.2.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 30 3.2.2. Đối tƣợng ................................................................................................... 30 3.2.3. Dụng cụ ..................................................................................................... 30 3.2.4. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 31 3.2.4.1. Nuôi rệp ................................................................................................... 31 3.2.4.2. Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh .............................................................. 31 3.2.4.3. Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh .......................................... 32 3.3. Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa Cayenne ....................................................................................... 33 3.3.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 33 3.3.2. Đối tƣợng ................................................................................................... 33 3.3.3. Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................... 33 3.3.4. Hóa chất ..................................................................................................... 33 3.3.5. Phƣơng pháp .............................................................................................. 33 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 35 4.1. Đánh giá đa dạng di truyền của cây dứa Cayenne bằng kỹ thuật RAPD ...... 35 4.1.1. Kết quả ly trích DNA tổng số từ lá dứa ..................................................... 35 4.1.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD ....................................................................... 35 4.1.3. Thực hiện phản ứng RAPD ........................................................................ 36 4.1.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot ............ 40 4.2. Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne ......................................... 43 4.2.1. Nuôi rệp ...................................................................................................... 43 4.2.2. Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh ................................................................. 45 4.2.3. Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh ............................................. 46 4.3. Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo ix đỏ đầu lá trên dứa Cayenne .................................................................................. 48 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 52 5.1. Kết luận ......................................................................................................... 52 5.2. Đề nghị .......................................................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 54 PHỤ LỤC x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT EB extraction buffer EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate OD Optical density OUT Operational Taxonomic Unit PCR Polymerase Chain Reaction PMWaV Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus QTL Quantivative Trait Locus RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TAE Tris – Acetate – EDTA TE Tris – EDTA Tm Melting temperature xi DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 2.1 Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD .............................. 10 Hình 2.2 Rệp sáp hồng (Dysmicoccus brevipes) và rệp sáp xám (D. neobrepes) ................................................................................................... 16 Hình 2.3 Cây dứa bệnh và không bệnh héo đỏ đầu lá ...................................... 18 Hình 2.4 Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá ...................................................... 19 Hình 2.5 Bọ rùa Cryptolaemus montrouzieri .................................................... 20 Hình 2.6 Ong bắp cày Anagyrus ananatis ........................................................ 20 Hình 3.1 Thả rệp lên bí ..................................................................................... 31 Hình 3.2 Dứa bệnh làm nguồn lây PMWaV ..................................................... 32 Hình 3.3 Vị trí thả rệp lên dứa sạch bệnh ........................................................ 33 Hình 4.1 Kết quả ly trích DNA dứa .................................................................. 35 Hình 4.2 Kết quả khảo sát nồng độ Taq polymerase ........................................ 36 Hình 4.3 Kết quả khảo sát nồng độ primer ....................................................... 