Nghiên cứu đặc trưng protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

ật qua biên giới, cho dù là những động vật được cho là sạch bệnh (Specific Pathogen Free – SPF). Nghiên cứu gần đây cho thấy việc truyền bệnh về mặt cơ học thông qua các vật chủ trung gian là chim và côn trùng cũng là một đường lây bệnh không kém phần và thậm chí còn nghiêm trọng hơn. Đôi khi, người ta còn tìm thấy TSV trong các xét nghiệm sinh học mô của Trichocorixa reticulata, một loài côn trùng phổ biến khắp thế giới sống ở của sông, và những phần có chứa virus của loài côn trùng này đã được chứng minh là gây ra sự lây nhiễm ở các con tôm chân trắng SPF trong các điều kiện thí nghiệm (Lighter, 1995). Các dạng lây lan và việc TCT chết ở Texas cũng cho thấy việc TCT ăn các côn trùng bị nhiễm bệnh có thể là một cơ chế lây lan bệnh TSV (Thompson et al., 1997). TSV có thể lây lan qua chim mòng biển (Larus atricilla) do những con chim này ăn tôm bị bệnh tại những đầm nuôi khác (Lighter, 1995 và 1996; Garza et al., 1997). Những kết quả thí nghiệm cho thấy những con tôm khỏe mạnh có thể bị nhiễm thông qua việc tiêm các yếu tố đươc tách từ tế bào tôm bị nhiễm bệnh hoặc trực tiếp ăn những con tôm bệnh (Brock et al., 1995; Hasson et al., 1995). Người ta thấy virus hội chứng Taura vẫn có thể lây lan sau một số chu kỳ làm đông lạnh. Điều này cho cho thấy khả năng truyền bệnh thông qua tôm đông lạnh đã nhiễm bệnh (Lighter, 1995; Brock et al., 1997). Tuy vậy, với những quy trình và biện pháp kiểm soát diệt khuẩn phù hợp, đường lây bệnh này hiện đang được coi là có tỷ lệ rủi ro thấp (Flegel và Fegan, 2000; Flegel, 2003). 2.3.8 Một số đặc tính của virus Taura với các yếu tố lý hóa - Bị mất hoạt tính trong tế bào ở 100oC trong vòng 10 phút - Các chất oxi hoá, SDS (sodium dodecyl sulfate), lipid hòa tan có thể làm mất hoạt tính của TSV (theo OIE) 13 13 2.4 Các phƣơng pháp và kỹ thuật chẩn đoán virus Taura. Tổ chức dịch tễ quốc tế (Office International Des Epizooties – OIE) đã liệt kê một số phương pháp để chuẩn đoán TSV. Bảng 2.3: Các phương pháp chuẩn đoán TSV Phương pháp Đối tượng Giả thiết Khẳng định Ấu trùng Tôm post Tôm non Trưởng thành Dấu hiệu lâm sàng - - - - ++ - Kính hiển vi - - - - ++ - Biểu hiệu bệnh lý - +++ +++ +++ +++ +++ Cảm nhiễm sinh học - - - - ++ ++ Kính hiển vi điện tử - - - - + + Chẩn đoán miễn dịch - - - - +++ +++ Chẩn đoán bằng mẫu dò - +++ +++ +++ +++ +++ RT – PCR - +++ +++ +++ +++ +++ Dấu (-) phương pháp không có sẵn hiện nay hoặc có nhưng chưa được thí nghiệm. Dấu (+) phương pháp có ứng dụng trong vài trường hợp, nhưng sự chính xác hoặc ứng dụng còn hạn chế. Dấu (++) phương pháp chuẩn với tính nhạy cảm và sự đặc biệt chẩn đoán tốt. Dấu (+++) phương pháp được khuyến cáo là đã sẵn sàng và chính xác. Trong 8 phương pháp liệt kê bởi OIE chỉ có 3 phương pháp được khuyến cáo đã sẵn sàng và có thể áp dụng được ngay (phương pháp mô bệnh học, lai DNA dot blot và (RT – PCR). Phương pháp mô bệnh học có thể nhận biết được bệnh nhưng không có giá trị chẩn đoán sớm, phương pháp chẩn đoán bằng chỉ thị gen (lai DNA, RT – PCR) có thể phát hiện rất sớm mầm bệnh TSV trước khi có biểu hiện bệnh lý. Hiện nay kỹ thuật PCR đã dùng để phát hiện nhiều loại virus (WSSV, IHHNV, YHV...), do đó sử dụng RT – PCR xác định TSV có nhiều thuận lợi khi triển khai rộng trong sản xuất. 2.4.1. Chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng Ở thời kì phát bệnh tôm có màu đỏ nhợt nhạt, toàn bộ vỏ thân và ở đuôi có màu đỏ rõ rệt (bệnh đỏ thân, hồng thể) kèm theo những dấu hiệu tiêu biểu mỏng vỏ, xoang 14 14 tiêu hóa rỗng, tôm thường chết nhiều trong thời gian lột xác. Trong thời kì ủ bệnh xuất hiện những bất thường ở sắc tố của biểu bì, những đốm sắc tố này là những haemocyte do những thương tổn trong biểu bì biểu mô. Tôm có thể có hoặc không bị vỏ mềm và có vết đỏ, có thể ăn bình thường. Mặc dù chỉ xuất hiện một ít ngày dịch bệnh, nhưng dấu hiệu trong thời kì ủ bệnh có thể giúp cho việc nhận biết sự lây nhiễm TSV. 2.4.2. Phƣơng pháp mô học Chẩn đoán TSV trong thời kì phát bệnh tùy thuộc vào sự biểu hiện của mô khi nhuộm haematoxylin và Eosin, những điểm nhuộm màu ở vùng necrosis trong biểu mô bì biểu bì của bề mặt toàn thân, tất cả các phần phụ mang, xoang tiêu hoá. Trong thời kì ủ bệnh. Những tổn thương biểu bì thời kì phát bệnh tiêu biểu biến đi và được thay thế bởi những haemocytes ở tại cùng vị trí đó. Số lượng nhiều haemocytes có thể trở thành các sắc tố là những vệt đen, đó là đặc điểm của thời kì ủ bệnh. Những tổn thương như vậy có thể làm mòn biểu bì, và dễ bị Vibrio spp xâm nhập. Trong thời kì ủ bệnh của TS không có những dấu hiệu chính của nhiễm bệnh, và về tế bào học dấu hiệu duy nhất của nhiễm bệnh là sự có mặt LOS (Lymphoid Organ Syndrome). Đó là những sự tích tụ những tế bào hình cầu ở trung tâm các ống lymphoi bình thường. 2.4.3 Phƣơng pháp cảm nhiễm sinh học Sự nhiễm TSV có thể được xác định bằng cách cho ăn trực tiếp những mảnh thức ăn nhiễm virus. Hoặc tiêm truyền trực tiếp dịch chiết từ tôm đang mắc bệnh vào đối tượng thí nghiệm. Những dấu hiệu bệnh lý hoặc dấu hiệu điển hình về tế bào học sẽ xuất hiện sau 3 – 8 ngày (Lighter, 1996). 2.4.4 Phƣơng pháp miễn dịch Có thể sử dụng Monoclonal Antibodies (MAs) để xác định TSV ở những mẫu huyết và dịch tế bào đồng thể từ tôm. MAs còn có thể áp dụng để kiểm tra những mẫu mô đông lạnh, hoặc đã cố định. Hiện trên thị trường có sản phẩm của DiagXotics (Wilton, CT, USA). 2.4.5 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng mẫu dò gen (gene probe) Nguyên lý của phương pháp là sử dụng một đoạn oligonucleotide (thiết kế trên trình tự gene đặc hiệu của TSV) gắn với một chất chỉ thị và gọi là mẫu dò (probe). Chất chỉ thị có thể là enzyme, đồng vị hoặc chất phát huỳnh quang… Sau đó lai probe với DNA – RNA của virus. Những probe này được tổng hợp trong phòng thí nghiệm 15 15 hoặc từ những nguồn thương mại. Phương pháp này có độ chính xác đặc hiệu, độ nhạy lớn hơn những phương pháp chẩn đoán truyền thống, tế bào học cổ điển. 2.4.6 Phƣơng pháp RT-PCR Phương pháp RT – PCR phát hiện virus Taura ở TCT được nhóm tác giả đại học Arizona thực hiện lần đầu tiên vào năm 1998 (Nunan L.M., et al., 1998). Tác giả sử dụng cặp mồi thiết kế tại vị trí 9195 và 9992 trên trình tự gen TSV khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 231bp bằng phản ứng RT – PCR 16 16 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu A. Thời gian thực hiện đề tài: 3/2006 – 7/2006. B. Địa điểm thực hiện: Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới (1– Mạc Đĩnh Chi – Q.1 – Thành phố Hồ Chí Minh). 