Nghiên cứu gây tạo trầm hương trên cây dó bầu bằng phương pháp vi sinh và hóa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***OOO*** PHẠM TIẾN LỢI NGHIÊN CỨU GÂY TẠO TRẦM HƢƠNG TRÊN CÂY DÓ BẦU BẰNG PHƢƠNG PHÁP VI SINH VÀ HÓA HỌC Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***OOO*** NGHIÊN CỨU GÂY TẠO TRẦM HƢƠNG TRÊN CÂY DÓ BẦU BẰNG PHƢƠNG PHÁP VI SINH VÀ HÓA HỌC Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: Th.S ĐINH TRUNG CHÁNH PHẠM TIẾN LỢI Khóa: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY INDUCTION OF AGARWOOD FORMATION ON AQUILARIA CRASSNA PIERRE EX. LECOMTE TREES BY FUNGI INNOCULATION AND CHEMICAL TREATMENTS GRADUATIONTHESIS Major: Biotechnology Guide: Student: B.a ĐINH TRUNG CHANH PHAM TIEN LOI Term: 2002 – 2006 Ho Chi Minh City 08/2006 LỜI CẢM TẠ  Chân thành cảm ơn! Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Bộ Môn Cảnh Quan Hoa Viên Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Trung Tâm Công Nghệ Quản Lý Môi Trường và Tài Nguyên Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Phòng Quản Trị Vật Tư Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Đã tạo mọi điều kiện cho chúng tôi học tập và hoàn thành luận án tốt nghiệp đúng tiến độ!  Chân thành cảm ơn! Tất cả các Thầy Cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức mới cho chúng tôi trong thời gian học tập!  Chân thành cảm ơn! ThS. Thầy. ĐINH TRUNG CHÁNH. Đã luôn tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài!  Chân thành cảm ơn! Tất cả các Anh, Chị vá các bạn, đã không ngừng động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiên đề tài! Xin chân thành bầy tỏ lòng biết ơn! Sv: PHẠM TIẾN LỢI DANH SÁCH HÌNH ẢNH Tên hình Trang H2.1 Cây Dó bầu được chọn làm thí nghiệm 4 H2.2 Tượng phật làm bằng Trầm 5 H2.3 Vòng đeo cổ bằng Trầm 5 H2.4 Vườn cây Dó bầu 6 H2.5 Quả cây Dó bầu còn non 7 H2.6 Quả cây Dó bầu khi chín 7 H2.7 Các mẫu tinh dầu Trầm 9 H2.8 Trầm hình thành ngoài tự nhiên 10 H3.1 Lỗ khoan làm thí nghiệm trên cây 27 H3.2 Một nghiệm thức 1 khi hoàn tất 27 H4.1 Phản ứng của cây quanh nghiệm thức 28 H4.2 Trầm hương hình thành trong lõi cây 29 H4.3 Vùng gỗ biến đổi màu và chỉ chạy dọc theo sớ gỗ 30 H4.4 Chỉ Trầm chạy dọc theo sớ gỗ 30 H4.5 Bào tử nấm Trichoderma 34 H4.6 Bào tử nấm Trichoderma đối chứng 34 H4.7 Bào tử nấm Macrophoma 34 H4.8 Bào tử nấm Macrophoma đối chứng 34 H4.9 Bào tử nấm Botriodiphodia 34 H4.10 Bào tử nấm Botriodiphodia đối chứng 34 H4.11 Bào tử nấm Diplodia 35 H4.12 Bào tử nấm Diplodia đối chứng 35 DANH SÁCH CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng3.1 Bảng đo cây Dó bầu làm thí nghiệm tại Thảo Cầm Viên tp HCM 18 Bảng 3.2 Bảng đo cây Dó bầu làm thí nghiệm tại đảo Phú Quốc 18 Bảng3.3 Sơ đồ bố trí nghiệm thức trên cây Dó bầu Ở Thảo Cầm Viên tp HCM 25 Bảng3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ở Phú Quốc 26 Bảng 4.1 Bảng đo diện tích vùng gỗ biến đổi màu 31 Bảng 4.2 Bảng đánh giá cảm quan 32 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1. Bo Botryodiplodia sp 2. Di Diplodia sp 3. Rh Rhyzoctonia sp 4. Ma Macrophoma sp 5. Pe Penicillium sp 6. Tu Tuyến Trùng 7. Th Thermomycce sp 8. STT Số thứ tự 9. NT Nghiệm thức 10. H Hình 11. DC Đối chứng 12. CV Chu vi PHẦN 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. Đặt vấn đề Cây Dó bầu còn gọi là cây Trầm hương, hay cây Kỳ nam, trong gỗ của nó có khả năng sinh ra một loại sản phẩm đặc biệt gọi là Trầm hương hay là Kỳ nam. Trầm hương có rất nhiều công dụng đã được biết và được sử dụng từ hàng ngàn năm qua, ở nhiều nước trên thế giới. Từ xưa đến nay Trầm hương và Kỳ nam là loại sản phẩm đặc biệt quý hiếm của rừng mà thiên nhiên đã ưu ái ban tặng cho con người. Chính vì vậy mà Trầm hương có giá trị kinh tế rất cao trên thị trường. Điều này đã làm cho cây Dó bầu trở thành loài thực vật đặc biệt được nhiều nhà khoa học và người dân chú ý, có giá trị đặc biệt về mặt nghiên cứu khoa học ở Việt Nam nói riêng và các nước trên thế giới nói chung. Tuy nhiên, những nghiên cứu có tính hệ thống về sự hình thành Trầm hương trên cây Dó bầu chỉ mới bắt đầu từ vài thập niên gần đây. Hầu hết các kết quả nghiên cứu được công bố đều chưa đưa ra được các quy trình tối ưu cũng như là cơ chế hình thành Trầm hương để có thể áp dụng rộng rãi ra sản xuất đại trà. Trong khi đó cùng với sự mất rừng thì nguồn Trầm hương tự nhiên cũng ngày càng cạn dần. Các loài thuộc chi Aquilaria có khả năng cho Trầm bị khai thác cạn kiệt. Ở Việt Nam những người khai thác Trầm chặt đốn bừa bãi những cây Dó bầu ở bất kỳ độ tuổi nào. Với cách khai thác như vậy thì chỉ trong một thời gian ngắn những cây thuộc họ Dó bầu gần như bị diệt chủng. Trước tình hình đó Hội Đồng Bộ Trưởng (Nay thuộc Chính Phủ) Đã ban hành Nghị Định số 18-HDBT ngày 17 tháng 1 năm 1992 quy định danh mục thực vật rừng, động vật rừng quý hiếm và có chế độ bảo vệ, đã xếp cây Dó bầu vào danh mục nhóm 1A, tức là được bảo vệ nghiêm ngặt. Trước tình hình đó hiện nay ở nước ta đã và đang có rất nhiều các tổ chức, cơ quan, cá nhân trồng cây Dó bầu đại trà, nhằm mục đích cải thiện kinh tế, phủ xanh đất trống đồi trọc, góp phần xoá đói giảm nghèo v.v… Tuy nhiên, phần lớn các dự án đó mới đang ở giai đoạn trồng và thử nghiệm gây tạo Trầm bằng các phương pháp khác nhau và các kết quả thu được đều chưa được khả quan lắm. Mặt khác nếu để cây Dó bầu mọc ngoài tự nhiên (ở rừng tự nhiên) thì khả năng cho Trầm hương của cây Dó bầu rất hạn chế (khoảng 10%). Chỉ một số cây vì lý do nào đó các tác nhân từ bên ngoài tác động đến cây Dó bầu như mưa, gió, sét đánh làm gẫy thân, cành… chiến tranh vi sinh vật làm tổn thương, xâm nhiễm vào cây. Từ đó qua quá trình thời gian thì Trầm hương được hình thành dần dần theo thời gian. Vì những lý do kể trên đồng thời dưới sự phân công của bộ môn Công Nghệ Sinh Học và dưới sự hướng dẫn của Th.S Đinh Trung Chánh chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu gây tạo Trầm hương bằng phương pháp vi sinh và hoá học”. 