36 Hình 4.4 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPAC10 ............................ 38 Hình 4.5 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPAH13 ............................ 38 Hình 4.6 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPB01 ............................... 39 Hình 4.7 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPB08 ............................... 39 Hình 4.8 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer S1384................................. 40 Hình 4.9 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer V20 .................................... 40 Hình 4.10 Cây phân nhóm di truyền dựa vào kết quả RAPD ........................... 41 Hình 4.11 Độ tin cậy của các phân nhóm ........................................................ 42 Hình 4.12 Các kiểu phân nhóm khác ................................................................ 43 Hình 4.13 Rệp phát triển trên bí sau 1 tháng .................................................... 44 Hình 4.14 Chuyển Rệp bằng đèn ...................................................................... 45 Hình 4.15 Rệp phát triển trên dứa bệnh 1 tuần sau khi chủng .......................... 46 Hình 4.16 Rệp bám vào mặt sau lá dứa bệnh .................................................... 46 Hình 4.17 Rệp phát triển trên dứa sau khi chủng ............................................. 47 xii Hình 4.18 Dứa biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá. ................................................... 48 Hình 4.19 Kết quả phân tích RAPD các cây dứa biểu hiện và không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá với primer OPAC10 ................................................... 49 Hình 4.20 Kết quả phân tích RAPD các cây dứa biểu hiện và không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá với primer OPB08 ...................................................... 49 Biểu Đồ 4.1 Sự phát triển của rệp ở 25-26oC và 33-34oC (nhiệt độ phòng) ..... 44 xiii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Sản lƣợng dứa của 5 quốc gia trồng nhiều nhất ....................................... 4 Bảng 2.2 Quả tƣơi xuất khẩu ................................................................................... 5 Bảng 2.3 Quả tƣơi nhập khẩu ................................................................................... 5 Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong tối ƣu hoá nồng độ Taq polymerase .................. 27 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng RAPD. ........................................................... 27 Bảng 3.3 Các nghiệm thức trong tối ƣu hoá nồng độ primer. ................................ 28 Bảng 4.1 Số band khuếch đại và band đa hình giữa dứa và lan ............................. 37 Bảng 4.2 Số band khuếch đại và band đa hình giữa dứa Cayenne và dứa Queen . 37 Bảng 4.3 Hệ số đồng dạng di truyền của 3 giống dứa Cayenne và các đối chứng 41 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây dứa (Ananas comosus) là loại cây ăn quả nhiệt đới rất đƣợc ƣa chuộng trên thế giới bởi hƣơng vị đặc trƣng và giàu dinh dƣỡng (vitamin, acid hữu cơ…). Trong các giống dứa chính, dứa Cayenne mang nhiều đặc điểm của công nghệ chế biến đồ hộp nên đang đƣợc trồng rất phổ biến trên thế giới. Hiện nay, cây dứa nói chung và dứa Cayenne nói riêng đang nằm trong chƣơng trình cung cấp giống cây chất lƣợng cao của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn thành phố Hồ Chí Minh. Để phát triển tốt hơn nữa ngành dứa ở vùng này thì điều trƣớc tiên là phải đánh giá đa dạng di truyền nguồn dứa để phục vụ công tác chọn giống và lai giống. Bên cạnh đó, cây dứa Cayenne có nhƣợc điểm chính là có nhiều sâu bệnh phá hại, đặc biệt là bệnh wilt – héo đỏ đầu lá. Bệnh này do virus “Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus” (PMWaV) gây ra. Bệnh làm cây dứa tăng trƣởng kém, trái teo nhỏ, không thành thƣơng phẩm. Bệnh cũng gây tác hại lên hệ thống rễ và làm vàng lá, gây suy thoái toàn bộ cây. Điều đáng quan ngại là, nhiều cây mang mầm bệnh ẩn nhƣng bên ngoài vẫn phát triển bình thƣờng gây khó khăn cho việc kiểm soát bệnh đặc biệt là khâu giống. Về lâu dài, để chống lại bệnh này chỉ còn cách dùng công nghệ sinh học để tạo ra các giống dứa có tính kháng bệnh. