Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phương pháp marker phân tử

PAGE  PAGE iv LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tạo mọi đều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài. TS. Nguyễn Thị Lang, Trưởng Bộ Môn Di Truyền và Chọn Giống - Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long đã trực tiếp và tận tình hướng dẫn về kiến thức chuyên môn, động viên, giúp đỡ, tạo mọi đều kiện thuận lợi và đóng góp nhiều ý kiến quý báo cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. TS. Trần Thị Dung, Trưởng Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học - Đại Học Nông Lâm đã tận tình hướng dẫn về kiến thức chuyên môn, động viên, giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báo cho tôi trong khóa luận tốt nghiệp này. Các thành viên trong gia đình đã động viên và giúp đỡ. Tập thể Anh Chị Bộ Môn Di Truyền và Chọn Giống –Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long đã giúp đỡ nhiều về kỹ thuật chuyên môn trong suốt thời gian thực tập.. Tập thể các bạn lớp CNSH27 khóa 2001 - 2005 đã chia sẽ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học tập cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sinh viên thực hiện LÊ THỊ THANH TUYỀN ABSTRACT The genus Ananas Comosus L. (Merill), Bromeliaceae, is an important crop in Vietnam for domestic consumption and export. In this study, genetic variation in 50 germplasm accession of Cayenne pineapple was analysed using morphological data and RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) marker. The phenotypic evaluation based on eight traits demonstrated that there is a variation even in the same variety. Results obtained from UPGMA analysis divided 50 accessions studied into four clusters with 26 % correlation. The analysis started by using RAPD marker that allowed to distinguishing 50 accession of Cayenne pineapple based on 9 selected random 10 - mer primers. A total of 38 didtinct DNA fragments ranging from 0.2 to 3 kb were detected. Among these primer, RAPD4 have hightest allen number. However, the hightest number of accession (57%) having allen is obtained with primer OPA10. UPGMA analysis on the basis of RAPD data clearly showed that 50 accessions of pineapple belong to three major clusters with 66% similarity indices. Genetic similarity between the first or the second cluster and the third one was 49%. In addition, genetic similarity within third cluster was 71%. The accession from OMK61 to OMK75 have close similarity (90 – 100 %). The accession of the third cluster can be chosen as crossed materal in plant breeding. By using Matel test in software NTSYSpc, it has been suggesterd that the analysis of genetic relationships based on RAPD data was more accurate than the same analysis based on morphological traits. In sort, RAPD analysis has been evaluated for detecting DNA polymorphisms in Cayenne pineapple cultivars from different provinces in order to assess its potential for genotype identification and phylogenetic analysis to assist future Cayenene pineapple improvement programs. TÓM TẮT LÊ THỊ THANH TUYỀN, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG NGUỒN GEN DỨA CAYENNE BẰNG MARKER PHÂN TỬ”. Hội đồng hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ LANG TS. TRẦN THỊ DUNG Ở Việt Nam, dứa là một trong những cây ăn quả hàng đầu, có tiềm năng lớn về kinh tế trong công nghiệp chế biến. Ở nước ta, giống dứa Queen được trồng phổ biến nhưng lại có nhiều hạn chế trong chế biến hơn là giống Cayenne. Bên cạnh đó giống Cayenne trồng rất ít và chủ yếu là qua lai tạo từ các nguồn khác nhau, vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng marker phân tử nhằm góp phần cung cấp những thông tin để chọn lựa vật liệu lai ban đầu cho công tác lai tạo để nâng cao về số lượng lẫn chất lượng giống. Những kết quả đạt được: Khảo sát được sự khác biệt của các dòng dứa từ giống Cayenne về kiểu hình bao gồm những tính trạng như chiều cao cây, chiều rộng tán, chiều dài lá, chiều rộng