Nghiên cứu định lượng đồng thời adenosin và allopurinol trong dung dịch wisconsin -A bằng phương pháp quang phổ cộng tính

Nghiên cứu định lợng đồng thời adenosin và allopurinol trong dung dịch wisconsin - a bằng phơng pháp quang phổ cộng tính bộ quốc phòng Học viện quân y ***** Ngời hớng dẫn: TS. Phan Văn Bình Thực hiện: SV. Nguyễn Hồng Sơn Dợc 7 Báo cáo khóa luận TN DS Đại học - Trong y học hiện đại ghép tạng là phơng pháp chữa bệnh hữu hiệu. - Dung dịch Wisconsin V là dung dịch để rửa và bảo quản tạng ghép dạng Wisconsin. - Dung dịch Wisconsin V đợc đóng gói thành 2 đơn vị thành phẩm riêng biệt. -Trong dung dịch Wisconsin A adenosin và allopurinol là các hợp chất hữu cơ có hàm lợng nhỏ nhng có vai trò quan trọng. đặt vấn đề Chúng tôi chọn đề tài: Nghiên cứu định lợng đồng thời adenosin và allopurinol trong dung dịch Wisconsin - A bằng phơng pháp quang phổ cộng tính ” với mục tiêu sau : 1. Xây dựng phơng pháp định lợng đồng thời adenosin và allopurinol trong dung dịch Wisconsin - A bằng phơng pháp quang phổ cộng tính. 2. Khảo sát độ lặp lại và độ đúng của phơng pháp. đặt vấn đề I. Tổng quan 1.1.Thành phần & nồng độ các chất trong dd Wisconsin - A. MgSO4 .7 H2O 0,63 g Adenosin 0,683 g Allopurinol 0,069 g Acid lactobionic 18,28 g Raffinose. 9,20 g Hydroxy ethyl starch: 25,50 g Kali hydroxyd vừa đủ đến pH = 7,0 Nớc cất pha tiêm vừa đủ 500ml 1.2. Tác dụng của adenosin và allopurinol. Trong tế bào cơ tim, adenosin thể hiện hoạt tính sinh lý và dợc lý, tham gia vào quá trình tái tạo ATP. Vì vậy adenosin đợc sử dụng làm thuốc chống loạn nhịp và bảo vệ mạch vành trong bệnh nhồi máu cơ tim. Trong dung dịch Wisconsin, adenosin có tác dụng phòng ngừa loạn nhịp sau ghép, và là nguồn dự trữ để tái tạo năng lợng. Allopurinol có hoạt tính ức chế enzym xanthin oxydase, có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric trong dịch nội tế bào. Do vậy trong y học allopurinol đợc sử dụng làm thuốc chữa bệnh gút Trong dung dịch Wisconsin, allopurinol là chất chống oxy hoá, chống acid uric, chống độc, chống peroxyd. 1.3.Định lợng hỗn hợp adenosin và allopurinol Nguyễn Chí Kiên nghiên cứu định lợng đồng thời adenosin & allopurinol trong dung dịch Wisconsin – A bằng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. 1.4.Phơng pháp quang phổ cộng tính Do độ hấp thụ có tính cộng tính nên nếu có một d dịch hỗn hợp gồm n chất thì độ hấp thụ của hỗn hợp bằng tổng độ hấp thụ của n dung dịch từng chất riêng rẽ có cùng nồng độ nh trong hỗn hợp. Trờng hợp đơn giản nhất là hỗn hợp gồm hai chất, ta có : Ahh = A1 + A2 Chọn hai bớc sóng 1,  2 và đo độ hấp thụ của hỗn hợp ở 2 bớc sóng đó Tại 1: Ahh 1 = E1 1C1 + E2 1C2 ; Tại 2: Ahh 2 = E1 2C1 + E2 2C2 Giải hệ phơng trình trên ta tìm đợc: = E1 1E2 2 – E1 2E 2 1 C1= A1E2 2-A2E2 1  x 100; C2= A2E1 1-A1E1 2  x 100; 2.1. Vật liệu nghiên cứu. 2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất, dung môi : - Adenosin ( C10H13N5O4 , ptl. = 267,2 đạt USP 24. - Allopurinol (C5H4N4O, ptl. = 136,1 ) đạt USP 24. 