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne (Ananas comosus) bằng phƣơng pháp RAPD ” đƣợc thực hiện với hy vọng là cơ sở để thực hiện có hiệu quả việc lai tạo giống đồng thời tạo cơ sở cho việc chọn ra giống dứa có khả năng kháng tự nhiên đối với bệnh héo đỏ đầu lá, góp phần bảo vệ năng suất, phẩm chất của cây dứa, mang lại hiệu quả kinh tế cho nông dân và xã hội. 2 1.2. Mục tiêu, nội dung và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu Phân tích đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng tại Tp. Hồ Chí Minh. Xác đinh marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa Cayenne. 1.2.2. Nội dung Đánh giá đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne tại Tp. Hồ Chí Minh. Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne. Xác Định marker liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá. 1.2.3. Yêu cầu Ly trích DNA tổng số từ lá dứa. Thực hiện PCR với mồi RAPD để xác định sự đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng tại Tp. Hồ Chí Minh. Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa. Thực hiện PCR với mồi RAPD để xác định band đa hình liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá dứa. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây dứa [8] 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc Dứa có tên khoa học là Ananas comosus (L.) Merr thuộc: Phân lớp: Magnoliophyta Lớp: Liliopsida Bộ: Poales Họ: Bromeliaceae Giống: Ananas Loài: Anana comosus Dứa có nguồn gốc ở Nam mỹ (Brazil, Achentina, Paragoay...). Hiện nay trên thế giới, cây dứa đƣợc trồng ở hầu hết các nƣớc nhiệt đới và một số nƣớc á nhiệt đới có mùa đông tƣơng đối ẩm. Dứa đƣợc coi là một trong những cây ăn quả nhiệt đới hàng đầu, loại quả “vua” rất đƣợc ƣa chuộng ở các nƣớc phƣơng Tây. 2.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa 2.1.2.1. Việt Nam Ở nƣớc ta, dứa đƣợc trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nƣớc hiện khoảng 40.000 ha với sản lƣợng khoảng 500.000 tấn trong đó 90% là phía Nam. Các tỉnh trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Long An…; miền Bắc là Thanh Hóa, Ninh Bình, Tuyên Quang, Phú Thọ…; miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam, Bình Định… Năng suất quả bình quân một năm ở các tỉnh phía Bắc khoảng 10 tấn/ha, phía Nam khoảng 15 tấn/ha. Trong năm cây dứa ra hoa nhiều vụ. Ở miền Bắc vụ chính ra hoa tháng 2-3, thu hoạch tháng 6-7, vụ trái ra hoa tháng 6-8, thu hoạch tháng 10-12. Ở miền Nam, dứa có thể ra hoa quanh năm, song thƣờng tập trung vào tháng 4-5 và tháng 9-10. Từ khi ra hoa đến thu hoạch trung bình khoảng 4-5 tháng. 4 Ngoài ăn tƣơi, quả dứa còn dùng chế biến thành dứa hộp và nƣớc dứa, là những mặt hàng xuất khẩu lớn. Xác bã quả dứa sau khi chế biến dùng làm thức ăn gia súc và phân bón. Thân lá dứa làm bột giấy. 2.1.2.2. Thế giới [18] Sản lƣợng dứa hằng năm của thế giới tăng gấp 3 trong suốt 40 năm từ 3.833.137 tấn năm 1961 đến 13.738.735 tấn năm 2001 (d’Eeckenbrugge và Leal, 2001) và hiện nay đã vƣợt quá 13 tỉ tấn (FAOSTAT, 2001). 5 quốc gia sản xuất dứa lớn nhất (bảng 2.1) chiếm khoảng 56% sản lƣợng của thế giới. Sản lƣợng của Brazil, Columbia và Trung Quốc tăng gấp 3 từ 1980, trong khi Philippines và Indonesia tăng nhẹ (Rieger, 2001). Bảng 2.1 Sản lƣợng dứa của 5 quốc gia trồng nhiều nhất Quốc gia Sản lƣợng 1999 (tấn) Thái Lan 2 353 037 Philippines 1 530 033 Ấn Độ 1 440 000 Trung Quốc 1 231 066 Brazil 1 175 200 Thế giới 13 768 426 Khoảng 70% sản lƣợng dứa trên thế giới đƣợc tiêu thụ trong nƣớc ở dạng quả tƣơi (d’Eeckenbrugge và Leal, 2001). Costa Rica, Côte d’Ivoire và Philippines có lƣợng quả tƣơi xuất khẩu chiếm khoảng 63% quả tƣơi xuất khẩu của thế giới. Bảng 2.2 cho biết tình hình xuất khẩu trong năm 1999 của 5 nƣớc xuất khẩu dứa tƣơi nhiều nhất thế giới. 5 Bảng 2.2 Quả tƣơi xuất khẩu Quốc gia Xuất khẩu trong năm 1999 (Tấn) Costa Rica 353 000 Côte d’Ivoire 183 000 Philippines 127 682 Mỹ 31 521 Ghana 21 849 Thế giới 1 051 706 Sản phẩm dứa chủ yếu là dứa đóng hộp. Trong năm 1999, hơn 1 triệu tấn dứa đóng hộp đƣợc xuất khẩu, chủ yếu từ Thái Lan, Philippines và Indonesia chiếm khoảng 76%. Thái Lan là nƣớc xuất khẩu nhiều nhất chiếm 46% lƣợng xuất khẩu toàn thế giới (FAOSTAT, 2001). Liên minh Châu Âu là 1 thị trƣờng lớn của quả tƣơi, tiếp sau là Mỹ. Bảng 2.3 Quả tƣơi nhập khẩu Quốc gia Nhập khẩu trong năm 1999 (Tấn) European Union 330 502 Mỹ 283 090 Nhật 89 866 Canada 32 507 Singapore 19 962 Thế giới 1 031 980 2.1.3. Các nhóm dứa chính [8] 2.1.3.1. Nhóm Queen Là loại đƣợc trồng chủ yếu ở nƣớc ta hiện nay. Đặc tính đóng hộp kém, nhƣng dùng để ăn tƣơi và xuất khẩu tƣơi rất tốt. 6 Các đặc điểm về hình thái: Lá: Đầy gai, lá ngắn hơn Cayenne. Chồi: Nhiều chồi cuống, chồi nhỏ. Dạng quả: Hình nón, mắt sâu. Trọng lƣợng quả trung bình 1 kg. Lõi nhỏ. Màu vỏ trái khi chín: Vàng. Màu ruột khi chín: Vàng. Hƣơng vị: Ngọt hơn Cayenne, ít chua, ít xơ, xơ ngắn, thơm. Thích hợp cho tiêu thụ tƣơi. Tính