3.2 Hoá chất, thiết bị, dụng cụ và vật liệu 3.2.1 Hóa chất 3.2.1.1 Các hoá chất để thực hiện sắc ký lọc gel  Bio Gel – P100  Đệm photphat 3.2.1.2 Các dung dịch gốc để thực hiện SDS-PAGE  Monomere solution (30,8% T; 2%Cbis)  4X Running Gel Buffer (1,5 M Tris HCl; pH 8,8)  4X Stacking Gel Buffer (0,5 M Tris HCl; pH 6,8)  SDS 10%  Ammonium Persulfate 10%  2X Treatment Buffer (0,125 M Tris HCl; 4% SDS; 20% v/v Glycerol; 0,2 M DTT; 0,02% Bromophenol Blue; pH 6,8)  Tank Buffer (0,025 M Tris HCl; 0,1% SDS; 0,192 M Glycine; pH 8,3)  Thang protein chuẩn Low Range (19,8 – 108,5 kDa) (Bio–rad) 3.2.1.3 Các dung dịch gốc để nhuộm gel  Dung dịch nhuộm (0,025% Coomassie Brillant Blue R250; 40% methanol; 7% acetic acid)  Dung dịch giải nhuộm I (40% methanol; 7% acetic acid)  Dung dịch giải nhuộm II (5% methanol, 7% acetic acid) 3.2.1.4 Các dung dịch gốc để thực hiện Western Blotting  Towbin transfer buffer (25mM Tris, 192mM glycine, 20%MeOH, 0,1%SDS) 17 17 - Các dung dịch để phát hiện bằng miễn dịch  Phosphate buffer saline (PBS): 10mM sodium phosphate; 0,9% NaCl  Tween PBS (TPBS)  Tris buffer saline (TBS): 100mM Tris/HCl ; 0,9% NaCl  Blocking buffer: Tween tris buffer saline (TTBS); TTBS có 5% skim milk - Các dung dịch cho hệ thống sinh màu  Peroxidase assay buffer  DAB  CoCl2  Hydrogen peroxidase 30% 3.2.1.5 Các dung dịch để thực hiện Dot Blot - Đệm rửa (A1): 10 mM Na2 H PO4; pH 7,2; 150 mM NaCl - Đệm rửa (A2): 0,05% Tween 20 trong dung dịch A 1 - Dung dịch Bloking (B): 1% casein trong dung dịch A 2 - Dung dịch cơ chất và thuốc nhuộm (DAB): DAB 0,01 % /0,03% H 2O2 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ  Bếp nhiệt khuấy từ IKAMAG  Bộ điện di nhỏ I Mudid  Bộ điện di SDS–PAGE và chuyển thẩm Power Pac Universal TM (Bio–rad)  Cân thường, cân phân tích  Máy sắc ký lọc gel (Bio–rad)  Máy lai HB–1000. Hybridize  Máy vortex VELP  Máy ly tâm thường Biofuge 13 (Heraus), máy ly tâm lạnh 4oC (Bio–rad)  Tủ lạnh –20oC, 4oC  Thiết bị hút chân không  Tủ ấm 37oC  Máy lắc  Cốc becher, ống đong, ống nghiệm, pipet, các loại micropipet, tube eppendoft, tip các loại, kẹp, kéo… 18 18 3.2.3 Vật liệu 3.2.3.1 Kháng thể - Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng tổng hợp kháng với WSSV, IHHNV, MBV, YHV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới) (K1). - Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng đặc hiệu với RTV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vât – Viện Sinh Học Nhiệt Đới) (K1). - Kháng thể thứ cấp: IgG kháng huyết thanh thỏ kháng IgY, được đánh dấu enzyme Peroxidase (K2) (A 9046 – SIGMA) 3.2.3.1 Mẫu Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm sú (RTV–Pm) được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9. Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm thẻ chân trắng (RTV-Pv) được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9 Dịch nuôi cấy tế bào côn trùng Sf9. Bảng 3.1: Các mẫu sử dụng Kí hiệu Nơi thu Nguồn RTV-PmLA Long An Tôm sú RTV-PmLA (SLT) Long An Tôm sú RTV-PmCG Cần Giờ Tôm sú RTV-Pv M Chợ HCM Tôm TCT DTB Sf9 3.3 Phƣơng pháp 3.3.1 Phƣơng pháp SDS–PAGE 3.3.1.1 Nguyên tắc SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS–PAGE) là phương pháp điện di protein đứng để phân tách được các thành phần protein theo trong lượng phân tử. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp này là: Gel polyacrylamide là lưới gel hình thành do các sợi polymer của acrylamide (polyacrylamide) liên kết lại với nhau bằng các cầu nối đồng hóa trị (khác với lưới gel agarose là sự liên kết các sợi polymer phân tử đường bằng các cầu nối không đồng hoá 19 19 trị). Gel polyacrylamide được pha từ hai thành phần chính là acrylamide và biacrylamide. Các sợi polyacrylamide được hình thành nhờ tác nhân hóa học hay tác nhân quang học. o Có hai tác nhân hóa học cần thiết đó là ammonium persulfate làm vai trò chất peroxide khởi động (initiator peroxide), và quaternary amine, N.N.N’.N’- tetramethylethylenediamine (TEMED) làm chất xúc tác. o Tác nhân quang học là ánh sáng UV bước sóng dài phối hợp với riboflavin làm tác nhân khởi động, và TEMED làm tác nhân xúc tác. Sự hình thành polyacrylamide để tạo lưới gel là một quá trình có sinh nhiệt. Do vậy, cần phải tối ưu hàm lượng tác nhân khởi động và tác nhân xúc tác để quá trình hoàn tất không nhanh quá, mà trong vòng 20 đến 60 phút là vừa. Nhờ Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) hoạt động như một chất tẩy mà làm biến tính được protein bằng cách bọc quanh phân tử protein, vì vậy đã tạo thành một lớp bọc điện tích âm chung quanh phân tử protein. Phân tử protein lúc này trở thành dạng que và mang điện tích âm nhiều hay ít tùy thuộc vào chiều dài (hay trọng lượng phân tử) của nó. Đây là động lực chính để các protein được phân giải theo trọng lượng phân tử của chúng khi điện di trong gel. Có hai hệ thống điện di: Hệ thống đệm liên tục và hệ thống đệm không liên tục. Hệ thống đệm không liên tục cho độ phân giải tốt hơn nhiều lần so với hệ thống đệm liên tục. Hiện nay, SDS–PAGE thường dùng hệ thống đệm không liên tục và phổ biến nhất là hệ thống Laemmli (Laemmli, 1970), biến thể từ hệ thống của Ornstein (1964) và Davis (1964). Trong hệ thống này, gel polyacrylamide được đổ thành hai lớp. Lớp ở trên có kích thước lưới gel lớn và không hạn chế, được gọi là lớp stacking gel. Lớp ở dưới là lớp gel để phân tách các thành phần protein chạy điện di, được gọi là running gel. Hai lớp gel này được pha với hai dung dịch đệm khác nhau về nồng độ muối đệm cũng như pH. Dung dịch điện di cũng được pha bằng một dung dịch đệm khác, gọi là tank buffer. Trong hệ thống đệm không liên tục này, khi bắt đầu điện di, các ion và thành phần protein di chuyển trước hết vào lớp stacking gel. Các thành phần protein tập trung thành một lớp mỏng giữa các ion dẫn đầu (leading ion) và các ion đi sau (trailing ion), và lớp mỏng protein này được di chuyển dần đến để tiếp cận lớp running gel. 20 20 Chính nhờ vậy mà các thành phần protein được phân giải rất tốt khi di chuyển trong running gel. 3.3.1.2 Phƣơng pháp tiến hành A. Đổ gel, chuẩn bị buồng điện di 1. Lắp ráp các khuôn đổ gel theo đúng sự hướng dẫn của nhà cung cấp. 2. Pha dung dịch running gel 12,5%. 