Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP (Axít domoic) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ

Có thể trộn 2 hay nhiều dung môi với nhau 1.6.2.2. Hệ thống tiêm mẫu: a. Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống tiêm mẫu: - Có tác dụng tiêm mẫu - Tự động tắt khi áp suất cao - Có thể bơm tuần hoàn mẫu b. Cấu tạo và sơ đồ hoạt động của van cao áp: - Vị trí nạp: mẫu được nạp vào ống chứa mẫu Hình 02 - Vị trí tiêm: van cao áp xoay 1 góc 60o và dung môi sẽ đẩy mẫu ở sample loop theo đường ống và đi vào cột (Hình 03) 17 Hình 02. Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạp Hình 03. Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm 1.6.2.3 Buồng cột Dùng để ổn định nhiệt độ cột và dung môi qua cột trong quá trình phân tích 1.6.2.4. Cột sắc ký Là một loại cột đặc biệt được nhồi đầy bằng các hạt nhồi (pha tĩnh), kích thước cột: Dài (L): 5-30cm, đường kính trong: 2-5mm, kích cỡ hạt: 1.7, 3, 5, 18 10µm. Có 2 loại cột thường dùng trong sắc ký lỏng đó lag cột pha đảo và cột pha thuận. a. Cột sắc ký lỏng pha đảo (Reversed Phase Liquid Chromatography - RPLC): Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyt (silica) có gắn các nhóm chức không phân cực và các nhóm silanol (Hình 04). Các chất phân tích có ái lực khác nhau với nhóm chức không phân cực: - Chất không phân cực: phần lớn dùng cột C18 - Chất phân cực: một số dùng cột C18 - Chất phân cực: Đa số dùng cột C8 Hình 04. Pha tĩnh của cột sắcký pha đảo. b. Cột sắc ký lỏng pha thuận (Normal Phase Liquid Chromatography - NPLC) Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyt (silica) có gắn các nhóm chức phân cực bởi sự thay thế mạch (CH2)nCH3 bằng các gốc phân cực như gốc Cyano, Amino... (Hình 05) 19 Hình 05. Pha tĩnh của cột sắc ký pha thuận. 1.6.2.5. Pha động Là các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm, yêu cầu: - Độ tinh khiết cao (ví dụ: nước/đệm với MeOH/ACN) - Không phản ứng với chất phân tích và pha tĩnh - Không có bọt khí, không có bụi (đánh siêu âm, lọc). 1.6.2.6. Đầu dò khối phổ MS Đầu dò MS được nối với đầu ra của cột sắc ký. Việc phân tích khối phổ (phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z) của ion”) dựa trên sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích (+) hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng cao (như va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa proton, bắn phá ion, ion hóa trường...). Ion phân tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng từ đó người ta tính được số khối z=m/e (khối lượng ion/điện tích). 1.6.2.6.1. Bộ kết nối phun điện ( Electrospray Ionizaton : ESI) 20 Hình 06. Bộ kết nối phun điện tử Nguyên tắc của phương pháp ion hóa phun điện là dòng chảy từ máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ra với tốc độ 1-40ml/phút đi qua 1 ống capillary có đường kính cỡ mm và điện trường cao 1-6kV. Chất lỏng được phun ra dưới dạng hạt rất nhỏ mang điện ở áp suất thường. Các hạt này đi đến điện cực của nguồn ion hóa áp suất khí quyển (API). Dòng khí N2 thổi vào làm mẫu bay hơi nhanh biến các hạt rất nhỏ trở thành cực nhỏ trước khi đưa đến buồng ion hóa. 1.6.2.6.2. Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization: APCI) Hình 07. Bộ ion hóa hóa học Mao quản Buồng hóa hơi Áp suất khí quyển Gia nhiệt Không khí khô Bơm chân không Chân không cao Chất lỏng Bộ phân phân tích Điện cực phóng điện Bộ lọc Khí nebulizer 21 Hỗn hợp khí này đến một vùng có áp suất khí quyển, và xảy ra sự ion hoá hoá học khi va chạm với 1 dòng ion dương (H2, CH4, H2O...) hoặc âm để biến các phân tử trung hòa thành các ion phân tử hay các mảnh ion qua sự bắn phá bởi dòng electron mang năng lượng cao do que Corona tạo ra. Mỗi phân tử khí có thể tạo ra các ion dương khác nhau làm tác nhân cho ion hóa hóa học. Thiết bị mà chúng tôi sử dụng để phân tích ở đây sử dụng khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer). Khối phổ kế tứ cực sử dụng 4 thanh tròn ngắn đặt song song nhau thành 1 bó, hai đầu đặt trên 2 giá đỡ: Vỏ ống dẫn khí Đầu kim dẫn mẫu Vùng phun điện (plasma) Vùng va chạm Bộ phận phân tích Block làm bay hơi bằng gia nhiệt Khí nebulizer Chất phân tích (M) và hơi dung môi Diễn giải vùng phun điện (plasma) Đầu kim dẫn mẫu (hiệu điện thế cao) 22 Hình 08. Hệ thống đầu dò tứ cực Từng cặp đối diện, tích điện âm hay dương của nguồn điện DC. Chúng làm cho các phân tử chuyển động quanh trục trung tâm. Do đó chỉ các ion nhất định mới tới được bộ góp, sự thay đổi tần số và điện thế cấp đã làm cho các ion có số khối khác nhau lần lượt tới bộ phận thu góp. Kỹ thuật MS một lần có một số nhược điểm như : không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoá học, do kỹ thuật ion hoá nhẹ nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử… Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những điểm này đồng thời tăng thêm độ nhạy, độ chính xác. Đầu dò khối phổ MS/MS hay máy đo khối phổ hai lần liên tiếp gồm hai hệ máy khối phổ riêng biệt độc lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va chạm ( collision cell ). MS đầu tiên ( tứ cực Q1 ) được sử dụng để cô lập ion mẹ ( precursor ion ), ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm collision cell để cho ra những ion con ( product ion ), tiếp theo MS thứ hai (tứ cực Q2 ) sẽ phân tách những ion này. Những ion mong muốn sẽ đi tới detector và chuyển thành tín hiệu. Nguồn Hiệu điện thế một chiều và xoay chiều Đầu dò Ion không cộng hưởng Ion cộng hưởng 23 Hình 09. Nguyên lý hoạt động của đầu dò MS/MS 1.6.2.7. Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô và phần mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính toán, xử lý, báo cáo, kết xuất dữ liệu thô vừa thu được. 1.6.3. Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng Các hợp chất phân cực, không phân cực, những hợp chất sinh học, dược liệu dễ bị phân hủy ở nhiệt độ sắc ký khí và những hợp chất có thể phản ứng với vật liệu dùng trong GC và cột tách của GC. 1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột Có 3 yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình tách trong cột đó là: - Tính chất hóa học của cột. - Tính chất của dung môi pha động. - pH của pha động. 1.6.4.1. Tính chất hóa học của cột Cột Silica C18 tách tốt hơn cột Silica C8 nhưng thời gian lưu của C18 dài hơn vì kích thước lỗ xốp của hạt lớn hơn cột C8 do có đầu kỵ nước dài hơn (18C so với 8C) dẫn đến sự tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh trong loại cột này cũng lớn hơn so với C8 (Hình 1010). Ion sơ cấp Ion thứ cấp Bề mặt photon va chạm 24 Đường kính cột càng nhỏ, lượng tiêu tốn dung môi càng ít, nhưng khó chế tạo. Cột càng dài, cỡ hạt càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt nhưng thời gian chạy càng lâu và áp suất càng phải cao. Hình 10. khả năng tách của cột C8 và C18. 1.6.4.2. Tính chất của dung môi pha động - Độ pH của pha động: pH của pha động cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách giữa các chất. Tuy nhiên tùy thuộc vào bản chất của các chất phân tích mà ảnh hưởng của pH có thể làm tăng hoặc giảm khả năng tách của cột (Hình 11). Hình 11. Ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng tách của chất - Độ phân cực của dung môi Độ phân cực của dung môi ảnh hưởng mạnh đến quá trình sắc ký (Hình ) 25 Hình 12. Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đối với quá trính sắc ký. 26 Bảng 01. Một số dung môi sử dụng trong HPLC Độ phân cực Dung môi Khả năng tan trong nước Không phân cực Phân cực Hexan Iso-octan Petroleum ete Cyclo-hexan Cacbon tetra-hydrochlorit Cloroform Dicloro metan Tetra-hydrofuran Dietyl ete Etyl axetat Axeton Axetonitril Isopropanol Metanol Nước Axít axetic Không Không Không Không Không Không Không Có Không ít Có Có Có Có Có Có 1.7. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký Trong các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký. Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm giàu các hợp phần của mẫu cần phân tích. Có rất nhiều phương pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng-lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, SPE, xung siêu âm, vi sóng.... nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các tiêu chí: - Làm sạch mẫu một cách chọn lọc. 27 - Tăng nồng độ lên nhiều lần. - Lượng mẫu không cần nhiều. - Lượng dung môi cần ít. - Độ thu hồi cao, không gây nhiễu. - Đơn giản, nhanh, giá thành thấp. Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành, thời gian... mà chúng ta chọn phương pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất. 1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: Phương pháp chiết lỏng - lỏng là phương pháp làm sạch mẫu thông dụng, dụng cụ thiết bị khá đơn giản nhưng hiệu quả chiết khá cao. Quá trình chiết lỏng - lỏng dựa trên định luật phân bố Nernst: bất cứ một hợp phần trung tính nào cũng sẽ phân bố giữa hai dung môi không trộn lẫn với tỷ số nồng độ trong hai pha là một hằng số. [A]hc KA= (0.9) [A]n KA : hằng số phân bố [Ahc]: nồng độ của chất A trong pha hữu cơ. [An]: nồng độ của chất A trong pha nước. 1.7.2. Chiết pha rắn SPE: Ngày nay, để làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký người ta thường sử dụng phương pháp chiết pha rắn SPE (chiếm hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu). Phương pháp chiết pha rắn ứng dụng cho nhiều nền mẫu (matrix) như các loại mẫu môi trường, các loại mẫu dược phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu hữu cơ và mẫu thực phẩm. Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn: Bước 1. Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được với chất hấp phụ. Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khi cho vào cột SPE để tránh làm tắc cột. 28 Bước 2. Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp thu chất phân tích. Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấp phụ. Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng nguy cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu thấp. Bước 3. Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi có điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu. Bước 4. Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE. Tốc độ dòng chảy của mẫu qua cột khoảng 3ml/phút. Bước 5. Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích. Bước 6. Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh. Tốc độ này phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc độ khoảng 1ml/phút. Qua các phân tích nêu trên, ta thấy việc kiểm soát độc tố gây mất trí nhớ ASP (axít domoic) trong thủy sản nói chung và nhuyễn thể hai mảnh vỏ nói riêng để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm là cần thiết. Vì vậy việc nghiên cứu xây dựng một quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản bằng phương pháp LC-MS/MS là cần thiết đáp ứng được yêu cầu kiểm soát an toàn thực phẩm của Việt Nam cũng như các thị trường nhập khẩu trên thế giới. 29 Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài - Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện để xây dựng quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản trên thiết bị LC-MS/MS . - Khảo sát các thông số xác định giá trị sử dụng của phương pháp (giới hạn phát hiện, độ thu hồi, độ lặp lại, và so sánh kết quả phân tích trên LC- MS/MS với phương pháp HPLC-UV). - Thu thập và phân tích một số mẫu nhuyễn thể 2 mảnh vỏ (NT2MV) tại một số vùng thu hoạch NT2MV ở 12 vùng thu hoạch NT2MV tại Việt Nam. 2.2. Mô hình thực nghiệm Tiến hành thực nghiệm theo mô hình dưới đây (Hình 1): Hình 14. Mô hình thực nghiệm 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ: 2.3.1.1. Cột sắc ký lỏng C18, kích thước cột 250 x 4.6 mm, kích thước hạt 5 μm (Merck- Licrocart 250-4 RP-18), Đức. Chọn dung môi chiết Chọn phương pháp chiết Chọn các thông số LC, MS/MS Chọn thành phần pha động, gradient Xây dựng qui trình chạy mẫu Xây dựng qui trình chiết mẫu Xây dựng phương pháp Kiểm tra độ lặp lại Kiểm tra độ thu hồi Tìm giới hạn phát hiện Xác định độ đặc hiệu Phân tích một số mẫu thật 30 2.3.1.2. Cột sắc ký lỏng C8 kích thước cột 4,6x150mm kích thước hạt 5µm (Merck- Licrocart 150-4 RP-8), Đức. 2.3.1.3. Máy đồng hóa mẫu (KCH-1000), Trung Quốc. 2.3.1.4. Máy ly tâm (Sigma 4 K 15), Mỹ . 