đề kháng: Mẫn cảm với bệnh héo đỏ đầu lá. Năng suất kém. 2.1.3.2. Nhóm Tây Ban Nha Loại dứa này cũng có đặc tính đóng hộp kém, nhƣng dùng để ăn tƣơi và xuất khẩu tƣơi rất tốt. Các đặc điểm về hình thái: Lá: Dài, hẹp, có gai. Dạng quả: Hơi tròn, mắt rộng, dẹp. Trọng lƣợng quả trung bình từ 1,2-1,5 kg. Lõi rất lớn. Màu vỏ trái khi chín: Cam. Màu ruột khi chín: Trắng đến vàng. Hƣơng vị: Ngọt, hơi có vị cay chua, nhiều xơ. Tính đề kháng: Kháng bệnh héo đỏ đầu lá. Năng suất kém. 2.1.3.3. Nhóm Cayenne Là loại đƣợc trồng rất phổ biến trên thế giới, đồng thời cũng đƣợc dùng để đóng hộp nhiều nhất. 7 Các đặc điểm về hình thái: Lá: Gần nhƣ không có gai, chỉ có một ít gai ở chóp lá. Chồi: Ít chồi. Dạng quả: Hình trụ, mắt dẹp, cạn. Trọng lƣợng quả trung bình từ 2-2,5 kg. Lõi (cùi dứa) trung bình. Màu vỏ trái khi chín: Vàng da cam. Màu ruột khi chín: Vàng nhạt đến vàng. Hƣơng vị: Ngọt, hơi chua, ít xơ, nhiều nƣớc, mềm. Tính đề kháng: Mẫn cảm với bệnh héo đỏ đầu lá. Năng suất cao. Dứa Cayenne chứa rất nhiều nƣớc, vỏ lại mỏng nên rất dễ thối khi vận chuyển đi xa. Tuy nhiên, nƣớc lại có tỉ lệ đƣờng cao, vị chua nhẹ (acid trong dứa Cayenne thấp hơn dứa Queen), mùi thanh, rất hợp khẩu vị ngƣời phƣơng Tây. Mắt dứa Cayenne lại rất cạn, gọt vỏ xong không cần lấy mắt có thể ăn ngay. Những ƣu điểm trên rất thuận lợi cho việc chế biến, đóng hộp qui mô công nghiệp nên dứa Cayenne là nguyên liệu chính cho ngành công nghiệp chế biến - xuất khẩu dứa và hầu nhƣ toàn bộ diện tích dứa Cayenne ở nƣớc ta hiện nay đều là vùng nguyên liệu của các nhà máy chế biến dứa. Các giống Cayenne đƣợc trồng phổ biến hiện nay là giống Cayenne Thái Lan, Cayenne Trung Quốc và Cayenne Lâm Đồng. Theo tài liệu của Viện cây ăn quả miền Nam, giống Cayenne Thái Lan và Trung Quốc đều cho trái to và phát triển tốt; tuy nhiên là giống mới nhập nội nên cần có thời gian để kết luận . Giống Cayenne Lâm Đồng đã phát triển lâu đời ở Việt Nam , thích nghi với khí hậu nƣớc ta , phẩm chất tốt nên phát triển trong giai đoạn hiện nay. 2.2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị 2.2.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của 8 một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền nhƣ vậy đƣợc gọi là tính đa dạng di truyền (trích dẫn bởi Lê Văn Huy, 2005) [5]. Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính trạng bên ngoài. Ngƣời ta thƣờng tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra đƣợc sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị. Có 3 loại chỉ thị thƣờng đƣợc sử dụng: Chỉ thị hình thái. Chỉ thị isozyme. Chỉ thị phân tử. 2.2.2. Chỉ thị hình thái Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ đƣợc liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà ngƣời ta có thể phát hiện đƣợc. Tuy nhiên nếu dựa vào những chỉ thị loại này để lập bản đồ gene và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lƣợng chỉ thị ít do không phải tất cả những tính trạng kiểu hình nào ta cũng có thể nhận diện đƣợc, đồng thời độ chính xác và độ tin cậy thấp. 2.2.3. Chỉ thị isozyme Isozyme là các dạng khác nhau của 1 enzyme của một cá thể, có cùng chức năng xúc tác cho một phản ứng (hoạt tính xúc tác tƣơng tự hoặc giống nhau) nhƣng lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau. Nói cách khác, isozyme là tất cả các dạng khác nhau của một enzyme đƣợc mã hoá bởi một locus di truyền. Hoạt tính của chúng đặc trƣng đối với một cơ chất và trợ chất enzyme nhất định. Chỉ thị isozyme là chỉ thị sinh hoá. Về di truyền isozyme đƣợc chia làm 2 loại: Isozyme đơn gene: chịu sự kiểm soát của một gene có thể có các kiểu phân tử khác nhau do có sự khác nhau về thành phần và trật tự acid amin và có thể phân tách đƣợc bằng điện di. 9 Isozyme đa gene: tạo ra bởi hai hay nhiều gene. Dựa vào đặc tính tích điện âm trên bề mặt, khi chiu tác động của dòng điện một chiều isozyme sẽ di chuyển (trên gel polyacrylamide hoặc gel tinh bột) về cực dƣơng của điện trƣờng. Isozyme đƣợc sử dụng trong nhiều mục đích khác nhau, đặc biệt trong nghiên cứu đa dạng di truyền của thực vật và động vật, khoảng cách lan rộng của hạt phấn , định danh giống, kiểm tra phả hệ… Kết quả mà chỉ thị isozyme đem lại khả quan hơn so với chỉ thị hình thái do số lƣợng chỉ thị có thể phát hiện đƣợc nhiều hơn, tuy nhiên số lƣợng chỉ thị cũng vẫn ít, không đáp ứng cho những nghiên cứu sâu rộng. 2.2.4. Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA Là những chỉ thị đƣợc tạo ra nhờ phƣơng pháp cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme) hoặc PCR. Các chỉ thị phân tử này có thể liên kết với một gene nào đó trong nhiễm sắc thể. Các chỉ thị DNA có nguồn gốc từ hai nhóm: Chỉ thị dựa vào phƣơng pháp lai DNA: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms). Chỉ thị dựa vào phƣơng pháp PCR: SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism), STS (Sequence – Tagged Sites), Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), DAF (DNA Amplification Fingerpriting) … Lợi ích của chỉ thị DNA so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme: Đo lƣờng trực tiếp các vật liệu di truyền. Có rất nhiều chỉ thị DNA trong quần thể. Phân tích không bị ảnh hƣởng bởi môi trƣờng và giai đoạn phát triển của đối tƣợng. 10 2.2.5. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR , bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide). Nếu 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có khác biệt giữa các cá thể thì sẽ có sự thay đổi về số lƣợng và vị trí bắt cặp ngẫu nhiên nên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể. Hình 2.1 Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD Ghi chú: - Các mũi tên biểu thị cho các vị trí gắn của primer trên mạch đơn DNA mẫu. Trong trƣờng hợp này, có 2 sản phẩm PCR đƣợc tạo thành: Sản phẩm A: là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 2 và 5. Sản phẩm B: là sản phẩm PCR khuếch đại. Không có sản phẩm PCR hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 1 và 4 do hai vị trí này quá xa nhau để cho phép hoàn thành sự khuếch đại. Không có sản phẩm hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 2 và 4, 3 và 5, do các primer không có chiều hƣớng vào nhau. (Nguồn: Kỹ thuật RAPD ra đời sau kỹ thuật RFLP, tuy khả năng tạo đa hình tƣơng đƣơng với kỹ thuật RFLP nhƣng quy trình thực hiện đơn giản hơn, chi phí thấp hơn và thu đƣợc kết quả nhanh hơn nên nhanh chóng có vị trí xứng đáng trong nghiên 11 cứu đa dạng di truyền một số cây trồng một và hai lá mầm nhƣ lúa, chuối, dứa, bông cải, cà chua, dừa, cacao, điều… Ngoài ra RAPD còn dùng để phát hiện đột biến , phát hiện chỉ thị phân tử, xây dựng bảng đồ gene. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện, thao tác đơn giản, chi phí thấp, không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng, chất lƣợng DNA tổng số không đòi hỏi quá tinh sạch, cho đa hình cao và thời gian thực hiện ngắn. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD: Kỹ thuật RAPD không ổn định (độ lặp lại thấp), cho đa hình cao nhƣng độ tin cậy lại thấp. 2.3. Các phƣơng pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài [3] Tất cả các phƣơng pháp nghiên cứu sự đa dạng của quần thể đều cho kết qủa cuối cùng là các dữ liệu phân tử phức tạp nhƣ các băng vạch trên bảng điện di hoặc thông tin trình tự DNA, RNA, protein. Để lấy đƣợc các thông tin sinh học từ dữ liệu thô này, các nhà khoa học cần đến sự hỗ trợ của máy tính với các phần mềm phân tích dữ liệu thực nghiệm. Các thông số về độ đa dạng kiểu gene, độ đa dạng kiểu hình, khoảng cách gene giữa các cá thể đƣợc tính toán theo phƣơng trình của Dice (1979). Từ các thông tin này, cây phát sinh loài sẽ đƣợc xây dựng khi dùng các phƣơng pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic), Neighbor Joining, Transformed distance, Neighbors-relation, Maximum parsimoni hoặc Maximum likehood, Minimum evolution. Trong các phƣơng pháp trên thì phƣơng pháp UPGMA là phƣơng pháp đơn giản nhất và đang đƣợc sử dụng phổ biến nhất. UPGMA phản ánh mức tƣơng tự kiểu hình giữa các OTU (Operational Taxonomic Unit) (đại diện cho các cá thể ) với các bƣớc sau : Trƣớc tiên tạo ma trận tƣơng quan giữa các OTU từ dữ liệu đa hình; với ma trận trên, thuật toán sẽ nhóm một cặp OTU có khoảng cách nhỏ nhất (có mức tƣơng đồng gene cao nhất) với giá trị bằng nửa khoảng cách giữa hai OTU; sau đó, cặp đơn vị tiến hóa này đƣợc xem nhƣ một OTU mới và khoảng cách giữa OTU mới này với một OTU khác là trung bình khoảng cách giữa OTU đó với OTU còn lại trong nhóm. Thuật toán tiếp tục 12 nhóm các OTU có khoảng cách nhỏ nhất cho đến khi chỉ còn có hai OTU . Sau cùng là tạo một cây tiến hóa có gốc . Để đánh giá độ chính xác của cây phân loài thì phƣơng pháp thông dụng nhất là dựng bootstrap. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là thay đổi các thông số của ma trận khoảng cách để tạo ra nhiều ma trận khoảng cách khác có cùng kích thƣớc với ma trận gốc. Mỗi một ma trận tạo ra sẽ lập thành một cây phát sinh loài. Độ tin cậy của 1 phân nhóm đƣợc đánh giá dựa vào mức độ lập lại của phân nhóm đó. 2.4. Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di truyền dứa trên Thế Giới và Việt Nam [4] 2.4.1. Nghiên cứu trên Thế Giới Hiện nay, nhu cầu sản lƣợng dứa trên thế giới dùng cho chế biến ngày càng tăng đòi hỏi các nhà chọn giống phải tạo ra những giống có chất lƣợng phù hợp với nhu cầu thị trƣờng. Vì thế, nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trên dứa đã đƣợc thực hiện và thành công với sự đóng góp của các loại marker (chỉ thị) phân tử nhằm cung cấp những thông tin về di truyền để chọn giống chính xác hơn. Những thành công đƣợc thể hiện qua những nghiên cứu sau: Nghiên cứu sự đa dạng di truyền dứa bằng marker AFLP ( Cecilia Y. Kato và ctv, 1992). Sự đa dạng di truyền đƣợc tiến hành trên 70 giống dứa (Ananas comosus L) và 3 họ có liên quan (Ananas ananassoidies, Ananas bracteatus và Ananas erctifolius). Kết quả cho thấy việc lai khác loài giữa A. comonus và A. ananassoidies với mức tƣơng quan của A. comonus (0,398) và A.ananassoidies (0,381). Qua đó cho thấy sự khác biệt di truyền trong số các giống dứa phần lớn có thể do đột biến. Phân tích đa dạng di truyền phân tử dứa bằng marker RFLP (Duval và ctv, 2001) đã cho thấy đƣợc sự giống nhau giữa Ananas comosus và Pseudananas comosus là 58,7% qua sử dụng 18 probe tƣơng đồng để lai. Xác định đặc tính của phôi dứa (Ananas spp) bằng marker AFLP: 40 giống (dòng) dứa đƣợc thu thập và xác định mức độ đa hình giữa các giống, đặc tính của chúng. Sự phân nhóm di truyền đã chỉ rõ mối liên quan giữa các nhóm và sự khác 13 biệt với các loài hoang dại. Sự khác biệt này do tự bản thân giống hoặc do yếu tố môi trƣờng, tỷ lệ đột biến và sự khác biệt dòng soma. Xác định độ tin cậy kiểu gene của cây dứa vi nhân giống liên quan đến marker isozyme và RAPD (Sergio Feuse và ctv, 2003). Đánh giá sự liên quan di truyền của giống dứa Ananas và Pseudananas bằng marker RAPD (Claudete de Fátima Ruas1và ctv, 2001). 2.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam Ở nƣớc ta, hiện nay đã có một số viện nghiên cứu và các trƣờng đại học đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gene bằng các kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ RAPD, AFLP, SSR… Tuy số lƣợng của các nghiên cứu này chƣa nhiều nhƣng đã cho thấy chúng ta có khả năng thực hiện những nghiên cứu sử dụng công nghệ tiên tiến nhằm đẩy mạnh công tác chọn tạo giống, vật nuôi, cây trồng. Dƣới đây là một số nghiên cứu đã ứng dụng thành công trên dứa nhƣ: Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống (dòng) dứa bằng phƣơng pháp RAPD (Hoàng Thị Bích Thuỷ và Bùi Văn Lệ, 2004). Kết quả nghiên cứu này đã phân nhóm đƣợc 7 giống (dòng) qua sử dụng 9 loại primer đã xác định đƣợc các quần thể Trung Quốc 220 và Trung Quốc 250; Đắc Lắc và Thái Lan có cùng nguồn gốc và quần thể dứa Lâm Đồng và Đắc Lắc; Lâm Đồng và Thái Lan là các quần thể xa nhau về mặt nguồn gốc. “Nghiên cứu đa dạng nguồn gene dứa Cayenne bằng phƣơng pháp marker phân tử” (Lê Thị Thanh Tuyền và Nguyễn Thị Lang, 2004). 13 primer RAPD (10 nucleotide) đƣợc sử dụng để khảo sát tính đa dạng di truyền của 50 dòng dứa Cayenne ở đồng bằng Sông Cửu Long (Long Định và viện lúa ĐBSCL). Bên cạnh phân tích bằng sinh học phân tử đề tài còn tiến hành đánh giá đa dạng nguồn gene dựa vào dữ liệu kiểu hình với các chỉ tiêu sau: Chiều cao cây, chiều rộng cây, chiều dài lá, chiều rộng lá, số lá, ngày trổ hoa, trọng lƣợng trái, hình dạng lá có gai, không gai hay lá viền (chỉ có gai một phần hoặc ở một số vị trí trên lá nhƣ ngọn, gốc hoặc giữa lá) và màu sắc lá. Kết quả: Phân nhóm di truyền của 50 giống Cayenne dựa trên dữ liệu sản phẩm PCR - RAPD phân thành 3 nhóm chính, với khoảng cách 14 phân nhóm là 0,66. Nhóm I gồm 20 dòng dứa, nhóm II gồm 3 dòng và nhóm III là 27 dòng, trong mỗi nhóm đều chứa những dòng dứa có nguồn gốc nhập ngoại và nhập nội. Sự tƣơng đồng về di truyền giữa nhóm I hoặc nhóm II với nhóm III là 49 % và nhóm I với nhóm II là 63%; trong cùng một nhóm thì nhóm III có mức tƣơng đồng về di truyền cao nhất 71%. Khoảng cách di truyền giữa 50 dòng dứa Cayenne qua phân nhóm dao động từ 0,27 – 1,0 với những dòng dứa đƣợc trồng từ dạng nuôi cấy mô có sự tƣơng đồng về di truyền cao nhất. Bên cạnh đồng bằng Sông Cửu Long, nơi cung cấp dứa có chất lƣợng thì Tp. Hồ Chí Minh cũng là vùng dứa lớn. Để phát triển tốt hơn ngành dứa ở vùng này thì điều trƣớc tiên là phải đánh giá về đa dạng di truyền nguồn dứa để phục vụ công tác chọn giống và lai giống. 