3. Trong khi đợi running gel trùng hợp pha dung dịch stacking gel 4% acrylamide. Khi running gel trùng hợp hoàn toàn, cho tiếp vào khuôn stacking gel cho đến khi gần đầy khuôn. Cắm lược vào, để yên 30 – 60 phút. 4. Sau khi stacking gel đã trùng hợp hoàn toàn, rút lược nhẹ nhàng ra khỏi gel, tránh làm lệch gel giữa các răng lược. Rửa sạch các giếng gel bằng tank buffer. Ráp khuôn gel vào buồng điện di. Đổ đầy tank buffer vào hai máng trên và dưới của buồng điện di. Chuẩn bị điện di. B. Chuẩn bị mẫu để điện di 1. Mẫu nhận trực tiếp từ phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới. 2. Trong một tube Eppendorf, trộn một thể tích (V) mẫu protein với một thể tích (V) 2X Treatment buffer. Đặt vào nồi đun cách thủy đang sôi để trong 2 phút. Mẫu sau khi chuẩn bị xong nên giữ trong đá bào cho đến khi thực hiện thí nghiệm. 3. Dùng pipette với đầu tip (cone) nhỏ, cho mẫu từ từ vào giếng gel. Luôn luôn để một giếng chứa thang protein chuẩn. C. Thực hiện điện di a) Đậy nắp máng điện di. Nối hai điện cực vào bộ cấp điện. b) Bật điện bộ nguồn. Chỉnh dòng điện 100 mA. c) Quan sát sự di chuyển của vạch màu trong gel điện di, nếu vạch màu chạm đáy gel, tắt bộ điện nguồn. Quá trình điện di đã hoàn tất. d) Đổ bỏ dung dịch điện di. Gở khuôn gel ra máng. Cẩn thận gở tách gel ra khỏi khuôn gel để tiến hành nhuộm hay blotting. 21 21 D. Nhuộm gel đã điện di 1. Cho gel vào khay nhuộm, đổ vào khay thuốc nhuộm Coomassie Blue cho ngập gel. Lắc đều và chậm trên máy lắc có xoay tròn (rotary shaker) trong 4 giờ hay qua đêm. 2. Thay thuốc nhuộm bằng dung dịch giải nhuộm I (Destaining solution I). Lắc tiếp trong 30 phút. 3. Thay dung dịch giải nhuộm I (Destaining solution I) bằng dung dịch giải nhuộm II (Destaining solution II). 4. Giữ gel trong dung dịch giải nhuộm II (Destaining solution II) cho đến khi chụp hình hay làm khô gel. Để tránh cho gel khỏi bị nứt, thêm vào dung dịch glycero l 1%. 3.3.2 Phƣơng pháp Western Blot 3.3.2.1 Nguyên tắc Western blotting và immunodetection là quá trình chuyển các band điện di từ gel SDS-PAGE sang màng nitrocelluse rồi sau đó dùng kháng thể đặc hiệu để phát hiện band protein đặc hiệu đã được chuyển lên màng. Hình 3.1: Các bước thực hiện Western Blot 22 22 Trong bước Western blotting, các band điện di từ gel được chuyển lên màng nitrocellulose bằng phương pháp sau:  Trong phương pháp sử dụng buồng (tank method): áp gel điện di lên trên màng nitrocellulose rồi cho chúng vào giữa hai tờ giấy thấm dày và vào giữa lớp nylon bọt mềm. Kẹp tất cả vào giữa hai khung lưới (cassette) rồi đặt vào buồng thấm có sẵn dung dịch đệm sao cho màng nitrocellulose thì ở gần lưới điện cực [+], còn gel điện di thì ở gần lưới điện cực [-]. Hình 3.2: Cách lắp ráp gel và màng nitrocellulose Khi áp điện thế vào giữa hai điện cực, các band protein trên gel điện di sẽ chịu tác động của lực điện trường để di chuyển về cực [+], nhờ vậy được chuyển rồi thấm lên màng nitrocellulose. Sau khi blotting, các band điện di đã được chuyển lên màng nitrocellulose và phát hiện theo nguyên tắc miễn dịch. Tiến trình này gồm các bước:  Trước hết, ủ màng với kháng thể đặc hiệu (kháng thể sơ cấp) cho protein muốn tìm, sau đó rửa sạch kháng thể thừa.  Phát hiện protein-kháng thể đặc hiệu bằng cộng hợp là kháng thể thứ cấp (secondary antibodies) gắn đặc hiệu với kháng thể sơ cấp. Cộng hợp này được gắn enzyme peroxidase (Horse radish peroxidase–HRPO) hay alkaline phosphatase (AP). Thông thường là alkaline phosphatase. Cơ chất sinh màu dùng cho cộng hợp alkaline phosphatase là hệ thống BCIP/NBT phát triển bởi Harlow và Lane (1998). Cơ chất cho cộng hợp peroxidase là hệ thống DAB/CoCl2. + _ Màng nitrocellulose Nylon bọt mềm Giấy thấm dày Gel điện di Tank method 23 23 3.3.2.2 Phƣơng pháp tiến hành A. Western Blotting chuyển band điện di từ gel lên màng nitrocellulose o Phƣơng pháp sử dụng buồng (tank method) 1. Tách bỏ phần stacking gel ra khỏi running gel. Ngâm running gel trong Towbin transfer buffer trong 5 – 15 phút để cân bằng ion. 2. Ứng với mỗi gel, cắt giấy thấm và màng nitrocellulose cho vừa với cassette. 3. Làm ướt màng nitrocellulose bằng cách thả dần vào trong khay nước cất trong 2 – 3 phút. 4. Đặt gel lên màng rồi cho vào giữa hai tờ giấy thấm dày đã cắt ở bước 2. Sau đó kẹp chúng vào giữa hai tấm bọc nylon mềm (sponge) và kẹp vào cassette. Tất cả các thao tác này đều phải thực hiện trong một khay chứa Towbin transfer buffer. 5. Dùng một pipette thủy tinh lăn lên trên để đuổi bỏ bọt khí (nếu có) giữa các lớp. 6. Cho dung dịch Towbin transfer buffer vào buồng để ngập hai hai lưới điện cực. Cho cassette đã chuẩn bị ở bước 4 và 5 vào buồng, chú ý đặt mặt có màng nitrocellulose gần lưới điện cực [+]. Các bước làm được trình bày như hình trên. 7. Đặt buồng lên trên máy khuấy từ. Nối hệ thống làm lạnh vào buồng. Bật máy quay từ để làm lạnh dung dịch đệm trong quá trình chuyển band. 8. Nối buồng với bộ cấp năng. Bật điện bộ cấp năng và điều chỉnh điện thế 50V. 9. Sau khi hoàn tất chuyển band, chuyển điện thế về zero, tắt nguồn điện. 10. Tháo cassette và lấy màng ra khỏi hệ thống. 