2.3.1.5. Bể đánh siêu âm (Branson 2210), Mỹ. 2.3.1.6. Cân kỹ thuật (Sartorious, d= 0,1g), Đức. 2.3.1.7. Cân phân tích (Sartorious, d= 0,1mg), Đức. 2.3.1.8. Máy lắc mẫu (IKA KS-260), Đức. 2.3.1.9. Transferpette 1ml (Eppendorf). 2.3.1.10. Ống ly tâm 50ml. 2.3.1.11. Màng lọc mẫu 0.45μm, φ: 25mm. 2.3.1.12. Ống tiêm nhựa loại 5ml. 2.3.1.13. Giấy lọc. 2.3.1.14. Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống đong, lọ chứa mẫu; cốc có mỏ,... 2.3.1.15. Hệ thống LC-MS/MS, model Micromass API, hãng Waters – Mỹ 2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: Tất cả các thuốc thử phải đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích 2.3.2.1. Chuẩn axít domoic (Sigma). Bảo quản chuẩn rắn trong ngăn đông tủ lạnh. 2.3.2.2. Nước tinh khiết dùng cho HPLC (nước HPLC), Merck – Đức. 2.3.2.3. Dung môi: axetonitrile và metanol loại dùng cho HPLC, Merck – Đức. 2.3.2.4. Axít Trifluoroacetic TFA) tinh khiết phân tích, Merck – Đức. 2.3.2.5. Axít Formic(FA) tinh khiết phân tích, Merck – Đức. Cách thức pha hóa chất, chất chuẩn được thực hiện theo mục 3.7 2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu: Tiến hành thu thập 36 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tại 12 vùng thu hoạch trong cả nước, chi tiết theo tại Bảng 02: Bảng 02. Chi tiết mẫu thực nghiệm TT Tên mẫu Số mẫu Nơi lấy mẫu Thời gian lấy mẫu 1. Nghêu Bến Tre 03 Giao Thủy – Nam Định 20/7; 18/8; 09/11 2. Nghêu Bến Tre 03 Tiền Hải – Thái Bình 20/7; 18/8; 09/11 3. Tu hài 03 Vân Đồn - Quảng Ninh 20/7; 17/8; 09/11 31 TT Tên mẫu Số mẫu Nơi lấy mẫu Thời gian lấy mẫu 4. Điệp 03 Phan Thiết – Bình Thuận 28/7; 18/8; 10/11 5. Sò anti 03 Tuy Phong – Bình Thuận 28/7; 18/8; 10/11 6. Nghêu Bến Tre 03 Bình Đại – Bến Tre 28/7; 18/8; 10/11 7. Nghêu Bến Tre 03 Ba Tri – Bến Tre 28/7; 18/8; 10/11 8. Sò huyết 03 Thạnh Phú – Bến Tre 28/7; 18/8; 10/11 9. Nghêu Bến Tre 03 Cần Giờ - Hồ Chí Minh 28/7; 18/8; 10/11 10. Nghêu Bến Tre 03 Tân Thành – Tiền Giang 28/7; 18/8; 10/11 11. Sò Lông 03 Bà Lụa – Kiên Giang 20/7; 17/8; 09/11 12. Nghêu lụa 03 Hiệp Thạnh – Trà Vinh 20/7; 17/8; 09/11 Tất cả các mẫu được bảo quản đông ít nhất ở -20oC cho đến khi xử lý. 2.5. Xác định các thông số tối ưu: 2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS Chúng ta cần tối ưu một số thông số sau: Capillary, Cone volte, Collision energy: thay đổi lần lượt từng thông số trên, nguyên tắc chọn điều kiện tối ưu cho từng thông số như sau: - Capillary (điện thế mao quản) và Cone Volte (điện thế cone): tại giá trị mà cường độ pic của ion sơ cấp (ion mẹ) là lớn nhất. - Collision energy (năng lượng va chạm): tại giá trị ứng với cường độ Pic của mỗi mảnh là lớn nhất. Mỗi một Ion con sẽ có một giá trị Collision energy tối ưu tương ứng. 2.5.2. Cột: Để lựa chọn cột sử dụng, chúng tôi tiến hành như sau: sử dụng dụng dịch chuẩn ở nồng độ 5ppm và tiến hành kiểm tra khả năng tách và thời gian lưu. Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi chỉ thực hiện khảo sát về khả năng tách, thời gian lưu trên cột C8 4,6x150mm 5µm và C18 4,6x150mm 32 5µm. Cột được chọn phải là cột có khả năng phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, pic cân đối, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài. 2.5.3. Pha động và chế độ gradient: Thay đổi và tối ưu thành phần pha động với mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn bằng cách thay đổi thành phần và tỷ lệ pha động: thực hiện phân tích mẫu thêm chuẩn lần lượt với pha động. Chúng tôi lựa chọn, nghiên cứu 02 pha động sau: - Pha động 1: 0,1% FA trong H20 (A), 0.1%FA trong ACN - Pha động 2: 0.05% TFA trong H2O (A), 0,05% TFA trong ACN (B). Pha động được chọn phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài. 2.5.4. Dung môi chiết: Sau khi chọn được cột tách và thành phần pha động phù hợp, sử dụng phương pháp chiết là chiết lỏng – lỏng với 03 loại dung môi: - Dung môi 1: MeOH:H20: 1:1 - Dung môi 2: Axít Formic: metanol:H2O: 2:5:93 - Dung môi 3: MeOH: H2O: 2:1. Quy trình chiết: Cân chính xác 2,0 g (m) mẫu đã đồng hóa trên cân kỹ thuật vào ống ly tâm. Thêm chính xác 8,0 ml dung môi chiết mẫu. Lắc mẫu trong vòng 20 phút trên máy lắc mẫu. Ly tâm ở 4500 vòng/ phút trong vòng 10 phút trên máy ly tâm. Lọc dịch trong qua màng lọc mẫu 0,45μm vào lọ thủy tinh vial 1,5 ml. Sau khi có kết quả, phương pháp được chọn phải là phương pháp loại đáng kể nhiễu nền có thể gây ảnh hưởng đến pic DA đồng thời độ thu hồi tốt. Nếu cả hai tiêu chí trên đều đạt thì chọn lựa phương pháp đơn giản, giá thành thấp và phù hợp với điều kiện ở thực tế. 2.5.5. Thiết lập bảng mẫu: 33 Thiết lập bảng mẫu với thứ tự sau: - Mẫu chạy thử (pre-test). - 5 mẫu chuẩn sắp xếp từ nhỏ đến lớn. - Mẫu trắng và mẫu kiểm soát. - Các mẫu thử nghiệm. - Mẫu chuẩn Chương trình chạy rửa cột (50% MeOH:50%H2O, 1mL/phút, 50 phút) 2.5.6. Tính toán : Việc tính toán kết quả bằng phần mềm trên hệ thống xử lý dữ liệu – Masslynx 4.0. Dựa vào thời gian lưu của mẫu chuẩn, lập đường cong chuẩn tuyến tính dựa trên diện tích pic và nồng độ của các mẫu chuẩn sau đó mẫu được tính theo đường hồi quy y=ax+b (xi = (yi-b)/a) với y là diện tích pic của mẫu còn x là nồng độ. Mẫu trắng, mẫu kiểm soát được dùng để tính toán độ thu hồi của mỗi đợt kiểm và xây dựng giản đồ kiểm soát. Sau khi xác định được các thông số tối ưu, tiến hành xác định khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện của phương pháp, độ lặp lại, độ thu hồi. 2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính: Để xác định khoảng tuyến tính của phương pháp, thực hiện chạy dãy chuẩn với 5 nồng độ pha từ 0,5 ppm đến 30 ppm trong 3 ngày liên tục. Nếu đồ thị tuyến tính trong khoảng nồng độ này (R2 >= 0,99) thì chấp nhận dãy nồng độ này, nếu không phải tiếp tục thu hẹp dải nồng độ cho đến khi nào R2 ≥ 0,99. 2.5.8. Giới hạn phát hiện của phương pháp: - Trong trường hợp khi tiến hành phân tích mẫu trắng mà có pic tại thời gian lưu hoặc trong vùng lân cận thời gian lưu của pic DA thì tiến hành xác định độ nhạy của phương pháp bằng cách dùng dãy mẫu thêm chuẩn (spike) giảm dần với nồmg độ để phân tích trong 3 ngày. Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có diện tích pic trung bình cao ít nhất gấp 3 lần dịên tích pic của mẫu trắng. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ 34 nhỏ nhất trong dãy chuẩn có diện tích pic trung bình cao gấp 10 lần dịên tích pic của mẫu trắng. - Trong trường hợp mẫu trắng không có pic tại vùng lân cận thời gian lưu của pic DA thì tiến hành xác định độ nhạy của phương pháp bằng cách dùng dãy mẫu thêm chuẩn (spike) giảm dần với nồmg độ để phân tích trong 3 ngày và kiểm tra độ nhạy của pic thông qua tính năng signal-to-noise ratio của chương trình. Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có tỷ lệ pic:nhiễu trung bình của pic DA ít nhất gấp 3 lần so với nhiễu nền. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có tỷ lệ pic:nhiễu trung bình của pic gấp 10 lần so với nhiễu nền. 2.5.9. Độ lặp lại của phương pháp: Để thử nghiệm độ lặp lại của phương pháp, tiến hành phân tích trong 3 ngày, mỗi ngày 7 mẫu nhuyễn thể thêm chuẩn DA 2ppm. Tính toán độ lặp lại của kết quả kết quả thu được thông qua độ lệch chuẩn Sr : 1n d 1n )XX( S 22 i r −=− −= ∑∑ (0.1) Trong đó: Sr = độ lặp lại Std: độ lệch chuẩn xi : kết quả thu được trên mẫu thứ i 2.5.10. Độ thu hồi của phương pháp: Để thử nghiệm độ thu hồi của phương pháp, chúng tôi tiến hành phân tích trong 3 ngày, mỗi ngày 7 mẫu trắng là nhuyễn thể và 7 mẫu thêm chuẩn DA 2ppm. Tính toán kết quả thu được như sau: spike uns m C CC R −= (0.2) Trong đó: ⎯Rm : độ thu hồi trung bình ⎯C : giá trị trung bình của các kết quả kiểm nghiệm, được tính như sau: ⎯C = Σxi/n 35 XSpike : nồng độ của dung dịch mẫu thêm chuẩn. 2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể. Tiến hành kiểm nghiệm 36 mẫu thử đã đề cập ở Bảng 01. Quy trình xử lý mẫu thực hiện giống như trong mục 2.5.4. Sau khi có kết quả, tiến hành lấy ngẫu nhiên một số mẫu đem đi phân tích và so sánh kết quả với phương pháp phân tích DA bằng HPLC-UV để đánh giá độ tin cậy của phương pháp đối với mẫu thật cũng như các thông số liên quan khác. 36 Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Xác định các thông số tối ưu: Để tối ưu hóa một quy trình phân tích DA trên thiết bị LC-MS/MS, chúng ta cần tối ưu 03 công đoạn: (i) các thông số cho đầu dò MS/MS, (ii) các thông số cho sắc ký lỏng, (iii) điều kiện tách chiết. 3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS Chúng ta cần lựa chọn được các thông số để tối ưu ion mẹ bao gồm hiệu điện thế mao quản (capillary) và hiệu điện thế cone (cone volt); tối ưu ion con bằng cách tối ưu giá trị năng lượng va chạm (collision energy). Dưới đây chúng tôi lần lượt tối ưu từn thông sô: 3.1.1.1. Capillary (hiệu điện thế mao quản): tiêm chuẩn DA thẳng vào đầu dò MS/MS và thay đổi các thông số về Capillary từ nhỏ tới lớn (cố định giá trị của các thông số khác) và chọn giá trị tối ưu capillary ứng với kết quả cường độ tín hiệu của ion [M+H]+ thu được là lớn nhất. Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 03 (chi tiết khảo sát có thể tham khảo tại mục 1 – Phụ lục 2). Qua bảng 03 ta thấy giá trị hiệu điện thế mao quản ở giá 2 kV là tối ưu nhất do thu được cường độ tín hiệu lớn nhất: Bảng 03. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế mao quản STT Capillary Cường độ tín hiệu 1. 1 kV 2,93 e5 2. 2 kV 1,00 e6 3. 3 kV 8,13 e5 4. 4 kV 7,1 e5 37 Hình 15. Sắc ký đồ ứng với giá trị tối ưu Capillary = 2 KV 3.1.1.2. Hiệu điện thế cone: tương tự như phần tối ưu thông số Capillary, điều chỉnh cone volt sao cho cường độ tín hiệu của ion mẹ 312 lớn nhất. Kết quả khảo sát điện thế cone và giá trị tối ưu hiệu điện thế cone được trình bày ở Bảng 04 (chi tiết khảo sát có thể tham khảo tại mục 2 – Phụ lục 2). Qua Bảng 04 ta thấy tại giá trị cone volt 30 eV là giá trị tối ưu do thu được cường độ tín hiệu là lớn nhất. Bảng 04. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế cone STT Cone volt Cường độ tín hiệu 1. 10 V 9,74 e4 2. 20 V 4,78 e5 3. 30 V 4,89 e5 4. 40 V 1,36 e5 5. 50 V 5,81 e5 38 Hình 16. Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng với giá trị tối ưu cone volt = 30 V 3.1.1.3. Năng lượng va chạm Chạy ở chế độ Full-scan của chế độ ESI (+) đối với ion phân tử [M+H+], đối với DA có m/z = 312: Thay đổi các giá trị năng lượng va chạm, chọn mảnh ion con và giá trị năng lượng va chạm tương ứng với giá trị mà cường độ của Ion con là lớn nhất. Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 05 (chi tiết khảo sát có thể tham khảo tại mục 3 – Phụ lục 2): Bảng 05. Kết quả khảo sát năng lượng va chạm Cường độ tín hiệu các ion STT Năng lượng va chạm 184,51 219,31 247,64 266,25 293,78 1. 10 eV 0 0 0 0 0 2. 15 eV 0 0 19793 80749 21573 3. 20 eV 52348 22530 0 0 0 4. 25 eV 0 0 0 0 0 5. 30 eV 21304 0 0 0 0 6. 35 eV 0 0 0 0 0 7. 40 eV 0 0 0 0 0 39 Hình 17. Cách phân mảnh ion của DA Kết quả khảo sát: chúng tôi đã chọn được các mảnh Ion thứ cấp và các điều kiện tối ưu của Collision energy tương ứng như sau: Bảng 06. Các Ion thứ cấp và các điều kiện tối ưu của năng lương va chạm STT Ion Collision energy (eV) 1. 184,51 20 eV 2. 219,31 20 eV 3. 247,64 15 eV 4. 266, 25 15 eV 5. 293,78 15 eV - H2O 184 40 Hình 18. Sắc ký đồ ở điều kiện Collision energy 15 eV Chúng tôi chọn mảnh Ion 266 dùng để định lượng do mảnh 266,25 cho cường độ lớn nhất so với các mảnh khác. 3.1.2. Pha động và chương trình chạy gradient. Chúng tôi sử dụng 02 pha động tham khảo theo một số bài báo trên tạp chí ScienDirect như sau: 1. Cặp pha động 1: 0,05% TFA trong ACN (A) và 0,05% TFA trong H20 (B) Bảng 07. Điều kiện gradient 1– pha động 1 Thời gian (Phút) A% B% Tốc độ dòng (mL/phút) Curve 0,00 10,0 90,0 0,400 1 4,90 10,0 90,0 0,400 1 5,00 50,0 50,0 0,400 1 6,00 90,0 10,0 0,400 1 10,00 90,0 10,0 0,400 1 10,01 10,0 90,0 0,400 1 41 Hình 19. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 1 Bảng 08. Bảng gradient 2 – pha động 1 Thời gian (Phút) A% B% Tốc độ dòng (mL/phút) Curve 0,00 50,0 50,0 0.400 1 5,00 50,0 50,0 0.400 1 6,00 90,0 10,0 0.400 1 10,00 90,0 10,0 0.400 1 10,01 50,0 50,0 0.400 1 42 Hình 20. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 1 Nhận xét: ta thấy pha động B có độ phân cực mạnh hơn pha A. Nên ở chế độ gradient 1, tại thời điểm xuất hiện pic DA tỷ lệ A:B = 10:90, độ phân cực của pha động mới đủ mạnh để kéo DA ra khỏi cột. Do vậy để rút ngắn thời gian chạy chúng tôi thay đổi tăng độ phân cực của pha động ngay từ đầu với chương trình gradient 2 với tỷ lệ A:B = 50:50. Kết quả pic của DA có ra sớm hơn tuy nhiên pic chưa được tách tốt. 2. Cặp pha động 2: 0,1% FA trong H2O (A) và 0,1%FA trong ACN (B) Bảng 09. Bảng gradient 1 – pha động 2 Thời gian (Phút) A% B% Tốc độ dòng (mL/phút) Curve 0,00 10,0 90,0 0,400 1 4,90 10,0 90,0 0,400 1 5,00 50,0 50,0 0,400 1 6,00 90,0 10,0 0,400 1 10,00 90,0 10,0 0,400 1 10,01 10,0 90,0 0,400 1 43 Hình 21. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 2 Bảng 10. Bảng gradient 2 – pha động 2 Thời gian (Phút) A% B% Tốc độ dòng (mL/phút) Curve 0,00 50,0 50,0 0,400 1 5,00 50,0 50,0 0,400 1 6,00 90,0 10,0 0,400 1 10,00 90,0 10,0 0,400 1 10,01 50,0 50,0 0,400 1 44 Hình 22. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 2 Bảng 11. Bảng gradient 3 – pha động 2 Thời gian (Phút) A% B% Tốc độ dòng (mL/phút) Curve 0,00 50,0 50,0 0,400 1 5,00 50,0 50,0 0,400 3 6,00 90,0 10,0 0,400 3 10,00 90,0 10,0 0,400 1 10,01 50,0 50,0 0,400 1 45 Hình 23. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 3– pha động 2 Nhận xét: Với pha động số 2, độ phân cực của pha động tăng khi tăng thành phần pha A (H2O). Theo kết quả các lần chạy ta thấy ở điều kiện gradient 3 cho pic ra với thời gian ngắn và pic sắc nhọn, cân đối nhất. 3.1.3. Dung môi chiết: Lựa chọn dung môi chiết: Chúng tôi chọn 03 loại dung môi a. Dung môi 1: MeOH:H20: 1:1 (mẫu spiked 2 ppm) 46 Hình 24. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH:H20: 1:1 b. Dung môi 2: Formic: metanol:H20: 2:5:93 (mẫu spiked 2 ppm) Hình 25. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi Formic: metanol:H20: 2:5:93 c. Dung môi 3: MeOH: H20: 2:1 47 Hình 26. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH: H20: 2:1 Nhận xét: Cả 03 dung môi trên đều cho kết quả khá tốt và đều có thể sử dụng được và chúng tôi đề xuất chọn dung môi 1 với lý do cường độ tín hiệu của ion định lượng 266,25 cho tín hiệu tốt nhất và thành phần dung môi đơn giản. Bảng 12. So sánh cường độ tín hiệu ion 266,25 ở nồng độ 2 ppm Dung môi 1 Dung môi 2 Dung môi 3 Cường độ tín hiệu ion 266,25 ở nồng độ 2,0 pmm 2,07 e5 2,03 e5 1,74 e5 3.2. Khoảng tuyến tính: Khảo sát khoảng tuyến tính của DA 48 Hình 27. Đồ thị biểu diễn đường tuyến tính Tổng hợp độ tuyến tính theo các Ion được thể hiện ở Bảng 13. Bảng 13. Bảng tổng hợp thông số về độ tuyến tính theo các ion Ion Hệ số hồi quy tuyến tính R2 Hệ số góc a Hệ số góc b 219,31 0,9984 346,635 -133,465 184,51 0,9846 314,745 -196,319 293,78 0,9972 1733,17 -784,847 266,25 0,9995 16764 -5244,29 247,64 0,9969 1812,02 -902,768 Kết luận: Từ kết quả khảo sát khoảng tuyến tính đường chuẩn của DA ở trên ta thấy trong khoảng nồng độ từ 0,5 ppm đến 10ppm thì đồ thị có độ tuyến tính tốt với R2> 0,98 (chi tiết về R2 tại Bảng 13). 49 3.3. Giới hạn phát hiện của phương pháp: Bảng 14. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp Độ nhạy (signal-to-noise ratio) theo nồng độ Ion Blank 0.5 ppm 2 ppm 4 ppm 7 ppm 10 ppm 184,51 2,4 7,9 53 144 259 439 266,25 20,7 373 2372 5368 8850 9189 Từ kết quả thu được ở Bảng 13. ta có ta thấy nồng độ 0,5 ppm tỷ số S/N của ion định lượng 266,25 ≈ 18 (S/N = 373/20,7) tuy nhiên ion định danh 184,51 có tỷ lệ S/N ≈ 3,2 (S/N = 7,9/2,4) nên ta chọn LOD = 0.5 ppm và giới hạn định lượng LOQ = 1,5 ppm (LOQ = 3 x LOD). Tuy độ nhạy này là không cao đối với phương pháp phân tich trên LC/MS/MS và điều quan trọng nhất là độ nhạy của phương pháp đã hoàn toàn đáp ứng với yêu cầu đề ra trong việc kiểm soát độc tố ASP (mức giới hạn cho phép trong thực phẩm là 20 ppm). 3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp: Bảng 15. Kết quả phân tích độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp. Hàm lượng DA trong mẫu spike ( 2.5 ppm) TT Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 1 2,63 2,61 2.40 2 2,43 2,93 2,58 3 2,45 2,58 2,53 4 2,46 2,25 2,36 5 2,72 2,73 2,20 6 2,60 2,42 2,74 7 2,43 2,61 2,60 Trung bình (1 ngày) 2,53 2,59 2,49 SD (1 ngày) 0,12 0,22 0,18 Trung bình (3 ngày) 2,53 50 Hàm lượng DA trong mẫu spike ( 2.5 ppm) TT Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 SD (3 ngày) 0,17 CV% 6,72 % Độ thu hồi (3 ngày) 101,2 % Từ Bảng 11. ta có kết luận như sau: - Độ lặp lại của phương pháp SD = 0,17 hay CV = 6,72% - Độ thu hồi của phương pháp: R = 101,2 % 51 3.5. Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể. Áp dụng qui trình chạy mẫu và xử lý mẫu chúng tôi phân tích trên mẫu thật, kết quả phân tích được đưa ra trên Bảng12 Bảng 16. Kết quả phân tích mẫu nhuyễn thể (tính trên Ion 266,25). STT Thời gian lưu (phút) Cường độ pic Nồng độ (ppm) 1. 5,07 1016 0,37 2. 5,10 1018 0,37 3. 5,10 997 0,37 4. 5,13 933 0,37 5. 4,93 775 0,36 6. 5,10 854 0,36 7. 5,07 852 0,36 8. 4,97 260 0,33 9. 4,70 20 0,31 10. 5,17 811 0,36 11. 5,13 894 0,37 12. 5,13 762 0,36 13. 4,77 39 0,32 14. 5,13 559 0,35 15. 4,80 52 0,32 16. 5,10 808 0,36 17. 5,07 580 0,35 18. 5,03 734 0,36 19. 5,07 739 0,36 52 20. 4,73 28 0,31 21. 5,03 515 0,34 22. 5,03 429 0,34 23. 5,03 376 0,34 24. 5,03 485 0,34 25. 5,07 494 0,34 26. 5,07 482 0,34 27. 4,93 90 0,32 28. 5,03 474 0,34 29. 5,00 444 0,34 30. 5,00 462 0,34 31. 5,07 484 0,34 32. 5,00 560 0,35 33. 5,07 355 0,33 34. 5,13 486 0,34 35. 5,10 277 0,33 36. 5,00 346 0,33 Nhận xét: Tất cả các mẫu phát hiện ở nồng độ rất thấp, nhỏ hơn LOD nên có thể kết luận không phát hiện DA trong mẫu đã phân tích. 3.6. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp: Để đánh giá độ tin cậy của phương pháp, đồng thời kiểm chứng lại kết quả vừa thực hiện trên 50 mẫu thu thập được, chúng tôi thực hiện kiểm khẳng định ngẫu nhiên 1 số mẫu âm tính và do không có mẫu phát hiện ở mức >0,5ppm nên chúng tôi sử dụng mẫu spiked ở nồng độ 2 ppm để so sánh, kết quả như sau: 53 Bảng 17. So sánh kết quả phương pháp HPLC-UV và LC-MS/MS TT Tên mẫu Kết quả (HPLC-UV) Kết quả (LC-MS/MS) 1. Mẫu nghêu – Nam Định ND ND 2. Mẫu Tu hài – Vân Đồn ND ND 3. Mẫu Nghêu – Tiền Giang ND ND 4. Mẫu Sò lông – Bà Lụa ND ND 5. Sò huyết – Thạnh Phú ND ND 6. Mẫu Spiked 2 ppm 2.12 ppm 2.06 ppm 7. Mẫu nghêu Spiked 2.5 ppm 2.64 ppm 2.53 ppm 8. Mẫu CRM DA: 41± 2 ppm C5’ – Epiaxít domoic: 3.2 ± 0.3 42.5 ppm 48.12 ppm Hình 28. Kết quả chạy mẫu nghêu tại Nam Định trên LC-MS/MS và HPLC-UV DA 54 Hình 29. Kết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS và HPLC-UV Chi tiết về kết quả phân tích mẫu trên HPLC-UV và sắc ký đồ có thể tham khảo tại Phụ lục 5. Từ kết quả ở Bảng 13 ta thấy: Như vậy, chúng tôi có thể khẳng định: Phương pháp chúng tôi xây dựng đạt độ tin cậy cao và có thể áp dụng để kiểm nghiệm DA trong thủy sản và sản phẩm thủy sản. Với khẳng định này, chúng tôi xin được đưa ra qui trình kiểm nghiệm độc tố sinh học biển ASP (DA) như sau: 3.7. Qui trình phân tích Axít domoic. 3.7.1. Phạm vi áp dụng: Hướng dẫn này qui định phương pháp xác định hàm lượng ASP trong mẫu thủy sản bằng LC-MS/MS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0.5 mg/kg. 3.7.2. Nguyên tắc: ASP được chiết tách từ mẫu nhuyễn thể bằng hỗn hợp metanol-nước (1:1). Hàm lượng ASP trong dịch chiết mẫu được xác định trên sắc ký ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS). 3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch: 3.7.3.1. Thiết bị- dụng cụ: 55 3.7.3.1.1. Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS, gồm các bộ phận sau: Bơm pha động, bộ tiêm mẫu tự động, bộ điều nhiệt cột, đầu dò MS/MS (Micro mass), bộ điều khiển hệ thống (Waters) và phần mềm xử lý. 3.7.3.1.2. Cột sắc ký lỏng C18, kích thước cột 250 x 4.6 mm, kích thước hạt 5 μm (Merck- Licrocart 250-4 RP-18), Đức hoặc tương đương. 3.7.3.1.3. Máy đồng hóa mẫu (KCH-1000), Trung Quốc hoặc tương đương. 3.7.3.1.4. Máy ly tâm (Sigma 4 K 15), Mỹ hoặc tương đương. 3.7.3.1.5. Bể đánh siêu âm (Branson 2210), Mỹ hoặc tương đương. 3.7.3.1.6. Cân kỹ thuật (Sartorious, d= 0,1g), Đức hoặc tương đương. 3.7.3.1.7. Cân phân tích (Sartorious, d= 0,1mg), Đức hoặc tương đương. 3.7.3.1.8. Máy lắc mẫu (IKA KS-260), Đức hoặc tương đương. 3.7.3.1.9. Transferpette 1ml (Eppendorf). 3.7.3.1.10. Ống ly tâm 50ml. 3.7.3.1.11. Màng lọc mẫu 0.45μm, φ: 25mm. 3.7.3.1.12. ống tiêm nhựa loại 5ml. 3.7.3.1.13. Giấy lọc. 3.7.3.1.14. Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống đong, lọ chứa mẫu; cốc có mỏ,... 3.7.3.2. Hóa chất, dung dịch: 3.7.3.2.1. Chuẩn axít domoic (Sigma) hoặc tương đương. Bảo quản chuẩn rắn trong ngăn đông tủ lạnh. 3.7.3.2.2. Nước tinh khiết dùng cho HPLC (nước HPLC). 3.7.3.2.3. Dung môi: axetonitrile và metanol loại dùng cho HPLC. 3.7.3.2.4. Axít Formic (FA) tinh khiết phân tích 3.7.3.2.5. Dung dịch pha động cho máy HPLC: Trộn đều 100ml ACN và khoảng 900ml nước HPLC trong bình định mức 1000ml, thêm 1.0 ml FA, và định mức đến 1L với nước HPLC. Đuổi khí bằng cách đánh siêu âm 15 đến 20 phút trên bể siêu âm. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ phòng, sử dụng trong 1 tuần. 56 3.7.3.2.6. Dung dịch chiết mẫu : Trộn đều metanol và nước HPLC theo tỉ lệ thể tích (1:1). Chuẩn bị dung dịch trước mỗi lần sử dụng. 3.7.3.2.7. Dung môi pha chuẩn: Trộn đều axetonitril và nước HPLC theo tỉ lệ thể tích (1:9). Chuẩn bị dung dịch trước mỗi lần sử dụng. 3.7.3.2.8. Dung dịch chuẩn gốc 1000μg/ml: hút chính xác 950μl Metanol bằng micropipette 1ml vào chai đựng chất chuẩn axít domoic, lắc đều. Bảo quản trong ngăn đông tủ lạnh, Dung dịch được dùng trong 1 năm. Lưu ý: Thể tích hút metanol trên phải được điều chỉnh hợp lý sau khi đã tính toán và hiệu chỉnh khối lượng theo giấy chứng nhận của nhà sản xuất sau đó tính toán lại nồng độ thực tế đã pha. 3.7.3.2.9. Dung dịch ASP 25μg/ml: Hút chính xác 250μl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml. Thêm dung dịch axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.10. Dung dịch ASP 10 μg/ml: Hút chính xác 100μl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml. Thêm dung dịch axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.11. Dung dịch ASP 7 μg/ml: Hút chính xác 70μl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml. Thêm dung dịch axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.12. Dung dịch ASP 4 μg/ml: Hút chính xác 40μl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml. Thêm dung dịch axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.13. Dung dịch ASP 2.5 μg/ml: Hút chính xác 1000μl dung dịch chuẩn ASP 25μg/ml vào bình định mức 10ml. Thêm axetonitrile 10 % đến 57 vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.14. Dung dịch ASP 2.0 μg/ml: Hút chính xác 800μl dung dịch chuẩn domoic 25μg/ml và định mức 10ml. Thêm axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.15. Dung dịch ASP 1.0 μg/ml : Hút chính xác 400μl dung dịch chuẩn 25 μg/ml solution vào bình định mức 10ml. Thêm axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC) khi không sử dụng, đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.16. Dung dịch ASP 0.5μg/ml: Hút chính xác 200μl dung dịch chuẩn 25μg/ml solution vào bình định mức 10ml. Thêm axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8oC) khi không sử dụng, đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.4. Chuẩn bị mẫu: 3.7.4.1. Chuẩn bị mẫu thô Tách vỏ nhuyễn thể, rửa sạch nước muối. Đồng hóa ít nhất 100g thịt nhuyễn thể trên máy đồng hoá mẫu. Bảo quản ở ít nhất -100C nếu mẫu không được phân tích ngay khoảng 1 tuần. 3.7.4.2. Chuẩn bị mẫu thử nghiệm: Cân chính xác 2.0 g (m) mẫu đã đồng hóa trên cân kỹ thuật vào ống ly tâm. Thử nghiệm 1 lần/mẫu 3.7.4.3. Chuẩn bị mẫu trắng: Mẫu trắng là mẫu nhuyễn thể đã xác định không có ASP. Chuẩn bị mẫu trắng giống như đối với mẫu thử nghiệm. 3.7.4.4. Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn: 3.7.4.4.1. Mẫu kiểm tra giới hạn phát hiện: đuơc chuẩn bị bằng cách thêm 40 μL dung dịch chuẩn 25 μg/mL vào 2.0 g mẫu trắng để được hàm lượng ASP là 0.5 mg/Kg. Tiến hành phân tích như đối với mẫu thử nghiệm. 58 3.7.4.4.2. Mẫu kiểm soát 4.0mg/kg: đuơc chuẩn bị bằng cách thêm 16μL dung dịch chuẩn 500μg/mL vào 2.0g mẫu trắng. Tiến hành phân tích như đối với mẫu thử nghiệm. 