1.2. Mục đích nghiên cứu của đề tài  Xây dựng qui trình kỹ thuật gây tạo Trầm hương nhân tạo bằng phương pháp vi sinh và hoá học có hiệu quả  Tạo ra được Trầm hương hàng hoá, tức Trầm hương có chất lượng và có giá trị thương phẩm cao.  Bước đầu dùng sắc ký khí GC/MS để xác định thành phần hoá học trong tinh dầu Trầm từ các mẫu Trầm có được từ quá trình gây tạo.  Hoàn thiện quy trình công nghệ cũng như chế phẩm gây tạo Trầm hương để chuyển giao cho người trồng Dó bầu. 1.3. Giới hạn của đề tài. Do quỹ thời gian và kinh phí còn hạn chế nên chúng tôi mới chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu các vấn đề liên quan đến việc hình thành Trầm hương trên cây Dó bầu ở các nghiệm thức đã bố trí thí nghiệm. Ngoài ra chúng tôi nghiên cứu đánh giá kết qủa sản phẩm Trầm hương tạo được bằng cảm quan. Cũng như xác định thành phần hoá học thông qua chạy sắc ký khi kết hợp khối phổ GC/MS. PHẦN 2. TỔNG QUAN 2.1. Tổng quan về cây Dó bầu Cây Dó bầu thuộc: Lớp (Class): Magnoliopsida Bộ (Order): Myrtales Họ (Family):Thymelaeaceae Giống Aquilaria có tất cả 24 loài (Species) khác nhau gồm: 01. Aquilaria beccariana van Tiegh 02. Aquilaria hirta Ridl 03. Aquilaria microcarpa Baill 04. Aquilaria cumingiana (Decne) Ridl 05. Aquilaria filaria (Oken) Merr 06. Aquilaria brachyantha (Merr.) Hall.f 07. Aquilaria urdanetensis (Elmer) Hall.f 08. Aquilaria citrinaecarpa (Elmer) Hall.f 09. Aquilaria apiculata Elmer 10. Aquilaria parvifolia (Quis.) Ding Hou 11. Aquilaria rostrata Ridl 12. Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte 13. Aquilaria banaense Pham-hoang-Ho 14. Aquilaria khasiana H. Hallier 15. Aquilaria subintegra Ding Hou 16. Aquilaria grandiflora Bth 17. Aquilaria secundana D.C 18. Aquilaria moszkowskii Gilg 19. Aquilaria tomentosa Gilg 20. Aquilaria baillonii Pierre ex Lecomte 21. Aquilaria sinensis Merr 22. Aquilaria apiculata Merr 23. Aquilaria acuminate (Merr.)Quis 24. Aquilaria yunnanensis S.C. Huang H2.1 Cây Dó bố trí thí nghiệm H2.2 Tượng phật H2.3 Vòng cổ 2.2. Công dụng và việc sử dụng Trầm hƣơng Cây Dó bầu và sản phẩm chính của nó là Trầm hương đã có lịch sử từ lâu đời, và là một trong những sản vật luôn góp mặt trong cuộc sống tinh thần của người dân Việt Nam ta nói riêng và trên thế giới nói chung. Đó là việc Trầm hương thường có mặt trong các tác phẩm văn học, trong tín ngưỡng tôn giáo, trong các đền đài.v.v…(theo Nguyễn Hiền và Võ Văn Chi -1991). Theo tài liệu khảo cổ học thì từ thời cổ đại xa xưa ông cha ta đã biết khai thác và sử dụng Trầm hương. Đời nhà Hán (206-220 TCN) nhiều nước trên thế giới đã đến Giao Châu để mua bán mà chủ yếu mua các sản vật từ Phương Nam đặc biệt quý hiếm như sừng Tê Giác, Ngà Voi, Trầm hương... Từ thế kỷ thứ X, thời vua Đinh Tiên Hoàng đã biết dùng Trầm hương để đóng những chiếc rương đựng gia bảo như Long Bào của Hoàng Đế. Trầm hương còn là sản vật dùng để cống nộp hoặc là tặng phẩm của vua chúa ở nhiều nước trên thế giới. Như là ở các nước Đông Nam Á, Ấn Độ, IRan, IRắc, Hy Lạp.v.v… Những người theo đạo Phật, đạo Hồi, đạo Ky Tô… đều tôn sùng Trầm hương trong những buổi cúng lễ. Hầu hết các tín đồ theo các đạo kể trên đều coi Trầm hương là vật linh thiêng, giao lưu truyền cảm giữa người sống và cõi tâm linh. Trầm hương đã được đề cao đặc biệt trong văn học Phương Đông cũng như trong nền văn học Việt Nam, cả văn học dân gian cũng như văn học chính thống. Như Nguyễn Du đã nói đến Trầm hương trong Truyện Kiều, Nguyễn Gia Thiều trong “Cung Oán Ngâm Khúc” v.v… và cả trong tục ngữ ca dao. Ngày nay cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật con người không ngừng tôn vinh giá trị của Trầm hương. Đó là việc chiết xuất tinh dầu Trầm để làm nước hoa đã và đang được rất nhiều phụ nữ trên thế giới ưa chuộng. Việc chiết xuất các chất thứ cấp có trong tinh dầu Trầm để làm dược liệu.v.v… Chính vì những vấn đề đó mà Trầm hương ngày càng có giá trị kinh tế cao. Hình 2.1 Cây Dó bầ u được chọ n làm thí nghiệm H2.4 Vườn cây Dó bầu 2.3. Đặc điểm thực vật của cây Dó bầu. Dó bầu còn có các tên gọi khác nhau dựa vào những sản phẩm của chúng như cây Tok, cây Trầm, cây Trầm hương, cây Kỳ nam.v.v… Theo Nguyễn Hiền và Võ Văn Chi (1991) cây Dó bầu được chính thức đặt tên khoa học và công bố dựa vào những mẫu vật do nhà thực vật học người Pháp là Pierre thu nhập tại đảo Phú Quốc (Việt Nam) và núi Aral tỉnh Samrongtong (Cambodia) vào tháng 5 – 1870. Pierre đã dựa vào tên Cambodia là Krasna để đặt cho cây Dó bầu là Aquilaria crassna nhưng đó chỉ là tên trần chưa có bảng mô tả và việc công bố chưa được hợp thức hoá. Sau đó Henri Lecomte trong bộ sách Thực Vật Chí Đông Dương lần đầu tiên mô tả các loài thuộc chi Aquilaria ở Đông Dương và công bố chính thức trong thực vật học của Pháp năm 1914 và xếp chi này vào họ Trầm. Phạm Hoàng Hộ (1992) trong công trình gần đây nhất xác nhận ở Việt Nam, chi Aquilaria thuộc họ Trầm hương có ba loài được định danh là: Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte: Dó bầu, Trầm ; ghi nhận ở Phú Khánh, Bảo Lộc và Phú Quốc. Aquilaria baillonii Pierre ex Lecomte Dó baillon; ghi nhận ở rừng dầy ẩm Bình Trị Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng. Aquilaria banaensae PhạmHoàng: Dó Bà Na; ghi nhận ở rừng dầy ẩm Quảng Nam, Đà Nẵng. Các tác giả khác như GS. Lê Văn Ký (1993), các tác giả trong quyển “Cây Gỗ Rừng Việt Nam Tập IV” (1991); “Phân Loại Thực Vật” (Nxb Giáo dục, 1972” và “Danh Mục Thực Vật Tây Nguyên” của đoàn điều tra thực vật (1984) đã ghi nhận cây Dó bầu với tên khoa học Aquilaria agallocha Roxb. Tuy nhiên, theo Vũ Văn Chiên (1976) trong “Tóm tắt đặc điểm họ cây thuốc” thì Aquilaria agallocha Roxb chỉ có ở Ấn Độ không có ở Việt Nam, không ghi nhận trong quyển “Thực vật chí Đông Dương” của Henri Lecomte. Một số công trình nghiên cứu khác như: “Định danh Dược thảo và Dược liệu Đông Y” của đoàn Dược sĩ Việt Nam (xuất bản ở Sài Gòn, 1973” và “Những cây Thuốc vị thuốc Việt Nam” (Nxb. Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội 1981) lại cho rằng Aquilaria agallocha Roxb là đồng danh của Aquilaria crassna Pierre. Ngoài ra những đặc điểm quan trọng về thực vật học của cây Dó bầu được nhiều tác giả ghi nhận như sau: Dó bầu là một loại cây gỗ lớn, tán thưa, cao khoảng 20m (cũng có thể đạt 40m). Đường kính ngang ngực 40-50cm (có thể đạt 80cm). Vỏ mỏng khoảng 2- 4mm, trong Vỏ có nhiều sợi dài, bền. Lá đơn, mọc cách, hình ngọn giáo, dài 6-15cm, rộng 2-3cm, đầu mũi nhọn. Hoa tự hình tán, mầu trắng. Quả mang hình trứng ngược, dài 3-5cm, rộng 2-3cm, có nhiều lông. Khi chín khai thành hai mảnh, và có từ một đến hai hạt mầu đen. Trái chín vào khoảng tháng 7- 8. Gỗ có mầu trắng hoặc vàng nhạt, không phân biệt rác lõi, gỗ nhẹ, mềm. Trong gỗ có cấu tạo đặc biệt là Libe xen gỗ (Đây là một trong những hiện tượng đặc biệt để nghiên cứu sự tạo Trầm). 2.4. Đặc điểm sinh thái. Trong những năm gần đây, một số tác giả đã đề cập rải rác trong nhiều báo cáo nghiên cứu các vấn đề sinh thái và phân bố của cây Dó bầu (Vũ Văn Cầu và Vũ Văn Dũng ,1987). GS. Lê Văn Ký cho biết Dó bầu phân bố ở nhiều nơi trên lãnh thổ Việt Nam, và nhiều nước Châu Á nhiệt đới khác như Lào, Cambodia, Ấn Độ v.v… Ở Việt Nam cây Dó bầu mọc rải rác ở nhiều tỉnh từ Bắc đến Nam như: Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Tuyên, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng. và hầu hết các tỉnh phía Nam. Nhưng tập trung nhiều nhất là ở các tỉnh Duyên hải và huyện đảo Phú Quốc. Nhìn chung, Dó bầu là loài thực vật ưa sáng, mọc rải rác trong các khu rừng nhiệt đới, mọc ở độ cao từ 50-1200m. Nơi cao nhất được tìm thấy ở núi ChuYang Sinh thuộc tỉnh Daklak của Việt Nam. Thường thì cây Dó bầu mọc riêng lẻ nhưng cũng có khi tìm thấy được một nhóm 5-6 cây mọc gần nhau. Theo Lê Mộng Châu và ctv H2.5 Quả Dó bầu còn non H2.6 Quả Dò bầu khi chín (1995), Dó bầu là loại cây mọc nhanh, lượng tăng trưởng được ghi nhận là 1- 1.2m/năm về chiều cao, và 1.2-1.5cm/năm về đường kính. Cây được 8 tuổi trở lên có khả năng cho hoa kết quả. Dưới tán rừng thứ sinh cây Dó bầu tái sinh kém. Thường thì gặp cây Dó bầu tái sinh ở những khoảng trống trong rừng như bìa rừng ven những con đường mòn… Ngoài ra thì Dó bầu cũng có khả năng tái sinh bằng chồi rất tốt. Việc nhân giống bằng phương pháp chiết cành, ghép cành, có tác động của thuốc kích thích cũng được thực hiện, nhưng cho đến nay vẫn chưa có công trình nào được công bố. 2.5. Tình hình khai thác Trầm hƣơng trong thiên nhiên. Trầm hương, Đinh hương, Nhục quế, Dầu thơm, Thuốc xức… xuất hiện rất sớm trên thị trường cùng với muối ăn. Trong đó Trầm hương được xem là mặt hàng quí giá nhất do có những công dụng đặc biệt trong đời sống cũng như trong các tín ngưỡng tôn giáo. Ở Việt Nam, việc khai thác và sử dụng Trầm hương đã có từ rất lâu đời. Vào thời Bắc thuộc, nhà nước phong kiến phương Bắc hàng năm buộc nhân dân ta phải cống nạp các sản vật quí giá như Ngà Voi, Sừng Tê Giác, Ngọc Trai, Yến Sào… Trong đó có cả Trầm hương. Dưới triều nhà Nguyễn, việc khai thác Trầm hương được nhà nước quản lý hết sức chặt chẽ. Đối với những vùng có nguồn Trầm hương để khai thác, triều đình cắt đặt các đội canh tuần và buộc những người đi điệu vào rừng lấy Trầm về cống nạp. Vào thời Pháp thuộc, lệ bắt dân lấy Trầm nạp cho vua quan được bãi bỏ, nhưng bù vào đó chính quyền thực dân Pháp tăng cường kiểm soát việc chặt đốn cây Dó bầu để khai thác Trầm. Sau năm 1975, do trải qua mấy chục năm chiến tranh, các khu rừng gỗ quý bị bom đạn tàn phá nặng, nhiều cây Dó bầu bị bệnh, bị bom đạn hủy hoại lại sản sinh ra những loại Trầm kỳ rất tốt. Các địa phương có trữ lượng Trầm hương tương đối tập trung như Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Đắc Lắc, Gia Lai, Kontum và đảo Phú Quốc được chính phủ cho phép khai thác và xuất khẩu Trầm hương để thu hút ngoại tệ và đổi một số máy móc thiết bị mà địa phương đang cần. Những đội công nhân chuyên nghiệp được thành lập để khai thác Trầm hương, nhưng thực tế số lượng những đội khai thác lâm sản của nhà nước tại các địa phương lại quá ít ỏi so với nhu cầu. Trong thời kỳ này, sự khai thác Trầm hương phần lớn qua đường dây của thương buôn cá thể. Trầm hương của nhà nước thu mua, một phần được sử dụng để sản xuất dược liệu, phần khác thì xuất khẩu qua Singapore, Hồng Kông, Nhật Bản… Đến cuối thập niên 1990, nguồn Trầm hương tự nhiên ở Việt Nam gần như cạn kiệt và để bảo vệ nguồn tài nguyên quốc gia, Chính phủ đã cấm hẳn việc khai thác, mua bán Trầm hương và xem đó là hàng quốc cấm. Trong tự nhiên, không phải bất kỳ cây Dó bầu nào cũng có Trầm và Kỳ. Thông thường chỉ có 1/10 những cây trưởng thành có đường kính thân trên 20cm là có khả năng tạo Trầm, đó là những cây bị bệnh sau một thời gian từ 10 đến 20 năm hoặc lâu hơn. Do đó, từ xưa đến nay, công việc tìm kiếm Trầm hương và Kỳ nam là một công việc nhiều khó khăn gian khổ. Những người đi tìm Trầm phải mất nhiều tháng trời luồn rừng lội suối vào tận rừng sâu núi thẳm để tìm Trầm. Đôi khi họ trở về tay không hoặc phải bỏ mạng ở nơi thâm sơn cùng cốc. Gần đây con người đã chủ động trồng cây Dó bầu để khai thác Trầm hương và chưng cất tinh dầu Trầm. Nhiều công trình khoa học đã nghiên cứu thành công các phương pháp cấy tạo Trầm trên thân gỗ của cây Dó bầu từ đầu những năm 80 của thế kỷ trước và đã mở ra một hướng đi mới cho thị trường Trầm hương trong nước cũng như trên thế giới. 2.6. Trầm và sự tạo Trầm. Mặc dầu số lượng cá thể các loài Aquilaria spp, cũng như nguồn cung cấp đã bị cạn kiệt, nhưng nhu cầu về Trầm hương trong nền thương mại thế giới lại gia tăng đáng kể. Hiện nay các nước tiêu thụ Trầm hương mạnh là Trung Cận Đông và Châu Á, và ngay cả ở Mỹ và châu Âu (TRP, 1997). H2.7 Tinh dầu Trầm H2.8 Trầm hương hinh thành ngoài tự nhiên Theo Vũ Văn Cần và Vũ Văn Dũng (1978) có thể phân loại nguồn gốc hai loại Trầm là Trầm sinh (Trầm lấy từ cây sống) và Trầm rục (Trầm lấy từ cây đốn hay cây chết đổ lâu ngày). Trầm sinh từ cây còn sống thường có mầu sáng. Ngược lại Trầm rục thì thường có mầu cánh dán, hay đen xỉ. Thường người ta lấy Trầm rục từ gốc