lá, số lá trên bụi, màu sắc lá, hình dạng lá. Dựa trên phần mềm NTSYSpc (Numercial Taxonomy System) version 2.1, 50 dòng dứa từ Cayenne được chia thành 4 nhóm chính ở mức tương quan 26% với 5 tính trạng hình thái khảo sát. Kết quả cho thấy những quần thể có nguồn gốc và điều kiện địa lý khác nhau nhưng lại biểu hiện kiểu hình giống nhau, trong khi đó các dòng trong cùng một quần thể thì biểu hiện sự không đồng nhất về kiểu hình. Qua thử nghiệm trên 13 primer cho quy trình phản ứng PCR – RAPD thì có 9 primer cho sản phẩm thể hiện sự đa dạng về di truyền. Trong đó primer RAPD4 có số lượng allen được tạo ra nhiều nhất (6 allen) và OPA10 có tần số xuất hiện allen cao nhất với 56 % dòng trên tổng số 50 dòng dứa nghiên cứu. Phân nhóm di truyền của 50 giống Cayenne dựa trên dữ liệu sản phẩm PCR - RAPD phân thành 3 nhóm chính, với khoảng cách phân nhóm là 0.66. Nhóm I gồm 20 dòng dứa, nhóm II gồm 3 dòng và nhóm III là 27 dòng, trong mỗi nhóm đều chứa những dòng dứa có nguồn gốc nhập ngoại và nhập nội. Sự tương đồng về di truyền giữa nhóm I hoặc nhóm II với nhóm III là 49 % và nhóm I với nhóm II là 63 %; trong cùng một nhóm thì nhóm III có mức tương đồng về di truyền cao nhất 71 %. Khoảng cách di truyền giữa 50 dòng dứa Cayenne qua phân nhóm dao động từ 0,27 – 1,0 với những dòng dứa được trồng từ dạng nuôi cấy mô có sự tương đồng về di truyền cao nhất. Dựa trên phân tích đặc tính kiểu hình và phân tích kiểu gen, một số dòng dứa trong nhóm III như OMK63, OMK65, OMK68...có thể chọn làm vật liệu để lai tạo với những dòng dứa trong nhóm khác. Xác định được dòng OMK19 không phải giống Cayenne mà thuộc giống Queen. Một số dòng bị phân ly và lai tạp giữa giống Queen và Cayenne như OMK16, OMK1.. Phân tích đa dạng nguồn gen dứa dựa trên chỉ thị (marker) RAPD với hệ số tương quan đánh giá độ tin cậy của phương pháp r = 0,9 thì tương đối chính xác hơn so với phân tích dựa trên kiểu hình với hệ số tương quan r = 0,67 thông qua kiểm tra Mantel. Qua kết quả trên, bước đầu có thể khẳng định hiệu quả của phương pháp chỉ thị (marker) RAPD trong nghiên cứu sinh học phân tử. Đặc biệt trong công tác nhận diện, định dạng và đánh giá các quần thể cây trồng, loại trừ những nhận định chỉ dựa trên cảm tính, nhất là đối với các tính trạng hình thái như màu sắc, chiều dài, chiều rộng…Đều này đặc biệt quan trọng đối với những nhà làm công tác giống và phân loại học. Đề tài này cũng giúp cho các nhà nghiên cứu và chọn giống có chiến lược khai thác nguồn tài nguyên di truyền tại vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long như công tác thanh lọc, tuyển chọn và lai tạo giống. Trong công tác sưu tầm và bảo tồn giống cần kết hợp khảo sát giữa các đặc tính DNA với các đặc tính hình thái để tránh sự lầm lẫn giống. MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Abstract iv Tóm tắt v Mục Lục vii Danh sách các chữ viết tắt x Danh sách các bảng xi Danh sách các hình xii Danh sách biểu đồ xiii 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu và yêu cầu 2 Mục tiêu 2 Yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Một số khái niệm về đa dạng sinh học 3 2.1.1. Đa dạng sinh học 3 2.1.2. Đa dạng di truyền 3 2.1.3. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền 4 Giới thiệu chung về dứa Cayenne 4 2.2.1. Nguồn gốc và phân loại 4 2.2.2. Giá trị kinh tế 5 2.2.3. Đặc tính thực vật 5 2.2.3.1. Rễ 6 2.2.3.2. Thân 6 2.2.3.3. Lá 7 2.2.3.4. Hoa, quả, hạt 7 2.2.4. Đặc tính di truyền 8 2.2.5. Tình hình sản xuất và tiêu thụ trên thế giới và Việt Nam 8 2.2.5.1. Trên thế giới 8 2.2.5.2. Trong nước 9 Nguyên tắc và ứng dụng của một số phương pháp dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền bằng chỉ thị 9 2.3.1. Marker hình thái 9 2.3.2. Marker isozyme 10 2.3.3. Marker phân tử 11 2.3.3.1. Marker RFLP 12 2.3.3.2 Nguyên tắc cơ bản và ứng dụng của PCR 13 2.4. Những thành tựu trong nghiên cứu về đa dạng di truyền trên thế giới và ở Việt Nam 19 2.4.1. Thế giới 19 2.4.2. Việt Nam 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thời gian