11. Màng nitrocellulose này sẽ được đưa vào qui trình phát hiện bằng phản ứng miễn dịch. B. Phát hiện băng protein đặc hiệu bằng phản ứng miễn dịch 12. Ủ màng trong 100ml dung dịch TTBS hoặc TTBS có chứa 5% skim milk (blocking buffer) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng hay qua đêm ở 4oC. 13. Đổ bỏ dịch này, rửa 3 lần trong 10 phút với TTBS. Tiếp tục ủ màng với TTBS có pha kháng thể đặc hiệu (primary antibody) ở độ pha loãng 1/5000. Thời gian ủ là 60 phút ở 37o C. 14. Rửa màng 3 lần trong 10 phút bằng TTBS 15. Ủ tiếp màng trong dung dịch TTBS có pha kháng thể cộng hợp ở nồng độ 1/50 000. Thời gian ủ là 60 phút ở 37o C. 24 24 16. Rửa màng 3 lần trong 10 phút bằng TTBS. Sau bước này, tiến hành quá trình sinh màu. 17. Cho màng vào dung dịch hiện màu (Pha dung dịch hiện màu bằng cách cho 1 mg DAB vào 4 ml PBS, trộn đều. Lọc qua giấy lọc. Sau đó cho 120 µl dung dịch CoCl2 1% vào dịch lọc trên. Tiếp tục cho 3µl H2O2 vào dịch mới pha. ). Ủ trong tối trong 5 – 30 phút cho đến khi màu xanh nâu của các band đặc hiệu hiện rõ. 18. Rửa màng nhiều lần với nước cất. Chụp hình ngay. Nếu muốn lưu lại thì để khô rồi gói trong giấy bạc. 25 25 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phương pháp SDS–PAGE và Western Blot Mẫu được phân đoạn bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,5%. (gồm 2 gel) Nhuộm với thuốc nhuộm Coomassie Blue. Chuyển thẩm qua màng nitrocellulose. Rửa lần 1 bằng dung dịch giải nhuộm I (Destaining solution I.) Rửa lần 2 bằng dung dịch giải nhuộm II (Destaining solution II ) Chụp hình Blocking bằng TTBS hoặc TTBS có chứa 5% skim milk. Ủ kháng nguyên mục tiêu trên màng với kháng thể sơ cấp Rửa Ủ với kháng thể thứ cấp có gắn enzyme peroxidase. Rửa Hiện màu Chụp hình 26 26 3.3.3. Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ (Penaeus vannamei) bằng RTV đƣợc nhân lên trong tế bào Sf9. A. Nuôi tôm trong phòng thí nghiệm  Môi trường nuôi tôm: * Nhiệt độ: 28 – 300C * pH: 7,8 – 8,5 * Độ mặn: 15 – 20‰ * Sục khí liên tục  Cho tôm ăn: * Cá hấp xay nhỏ và lòng đỏ trứng gà * Ngày 3 buổi: 8h, 13h và 18h * Lượng thức ăn bằng 10% trọng lượng cơ thể tôm/ngày  Vệ sinh bể: * Vào buổi sáng và chiểu tối * Hút loại bỏ chất cặn lơ lửng B. Thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm Tôm trước khi thí nghiệm được chẩn đoán bệnh bằng phương pháp Dot Blot cho chỉ thị bệnh âm tính (phần 4.4.1và 4.4.2). Ghi nhận số tôm sống hàng ngày sau khi gây nhiễm. Tôm chết trong nghiệm thức gây nhiễm được kiểm tra lại bằng phương pháp Dot Blot cho chỉ thị dương tính (phần 4.4.3 và 4.4.4).  Thí nghiệm 1: Gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm thẻ. Tôm 35 – 40 ngày tuổi ở Hồ Cốc – Vũng Tàu. Chọn tôm khoẻ và đồng đều. Nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm 7 ngày. Thí nghiệm được chia làm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 8 con: * Nghiệm thức 1 (NT1): Đối chứng - không gây nhiễm. * Nghiệm thức 2 (NT2): Sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pmon từ tôm sú (RTVPmoLA): 50 l virus + cá hấp. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày. Sau 1 tuần gây nhiễm thêm 1 lần nữa. 27 27 * Nghiệm thức 3 (NT3): Sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pvan từ tôm TCT (RTV- PvanM): 50 l virus + cá hấp. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày. Sau 1 tuần gây nhiễm thêm 1 lần nữa.  Thí nghiệm 2: Gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm sú giống. Tôm giống 12 ngày tuổi mua ở Cần Giuộc – Long An. Chọn tôm khoẻ và đồng đều. Nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm 10 ngày. Thí nghiệm được chia làm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 70 con: * Nghiệm thức 1 (NT1): Đối chứng – không gây nhiễm. * Nghiệm thức 2 (NT2): Sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pm từ tôm sú (RTVPmoLA): 50 l virus +100 mg lòng đỏ trứng, để khô ở -20oC. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày. * Nghiệm thức 3 (NT3): sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pv từ tôm TCT (RTV- PvanM): 50 l virus +100 mg lòng đỏ trứng để khô ở -20oC. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày. 3.3.4 Phƣơng pháp Dot Blot 3.3.4.1 Nguyên tắc Protein được đưa trực tiếp lên giấy lọc. Sau đó ủ với kháng thể sơ cấp, đến kháng thể thứ cấp và cho cơ chất tạo màu vào. Cuối cùng là so màu để đánh giá mức độ nhiễm bệnh. 3.3.4.2 Phƣơng pháp tiến hành: a) Sử dụng 20 µl dịch tế bào nhiễm virus hoặc dịch nghiền đồng thể (đã được ly tâm hoặc lọc qua giấy lọc) từ mẫu tôm nghi nhiễm bệnh đưa lên màng. Để yên khoảng 10 phút cho màng thấm khô. b) Chuyển màng vào dung dịch A2, lắc nhẹ trên máy lắc trong 15 phút. Thay dịch rửa và lặp lại thêm hai lần tiếp. c) Chuẩn bị dung dịch bloking ngay trước khi dùng. Ủ màng trong dung dịch bloking ít nhất 60 phút ở 37oC. Rửa màng 1 lần với dung dịch A2 và 2 lần với dung dịch A1 trên máy lắc. d) Chuẩn bị dung dịch K1 ngay trước khi dùng. Ủ màng trong dung dịch K1 trong 60 phút ở 37oC. Rửa màng như ở bước trên. 28 28 e) Chuẩn bị dung dịch K2 ngay trước khi dùng. Ủ màng trong dung dịch K2 trong 60 phút ở 37oC. Rửa màng như ở bước trên. f) Chuẩn bị dung dịch DAB ngay trước khi dùng. Ủ màng trong dung dịch DAB ở 37oC cho tới khi tín hiệu màu xanh xuất hiện trên màng. Ngừng phản ứng bằng cách rửa màng ba lần với dung dịch A1. Đánh giá kết quả ngay khi màng còn ở trong dung dịch rửa hoặc khi màng đã được lấy ra và làm khô ở nhiệt độ phòng. Cường độ màu trên màng phản ánh mức độ bệnh. Hình 3.3: Sơ đồ hệ thống chẩn đoán miễn dịch (Oberfelder, 1989) (nguồn: Oberfelder, 1989; trích dẫn bởi Văn Thị Hạnh, 2001) 3.3.5 Phƣơng pháp sắc ký 3.3.5.1 Nguyên tắc Sắc ký gel lọc (còn gọi là sắc ký rây phân tử, sắc ký gel, sắc ký thẩm thấu gel, sắc ký gel thâm nhập…) là một dạng sắc ký mới nhưng có khả năng lớn để phân tách, xác định kích thước và trọng lượng phân tử của các hợp chất cao phân tử. M a øn g N i t r o c e l l u l o s e P r o t e i n k h a ùn g n g u y e ân M a øn g N i t r o c e l l u l o s e P r o t e i n k h o a ù K h a ùn g t h e å ñ a ëc h i e äu M a øn g N i t r o c e l l u l o s e M a øn g N i t r o c e l l u l o s e K h a ùn g t h e å t h ö ù c a áp ñ a ùn h d a áu e n z y m e M a øn g N i t r o c e l l u l o s e S a ûn p h a åm C ô c h a át Kháng thể sơ cấp bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên trên màng, tạo phức kháng nguyên – kháng thể đặc hiệu Protein kháng nguyên được đưa lên màng Phần màng không gắn kháng nguyên được trám bằng protein Casein Kháng thể thứ cấp gắn enzyme kết hợp với phức kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu Enzyme phân hủy cơ chất, tạo phức màu trên màng. Cường độ màu phản ánh nồng độ enzyme liên quan đến protein đưa vào 29 29 Phương pháp này chủ yếu dựa trên khả năng khác nhau của các phân tử chất tan thẩm thấu vào khung gel hoặc chui qua lỗ của các rây