3.7.5. Tiến hành thử nghiệm: 3.7.5.1. Chiết mẫu và làm sạch mẫu: - Thêm chính xác 8.0 ml dung dịch chiết mẫu (3.7.3.2.6) vào các ống ly tâm chứa mẫu đã chuẩn bị ở các bước (3.7.4.2), (3.7.4.3), (3.7.4.4). Lắc mẫu trong 20 phút trên máy lắc mẫu. - Ly tâm ở 4500 vòng/ phút trong 10 phút trên máy ly tâm Lọc dịch trong qua màng lọc mẫu 0.45μm vào lọ thủy tinh 1.5 ml. Xác định hàm lượng ASP trong dịch chiết này trên máy LC-MS/MS. 3.7.5.2. Phân tích mẫu trên HPLC: 3.7.5.2.1. Thông số cài đặt cho HPLC: - Pha động A: 0.1% FA trong H20 - Pha động B: 0.1%FA trong ACN - Thành phần pha động thay đổi theo thời gian (chế độ gradient) được mô tả ở bảng sau: Thời gian (Phút) A% B% Tốc độ dòng (mL/phút) Curve 0,00 50,0 50,0 0,400 1 5,00 50,0 50,0 0,400 3 6,00 90,0 10,0 0,400 3 10,00 90,0 10,0 0,400 1 10,01 50,0 50,0 0,400 1 - Thể tích tiêm: 20µl - Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút - Thời gian phân tích: 10 phút - Nhiệt độ cột: 35oC 59 3.7.5.2.2. Thông số cài đặt cho đầu dò MS - Chế độ vận hành: ESI+ - Nguồn ESI (+) - Điện thế mao quản: 1kV - Điện thế extractor: 2,0 V - Điện thế RF: 0,0 V - Nhiệt độ nguồn: 120oC - Nhiệt độ khử dung môi:400oC - Tốc độ khí cone: 40 l/giờ - Tốc độ khí khử dung môi: 460 l/giờ - Bộ phân tích Độ phân giải vùng khối lượng thấp LM1: 15,0 Độ phân giải vùng khối lượng cao HM1: 15,0 Năng lượng ion hoá 1: 0,5 Điện thế cửa vào: -1 Điện thế cửa ra: 1 Độ phân giải vùng khối lượng thấp LM2: 15,0 Độ phân giải vùng khối lượng cao HM2: 15,0 Năng lượng ion hoá 2: 3 Điện thế bộ khuyếch đại: 650 V Áp suất chân không: 4-5e-3 mbar Chế độ vận hành : chuẩn - Các điều kiện phân ly MS/MS: Tên chất ion sơ cấp (m/z) ion thứ cấp (m/z) Thời gian Dwell (s) Điện thế cone (V) Năng lượng cone (eV) 184,51 0,1 30 20 Axít Domoic 312 266,25 0,1 30 15 60 Thứ tự tiêm mẫu: -Tiêm các dịch mẫu xây dựng đường chuẩn. -Tiêm dịch mẫu trắng. -Tiêm các dịch mẫu thử nghiệm.Tính Hàm lượng DA trong mẫu thử nghiệm. 3.7.6. Đảm bảo chất lượng 3.7.6.1. Định tính: Chất cần phân tích được khẳng định là có mặt khi các yêu cầu về thời gian lưu, mức dung sai cường độ ion tương đối… đáp ứng theo chỉ thị 2002/657/EC của Cộng đồng Châu Âu. 3.7.6.2. Định lượng: - Tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu của các ion thứ cấp trong mẫu phải ≥3:1 - Hệ số hồi qui tuyến tính của đường chuẩn R2 phải ≥0.99 3.7.7. Tính toán kết quả: 3.7.7.1. Tính tỉ số ion theo phương trình: (%) A 100 R 2 1A×= Trong đó: R: tỉ số ion (%) A1: diện tích của các pic ion thứ cấp có cường độ thấp. A2: diện tích của các pic ion thứ cấp có cường độ cao 3.7.7.2. Dựng đồ thị hệ số tín hiệu của dịch mẫu xây dựng đường chuẩn với nồng độ chất chuẩn bổ sung theo phương pháp hồi qui tuyến tính: Y = ax + b Trong đó: b: tung độ góc của đường chuẩn a: hệ số góc của đường chuẩn 3.7.7.4. Tính hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu dựa theo hệ số tín hiệu của từng mẫu phân tích và đường chuẩn. 61 KẾT LUẬN Qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi đã hoàn thành các nhiệm vụ của luận văn đã đề ra với kết quả như sau: - Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện để xây dựng quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản trên thiết bị LC-MS/MS: (i) Phương pháp chiết: lựa chọn phương pháp chiết lỏng-lỏng với dung môi chiết là MeOH:H2O tỷ lệ 1:1. (ii) Tối ưu các thông số liên quan đến HPLC: sử dụng cột C18, kích thước cột 250 x 4.6 mm, kích thước hạt 5 μm (Merck- Licrocart 250-4 RP-18); lựa chọn và sử dụng pha động là 0.1% FA trong H20 (A) và 0.1%FA trong ACN (B); tốc độ dòng 0,4 ml/phút. (iii) Tối ưu hóa các thông số của đầu dò MS/MS: hiệu điện thế mao quản (capillary = 2 kV), điện thế cone (cone volt = 30 V), năng lượng va chạm (collission energy = 20 eV và 15 eV tương ứng với 02 ion con là 184,51 và 266,25). - Khảo sát giá trị sử dụng của phương pháp trên mẫu thật và mẫu chuẩn: (i) Khoảng tuyến tính: khoảng tuyến tính có nồng độ từ 0.5 ppm đến 10 ppm (R2 > 0,98). (ii) Độ nhạy của phương pháp: Giới hạn phát hiện LOD: 0,5 ppm. Giới hạn định lượng LOQ: 1,5 ppm. (iii) Độ lặp lại của phương pháp: Độ thu hồi của phương pháp: 101.2%. Độ lặp lại của phương pháp SD = 0.17 hay CV = 6.72%. - Đã phân tích 36 mẫu nhuyễn thể tại 12 vùng thu hoạch nhuyễn thể của Việt Nam. - Kiểm đối chứng: lấy xác suất 1 số mẫu nhuyễn thể, mẫu thêm chuẩn (spiked) và mẫu vật liệu chuẩn (CRM). - Trong khuôn khổ luận văn, với thời gian và điều kiện hạn hẹp nên chúng tôi chỉ mới chỉ nghiên cứu trong phạm vi là phân tích DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Vì vậy mong muốn của chúng tôi là trong thời gian sắp đến cần phải mở rộng nghiên cứu phương pháp này thành phương pháp chung có thể áp dụng phân tích đồng thời nhiều chất nhóm độc tố sinh học biển khác như DSP, PSP. 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất bản giáo dục. 2. Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyết của HPLC trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội. 3. Bùi Thị Như Thuận, Nguyễn Phùng Tiển, Bùi Minh Đức (1991), Kiểm nghiệm chất lượng và thanh tra vệ sinh an toàn thực phẩm, Nhà xuất bản y học, tr. 236-242. 4. Tạ Thị Thảo, Bài giảng chuyên đề “Thống kê trong hóa phân tích”, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, 2005 5. Phạm Hùng Việt (2003), Sắc kí khí, NXB Khoa học Kĩ thuật. Tiếng Anh 6. H. Dizer, B. Fischer, A.S.A. Harabawy, M.-C. Hennion, P.-D. Hansen (2001), Toxicity of axít domoic in the marine mussel Mytilus edulis, Aquatic Toxicology, Vol.55, pp.194-156. 7. Intergovernmental Oceanographic Commission (1995), Manuals and Guides No. 31, Volume 1. 8. Jean-Philippe Antignac, Bruno Le Bizec, Fabrice Montau, Francois Andre (2003), Validation of Analytical Mehtods Based on Mass Spectrometric Detection according to “2002/657/EC” European Decision: Guideline and Application, Analytica Chimica Acta, Vol. 483, pp. 325-334. 9. Jonathan Clayden,* Benjamin Read and Katherine R. Hebditch (2005), Chemistry of axít domoic, isoaxít domoics, and their analogues, Tetrahedron report number 720. 