và địa điểm 21 Vật liệu 21 Nguồn gốc mẫu 21 Dụng cụ và hoá chất 22 Dụng cụ và hoá chất ly trích DNA 22 . Dụng cụ và hoá chất để thực hiện điện di trên gel 23 . Dụng cụ và hoá chất để thực hiện phản ứng chuỗi polymerase 24 Phương Pháp tiến hành thí nghiệm 25 Đánh giá kiểu hình 25 Đánh giá kiểu gen 25 Tách chiết DNA 25 Kiểm tra chất lượng DNA 26 Tiến hành PCR cho phản ứng RAPD 27 Phân tích kết quả PCR bằng phần mềm NTSYSpc (Rolfh) 29 Ước đoán độ chính xác giữa phân nhóm dựa vào kiểu gen và dựa vào kiểu hình 30 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá đa dạng nguồn gen dựa vào kiểu hình 30 Đánh giá đa dạng nguồn gen dựa vào kiểu gen 37 4.2.1. Kết quả tách chiết DNA 37 4.2.2. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR 38 4.2.3. Phân nhóm di truyền dựa trên dữ liệu PCR 43 Ước đoán độ chính xác giữa phân nhóm dựa trên kiểu hình và kiểu gen 48 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 49 Đề nghị 49 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Tiếng việt 50 Tiếng nước ngoài 51 PHỤ LỤC 54 Phụ lục I 54 Phụ lục II 55 Phụ Lục III 56 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP: Amplified fragment length polymorphism ALP: Amplicon length polymorphism bp: base pair Ctv: cộng tác viên DNA: Deoxyribonuleotide acid dNTP: 2’- dideoxynucleotide - 5’- triphosphate Kb: kilo base Marker: chỉ thị NTSYSpc: Numercial Taxonomy System PCR: Polymerase chain reaction RFLP: Restriction fragment length polymorphism RAPD: Random amplified polymorphic DNA SSR: Simple sequence repeat (microsatellite) STS: Sequence-tagged sites SAHN: Sequential, agglom-erative, hierarchic, non-overlapping Taq: Thermus aquaticus UPGMA: Unweighted pair group method using arithmetic average UV: Ultra violet VLĐBSCL: Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Các loại marker DNA 12 Bảng 3.1. Danh sách các giống Cayenne sử dụng trong đề tài 21 Bảng 3.2. Thành phần dung dịch đệm ly trích DNA 22 Bảng 3.3. Thành phần dung dịch đệm TE 23 Bảng 3.4. Thành phần dung dịch TAE 23 Bảng 3.5. Thành phần dung dịch loading buffer 24 Bảng 3.6. Thành phần dung dịch đệm PCR 24 Bảng 3.7. Thành phần hỗn hợp dung dịch chạy PCR 28 Bảng 3.8. Chương trình chạy PCR cho RAPD marker 28 Bảng 4.1. Đặc tính nông học của 50 dòng dứa Cayenne 31 Bảng 4.2. Kết quả phân nhóm 50 dòng dứa Cayenne dựa trên kiểu hình 36 Bảng 4.3. Danh sách các primer sử dụng trong phân tích đa dạng nguồn gen dứa Cayenne 38 Bảng 4.4. Sự đa hình của 9 primer với 50 dòng Cayenne 42 Bảng 4.5. Sự khác biệt về kiểu gen giữa dòng dứa có gai và không có gai dựa vào sự đa hình của các primer 43 Bảng 4.6. Kết quả phân nhóm 50 dòng dứa Cayenne dựa trên kiểu gen 47 Bảng 4.7. Mối tương quan về di truyền giữa các nhóm 47 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Minh hoạ quy trình kỹ thuật RAPD 17 Hình 4.1. A: hình cây Thơm Trung An, B: hình cây Thơm Hà Nội 34 Hình 4.2. Hình dạng và màu sắc lá của dứa Cayenne 34 Hình 4.3. A: Thơm Cần Thơ, B: Thơm Hà Nội 34 Hình 4.4. Sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan giữa 50 dòng dứa từ Cayenne trên đặc tính kiểu hình. 36 Hình 4.5. Kết quả kiểm tra DNA 38 Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer RAPD3 và RAPD4 39 Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPC15 40 Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer RAPD2 40 Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPA04 41 Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPA10 41 Hình 4.11. Sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan giữa 50 dòng dứa từ Cayenne trên cơ sở kiểu gen 44 BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1. Chiều cao cây của những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và từ dạng hom 32 Biểu đồ 4.2. Số lá trên bụi của những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và từ dạng hom 33 Biểu đồ 4.3. Năng suất của những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và từ dạng hom 33 Biểu đồ 4.4. Sự đa dạng về hình dạng lá của 50 dòng dứa Cayenne 35