hoặc rễ. Giá Trầm sinh thường cao hơn Trầm rục từ 2-3 lần và trên mỗi cây có Trầm có thể thu hoạch được từ 5-10kg Trầm. Ngoài ra phần gỗ xung quanh khối Trầm kỳ cũng bị biến đổi ít nhiều với sự xuất hiện rải rác các chỉ Trầm xen kẽ với sớ gỗ, thường gọi là Tok trong tiếng Khmer. Tok khi cháy cho mùi hương thơm và được dùng làm Nhang Trầm.Theo Phillips (1997), các dạng Trầm và sản phẩm của Trầm được ghi nhận trên thị trường là: Trầm mảnh, Trầm bóng, Trầm vụn và bột Trầm, Trầm bánh, tinh dầu Trầm (Dùng làm hương liệu và dược liệu). Việc phân tích Trầm và tinh dầu Trầm đã được Erhartdt, Lê Công Thuân và Hopwood (1997) thực hiện bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp với khối phổ (Gas Chromatography/Mass Spectrometry). Ghi nhận có hai sesquiterpen tồn tại phổ biến trong gỗ cũng như trong tinh dầu, đó là (+) –Aromadendrene và –Selinene. Tuy nhiên, Selinene không xuất hiện trong mẫu gỗ Trầm chất lượng thấp. Một mặt khác, Guaiene, một Sesquiterpene khác có trong mẫu gỗ Trầm tự nhiên nhưng chỉ gặp trong mẫu tinh dầu, trong khi Guriunene, một đồng phân của Aromadendrene có nhiều trong các mẫu tinh dầu nhưng không thấy trong mẫu gỗ tự nhiên. Cho đến hiện nay có một vài công trình nghiên cứu về sự tạo Trầm, tuy nhiên, việc vận dụng các hiểu biết một cách chắc chắn về cơ chế tạo Trầm để sản xuất Trầm một cách bền vững vẫn đang là thử thách đối với các nhà khoa học. Lý do là cho đến nay, chưa có thực nghiệm hoàn chỉnh nào, mặc dù có rải rác vài công trình đã được tiến hành trên những cây Dó bầu còn non trồng trong môi trường được kiểm soát. Theo Phạm Hoàng Hộ (1985) Dó bầu có Trầm là cây Dó bầu bị bệnh. Nguồn gốc của bệnh đó chỉ mới được biết trong những năm gần đây. Khảo sát của Julaluddin (1977) cho rằng vùng Tok Trầm chứa một loại nấm được xác định là Cryptosphaeria mangifera. Ông đã xác định bằng cách cho những cây Dó bầu lành mạnh nhiễm nấm. Sau một thời gian, vùng bị nhiễm trở nên sẫm màu và trở thành Tok rõ rệt và khi đốt cũng toả mùi Trầm rõ rệt. Tuy nhiên đó chỉ là những tín hiệu bước đầu của sự hình thành Trầm. Việc nghiên cứu này còn quá ngắn để đi đến giai đoạn Trầm kỳ. Trầm có thể xuất hiện trên cây Dó bầu đã to hay còn nhỏ. Trong thực tế, có nhiều cây Dó bầu đã to, với đường kính 50-60cm nhưng không có Trầm. Ngược lại, có những cây Dó bầu đường kính mới chỉ có 15cm đã có Trầm. Các thí nghiệm gần đây cho thấy có thể kích thích tạo Trầm ở những cây Dó bầu trồng ở 4-5 năm tuổi. Tuy nhiên, trên những cây Dó bầu to, già cỗi Trầm xuất hiện nhiều hơn. Theo kinh nghiệm dân gian, có thể phân biệt cây đã có Trầm qua một số đặc điểm hình thái của cây và điều kiện hoàn cảnh nơi mọc như sau:  Cây đã lớn đường kính trên 20cm.  Thân cành có u bướu, cây nhiều mắt, cây bị bệnh hoặc bị thương.  Lá cằn cỗi, màu xanh vàng.  Vỏ khó bóc hơn những cây bình thường.  Gỗ màu vàng.  Cây mọc trên đất xấu nhiều sỏi đá. Trong cây Trầm hương xuất hiện ở ba nơi: rễ, gốc, đoạn thân, cành ở độ cao trên 60cm so với mặt đất rất hiếm khi có Trầm hương. Phần nhiều Trầm hương nằm nhiều ở quanh gốc, nhất là ở rễ. Chính vì thế, khi tìm Trầm hương, rễ mọc tới đâu phải đào tới đó. Người tìm Trầm không sợ bị rắn rết cắn vì họ tin rằng khi có Trầm thì rắn rết đã bị đuổi đi hết. Ở Ba Rền (Bình Trị Thiên) đôi khi người ta chặt ngọn cành để cho Trầm hình thành thấp. Gần đây nhất, nhóm nghiên cứu Rừng Mưa Nhiệt Đới Châu Âu kết hợp với trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên và hai tỉnh Kiên Giang và An Giang đã tiến hành một chương trình nghiên cứu nhằm gây tạo Trầm hương trên cây Dó bầu trồng từ hạt ở Phú Quốc. Huỳnh Văn Mỹ (1997) cho biết ở Tiến Phước (Quảng Nam), nông dân đã tự nghiên cứu xử lý kỹ thuật để tạo Trầm trên cây Dó bầu từ 10 năm tuổi trở lên kết Trầm theo ý muốn. Đây là một trong những vần đề mà các nhà khoa học cần nghiên cứu, tổng kết, đánh giá và nhân rộng. 2.7. Tình hình trồng và phát triển cây Dó bầu trong nƣớc. Đã từ lâu chất lượng Trầm hương của Việt Nam nổi tiếng trên thế giới, đây là loại Trầm được hình thành từ thân gỗ của cây Dó bầu (Aquilaria Crassna Pierre ex Lecomte) vốn chỉ có ở Việt Nam và Campuchia. Trầm hương Việt Nam được thị trường thế giới ưa chuộng và mua với gía rất cao trong khi đó nguồn khai thác Trầm hương trong tự nhiên đã cạn kiệt. Kỹ thuật cấy tạo Trầm nhân tạo ngày nay đã trở nên phổ biến với chất lượng không thua kém Trầm trong tự nhiên nhưng với thời gian nhanh hơn (Cây Dó bầu chỉ sau trồng từ 6-7 năm là có thể cấy tạo Trầm và sau thời gian từ 24 – 36 tháng kể từ khi cấy hóa chất là khai thác Trầm). Mặt khác, điều kiện tự nhiên của Việt Nam rất thích hợp để cây Dó bầu sinh trưởng và phát triển. Những nguyên nhân trên đã làm động lực thúc đẩy cho sự phát triển vườn cây Dó bầu ở Việt Nam. Ngày nay nhiều nông dân ở Việt Nam đã làm giàu nhờ vào việc trồng và cấy tạo Trầm hương trên cây Dó bầu (Trung bình, lợi nhuận thu được từ 50 – 150 triệu/ha/năm). Theo số liệu thống kê của “Hội Trầm hương Việt Nam“ tính đến cuối năm 2004 có khoảng 22 tỉnh trong cả nước đã trồng cây Dó bầu với diện tích trên 7.000 hecta trong đó diện tích có thể khai thác Trầm hương vào khoảng 190 hecta. Ở phía Bắc, một số tỉnh như Thái Nguyên, Phú Thọ…vừa bắt đầu trồng trong năm 2004 do đó diện tích chưa cao. Các tỉnh Miền Trung từ Hà Tỉnh cho đến Khánh Hòa đã trồng trên 3.240 hecta, trong đó nhiều nhất là Hà Tỉnh (840 hecta), Quảng Bình (740 hecta), kế đến là Quảng Nam (425 hecta), và còn lại các tỉnh khác. Tây Nguyên tổng diện tích trồng khoảng 1.700 hecta bao gồm các tỉnh Kon Tum (325 hecta), Gia Lai (225 hecta), Đắc Lắc (615 hecta), Đắc Nông (226 hecta) và Lâm Đồng (265hecta). Các tỉnh Miền Đông Nam Bộ trồng được khoảng 1.743 hecta bao gồm Đồng Nai (345 hecta), Tây Ninh (218 hecta), Bình Dương (230 hecta), và nhiều nhất là Bình Phước (950 hecta). Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long gồm có 2 tỉnh An Giang và Kiên Giang (kể cả đảo Phú Quốc) với diện tích trồng khoảng 387 hecta. Theo ước tính, đến năm 2010 diện tích trồng Dó bầu trên cả nước vào khoảng 30.000 hecta, trung bình hàng năm diện tích tăng từ 2.500 – 4.000 hecta. 