2.5. Bệnh héo do virus [1] Bệnh héo đỏ đầu lá hiện diện ở hầu hết các vùng trồng dứa trên thế giới. Theo Sether D.M. và Hu J.S. (2002), bệnh đã xuất hiện ở Mỹ, Đài Loan, Singapore, Brazil, Jamaica, Philippines, Venezuela, Thái lan, Malaysia và cả ở Việt Nam. Đây là bệnh rất nguy hiểm và ảnh hƣởng lớn đến nghề trồng dứa. Không nhƣ các bệnh khác trên dứa do vi khuẩn, nấm hay tuyến trùng đều có các loại thuốc phòng trị đặc hiệu, bệnh héo đỏ đầu lá cho đến nay vẫn chƣa có biện pháp phòng trừ triệt để ngoài việc hạn chế sự lây lan là diệt môi giới truyền bệnh (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2001). Bệnh do virus PMWaV gây ra. Virus đƣợc bảo tồn và lan truyền sang đời sau chủ yếu qua chồi giống và tàn dƣ của cây bệnh. Những chồi giống mang mầm bệnh lại thƣờng chỉ biểu hiện triệu chứng vào giai đoạn cây đang phân hóa mầm hoa trở đi, tức là sau một thời gian trồng rất dài (9 - 12 tháng). Chính đặc điểm này của bệnh héo đỏ đầu lá đã gây nên những thiệt hại kinh tế to lớn cho ngƣời trồng dứa (Borroto E.G. và cs, 1998). 15 2.5.1. Lịch sử phát hiện virus PMWaV [14] [12] [16] [17] Trong những năm 1920, ngƣời trồng dứa ở Hawaii nhận thấy có nhiều kiến trong các vùng trồng dứa bị bệnh. Họ cho rằng kiến là nguyên nhân gây bệnh và tìm cách tiêu diệt kiến để bảo vệ vƣờn dứa. Illingworth (1931) đã chứng minh rằng kiến không phải là nguyên nhân gây bệnh mà rệp sáp mới là nguyên nhân gây bệnh. Carter (1939) báo cáo rằng nƣớc bọt của rệp sáp gây độc cho dứa dựa trên các quan sát sau : Bệnh xảy ra khi có 1 lƣợng lớn rệp hiện diện trên dứa; có mối quan hệ bằng thực nghiệm giữa số lƣợng rệp, thời gian rệp tồn tại trên dứa với cừơng độ bệnh; cây phục hồi khi rệp bị diệt. Carter và Schmidt (1935) thực hiện thí nghiệm xác định số lƣợng rệp tối thiểu để gây bệnh héo đỏ đầu lá. Tuy nhiên tỉ lệ mắc bệnh lại không khác biệt có ý nghĩa giữa lô chỉ thả 1 rệp với lô đối chứng không có rệp, do lô chỉ thả 1 rệp chỉ có vài cây biểu hiện bệnh. Carter kết luận 1 rệp cũng có thể gậy bệnh và bệnh có thời gian ủ bệnh có thể tới 2 tháng. Gunasinghe và German (1989), Maramorosch và cộng sự (1984), Ullman và cộng sự (1989) đã phân lập đƣợc 1 loại closterovirus hình que trên các cây dứa có và không có triệu chứng bệnh và gọi là Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus (PMWaV). Hu và cộng sự (1996) phát hiện PMWaV trên rệp thu từ các cây dứa bệnh mà không phát hiện PMWaV trên rệp thu từ bí đỏ. Các nghiên cứu này đã chứng minh đƣợc PMWaV là nguyên nhân chính gậy ra bệnh héo đỏ đầu là trên dứa. Melzer và cộng sự (2001) đã phát hiện có ít nhất 2 loại PMWaV (PMWaV-1, PMWaV-2) gây bệnh trên dứa. Sether và Hu (2002) chứng minh rằng bệnh chỉ biểu hiện triệu chứng khi có sự xâm nhiễm của rệp sáp và virus PMWaV-2, bệnh không biểu hiện triệu chứng khi không có rệp hoặc cây có rệp mà chỉ nhiễm PMWaV-1. Sether, Hu, Melzer, Busto và Zee (2004) thực hiện RT-PCR với primer thoái hóa cho protein HSP-70 đã phát hiện thêm 2 loại PMWaV là PMWaV-3 và PMWaV-4. Nhƣ vậy cho đến nay đã phát hiện đƣợc 4 loại PMWaV trên dứa có biểu hiện triệu 16 chứng bệnh nhƣng chỉ có PMWaV-2 gây biểu hiện triệu chứng theo nghiên cứu của Sether và Hu (2002). 2.5.2. Tác nhân lây truyền bệnh [1] [19] [20] PMWaV-1 và PMWaV-2 đƣợc truyền bởi 2 loại rệp sáp: Dysmicoccus brevipes (rệp màu hồng) và D. neobrepes (rệp màu xám) (Sether và Hu, 1997; Sether và cộng sự, 1998). Hình 2.2 Rệp sáp hồng (Dysmicoccus brevipes) và rệp sáp xám (D. neobrepes) (Nguồn: Rệp sáp D. neobrevipes sinh sản hửu tính. Không đẻ trứng, trứng nở trong cơ thể con mẹ và ấu trùng chui ra từ con mẹ gọi là crawler. Giai đoạn crawler là giai đoạn phát tán chính. Crawler di chuyển trong khoảng thời gian ngắn không quá 1 ngày và có thể di chuyển hàng trăm mét nhờ gió. Con cái trải qua 3 lần lột xác trƣớc khi thành thục. Các giai đoạn ấu trùng của con cái kéo dài 11–23 ngày, 6–20 ngày và 7–28 ngày theo thứ tự. Tổng thời kì ấu trùng của con cái khoảng 26–52 ngày. Trong thời kỳ ấu trùng rệp chỉ ăn trong giai đoạn 1 và 2. Khi con cái trƣởng thành có 1 khoảng thời gian 25 ngày trƣớc khi nó sinh lứa con đầu tiên. Trong khoảng thời gian này con cái giao phối với con đực. Con cái sau đó sinh trong khoảng 30 ngày và chết sau 4 ngày ngừng sinh sản. Mỗi con cái có thể sinh 350 con nhƣng có thể lên tới 1000 con. Con cái không đƣợc giao phối sống trung bình 148 ngày, trong khi con cái đƣợc giao phối sống trung bình 95 ngày. Con đực lột xác 4 lần trƣớc khi mọc cánh (trƣởng thành); mỗi giai đoạn ấu trùng kéo dài 11–19 ngày, 7–19 ngày, 2–7 ngày và 2–8 ngày theo thứ tự. Tổng thời 17 gian giai đoạn ấu trùng là 22–53 ngày. Con đực chỉ ăn trong giai đoạn 1 và 2. Các lần lột xác xảy ra trong kén sáp trong khoảng thời gian là 12 ngày. Khi ra khỏi kén thì con đực trƣởng thành chỉ dài 1 mm với 1 đôi cánh màng và không có vòi chích hút (mouthparts). Con đực trƣởng thành sống đƣợc khoảng 3-7 ngày. Con đực có vòng đời khoảng 59–117 ngày. Rệp sáp Dysmicoccus brevipes có các đặc điểm sinh học tƣơng tự nhƣ rệp sáp Dysmicoccus neobrevipes: Giai đoạn ấu trùng của con cái trải qua 3 giai đoạn lần lƣợt là 10; 6,7 và 7,9 ngày. Giai đoạn