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị : Quang phổ kế UV - VIS Cintra - 40 GBC corporation úc. 2.1.3. Cơ sở thực nghiệm: 2.2. đối tợng nghiên cứu: Hoá chất adenosin, allopurinol và dung dịch Wisconsin - A II. Vật liệu & phơng pháp nC 2.3. Phơng pháp nghiên cứu. 2.3.1.Khảo sát ảnh hởng của pH dung dịch đến phổ hấp thụ ánh sáng của adenosin và allopurinol. Ghi phổ hấp thụ từ bớc sóng 200 – 400nm các dung dịch adenosin và allopurinol có pH từ 6,0 đến 8,0. So sánh phổ hấp thụ của các dung dịch đó. Lựa chọn pH thích hợp. 2.3.2. Khảo sát ảnh hởng của các thành phần khác trong dd Wisconsin - A đối với độ hấp thụ của Adenosin và Allopurinol. Ghi phổ hấp thụ từ bớc sóng 200 – 400nm các dung dịch Magnesi sulfat, Acid lactobionic, Raffinose, Hydroxyethyl starch, dung dịch chuẩn hỗn hợp adenosin và allopurinol, dung dịch chuẩn hỗn hợp có thêm các thành phần khác. Xem xét phổ hấp thụ của các dung dịch thành phần khác trong dung dịch Wisconsin – A. So sánh phổ hấp thụ của hai hỗn hợp. 2.3.3. Khảo sát, chọn cặp bớc sóng thích hợp để định lợng đồng thời adenosin và allopurinol trong d dịch Wisconsin - A. Trên cơ sở phổ UV của adenosin và allopurinol trong dung dịch đệm phosphat pH = 7,0 chọn 4 bớc sóng tơng ứng với cực đại hấp thụ của adenosin và allopurinol là 205, 207, 250, 260nm. đo độ hấp thụ của tất cả các mẫu tại các bớc sóng 205, 207, 250, 260nm. Lấy giá trị độ hấp thụ quang trung bình của adenosin và allopurinol ở từng bớc sóng… Tính nồng độ adenosin và allopurinol trong hỗn hợp theo công thức : = E1 1E2 2 – E1 2E 2 1 Chọn cặp bớc sóng thích hợp để định lợng đồng thời adenosin và allopurinol. CAd= A1E2 2-A2E2 1  x 100; CAL= A2E1 1-A1E1 2  x 100; 2.3.4. Xây dựng phơng pháp định lợng đồng thời adenosin và allopurinol trong dung dịch Wisconsin - A. 2.3.4.1. đề xuất phơng pháp. Dựa vào kết quả nghiên cứu ở các mục 2.3.1, 2.3.2, 2.3.3 để đề xuất phơng pháp định lợng đồng thời adenosin và allopurinol trong dung dịch Wisconsin - A. 2.3.4.2. Khảo sát ảnh hởng của độ lệch tỷ lệ nồng độ adenosin và allopurinol đối với kết quả phân tích. Pha 2 dung dịch hỗn hợp adenosin và allopurinol chuẩn có độ lệch nồng độ là 11/0,9 & 9/1,1. định lợng theo phơng pháp đã đề xuất. 2.3.4.3. Khảo sát độ lặp lại của phơng pháp. độ lặp lại của phơng pháp đợc xác định bằng độ lệch chuẩn t- ơng đối của 5 mẫu đo trên cùng 1 chai WA ( lô 20/10/04 ) và so sánh nồng độ trung bình tìm thấy trên một chai khác cùng lô, định lợng vào ngày hôm sau. 2.3.4.4. Khảo sát độ đúng bằng phơng pháp thêm chuẩn. độ đúng của phơng pháp đợc xác định bằng phơng pháp thêm một lợng chính xác adenosin và allopurinol chuẩn vào hai mẫu thử WA trong cùng lô 20/10/04 (đã đợc xác định hàm lợng adenosin & allopurinol ở mục khảo sát độ lặp lại ). đánh giá độ đúng dựa vào độ sai số tơng đối. 2.4. Phơng pháp xử lý số liệu. Các số liệu đợc xử lý bằng phơng pháp toán thống kê dùng trong y sinh học. Thông qua các đặc trng: Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tơng đối, t tính toán ... 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hởng của pH đến độ hấp thụ quang phổ của dung dịch adenosin và allopurinol 3.1.1.