2.8 Các công trình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc. 2.8.1 Trong nƣớc. Trước nhu cầu ngày càng cao trên thế giới về Trầm hương nguyên liệu, cộng với giá cả ngày một tăng, thiên nhiên ưu đãi.v.v… Hiện nay có rất nhiều dự án của các tổ chức và cá nhân trong và ngoài nước đầu tư vào trồng cây Dó bầu để tạo Trầm. Như ông Nguyễn Ngọc Toàn , chủ tich Hội đồng quản trị công ty FongSan đã đầu tư trồng 60 hecta Dó bầu tại xã An Khương, huyện Bình Long, tỉnh Bình Phước. Đến nay đã được 5 năm tuổi. Hiện nay ông Toàn và ông Sơn đã và đang gây tạo Trầm hương trên những cây Dó bầu này và bước đầu cũng đã thu được thành công. Chính vì vậy mà công ty này đã nhân rộng mô hình này tại nhiều tỉnh thành trong cả nước như: Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Phú Yên, Lâm Đồng, Gia Lai.vv…(theo tài liệu của sở Lâm Nghiệm tỉnh Gia Lai). Ngoài ra ở nhiều tỉnh thành khác trên cả nước nhiều bà con nông dân cũng phát triển và trồng Dó bầu ngay tại những vùng đất của nhà mình. Theo kinh nghiệm dân gian họ tự truyền nhau và mày mò tìm cách tạo Trầm sao cho hiệu quả. Như cấy bột sắt vào cây, cấy mảnh bom, đạn, cho dầu vào các vết thương để dẫn dụ kiến. Khi kiến lên ăn dầu vô tình làm tổn thương cây. Qua quá trình thời gian cây sẽ tạo ra Trầm mắt kiến…. Đề tài điều tra số liệu khai thác Trầm ngoài tự nhiên của 59 cây Dó bầu của Viện Khoa Học Lâm Việt Nam. Trong đó có 13 cây cho Trầm hương có khả năng xuất khẩu chiếm 21%, 21 cây có dấu hiệu hình thành Trầm hương ở các vị trí khác nhau trên cây chiếm 35.6% còn lại 25 cây không có Trầm hương. Đề tài gây tạo Trầm hương bằng tác động cơ giới của Kỹ sư Nguyễn Hồng Lam Trung Tâm Nghiên Cứu Lâm Đặc Sản. Đề tài đã thực hiện trên 54 cây Dó bầu ở độ tuổi từ 6 đến 18 tuổi. Kết quả đối với 27 cây chỉ tác động cơ giới làm tổn thương cây mà không gây tác động gì thêm. Và theo định kỳ 2 năm quan sát một lần. Đối với 27 cây còn lại thì sau khi tác động cơ giới gây tổn thương cho cây, sau đó ta tiến hành phun dung dịch phòng bệnh Benlat 1%. Phun theo định kỳ 2 tháng một lần, và phun trong 3 lần. Kết quả cho thấy đối với 27 cây chỉ tác động cơ giới làm tổn thương mà không phun Benlat thì 2 năm đầu không thấy có dấu hiệu gì. 4 năm, 6 năm, 8 năm sau thấy có 2 cây tạo Trầm hương. Còn 27 cây sau khi gây chấn thương có sử dụng Benlat để phun thì không cho kết quả tạo Trầm hương. Vậy việc tạo Trầm có liên quan đến bệnh lý của cây. Đề tài nghiên cứu khả năng tạo Trầm bằng chế phẩm sinh học (Lt) (Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam. Trung tâm nghiên cứu Lâm đặc sản). Sau khi gây chấn thương bằng tác động cơ giới như đục khoan vào thân cây ở vị trí 0.8m, 1.2m, 1.5m so với mặt đất. Sau đó đưa chế phẩm sinh học vào vết thương. Đề tài tiến hành trên 3 nhóm tuổi khác nhau của cây Dó bầu. Nhóm 1 từ 4-8 tuổi. Nhóm 2 từ 10-14 tuổi. Nhóm 3 từ 16 đến 20 tuổi. Ngoài ra trong phạm vi đề tài còn đánh giá sự tạo Trầm ở rừng trồng tập trung và phân tán. Kết quả cho thấy sự hình thành Trầm ở các nhóm lứa tuổi là như nhau. Sự tạo Trầm bằng chế phẩm sinh học không phụ thuộc vào độ tuổi. Tuy nhiên, với cây có độ tuổi cao hơn đường kính gốc lớn hơn thì cho sản lượng Trầm nhiều hơn. Từ năm 1996 đến năm 1998 GS.TS Trịnh Tam Kiệt (Đại Học Quốc Gia TP HCM) đã phối hợp với tổ chức rừng mưa nhiệt đới quốc tế và các sở Lâm nghiệp các tỉnh Kiên Giang, Lâm Đồng và Quảng Nam triển khai dự án gây tạo Trầm hương trên cây Dó bầu. Dự án đã sử dụng một số chế phẩm sinh hoc, hoá học để gây tạo Trầm hương trên cây Dó bầu trên cơ sở gây chấn thương cơ giới. Cho đến nay các tác giả nay vẫn chưa công bố kết quả đạt được. Từ năm 1996 đến nay, theo yêu cầu của Hội đồng khoa học Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn. Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam. Trung tâm nghiên cứu Lâm đặc sản thực hiện đề tài “Tiếp tục nghiên cứu kỹ thuật tạo Trầm hương trên cây Dó bầu”. 2.8.2. Ngoài nƣớc. Ở Ấn Độ TS. Shiva thì cho rằng kết quả hình thành Trầm hương trong tự nhiên có liên quan đến bệnh lý của cây. Nhưng nguồn gốc gây bệnh thì tác giả chưa có kết luận. Ở Malaysia sau khi tìm hiểu và nghiên cứu về vấn đề tạo Trầm hương ngoài tự nhiên thì tiến sĩ khoa học Julajudin đã đi đến kết luận. Quá trình hình thành Trầm ngoài tự nhiên có liên quan đến bệnh lý của cây. Nguồn gốc hình thành Trầm là do sự cộng sinh của loài nấm Criptophoerica Mangifera với thân gỗ mà thành. (1996) Năm 1989 tiến sĩ Naiyna Thongijem và các cộng sự (Thái Lan) nghiên cứu về vấn đề tạo Trầm cho rằng quá trình hình thành Trầm hương trên cây Dó bầu là kết quả cộng sinh của các loài nấm sau đây Cephalos Potrium, Fusarium, Botriodiplodia, Chactomium. PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Vật liệu thí nghiệm.  Khoan điện 01 cái.  Mũi khoan gỗ có đường kính 10 - 12mm.  Khoan tăng trưởng Pressler  Hai chủng nấm đã được phân lập.  Nấm trắng.  Nấm đen.  Bốn loại hoá chất đã được chuẩn bị từ trước.  Dầu  Cl2  NO3  SO4  Chất phụ gia (bột trơ) 0.5kg.  06 Xilanh loại lớn.  06 ly thuỷ tinh để đựng hoá chất.  Nước cất vô trùng.  Những cây Dó bầu đã được chọn để bố trí thi nghiệm.  Thiết bị định vị toàn cầu GPS.  Thước dây. 3.2. Phƣơng pháp tiến hành. 3.2.1 Khảo sát đo đạc. Tiến hành khảo sát và đo đạc thực địa những cây Dó bầu để tiện cho việc chọn ra những cây, những nhóm cây có đủ tiêu chuẩn để bố trí thí nghiệm như:  Đường kính gốc.  Đường kính thân cách mặt đất 1.3m.  Đường kính của các nhánh cách mặt đất 1.3m.  Chiều cao của cây.  Chiều cao của phân nhánh đầu tiên.  Chiều rộng và chiều dài của lá.  Vị chí địa lý.  Điều kiện thổ nhưỡng.  Môi trường sinh sống.  