ấu trùng của con đực gồm 4 giai đoạn 9,9; 5,8; 2,5 và 3,7 ngày. Giai đoạn từ ấu trùng đến thành trùng khoảng 24 ngày (cả đực và cái). Thành trùng cái sống trong khoảng từ 17- 49 ngày, trong khi đó thành trùng đực chỉ sống đƣợc 1-3 ngày. Thành trùng cái đẻ từ 19-137 con, trong tự nhiên tỷ lệ đực cái là 1:1. Rệp sáp D. brevipes Có 2 kiểu sinh sản: Đơn tính và lƣỡng tính. Kiểu sinh sản đơn tính tìm thấy ở Hawaii, ở đây chỉ có con cái đƣợc sinh ra và không cần con đực thụ tinh. Còn ở Brazil có cả 2 dạng sinh sản đơn tính và lƣỡng tính. Ở nƣớc ta Rệp xuất hiện nhiều vào các tháng có ẩm độ không khí 70-80%, nhiệt độ thấp 15-20oC. Rệp tập trung ở gốc dứa, phần ngầm dƣới đất và sát trên mặt đất. Vào tháng 5-9 rệp thƣờng bò trên lá, quả, chồi ở trên cao. Rệp sáp bám vào các lá non, vào gốc lá già, vào mắt quả, vào rễ cây để hút dịch cây làm cây sinh trƣởng kém, lá vàng và khô. Trong khi chích hút nhựa chúng thải ra chất đƣờng mật hấp dẫn kiến và nấm bồ hóng làm cho cây kém phát triển trầm trọng. Khi cây dứa suy kiệt (gần hết nhựa) thì kiến lại tha rệp đến cây khác. Ngoài ra Kiến còn ăn một số động vật là kẻ thù tự nhiên của rệp nên có thể xem rệp và kiến có sự cộng sinh với nhau. Rệp thực chất không chứa virus, chúng sống trên cây dứa nhiễm PMWaV và thu đƣợc virus. Rệp tiếp thu và truyền virus trong suốt quá trình dinh dƣỡng. Không có ký chủ khác của virus đƣợc tìm thấy ngoài cây dứa mặc dù nhiều loài cỏ cũng là ký chủ của 2 loại rệp này. Điều đó cho thấy cây dứa nhiễm PMWaV là nguồn chứa virus duy nhất cho rệp truyền sang cây khác. 18 2.5.3. Triệu chứng [1] Theo Sether D. M. và cộng sự (1998), biểu hiện triệu chứng bệnh rất thất thƣờng và có quan hệ với thời tiết, mật độ rệp sáp và hệ gene của dứa. Theo Nguyễn Văn Kế (2002), bệnh biểu hiện đầu tiên trên các lá già nhất, sau đó đến các lá già và các lá bên trên. Dứa bị bệnh thì lá bị đỏ đầu, các lá đỏ dần lên, vỏ lụa bung ra, lá kém trƣơng nƣớc, rìa lá cuốn về phía lƣng, đầu lá cong xuống đất, hóa nâu và khô dần. Rễ ở những cây bị nhiễm bệnh cũng bị hƣ hoại, khi nhổ lên thì thấy phần vỏ rễ tuột ra khỏi phần lõi nhƣ một cái ống. Tùy theo giống từ khi cây bị nhiễm bệnh tới khi biểu hiện triệu chứng mất từ 2 tuần đến 6 tháng. Nhiều cây con bị nhiễm trong vƣờn ƣơm không có dấu hiệu bệnh, sau một thời gian trồng mới biểu hiện. Hình 2.3 Cây dứa bệnh và không bệnh héo đỏ đầu lá a: Dứa không bệnh; b: dứa bệnh Bệnh héo đỏ đầu lá thƣờng trải qua 4 giai đoạn phát triển: Xâm nhiễm: Biểu hiện bệnh là chóp lá có màu đỏ. Lây lan: Lá chuyển từ màu đỏ sang hồng, mép phiến lá uốn cong về phía mặt dƣới. Héo lá: Các lá bị bệnh khô dần, lá ở nõn vẫn mọc bình thƣờng. Gây chết cây. 19 Hình 2.4 Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá Trong chu kì của thực vật, giai đoạn cây đang phân hóa mầm hoa và sau đó một chút là lúc cây dễ nhiễm bệnh nhất. Hậu quả là quả bị nhỏ, chua, khô, mắt lộ rõ, không có giá trị thƣơng phẩm (Trần Thế Tục - Vũ Mạnh Hải, 2001). 2.5.4. Cách phòng trị [1] [20] Để phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá, theo Nguyễn Văn Kế (2000), cần áp dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp nhƣ: Chọn giống kháng bệnh. Lấy giống từ vùng ít bệnh. Xử lý vật liệu trồng bằng thuốc trừ rệp sáp. Trƣớc khi trồng, khử đất để trừ kiến và các ổ rệp. Vệ sinh đồng ruộng để khỏi lây lan vụ sau. Trong quá trình dứa phát triển cần theo dõi phun thuốc trừ rệp, kiến. Hiện nay trên thế giới biện pháp sinh học đã đƣợc áp dụng khá phổ biến và tỏ ra hữu hiệu để phòng trị rệp sáp trên dứa. Các loài thiên địch sau đây đã đƣợc du nhập và Hawaii để phòng trị rệp sáp: Các loài kí sinh bao gồm Aenasius cariocus Compere, Aenasius colombiensis Compere, Anagyrus ananatis Gahan, Euryhopauus propinquus Kerrich, Hambletonia pseudococcina Compere và Ptomastidae abnormis (Girault). Động vật ăn thịt bao gồm Cryptolaemus montrouzieri Mulsant, Lobodiplosis pseudococci Felt, Nephus bilucernarius Mulsant, Scymnus (Pullus) unicatus Sicard và Scymnus pictus Gorham. Tuy nhiên các loài này sẽ không hiệu quả nếu có sự hiện diện của kiến công sinh. 20 Hình 2.5 Bọ rùa Cryptolaemus montrouzieri [10] a: Ấu trùng; b: Bọ rùa trƣởng thành Hình 2.6 Ong bắp cày Anagyrus ananatis [10] 2.6. Marker liên kết tính kháng bệnh trên thực vật. 2.6.1. Tính kháng bệnh trên thực vật [2] Cây thể hiện tính kháng đối với ký sinh gây bệnh là do chúng mang các đặc tính phân loại khác với nhóm ký chủ của ký sinh gây bệnh, hoặc là cây chứa các gene kháng mà ký sinh không có gene tƣơng ứng để phá vỡ. Hiện tƣợng từ kháng trở thành nhiễm của cây trồng đối với vi sinh vật gây bệnh là do số lƣợng khác nhau của gene kháng hiện diện ở mỗi