63 10. Marios Maroulis, Ioannis Monemvasiosa, Elisabeth Vardakaa, Pantelis Rigasa (2008) Determination of axít domoic in mussels by HPLC with post-column derivatization using 4-chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3- diazole (NBD-Cl) and fluorescence detection, Journal of Chromatography B, 876, pp. 245–251. 11. Lefebvre KA, Powell CL, Busman M, Doucette GJ, Moeller PD, Silver JB, Miller PE, Hughes MP, Singaram S, Silver MW, Tjeerdema RS (1999), Detection of axít domoic in northern anchovis and California sea lions associated with an unusual mortality event, Natural toxins , 7(3), pp.85-92. 12. Philipp Hess, Steven Morris, Lesley A. Stobo, Nigel A. Brown, John D.G. McEvoy, Glenn Kennedy, Paul B. Young, Deirdre Slattery, Evin McGovern, Terry McMahon, Susan Gallacher (2005), LC-UV and LC- MS methods for the determination of axít domoic, Trends in Analytical Chemistry, Vol. 24, No. 4, 2005. 13. Quilliam MA (1995), Seafood toxins, Journal of AOAC International, 78(1), pp. 144-148. 14. Yasumoto T; Fukui M; Sasaki K; Sugiyama K (1995), Determinations of marine toxins in foods, Journal of AOAC International, 78(2), pp. 574-582. 15. Whitney PL, Baden DG (1996), Complex association and dissociation kinetics of brevetoxin binding to voltage-sensitive rat brain sodium channels, Natural toxins, 4, pp. 261-270. PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN 1. Nhóm ASP Axít domoic 2. Nhóm DSP 2.1 Dinophysis Toxin 2.2 Okadaic Acid 2.3 Pectenotoxin 2.4 Yessotoxin 3. Nhóm PSP 4. Nhóm NSP PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU 1. Khảo sát capillary Hình 32. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện Capillary 1 kV Hình 33. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện Capillary 2 kV Hình 34. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện Capillary 3 kV Hình 35. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện Capillary 4 kV Nhận xét: tại điều kiện capillary = 2 kV là tối ưu nhất. 2. Khảo sát cone volt Hình 36. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện cone volt 10 V Hình 37. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện cone volt 20 V Hình 38. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện cone volt 30 V Hình 39. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện cone volt 40 V Hình 40. Sắc ký đồ của Ion sơ cấp tại điều kiện cone volt 50 V Nhận xét: Tại điều kiện 30 V là tối ưu nhất và ion mẹ là 312 3. Khảo sát năng lượng va chạm (Collission energy) Hình 41. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 5 eV Hình 42. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 10 eV Hình 43. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 15 eV Hình 44. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 20 eV Hình 45. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 25 eV Hình 46. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 30 eV Hình 47. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 35 eV Hình 48. Sắc ký đồ của Ion thứ cấp tại điều kiện Collision energy 40 eV Nhận xét: Tổng hợp tín hiệu của các mảnh ion con (5 mảnh) ta có bảng tóm tắt như sau: Mass Collision Energy 10 15 20 25 30 35 40 184.51 52348 21304 184.92 16651 184 219.31 22530 219.92 17764 219 247.64 19793 247.84 13518 248.04 11555 247 265.65 40379 265.85 17217 266.05 25038 266.25 80749 266 293.58 14042 293.78 21573 294 Bảng 14. Bảng tổng hợp tín hiệu của các mảnh Ion sơ cấp PHỤ LỤC 3. ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH Hình 49. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 0.5 ppm Hình 50. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 1 ppm Hình 51. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 2ppm Hình 52. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 3 ppm Hình 53. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 5 ppm Hình 54. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 7ppm Hình 55. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ 10 ppm 1. Đường tuyến tính của Ion 219 2. Đường tuyến tính của Ion 184 3. Đường tuyến tính của Ion 293 4. Đường tuyến tính của Ion 266 5. Đường tuyến tính của Ion 247 PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ Hình 56. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 1 tại Giao Thủy – Nam Định Hình 57. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 2 tại Giao Thủy – Nam Định Hình 58. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 3 tại Giao Thủy – Nam Định Hình 59. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 1 tại Tiền Hải – Thái Bình Hình 60. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 2 tại Tiền Hải – Thái Bình Hình 61. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 3 tại Tiền Hải – Thái Bình Hình 62. Sắc ký đồ chạy mẫu Tu Hài tại Vân Đồn – Quảng Ninh Hình 63. Sắc ký đồ chạy mẫu Điệp số 1 tại Phan Thiết Hình 64. Sắc ký đồ chạy mẫu Điệp số 2 tại Phan Thiết Hình 65. Sắc ký đồ chạy mẫu Điệp số 3 tại Phan Thiết Hình 66. Sắc ký đồ chạy mẫu Sò số 1 tại Tuy Phong Hình 67. Sắc ký đồ chạy mẫu Sò số 2 tại Tuy Phong Hình 68. Sắc ký đồ chạy mẫu Sò số 3 tại Tuy Phong Hình 69. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 1 tại Bình Đại Hình 70. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 2 tại Bình Đại Hình 71. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 3 tại Bình Đại Hình 72. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 1 tại Ba Tri Hình 73. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 2 tại Ba Tri Hình 74. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 3 tại Ba Tri Hình 75. Sắc ký đồ chạy mẫu sò huyết số 1 tại Thạnh Phú PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ BẰNG HPLC –UV Hình 76. Đường chuẩn chạy DA bằng HPLC-UV Hình 77. Kết quả chạy mẫu Spiked 2 ppm DA Hình 78. Kết quả chạy mẫu Spiked 2.5 ppm Hình 79. Kết quả chạy mẫu nghêu tại Giao Thủy – Nam Định DA Hình 80. Kết quả chạy mẫu Tu hài tại Vân Đồn Hình 81. Kết quả chạy mẫu nghêu tại Tiền Giang Hình 82. Kết quả chạy mẫu sò lông tại Bà Lụa Hình 83. Kết quả chạy mẫu sò huyết tại Bà Lụa Hình 84. Kết quả chạy mẫu CRM trên HPLC Hình 85. Kết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS DA