Đối với adenosin. nm 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 260  207   226 Hình 3.1. Phổ hấp thụ của dung dịch adenosin ở pH = 6,0. III. Kết quả nghiên cứu & bàn luận nm 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 260  207   226 Hình 3.2. Phổ hấp thụ của dung dịch adenosin ở pH = 6,5. nm 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 260  207   226 Hình 3.3. Phổ hấp thụ của dung dịch adenosin ở pH = 7,0. nm 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 260  207   226 Hình 3.4. Phổ hấp thụ của dung dịch adenosin ở pH = 7,5. nm 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 260  207   226 Hình 3.5. Phổ hấp thụ của dung dịch adenosin ở pH = 8,0. 0.0 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm 250  205   230 3.1.2. Đối với allopurinol Hình 3.6. Phổ hấp thụ của dung dịch allopurinol ở pH = 6,0 0.0 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm 250  205   230 Hình 3.7. Phổ hấp thụ của dung dịch allopurinol ở pH = 6,5 0.0 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm 250  205   230 Hình 3.8. Phổ hấp thụ của dung dịch allopurinol ở pH = 7,0 0.0 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm 250  205   230 Hình 3.9. Phổ hấp thụ của dung dịch allopurinol ở pH = 7,50 0.0 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm 250  205   230 Hình 3.10. Phổ hấp thụ của dung dịch allopurinol ở pH = 8,0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm Hình 3.11. Phổ hấp thụ của mẫu trắng pH = 7 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hởng của các thành phần khác trong dd Wisconsin. A đối với độ hấp thụ của Adenosin và Allopurinol 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm Hình 3.12. Phổ hấp thụ của dung dịch Magnesi Sulfat 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Abs Hình 3.13. Phổ hấp thụ của dung dịch Raffinose 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm Hình 3.14. Phổ hấp thụ của dung dịch acid lactobionic Hình 3.15. Phổ hấp thụ của dung dịch Hydroxyethyl starch Abs 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm nm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 258  206,5  227  Hình 3.16. Phổ hấp thụ của dung dịch adenosin và allopurinol Hình 3.17. Phổ hấp thụ của dung dịch adenosin, allopurinol và các thành phần khác của WA 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Abs 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm 258  206,5  227  XCặp bớc sóng Nồng độ đa vào (g/l) Nồng độ tìm thấy (g/l) X % SD% 1 2 3 4 5 205/250 0,68 0,6849 0,6793 0,6824 0,6846 0,6813 0,6825 0,37 0,34 205/260 0,68 0,6827 0,6789 0,6849 0,6863 0,6788 0,6823 0,33 0,50 207/250 0,68 0,6839 0,6778 0,6839 0,6871 0,6839 0,6833 0,38 0,49 207/260 0,68 0,6823 0,6784 0,6854 0,6870 0,6794 0,6825 0,37 0,54 250/260 0,68 0,6817 0,6787 0,6860 0,6870 0,6777 0,6822 0,33 0,61 Bảng 3.8: Kết quả định lợng adenosin trong d. dịch chuẩn hỗn hợp 3.3. Kết quả khảo sát chọn cặp bớc sóng thích hợp để định lợng đồng thời adenosin và allopurinol trong dung dịch