phân tử tuỳ theo kích thước và trọng lượng phân tử. Nghĩa là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa dung môi tự do (pha động) và dung môi nằm trong các hốc của các vật xốp (pha tĩnh). Mức độ thâm nhập của các phân tử chất tan chủ yếu phụ thuộc vào kích thước lỗ và cấu trúc của chúng. Các đại phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ không thể thâm nhập vào các lỗ, các hốc, chúng chỉ có thể khuếch tán vào khe hở giữa các hạt rắn xốp và do đó bị rửa ra khỏi cột rất sớm. Các phân tử có kích thước nhỏ hơn kích thước các lỗ có khả năng thâm nhập vào lỗ. Khi dòng pha động đi qua, các phân tử đó lại ra khỏi các lỗ và di chuyển cùng pha động. 3.3.5.2. Phƣơng pháp tiến hành 1. Chuẩn bị gel Gel sử dụng có khả năng phân tách các protein trong khoảng 5000 – 100.000 kDa Dùng 1 cốc thủy tinh, cân 1lượng gel khô thích hợp (8,5 g gel khô) (dựa vào tỉ lệ 12 ml dung dịch đệm/1g gel khô). Sau đó cho thêm 200 ml dung dịch đệm vào rồi để yên trong 12 giờ để gel trương nở hoàn toàn. Hút bỏ dịch trên, thêm 2 lần thể tích dung dịch đệm để rửa gel, lập lại khoảng 4 lần. 2. Nhồi cột Ở đây ta dùng cột có đường kính 2 cm, cao 50 cm. Đổ gel vào cột sắc ký để yên khoảng 24 giờ để gel ổn định trong cột. Sau đó rửa cột bằng đệm trong 2 giờ. 3. Đưa mẫu vào cột Thực hiện sắc ký trên các dịch protein. Đưa mẫu vào cột cùng với dòng dung môi vì đưa mẫu như vậy không làm xáo trộn gel nhồi trong cột và tránh tạo bọt khí. Đưa mẫu vào thời điểm dung môi hạ xuống ngang bề mặt cột gel, để mẫu ngấm xuống thì đặt ống nghiệm bắt đầu hứng, mỗi ống nghiệm hứng 2 ml dịch lọc, tốc độ chảy 0,14 ml/phút. 4. Lượng mẫu đưa vào cột Lượng mẫu đưa vào cột phụ thuộc độ nhạy của bộ phận phát hiện mẫu, kích thước lỗ của gel, nồng độ mẫu có thể từ 2 – 100mg/ml. Thể tích mẫu đưa vào cột không quá 2% thể tích cột. 5. Thu mẫu 30 30 Để thu mẫu, dùng máy thu mẫu phân đoạn tự động gồm 80 ống nghiệm được sắp xếp theo vòng tròn. Dung dịch chảy ra khỏi cột được hứng vào ống nghiệm và khi đủ 2 ml máy sẽ di chuyển sang ống khác. Mẫu thu được trong các ống nghiệm sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 31 31 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả SDS – PAGE Hình 4.1: Kết quả SDS – PAGE Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range Giếng 2: dịch tế bào (DTB) Sf9 Giếng 3, 4: dịch siêu ly tâm tế bào nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Long An (RTV- PmLA/SLT). Giếng 5, 6: DTB nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Cần Giờ bị bệnh (RTV-PmCG). Giếng 7, 8: DTB nhiễm virus thu từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA). Giếng 9, 10: DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng (RTV-PvM). 108,5 kDa 98,7 54,6 29,5 33,5 19,8 1 2 5 6 7 a 4 9 10 8 3 51-52 kDa 40 28 17-19 108 > 108 kDa 31 33 55 24 32 32 Nhận xét Bảng 4.1: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi SDS-PAGE và trọng lượng của các protein đã được công bố. Tên mẫu Các protein của TSV đã được công bố RTV-PmLA (SLT) RTV-PmLA RTV-PmCG RTV-PvM Bonami (1997) Lightner (1996) T rọ n g l ƣ ợ n g p ro te in ( k D a ) <17 <17 <17 <17 17 17 17 19 19 19 23 24 24 24 24 24 28 28 28 31 31 31 33 33 33 36,8 40 40 40 40 40 40 49 51-52 51-52 51-52 51-52 51,5 52,5 55 55 55 55 55 58 108 108 108 >108 >108 >108 Bảng 4.4 cho thấy các mẫu nhiễm virus có nhiều vạch khác so với tế bào đối chứng: 108 kD. Các mẫu nhiễm virus về cơ bản có các protein giống với các protein của TSV đã được công bố. Trong đó, protein 40 kDa có thể tương ứng với VP2 (40 kDa) là protein đặc trưng có thể sử dụng để nhận dạng các chủng TSV (Bonami,1997, Mari, 1998, Mari, 2002). Tuy vậy, để khẳng định sự có mặt của các vạch protein thuộc về virus, chúng tôi thực hiện điện di miễn dịch (Western Blot) dùng kháng thể đặc hiệu để chỉ thị các vạch protein đã được chuyển thẩm lên màng lai. 33 33 4.2. Kết quả Western Blot Hình 4.2: Kết quả Western Blot Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range. Giếng 2, 3: dịch siêu ly tâm tế bào nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Long An (RTV- PmLA/SLT) Giếng 4, 5: dịch tế bào (DTB) Sf9 Giếng 6, 7: DTB nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Cần Giờ bị bệnh (RTV-PmCG). Giếng 8: DTB nhiễm virus thu từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA) Giếng 9, 10: DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng (RTV-PvM). Nhận xét Kết quả cho thấy một số vạch protein từ gel điện di đã được thể hiện trên màng lai này. Đó là các protein gắn đặc hiệu với kháng thể. Kết quả xác định được một số vạch protein từ các mẫu nhiễm virus khác so với mẫu tế bào đối chứng (Bảng 4.2) 108,5 kDa 98,7 54,6 29,5 33,5 19,8 1 2 5 6 7 4 9 10 8 3 28 51-52 kDa 40 17-19 29 33 30-31 26 22 2 2 24 34 34 Bảng 4.2: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi Western Bloting và trọng lượng của các protein đã được công bố. Tên mẫu Các vạch protein thu đƣợc (kDa) RTV- PmoLA/LT >108 52 51 40 RTV-PmoCG 52 51 40 có 4 vạch 29, 30-31, 33 kDa RTV-PmoLA 52 51 40 có 4 vạch 29, 30-31, 33 kDa RTV-PvanM 52 51 40 24 có 9 vạch trong khoảng 17- 29 kDa TSV đã công bố Lightner (1996), Bonami (1997) 58 55 52,5 51,5 49 40 36,8 24 23 Kết quả bảng trên cho thấy tất cả các mẫu dịch tế bào nhiễm virus gây bệnh đỏ đuôi đặc trưng ở cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng về cơ bản có các protein giống nhau. Tuy nhiên RTV từ tôm thẻ có nhiều protein hơn từ tôm sú. Các mẫu tế bào nhiễm RTV có các protein trùng với TSV đã công bố là 52, 51 và 40 kD. Đây là các protein chính của RTV ở cả tôm sú và tôm TCT, trong đó có protein 40 kD tương ứng với VP2 (40 kDa) là protein đặc trưng có thể sử dụng để nhận dạng các chủng TSV (Bonami,1997, Mari, 1998) RTV-PmoLA/LT: Có 3 protein trọng lượng giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn có thêm 2 protein có trọng lượng >108 kDa. RTV-PmoLA: Có 3 protein giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn có thêm 4 protein có trọng lượng 29, 30 – 31 và 33 kDa RTV-PmoCG: Có 3 protein giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn có thêm 4 protein có trọng lượng 29, 30 – 31 và 33 kDa RTV-PvanM: Có 4 protein giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn có thêm 9 protein có trọng lượng 33, 31, 30, 29, 28, 26, 22, 19 và 17 kD. Sử dụng RTV ở tôm sú nhân qua tế bào làm kháng nguyên để thu kháng thể đặc hiệu dùng cho phương pháp Western Blot (Hình 4.2). Kết quả thu được các protein đặc trưng rất tách biệt ở mẫu RTV từ tôm TCT (RTV-PvM). Kết quả trên cho thấy kháng thể đặc hiệu RTV từ tôm sú đã nhận biết RTV từ tôm TCT. Như vậy có thể giả thiết rằng RTV ở tôm sú có quan hệ gần với RTV ở tôm thẻ chân trắng. 