Nguồn gốc, xuất sứ của cây. Mục đích của việc đo đạc và tuyển chọn một số cây Dó bầu để bố trí thí nghiệm là để khảo sát, đánh giá mức độ tương tác, phản ứng của cây với các nghiệm thức. Kết quả của việc tương tác, phản ứng đó là khả năng hình thành Trầm hương của từng giống cây, từng điều kiện sinh sống, từng nghiệm thức cũng như là từng điều kiện thổ nhưỡng… Để từ đó tìm ra được những giống cây Dó bầu, có khả năng cho Trầm hiệu quả, cùng điều kiện sinh sống thích hợp.v.v… Vì vậy chúng tôi đã tiến hành khảo sát những cây Dó bầu được trồng ở các địa phương khác nhau như: Đảo Phú Quốc tỉnh Kiên Giang., Đại Lãnh tỉnh Khánh Hoá, ở Vỉnh Long và ở Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh. Ở từng địa điểm thí nghiệm ta xác định điều kiện sống, vị trí của từng nhóm cây mà ta thực hiện thí nghiệm, cũng như là nguồn gốc của từng nhóm cây. Ngoài ra với những số liệu đo đạc ngoài thực tế đã giúp cho chúng tôi tính toán, lập sơ đồ, chọn cây để bố trí thí nghiệm trên lý thuyết trước khi đưa ra bố trí ngoài thực tế.  Bảng số liệu khảo sát cây Dó bầu ở Thảo Cầm Viên. Địa điểm: Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh. Ngày lây nhiễm: 15/02/2003. Ngày lấy mẫu: 13/04/2005. Nguồn gốc: Cây có nguồn gốc từ An Giang. Tuổi của cây: Trồng từ năm 1994. Bảng 3.1 Đo số liệu cây ở Thảo Cầm Viên. Tên cây Chiều cao (m) CV/Gốc (cm) CV/Các Nhánh 1.3m (cm) Ghi chú 1 2 3 4 A 11 72 - - - B 15 70 80 - - C 12 72 - -  Bảng số liệu khảo sát cây Dó bầu ở Phú Quốc. Địa điểm: Ấp Suối Cát xã Cửa Dương, Phú Quốc. Toạ độ: N 10019’19.2’’ – E 103058’31.6’’. Ngày lây nhiễm: 07/08/2005. Ngày lấy mẫu: 21/04/2006. Nguồn gốc: Cây có nguồn gốc ở địa phương. Tuổi của cây: Trồng từ năm 1999. Bảng 3.3 Đo số liệu cây ở Phú Quốc. Tên cây Chiều cao (m) CV/Gốc (cm) CV/ Các Nhánh 1.3m (cm) Ghi chú 1 2 3 4 B 5 63 23 16 18 21 C 6 44 26 21 23 - E 5 44 21 27 21 - 3.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu để phân lập vi sinh. Sau khi mẫu được đưa về phòng thí nghiệm thì chúng tôi tiến hành bảo quản mẫu ở tủ mát, và tiến hành xử lý từng mẫu một. Mẫu là khối gỗ lớn, Trầm được hình thành trong lõi của khối gỗ đó. Vì vậy để phân lập vi sinh trước hết phải chẻ khối gỗ để lộ phần Trầm ra ngoài. Khi phần Trầm đã lộ thì tiếp tục phẫu thuật vô trùng để loại bỏ hết phần mẫu vật bị nhiễm từ bên ngoài bằng việc gọt bỏ hết lớp gỗ và lớp Trầm hình thành ở bề mặt ngoài. Khi đã gọt sạch hết lớp gỗ bên ngoài thì tiến hành cắt mẫu bằng dao phẫu thuật vô trùng. Khi cắt mẫu lưu ý cắt cả phần có Trầm và phần gỗ chưa hình thành Trầm. Mẫu được cắt không nên quá lớn cũng không nên quá nhỏ, làm sao cho ta dễ thao tác là được. Tiến hành cắt 10 miếng mẫu nhỏ trong một mẫu lớn có Trầm được lấy về. Rửa mẫu sau khi cắt mẫu, mẫu được cho vào cốc thủy tinh rồi rửa bằng nước cất vô trùng, sau đó lập lại thêm một lần nữa. Tiếp tục rửa mẫu bằng cồn 960 trong vòng một phút. Sau đó lại rửa lại bằng nước cất vô trùng và cũng lập lại hai lần để cho sạch hết cồn. Dùng hai miếng giấy thấm cho khô mẫu vật để chuẩn bị cho việc nuôi cấy. 3.2.3. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy vi sinh. Tiến hành phân lập nấm trên hai môi trường cơ bản là môi trường bột bắp Agar và môi trường PGA.  Đối với môi trường bột bắp Agar. Cân 50g bột bắp đã xay nhuyễn. 20g agar Một lít nước cất vô trùng Cho một lít nước cất với 50g bột bắp vào nồi nấu chín bột bắp. Đối với agar thì cho 20g vào cốc thuỷ tinh loại 500ml sau đó thêm nước cất cho tới 200ml để hoà tan agar. Khi bột bắp đã chín thì tiến hành đổ agar vào và dùng đũa thuỷ tinh khuấy cho đều bột bắp với Agar. Tiếp tục đun cho bột bắp sôi trở lại để cho chín agar. Sau đó tiến hành đổ đĩa hay bình tam giác để giữ mẫu.  Đối với môi trường PGA. Khoai tây sau khi mua về tiến hành rửa sạch, gọt vỏ sau đó rửa sạch lại một lần nữa, rồi cắt khoai tây ra thành từng miếng và cân cho đủ 300g. Cho vào 1 lít nước cất vô trùng và tiến hành đun cho khoai tây chín kĩ. Cân 20g glucose cho vào cốc thuỷ tinh và thêm 100ml nước cất vô trùng để hoà tan. Cân 20g agar cũng cho vào cốc thuỷ tinh có dung tích 500ml và thêm nước cất vô trùng vào cho đủ 200ml để hoà tan agar. Sau khi khoai tây đã chín kĩ tiến hành vớt hết bã khoai tây ra. Cho agar và glucose vào dùng đũa thuỷ tinh khuấy cho đều và tiếp tục nấu cho agar chín. Trong thời gian nấu môi trường thì đồng thời chuẩn bị: 20 đĩa Petri vô trùng. 40 ống nghiệm vô trùng. 5 bình tam giác loại 250ml vô trùng. Khi môi trường đã chín thì ta tiến hành đổ môi trường vào 40 ống nghiệm đã chuẩn bị. Phần môi trường còn lại đổ vào các bình tam giác vô trùng, sao cho mỗi bình khoảng 150ml. Nút bình tam giác bằng nút bông không thấm nước có bọc một lớp giấy báo bên ngoài. Sau khi đổ xong môi trường thì tiến hành hấp môi trường để diệt hết những vi sinh vật có trong môi trường. Các ống nghiệm đã có môi trường được gói lại bằng giấy báo và cho vào nồi hấp cùng với các bình tam giác đã có môi trường, tiến hành hấp ở 121 oc trong 15 phút. Sau khi hấp môi trường xong, phần môi trường trong ống nghiệm để đổ thạch nghiêng. Bằng cách cho ống nghiệm nằm nghiêng gối đầu lên một đũa thuỷ tinh hay ống hút. Để một thời gian cho môi trường trong ống nghiệm khô. Sau khi môi trường đã khô cả trong ống nghiệm cũng như trong bình tam giác thì tiến hành bảo quản và theo dõi trong hai ngày xem có sự lây nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài vào không. Nếu có sự lây nhiễm thì tiến hành đổ bỏ môi trường đó, nấu lại môi trường khác. Còn nếu không có sự lây nhiễm thì tiến hành nấu cách thủy đối với những bình tam giác môi trường đến khi môi trường trong bình chảy ra hoàn toàn. Sau đó tiến hành đổ vào đĩa Petri vô trùng đã được chuẩn bị từ trước. Lưu ý khi đổ đĩa thì nên đổ trong tủ cấy vi sinh hoặc trên ngọn lửa đèn cồn để tránh sự xâm nhiễm. Sau khi đổ đĩa thì chúng ta tiếp tục theo dõi trong hai ngày nếu không có sự sâm nhiễm thì mới tiến hành cho cấy mẫu. 3.2.4. Tiến hành cấy mẫu vi sinh. Sau khi đổ môi trường xong chúng ta tiến hành cấy mẫu như sau: Những mẫu đã được cắt nhỏ và thấm cho khô chúng ta tiến hành cấy vào môi trường đĩa Petri. Cấy sao cho mỗi đĩa Petri là 5 mẫu theo hình chữ thập với một mẫu ở tâm. Ta tiến hành làm như vậy với tất cả các mẫu Trầm đã được mang về. Đối với