Wisconsin – A. XCặp bớc sóng Nồng độ đa vào (g/l) Nồng độ tìm thấy (g/l) X % SD% 1 2 3 4 5 205/250 0,068 0,0662 0,0675 0,0695 0,0696 0,0691 0,0684 0,55 2,17 205/260 0,068 0,0675 0,0678 0,0681 0,0686 0,0705 0,0685 0,74 1,74 207/250 0,068 0,0670 0,0687 0,0683 0,0676 0,0670 0,0677 - 0,41 1,13 207/260 0,068 0,0679 0,0684 0,0674 0,0676 0,0697 0,0682 0,29 1.34 250/260 0,068 0,0687 0,0680 0,0666 0,0677 0,0720 0,0686 0,88 2,98 Bảng 3.9. Kết quả định lợng allopurinol trong dung dịch chuẩn hỗn hợp 3.4. Kết quả xây dựng phơng pháp định lợng đồng thời Adenosin và Allopurinol 3.4.1. Đề xuất phơng pháp Từ các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đề xuất phơng pháp định l- ợng đồng thời adenosin và allopurinol trong dung dịch Wisconsin- A nh sau: - Pha dung dịch adenosin và allopurinol chuẩn, đo độ hấp thụ quang ở bớc sóng 207 và 260 nm. - Pha loãng dung dịch Wisconsin-A 200 lần bằng dung dịch đệm phosphat pH = 7,0 đo độ hấp thụ quang ở bớc sóng 207 và 260nm. - Tính nồng độ của adenosin và allopurinol trong dung dịch Wisconsin- A theo phơng pháp quang phổ cộng tính. XNồng độ đa vào (g/l) Nồng độ tìm thấy (g/l) X % SD% 1 2 3 4 5 0,748 0,7572 0,7535 0,7482 0,7462 0,7494 0,7509 0,39 0,58 0,612 0,6175 0,6078 0,6151 0,6206 0,6115 0,6145 0,41 0,81 Bảng 3.10. Kết quả định lợng adenosin trong dung dịch hỗn hợp chuẩn có độ lệch 11/0,9 và 9/1,1. 3.4.2. Kết quả khảo sát ảnh hởng của độ lệch tỷ lệ nồng độ adenosin và allopurinol đối với kết quả phân tích. XNồng độ đa vào (g/l) Nồng độ tìm thấy (g/l) X % SD% 1 2 3 4 5 0,0612 0,0617 0,0615 0,0594 0,0619 0,0626 0,0614 0,33 1,92 0,0748 0,0755 0,0748 0,0736 0,0757 0,0758 0,0751 0,40 1,22 Bảng 3.11. Kết quả định lợng allopurinol trong dung dịch hỗn hợp chuẩn có độ lệch 11/0,9 và 9/1,1. Từ kết quả ở hai bảng 3.10 và 3.11 cho thấy khi ta thay đổi độ lệch nồng độ thì kết quả định lợng adenosin và allopurinol đều cho độ chính xác cao. Vậy khi ta thay đổi độ lệch nồng độ adenosin và allopurinol trong khoảng từ 9/1,1 đến 11/0,9 thì không ảnh hởng đến kết quả phân tích. 1AdX 310.96,7 SD 58,0% S Số lần định lợng Dung dịch WA lô 20/10/04 Chai số 1 Chai số 2 Nồng độ tìm thấy (g/l) XAd1= 1,3626 SD = 7,96.10-3 SD% = 0,58 Nồng độ tìm thấy (g/l) XAd2 = 1,3588 SD = 5,2.10-3 SD% = 0,38 1 1,3757 1,3532 2 1,3546 1,3613 3 1,3584 1,3585 4 1,3620 1,3662 5 1,3627 1,3548 3.4.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phơng pháp. Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ lặp lại của pp định lợng đối với adenosin. 1362,01 ALX 410.18,5 SD 38,0% S Số lần định lợng Dung dịch WA lô 20/10/04 Chai số 1 Chai số 2 Nồng độ tìm thấy (g/l) XAL1 = 0,1362 SD = 5,18.10-4 SD% = 0,38 Nồng độ tìm thấy (g/l) XAL2 = 0,1366 SD = 4,85.10-4 SD% = 0,35 1 0,1369 0,1370 2 0,1365 0,1367 3 0,1358 0,1360 4 0,1359 0,1362 5 0,1357 0,1371 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ lặp lại của pp định lợng đối với allopurinol. Để đánh giá kết quả từ chai 1 và chai 2 xem sự khác biệt có ý nghĩa hay không, tiến hành so sánh 2 giá trị trung bình của 2 dãy kết quả dựa trên test