35 35 A B Để khẳng định lại các protein mà chúng tôi thu được từ kết quả điện di SDS- PAG và Western blot chính là protein của RTV, chúng tôi tiến hành gây nhiễm trở lại trên tôm thẻ thịt và tôm sú giống bằng dịch tế bào nhiễm RTV. 4.3 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm 4.3.1 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm thẻ Bảng 4.3: Số tôm thẻ sống sót sau ba tuần gây nhiễm Chỉ tiêu quan sát Phƣơng pháp Tổng số Số chết Số sống Tỷ lệ sống Nghiệm thức 1 / Đối chứng 8 2 6 75% Nghiệm thức 2 / RTVPmoLA 8 8 0 0% Nghiệm thức 3 / RTVPvanM 8 8 0 0% Kết quả cho thấy: - Qua bảng 4.1 có thể thấy tỉ lệ sống chết ở các nghiệm thức gây nhiễm và không gây nhiễm có sự khác biệt về mặt thống kê (P << 0,05) (Phụ lục 3) - Kết quả ở đợt thí nghiệm này cho thấy RTV có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm TCT đều có khả năng gây nhiễm cho tôm thẻ. - Tôm ở hai bể gây nhiễm chết trong lúc lột xác, đỏ đuôi, hoại tử lan dàn từ mép đuôi quạt vào, chết liên tục trong 7 ngày (sau 2 tuần gây nhiễm) (Hình 4.4). Hình 4.3: Tôm thẻ không gây nhiễm và tôm thẻ gây nhiễm. Hình A: Tôm thẻ không gây nhiễm Hình B: Tôm thẻ gây nhiễm (sau 7 ngày gây nhiễm) 36 36 B A Hình 4.4: Tôm thẻ chết do gây nhiễm thực nghiệm với RTV. Hình A: Tôm thẻ chết trong lúc lột xác, có nhiều đốm hoại tử trên thân, đuôi đỏ Hình B: Tôm thẻ chết có biểu hiện đỏ đuôi. 4.3.2 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm sú Bảng 4.4: Số tôm sú sống sót sau hai tuần gây nhiễm Chỉ tiêu quan sát Phƣơng pháp Tổng số Số chết Số sống Tỷ lệ sống Nghiệm thức 1 / Đối chứng 70 24 46 66% Nghiệm thức 2 / RTVPmoLA 70 51 19 27% Nghiệm thức 3 / RTVPvanM 70 45 25 36% Kết quả cho thấy: Qua bảng 4.2 có thể thấy tỷ lệ sống chết ở các nghiệm thức gây nhiễm và không gây nhiễm có sự khác biệt về mặt thống kê (P << 0,05) (Phụ lục 3). Kết quả ở đợt thí nghiệm này cho thấy RTV có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm TCT đều có khả năng gây nhiễm cho tôm sú giống. Quan sát ghi nhận được ở các thí nghiệm trên cho thấy khoảng 10 ngày sau khi gây nhiễm, phần lớn tôm chuyển màu đỏ ở đuôi quạt, vây râu và ăng ten (Hình 4.6). Sau đó xuất hiện các vết đen hoại tử và toàn thân chuyển màu hồng nhạt hoặc đỏ (Hình 4.6). Sau hai tuần gây nhiễm tôm có biểu hiện bỏ ăn, bơi lờ đờ và thường bị chết khi lột xác. Tỷ lệ chết 100% sau 24 ngày gây nhiễm. Các dấu hiệu quan sát thấy cũng tương tự như tôm bị bệnh tự nhiên: Phần đuôi đỏ hoại tử lan dần từ quạt đuôi lên các 37 37 đốt thân phía trên, vỏ thân mỏng, lỏng lẻo. Phần vây râu và ăng ten chuyển sang màu đỏ sau 10 ngày gây nhiễm (Hình 4.6). Sau 15 ngày gây nhiễm phần đuôi tôm chuyển màu đỏ đậm. Tế bào biểu mô sưng phồng. Đám hoại tử màu đen (Hình 4.7) bắt đầu xuất hiện ở quạt đuôi. Hình 4.5: Ảnh chụp hiển vi tôm sú đối chứng nuôi trong phòng thí nghiệm (x40) Hình 4.6: Ảnh chụp hiển vi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV (10 ngày sau gây nhiễm) (x40) Hình 4.7: Ảnh chụp hiển vi phần đuôi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV (15 ngày sau gây nhiễm) 38 38 Hình 4.8: Tôm sú giống gây nhiễm nhiễm thực nghiệm với RTV (15 ngày sau gây nhiễm) Phần quạt đuôi và ăng ten chuyển màu đỏ sớm nhất, sau đó phần đỏ lan dần toàn thân và bắt đầu xuất hiện đốm đen hoại tử ở phần quạt đuôi của tôm. Nhận xét: Tôm gây nhiễm nhân tạo với RTV có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm thẻ đều chết với dấu hiệu lâm sàng phần đuôi đỏ hoại tử lan dần từ mép đuôi quạt vào. Tôm chết trong khi lột xác. Qua 2 lần thí nghiệm cho thấy RTV nhân lên trong tế bào có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm TCT đều có khả năng gây nhiễm cho tôm sú giống và tôm thẻ thịt. 4.4. Kết quả Dot Blot chỉ thị virus Hình 4.9: Chỉ thị mức độ bệnh theo phương pháp Dot Blot 39 39 4.4.1. Kết quả kiểm tra tôm thẻ trƣớc khi thí nghiệm bằng phƣơng pháp Dot Blot với kháng thể tổng hợp. Hình 4.10: Kết quả kiểm tra tôm thẻ trước khi gây nhiễm. Nhận xét: Kết quả âm tính 4.4.2. Kết quả kiểm tra tôm sú giống trƣớc khi thí nghiệm bằng phƣơng pháp Dot Blot với kháng thể tổng hợp Hình 4.11: Kết quả kiểm tra tôm sú giống trước khi gây nhiễm. Nhận xét: Kết quả âm tính 4.4.3. Kết quả kiểm tra tôm thẻ sau khi thí nghiệm bằng phƣơng pháp Dot blot với kháng thể đặc hiệu RTV Mức độ bệnh: - Mức độ bệnh: ++++ Mức độ bệnh: ++ Hình 4.12: Kết quả kiểm tra tôm thẻ sau khi gây nhiễm. 40 40 Nhận xét: NT 1: kết quả âm tính NT 2: kết quả dương tính với mức độ nhiễm (++++) NT 3: kết quả dương tính với mức độ nhiễm (++) 4.4.4 Kết quả kiểm tra tôm sú giống sau khi thí nghiệm bằng phƣơng pháp Dot blot với kháng thể đặc hiệu RTV Mức độ bệnh: - Mức độ bệnh: ++++ Mức độ bệnh: +++ Hình 4.13: Kết quả kiểm tra tôm sú giống sau khi gây nhiễm. Nhận xét: NT 1: kết quả âm tính NT 2: kết quả dương tính với mức độ nhiễm (++++) NT 3: kết quả dương tính với mức độ nhiễm (+++) Như vậy từ kết quả gây nhiễm thực nghiệm trên tôm thẻ thịt và tôm sú, kết quả Dot Blot khẳng định rằng các protein mà chúng tôi đã xác định từ kết quả SDS-PAGE và Western Blot hoàn toàn là protein của RTV. Bước tiếp theo là chúng tôi thăm dò khả năng phân tách các thành phần protein của RTV bằng sắc ký lọc gel với hy vọng là thu được từng loại protein tinh sạch để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 41 41 4.5 Kết quả sắc ký lọc gel Hình 4.14: Kết quả dịch tế bào (DTB) Sf9 Hình 4.15: Kết quả DTB nhiễm virus từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA) 42 42 Hình 4.16: Kết quả DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng bị bệnh RTV (RTV-PvM)  Nhận xét Sau khi chạy 3 mẫu: - Dịch tế bào côn trùng Sf9 không nhiễm RTV thu được 2 peak. - Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm sú (RTV-Pm) được nhân lên trong dịch tế bào côn trùng Sf9 thu được 2 peak lớn và 1 peak rất nhỏ ở ở phút thứ 540. - Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm thẻ chân trắng (RTV-Pv) được nhân lên trong dịch tế bào côn trùng Sf9 thu được 2 peak lớn và 1 peak rất nhỏ ở phút thứ 360. Chúng tôi nhận thấy 2 mẫu nhiễm RTV tuy có thêm 1 peak so với mẫu đối chứng nhưng chưa đủ tạo thành tín hiệu peak rõ ràng. Cả hai mẫu nhiễm RTV có 2 peak hoàn toàn giống nhau và giống với đối chứng, điều đó cho thấy 2 peak đó là của protein từ dịch tế bào côn trùng Sf9. Như vậy theo chúng tôi phương pháp sắc ký lọc gel khó có thể áp dụng vào việc tinh sạch các protein của RTV, vì kích thước lỗ của gel có thể cho ra đồng thời nhiều loại protein có trọng lượng phân tử gần nhau, mặt khác hàm lượng mỗi loại protein của RTV quá thấp nên nó khó có thể tạo thành tín hiệu peak. 43 43 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 1. RTV được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9 có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm TCT đều có khả năng gây nhiễm cho tôm sú giống và tôm thẻ thịt ngày tuổi. 2. RTV của tôm sú và tôm thẻ có các protein đặc trưng giống TSV ở tôm TCT là 52, 51 và 40 kD. 3. Có thể RTV từ tôm sú là một loại virus mới có liên quan gần với TSV hoặc là TSV đã biến thể để thích nghi với vật chủ mới là tôm sú. 5.2 Đề nghị 1. Hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú và tôm thẻ chân trắng là bệnh do virus gây ra. Vì vậy cần khuyến cáo người sản xuất lưu ý hiện tượng bệnh này để tránh lây lan thành dịch bệnh. 2. RTV có thể là virus mới, có khả năng gây bệnh cho nhiều đối tượng tôm nuôi. Vì vậy cần tiếp tục nghiên cứu định danh loại virus này và khảo sát tình hình phát triển bệnh do virus này gây ra trên đối tượng tôm sú và tôm thẻ chân trắng. 44 44 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Phạm Thị Quang Anh, 2003. Khảo sát đặc trưng protein của một số virus gây bệnh phổ biến trên tôm sú (Penaeus Monodon). Khóa luận tốt nghiệp Cử Nhân Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên 2. Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín Ngô Đại Nghiệp, 2004. Giáo trình thực tập sinh hóa lớn. Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. 3. Lê Phúc Chiến, 2005. Khảo sát đặc tính kháng virus đốm trắng WSSV (White spot syndrome virus) trên tôm sú (Penaenus monodon) của kháng thể lòng đỏ trứng gà-ASV. Khoá luận tốt nghiệp Cử Nhân Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. 4. Văn Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Thu Hằng, Nguyễn Trọng Bình, 2001. Phương pháp chẩn đoán bệnh virus hội chứng đốm trắng trên tôm dùng phản ứng miễn dịch trên màng nitrocellulose. Bài đã gửi đăng Tạp chí Sinh học, năm 2001. 5. Văn Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Hồng Vân, 2003. Phương pháp enzyme miễn dịch dùng màng nitrocellulose chỉ thị virus gây bệnh ở tôm sú. Báo cáo khoa học Hội Nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ Thuật, Hà Nội , tr 603 – 606. 6. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TPHCM. 7. Chalos Limsuwan, Nguyễn Văn Hảo, 2005. Một số định hướng chiến lược cho nghề nuôi tôm sú trong tình hình hiện nay. Thông tin hội thảo kỹ thuật nuôi tôm sú NXB Nông Nghiệp Tp. HCM. 8. Nguyễn Ngọc Kiểng, 1996. Thống kê sinh học trong nghiên cứu khoa học. Nhà xuất bản giáo dục. 9. Nguyễn Văn Thanh, 2003. Một nghề còn lắm bất trắc: Ngành nuôi tôm Việt Nam - Tác động & cải thiện. Nhà xuất bản Chính Trị Quốc Gia Hà Nội. 10. Phạm Hùng Vân, 2004. Cẩm nang thực hành SDS-PAGE và Western Blotting- Immunodetection. Bộ y tế, Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. 45 45 11. Nguyễn Hoàng Uyên, 2005. Điều tra nghiên cứu bệnh Taura và một số bệnh thường gặp ở tôm chân trắng (Penaeus vannamei) nuôi tại Việt Nam và khả năng lây nhiễm. Báo cáo đề tài KHCN cấp Bộ TS. 12. Thông tin Khoa học Công nghệ - Kinh tế Thủy sản tháng 3/2005, 04/2005. 13. VietNamNet 03/10/04/ Q:\ khoa giao\NKY\DU PHONG\tom the chan trang.doc). TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14. Anne Marie Moore, Jeffrey M. Lotz, Shiao Y. Wang, Acacia Alcivar-Warren và Arun K. Dhar, 2000. Detection of Taura syndrome virus using reverse transcription polymerase chain reaction. World Aquaculture society. 15. Bonami JR, Hassen KW, Mari J, Poulos BT, Lightner DV, 1997. Taura syndrome of marine penaeid shrimp: characterization of the viral agent. Journal of General Virologyl 78: 313-319. 16. Brock JA, Gose RB, Lightner DV & Hasson KW, 1997. Recent developments and an overview of Taura syndrome of farmed shrimp in the Americas, In: Diseases in Asian Aquaculture III, Flegel TW &MacRae IH, eds. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, the Philippines, 275-283. 17. Aquatic animal health code, 2003. Taura syndrome. International health standards. 18. Carlos R. Pantoja, Solangel A. Navarro, Jaime Naranjo, Donal V. Lightner and Charles P. Gerba, 2004. Nonsusceptibility of Primate Cells to Taura Syndrome Virus. University of Arizona, Tucson, Arizona, USA. Suggested citation. 19. Center for Tropical and Subtropical Aquaculture-The Oceanic Institute, 1996. Shrimp Diseases. CTSA Publication No. 121 20. Diagnostic manual for aquatic animal disease, 2000. Taura syndrome-chapter 4.1.1. International health standards. 21. Heidi S. Erickson, Martha Zarain-Herzberg, Donald V. Lightner, 2002. Detection of Taura syndrome virus (TSV) strain differences using selected diagnostic methods: diagnostic implications in penaeid shrimp. Dis Aqua Organ 52: 1 – 10. 22. Isawa, H ., Asano, S., Sahara, K., Iizuka, T. & Bando, H., 1998). Analysis of genetic information of an insect picorna-like virus, infectious flacherie virus of 46 46 silkworm: evidence for evolutionary relationships among insect, mammalian and plant picorna (-like) viruses. Archives of Virology 143, 127-143. 23. Lightner DV, Redman RM, Poulos BT, Nunan LM, Mari JL, Hasson KW, 1997. Risk of spread of penaeid shrimp viruses in the Americas by the international movement of live and frozen shrimp. J Struct Biol 120(2): 134-145 24. Lightner DV, 1996a. Epizootiology, distribution and the impact on international trade of two penaeid shrimp viruses in the Americas. Rev Sci Tech 15(2):579-601. 