các mẫu Trầm đã cấy xong thì tiếp tục được giữ và bảo quản ở tủ mát, để sẵn sàng cấy lại nếu mẫu cấy bị hỏng Khi đã cấy xong mẫu thì bảo quản mẫu ở tủ cấy và để ở nhiệt độ phòng để theo dõi. Đối với các đĩa không bị tạp nhiễm. Khi các nấm đã mọc nhiều trên mặt đĩa thì ta tiến hành cấy truyền. Còn đối với những đĩa đã xác định bị tạp nhiễm thì đổ bỏ và tiến hành cấy lại. Trên cùng một đĩa các khuẩn lạc khác nhau thì được cấy trên các đĩa môi trường khác nhau. Để phân tách ra thành từng giống nấm riêng biệt (thường thì trên cùng một đĩa có nhiều loại khuẩn lạc cùng mọc). Và cứ tiếp tục cấy truyền đến khi thấy khuẩn lạc là đồng nhất trên mỗi đĩa thì dừng để tăng sinh khối nhằm mục đích định danh nấm. Mặt khác nếu những chủng nấm nào đã thuần thi đem cấy vào môi trường ống nghiệm để bảo quản, giữ mẫu tiện cho việc thí nghiệm và nghiên cứu về sau. Khi các mẫu nấm đã sinh bào tử thì ta tiến hành chuẩn bị định danh nấm. Định danh nấm: Các mẫu nấm đã được phân lập tiếp tục được bảo quản và nuôi cấy đến thời kỳ sinh sản thí ta mới định danh chính xác được các loại nấm. Bằng cách dựa vào cơ quan sinh sản, sợi nấm, hình thức sinh sản. Mỗi loại nấm có một đặc tính riêng ta dựa vào những đặc điểm riêng của từng loài nấm để có thể xác định được các loài nấm khác nhau. Các loài nấm đã định danh được và cả một số loài nấm chưa định danh được vẫn tiếp tục nhân sinh khối. Mục đích của việc nhân sinh khối này là để phục vụ cho các thí nghiệm cũng như phục vụ cho việc nghiên cứu kỹ hơn về sau này. Song song với việc nhân sinh khối thì ta vẫn tiếp tục bảo quản các mẫu nấm trong ống nghiệm để bảo tồn và lưu trữ mẫu. 3.2.5. Đặc điểm định danh một số loài nấm có liên quan đến sự tạo Trấm. Aspergillus spp (Jaladaddin, 1970). Có cuống sinh bào tử gọi là túi đỉnh, túi đỉnh có hình cầu, hình bầu dục hoặc hình thuỳ. Cuống sinh bào tử phát triển từ tế bào khuẩn ty. Đầu túi đỉnh mọc ra các tế bào hình ống gọi là thể bình, thể bình có thể ở dạng đơn hoặc đôi. Các bào tử đơn hình cầu nối tiếp nhau sinh ra từ thể bình. Khi chín các bào tử tách rời ra và phát tán ra môi trường ngoài. Penicillium sp (Jaladaddin, 1970). Bào tử hình cầu hoặc hình trứng, có màu sáng hoặc trong suốt. Bào tử nối tiếp nhau đính lên cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử có thể phân nhánh 1, 2 hoặc 3 tầng trên thể bình. Khi chín bào tử tách rời nhau và rời cuống sinh bào tử để phát tán ra ngoài. Botryodiplodia sp (Gibson, 1977). Bào tử có hình trứng, khi còn non không có màu, trong suốt, không có vách ngăn, khi chín có màu nâu đen bào tử có vách ngăn. Các bào tử được chứa đựng trong một cái túi gọi là Pycnidia. Thường thì các Pycnidia tập trung lại với nhau tạo thành những ổ nấm. Khi chín thì các Pycnidia vỡ ra cho các bào tử phát tán ra ngoài. Cladosporium sp (Blanchette, 2002). Bào tử thường biến đổi từ 1 đến 2 tế bào. Thường bào tử có hình dạng không ổn định hình cầu hoặc hình trứng không đều, hoặc hình trái chanh. Bào tử đính lên cây sinh bào tử. Loại nấm này thường sống ký sinh và hoại sinh trên thực vật bậc cao. Diplodia sp (chưa biết tác giả tuy nhiên có nhiều tài liệu nói đến khả năng tạo Trầm từ nấm này). Có bào tử đơn khi còn non trong suốt, khi chín có màu nâu đen và có vách ngăn. Bào tử có hình trứng hoặc hình bầu dục. Khi chưa chín bào tử nằm trong Pycnidia. Các Pycnidia mọc đơn độc không mọc thành cụm như Pycnidia của Botriodiplodia sp. Các Pycnidia cũng chứa ít bào tử. Khi chín Pycnidia vỡ ra cho bào tử phát tán ra ngoài. Bào tử thường ít và đơn độc. Macrophoma sp (chưa biết tác giả) Sinh sản bằng bào tử đơn. Bào tử có màu trong suốt giống như Botriodiplodia còn non. Bào tử cũng bao bọc bởi Pycnidia. Pycnidia cũng mọc đơn lẻ như như Diplodia. Rhizoctonia sp (Gibson, 1977). Khuẩn ty là những tế bào dài không nhân, có vách ngăn giữa các tế bào. Bào tử nhỏ không nhân, thường có màu tối hoặc đen, hình dạng không ổn định. Bào tử được sinh ra từ những khuẩn ty. Trichoderma sp (Gibson 1977). Cuống bào tử đính trong suốt và có nhiều nhánh. Bào tử có một tế bào trong suốt không nhân hình trứng. Thường thì dễ nhận biết bằng sự tăng trưởng nhanh, thường có đốm xanh ở cuống bào tử. Torula sp (Blenchette 2002). Cuống sinh bào tử ngắn, đôi khi không có. Bào tử hình cầu nối tiếp nhau gắn trên đỉnh sinh bào tử, đôi khi có phân nhánh. Bào tử đôi khi có một hoặc nhiều tế bào. Phialophora sp (tác giả Gibson 1977). Cuống bào tử ngắn, đôi khi có nhánh. Có thể bình đôi khi tròn, đầu cuống sinh bào tử hơi bè ra và bào tử mọc ra từ đây. Bào tử hình cầu, bào tử đơn có màu tối. Ngoài ra còn có rất nhiều loài nấm khác có ít nhiều liên quan đến sự tạo Trầm nhưng với giới hạn của đề tài nên chúng tôi chưa thể thống kê hết được. Mong rằng các quý độc giả thông cảm và đóng góp ý kiến xây dựng cho chúng tôi. (Theo Illustrated genera of imperfect fungi của H.L: Barnett division of plant sciences Wets Virginia University Morgantown West Virginia and Barry B. Hunter Department of Biologi California State College California, Pennsylvania). 3.2.6. Khoan cây để bố trí thí nghiệm. Sau khi đã chuẩn bị song các điều kiện cần (chủng vi sinh, hoá chất) thì chúng ta tiến hành bố trí thí nghiệm như sau: Các cây Dó bầu đã được chọn để bố trí thí nghiệm được đánh dấu và khoan vào những vị trí đã được đánh dấu. Việc bố trí các lỗ khoan sao cho theo hình xoắn ốc, vòng quanh theo thân cây từ dưới lên. Sao cho mỗi mũi khoan cách nhau 20cm về chiều cao. Còn về chiều ngang thì tuỳ theo chu vi trung bình của mỗi cây. Chiều ngang được tính theo số đo trung bình của chu vi đoạn cây dùng để khoan chia cho 7 nghiệm thức. Với việc bố trí mũi khoan như vậy thì tất cả các mũi khoan, từng đôi một sẽ không nằm trên một đường thẳng của mạch gỗ. Khi đã tính toán và đánh dấu chính xác vị trí các lỗ cần khoan thì ta tiến hành khoan. Dùng khoan tăng trưởng Pressler để khoan với mũi khoan có đường kính 10 đến 12mm, và khoan sâu vào thân cây khoảng 5 đến 8cm. 3.2.7. Chọn chủng loại nấm và hoá chất để bố trí thí nghiệm. Việc