t. So sánh 2 giá trị trung bình: - Đối với adenosin: ttt = 0,893. Nh vậy ttt = 0,893 < t0,95 = 2,306 (ở  = 0,05; n1 + n2 – 2 = 8) - Đối với allopurinol: ttt = 1,974. Nh vậy ttt = 1,974 < t0,95 = 2,306 (ở  = 0,05; n1 + n2 – 2 = 8) Kết quả so sánh cho thấy: 2 giá trị trung bình của 2 dãy kết quả thu đợc từ 2 chai 1 và chai 2 khác nhau không có ý nghĩa (p>0,05), hay không có sự khác biệt giữa kết quả thu đợc từ chai 1 và chai 2, phơng pháp có độ lặp lại cao 4309,13 AdX 310.56,4 SD 32,0% S Số lần định lợng Dung dịch WA, lô sản xuất 20/10/04 có nồng độ adenosin 1,3607g/l, lợng thêm vào là: 0,068g/l Chai số 3 Chai số 4 Nồng độ tìm thấy (g/l) XAd3 = 1,4309 SD = 4,56.10-3 SD% = 0,32 Nồng độ tìm thấy g/l) XAd4 = 1,4272 SD = 3,15.10-3 SD% = 0,22 1 1,4326 1,4275 2 1,4245 1,4324 3 1,4285 1,4266 4 1,4324 1,4244 5 1,4365 1,4251 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng của ph. pháp định lợng adenosin. 3.4.3. Kết quả khảo sát độ đúng của phơng pháp. % = 0,51 3ALX SD %SD Số lần định lợng Dung dịch WA, lô sản xuất 20/10/04 có nồng độ allopurinol 0,1362g/l, lợng thêm vào 0,0068g/l Chai số 3 Chai số 4 Nồng độ tìm thấy (g/l) XAL3 = 0,14326 SD = 9,2.10-4 SD% = 0,64 Nồng độ tìm thấy g/l) XAL4 = 0,14334 SD = 9,84.10-4 SD% = 0,69 1 0,1426 0,1418 2 0,1434 0,1441 3 0,1421 0,1430 4 0,1444 0,1442 5 0,1438 0,1436 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng của ph pháp định lợng allopurinol % = 1,47 Việc áp dụng phơng pháp quang phổ cộng tính để định lợng đồng thời adenosin và allopurinol trong dung dịch WA cha đợc đề cập trong các tài liệu. đối tợng chúng tôi nghiên cứu là dung dịch Wisconsin - A là dung dịch có nhiều thành phần phức tạp, lợng hoạt chất chứa trong mẫu phân tích cần định lợng nhỏ, vì vậy để thu đợc kết quả chính xác cần phải thao tác cẩn thận. Trên cơ sở kết quả thu đợc bằng thực nghiệm, chúng tôi đã chọn đợc dung dịch đệm pH và cặp bớc sóng thích hợp cho phép định lợng đồng thời adenosin và allopurinol trong dung dịch WA. Phơng pháp đợc tiến hành nhanh, thuận lợi, có độ đúng và độ chính xác có thể chấp nhận đợc trong phân tích định lợng. 1. đã xây dựng đợc ph.pháp định lợng đồng thời adenosin & allopurinol trong dung dịch Wisconsin - A bằng phơng pháp quang phổ cộng tính với qui trình sau : + Pha dung dịch adenosin và allopurinol chuẩn, đo độ hấp thụ quang ở bớc sóng 207 và 260nm. + Pha loãng dung dịch WA 200 lần bằng dung dịch đệm phosphat pH = 7,0 đo độ hấp thụ quang ở bớc sóng 207 và 260nm. + Tính nồng độ của adenosin và allopurinol trong dung dịch WA theo phơng pháp quang phổ cộng tính. 2. Qui trình có độ lặp lại cao với SD% dao động từ 0,38 đến 0,58% và độ đúng vói sai số tơng đối % là 0,51 đối với adenosin và 1,47% đối với allopurinol, do đó có thể ứng dụng để kiểm soát nồng độ adenosin và allopurinol trong dung dịch Wiscosin – A. IV. Kết luận đề nghị áp dụng phơng pháp quang phổ cộng tính để xác định nồng độ adenosin và allopurinol trong dung dịch WA trong quá trình bào chế và bảo quản . đề xuất Em xin trân trọng cảm ơn Hội đồng, Quý vị đại biểu đã quan tâm theo dõi!