25. Lightner DV, 1996b. “Taura syndrome of maine penaeid shrimp: Development and application of molecular detection methods of TSV from domestic shrimp aquaculture and evaluation of challenge studies in Gulf of Mexico Species. N OAA fisheries. 26. Lightner DV, Redman RM, Hasson KW, Pantoja CR, 1995. “Taura syndrome in Penaeus vannamei (Crustacea: Decapoda): gross signs, histopathology and ultra structure. Dis Aquat Organ 21: 53-59. 27. Mari J, Poulos BT, Lightner DV, Bonami JR, 2002. Shrimp Taura syndrome virus: genomic characterization and similarity with members of the genus Cricket paralysis-like viruses. Journal of General Virology 83(Pt 4):915-26. 28. Mari J, Bonami JR, Lightner DV, 1998. Taura syndrome of penaeid shrimp: cloning of viral genome fragments and development of specific gene probes. Dis Aquat Organ 33(1):11-7. 29. M. A. Mayo, 2005. Changes to virus taxonomy 2004. Arch Virol.150, 189-198 30. Nunan LM, Poulos BT, Lightner DV, 1998. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) used for the detection of Taura syndrome virus (TSV) in experimentally infected shrimp. Dis Aquat Organ 34(2):87-91. 31. Kathy F.J. Tang, 2005. Phylogenetic analysis of Taura syndrome virus isolates collected between 1993 and 2004 and virulence comparison between two isolates representing different genetic variants. Virus research, 112, 69-76 32. Refugio Robles-Sikisaka, Kenneth W. Hasson, Denise K. Garcia, Katherine E. Brovont, Karyn D. Cleveland, Kurt R. Klimpel and Arun K. Dhar, 2002. Genetic variation and immunohistochemical differences among geographic isolates of Taura syndrome virus of penaeid shrimp. Journal of General Virology, 83, 3123- 3130. 47 47 33. Jocelyne Mari, Bonnie T. Poulos, Donald V. Lightner and Jean-Rober, 2002. Shrimp Taura syndrome virus: genomic characterization and similarity with members of the genus Cricket paralysis-like viruses. Journal of General Virology. 34. Yun-Shiang Chang, 2004. Genetic and phenotypic variations of isolates of shrimp Taura syndrome virus found in Penaeus monodon and Metapenaeus ensis in Taiwan. Journal of General Virology, 85, 2963-2968. SÁCH 35. Donald V. Lightner. A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of Penaeid shrimp. Published by THE WORLD AQUACULTURE SOCIETY. (Edited, 1996) 36. Rodney F. Boyer. Modern Experimental Biochemistry. ( Second Edited, 1992) 48 48 PHỤ LỤC 1 49 49 PHỤ LỤC 2 Danh mục pha hoá chất  Running gel 12,5%  Monomere 5,45 ml  4X running gel 3,25 ml  SDS 10% 0,13 ml  Cho nước cất vào đến 4,16 ml  Amonium persulphate 10% 65 l  TEMED 4,3 l  Stacking gel  Monomere 0,88 ml  4X stacking gel 1,66 ml  SDS 10% 66 l  Cho nước cất vào đến 4,06 ml  Amonium persulphate 10% 33,4 l  TEMED 3,3 l  Loading buffer  4X stacking gel buffer 1 ml  Glycerol 0,8 ml  10% SDS 1,6 ml  2 – Mecapto etanol 0,4 ml  0,05% Bromophenol blue 0,2 ml 2 mg  Cho nước cất vào đến 4 ml  Destaining solution I  Methanol 80 ml  Acid acetic 14 ml  Cho nước cất vào đến 200 ml  Destaining solution II  Methanol 50 ml  Acid acetic 70 ml 50 50  Cho nước cất vào đến 1 lít  TTBS  Tris 12,11 g  Cho nước cất vào đến 900 ml  Chỉnh pH 7,5  NaCl 9 g  Cho nước cất vào đến 1 lít  Tween 20 1 ml  Khuấy đều  Đệm phosphate  NaH2PO4 0,0262 g  NaHPO4 0,115 g  NaCl 0,9 g  Cho nước cất vào đến 100 ml  Thuốc nhuộm gel  Coomassie brilliant blue R250 1,125 g  Metanol 200 ml  Trộn đều  Acid acetic 35 ml  Cho nước cất vào đến 500 ml 51 51 PHỤ LỤC 3 1. Tỷ lệ sống chết của thí nghiệm 1 a. Tỷ lệ sống chết giữa NT 1 và NT 2 Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -------------------------------------------------------------------- Chi-square D.F. Significance -------------------------------------------------------------------- 9.60000 1 1.94577E-3 6.66667 1 9.82327E-3 with Yates correction WARNING: Expected values in 2 cells < 5 and 0 cells < 2. With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent -------------------------------------------------------------------- Lambda 0.71429 0.66667 0.75000 Uncertainty Coeff. 0.56159 0.57500 0.54879 Somer's D -0.77419 -0.75000 -0.80000 b. Tỷ lệ sống chết giữa NT 1 và NT 3 Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -------------------------------------------------------------------- Chi-square D.F. Significance -------------------------------------------------------------------- 9.60000 1 1.94577E-3 6.66667 1 9.82327E-3 with Yates correction WARNING: Expected values in 2 cells < 5 and 0 cells < 2. With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent -------------------------------------------------------------------- Lambda 0.71429 0.66667 0.75000 Uncertainty Coeff. 0.56159 0.57500 0.54879 Somer's D -0.77419 -0.75000 -0.80000 52 52 2. Tỷ lệ sống chết của thí nghiệm 2. a. Tỷ lệ sống chết giữa NT 1 và NT 2 Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -------------------------------------------------------------------- Chi-square D.F. Significance -------------------------------------------------------------------- 20.9354 1 4.75042E-6 19.4133 1 1.05271E-5 with Yates correction With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent -------------------------------------------------------------------- Lambda 0.36296 0.33846 0.38571 Uncertainty Coeff. 0.11100 0.11121 0.11080 Somer's D -0.38670 -0.38571 -0.38769 b. Tỷ lệ sống chết giữa NT 1 và NT 3 Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -------------------------------------------------------------------- Chi-square D.F. Significance -------------------------------------------------------------------- 12.6026 1 3.85220E-4 11.4309 1 7.22326E-4 with Yates correction With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent -------------------------------------------------------------------- Lambda 0.29496 0.28986 0.30000 Uncertainty Coeff. 0.06595 0.06596 0.06595 Somer's D -0.30003 -0.30000 -0.30006 53 53 PHỤ LỤC 4 Các dụng cụ thiết bị thực hiện kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blotting Đang thực hiện điện di SDS-PAGE