tìm, chọn ra được loài nấm cần cho việc bố trí thí nghiệm trong rất nhiều loài nấm đã được tìm thấy và định danh là một việc tương đối khó và tốn rất nhiều thời gian. Cùng với việc thừa hưởng những thành tựu và kết quả nghiên cứu của những nhà khoa học đi trước ở cả trong và ngoài nước. Kết hợp với những số liệu về chủng loại nấm mà ta phân lập, định danh được ở các mẫu Trầm hương trong nước. Chúng tôi đã chọn được ra hai loài nấm dùng để bố trí vào hai mẫu nghiệm thức vi sinh. Vi sinh vật được chọn là hai loại nấm trắng và đen được phân lập, tuyển chọn từ những mẫu Trầm có ngoài tự nhiên. Hai loài nấm này được phân lập từ những mẫu Trầm hương ngoài tự nhiên ở nước ta nên nó hoàn toàn thích nghi với điều kiện khí hậu, môi trường khi bố trí vào các nghiệm thức. (Phương pháp phân lập chúng tôi sẽ giới thiệu ở phần sau). Đối với hai loài nấm trên thì ta không thể định lượng được vì hai loài nấm mà ta dùng để bố trí thí nghiệm sinh sản bằng bào tử túi (một túi bào tử bên trong có nhiều bào tử nhỏ). Do đó ta chọn những ống nghiệm mà nấm đã mọc kín bề mặt môi trường và đã sinh bào tử. Khi bơm nấm vào nghiệm thức ta bơm cả phần môi trường của nấm trong ống nghiệm. Đối với hoá chất: việc chọn ra 4 loại hoá chất cũng dựa vào cơ sở thực tế. Việc những cây Dó bầu ngoài tự nhiên bị bom, đạn làm tổn thương sau chiến tranh lại cho Trầm kỳ tốt hơn. Đó là một cơ sở khoa học để cho chúng tôi lựa chọn hoá chất. Ngoài ra việc nông dân một số nơi dùng Dầu để bố trí vào vét thương hở của cây để dẫn dụ kiến làm tổn thương cây tạo Trầm mắt kiến… Đó là một trong những cơ sở mà chúng tôi cần nghiên cứu để làm sáng tỏ. Với 4 hoá chất còn lại mỗi loại hoá chất được bơm vào một lỗ khoan mà ta gọi đó là một nghiệm thức. Liều lượng hoá chất được đưa vào một nghiệm thức là 0,2g. Với 0.2g hoá chất thì không thể lấp đầy khoảng không gian của lỗ khoan được, nên ta phải chộn hoá chất chung với bột trơ. (Bột trơ là một loại bột màu trắng không mùi, không gây phản ứng hoá học). Khối lượng của bột trơ cho vào được tính như sau: Thể tích khối lượng bột trơ bằng thể tích lỗ khoan trừ cho thể tích của 0.2g hoá chất Khi tính toán khối lượng bột trơ cần dùng cho mỗi nghiệm thức. Ta cho mỗi loại hoá chất và mỗi loại vi sinh vào một cốc thuỷ tinh sạch rồi thêm bột trơ vào trộn đều. Sau đó cho thêm nước cất vô trùng vào trộn để được một hỗn hợp hơi đặc sệt, vừa đủ lỏng để có thể bơm được vào các nghiệm thức. Khi bơm mẫu ta dùng Xilanh loại lớn 200ml để bơm. Mỗi loại hóa chất và vi sinh cho vào một Xilanh riêng rẽ. Các nghiệm thức được chọn để bơm hoá chất hoặc vi sinh một cách ngẫu nhiên dựa vào bảng ngẫu nhiên bằng việc bốc thăm hai lần như sau: Chuẩn bị hai nhóm thăm. Nhóm thăm thứ nhất đánh số từ 1 đến 7 tương ứng với 7 vị trí khoan trên cây. Nhóm thăm thứ hai ghi tên các nghiệm thức mà ta cần bố trí thí nghiệm. Để có được sự khách quan ngẫu nhiên thì chúng tôi tiến hành bắt một thăm ở nhóm thứ nhất và một thăm ở nhóm thứ hai rồi ghép lại với nhau thì ta được một nghiệm thức bố trí trên cây. Sơ đồ bố trí nghiệm thức cây ở Thảo Cầm Viên : Quy ước về nghiệm thức. Nghiệm thức Vật liệu bố trí 1 Nấm trắng 2 Nấm đen 3 Đối chứng 4 Cl 5 Dầu 6 SO4 7 NO3 Bảng 3.3 Sơ đồ bố trí các nghiệm thức trên cây ở Thảo Cầm Viên Vị trí Tên cây Ghi chú A B C I 7 6 7 II 6 1 1 II 1 4 2 IV 3 3 6 V 2 7 3 VI 4 5 4 VII 5 2 5 Sơ đồ bố trí nghiệm thức cây ở Phú Quốc : Quy ước về nghiệm thức. Nghiệm thức Vật liệu bố trí 1 Cl 2 SO4 3 Dầu 4 Nấm trắng 5 Nấm đen 6 NO3 7 Đối chứng Bảng 3.4 Sơ đồ bố trí các nghiệm thức trên cây ở Phú Quốc Vị trí Tên cây Ghi chú B C E I 7 7 1 II 6 1 3 II 1 2 6 IV 3 6 5 V 2 3 2 VI 4 4 7 VII 5 5 4 Đối với nghiệm thức đối chứng ta chỉ khoan mà không xử lý với bất kỳ tác nhân nào. Sau khi hoàn thành xong việc bơm hoá chất và vi sinh vào các lỗ khoan thì chúng ta tiến hành cắm ống Bio vào các lỗ khoan để tránh cho cây gắn liền vết thương tại đó lại. Khi đã bố trí xong các nghiệm thức thì chúng tôi vẫn tiếp tục theo dõi sự phản ứng của cây với các nghiệm thức cũng như sự sinh trưởng và phát triển của cây. Thời gian khai thác cây để khảo sát sự hình thành Trầm hương ở từng nghiệm thức được ấn định 6 tháng, 12 tháng khai thác một lần để khảo sát. H3.1 Lỗ khoan thí nghiệm H3.2 Nghiệm thức 1 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả quan sát phản ứng của cây sau khi bố trí các nghiệm thức. Sau 1-2 tuần theo dõi thì thấy phần lớn các cây được bố trí thí nghiệm có các phản ứng mạnh mẽ ở các nghiệm thức khác nhau. Đối với các nghiệm thức được bố trí bằng hợp chất hoá học thì có phản ứng mạnh hơn những nghiệm thức được bố trí bằng vi sinh. Ở các nghiệm thức này thì vùng mô chết lớn hơn. Diện tích của vùng mô chết không đồng đều giữa các nghiệm thức cũng như giữa các cây. Trung bình diện tích vùng mô bị chết là 6,5cm*2cm. Đối với các nghiệm thức bố trí bằng vi sinh thì hầu như không có phản ứng. Vùng mô chết quanh các nghiệm thức là do kết quả của quá trình khoan cây mang lại. Do đó có nhiều dấu hiệu hình thành mô mới để hàn gắn vết thương. Kết quả này có được là do sự đối chứng với các nghiệm thức khoan đối chứng, là chỉ khoan mà không tác động gì thêm. Đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây, chúng tôi không đi sâu vào nghiên cứu mà chỉ quan sát những phản ứng biến đổi bên ngoài thì thấy các cây có bố trí thí nghiệm và cây không bố trí thí nghiệm hầu như không có sự biến đổi nào lớn. Đỉnh sinh trưởng của cây cũng như ở các cành của cây được bố trí thí nghiệm vẫn phát triển bình thường như những cây không được bố trí thí nghiệm. Các cành sơ cấp và thứ cấp không bị chết. Tuy nhiên mà lá của cây có bố trí thí nghiệm bị biến đổi hơi vàng và bị xoăn mép. Về khả năng sinh sản khả năng cho hoa của cây có bố trí thí nghiệm và cây không có bố trí thi nghiệm là như nhau. Nhưng khả năng kết trái của cây không bố trí thí nghiệm cao hơn cây có bố trí thí nghiệm là rõ rệt. Đối với một số cây có bố trí thí nghiệm thì cho hoa rất nhiều nhưng đến khi bắt đầu kết quả thì quả non bị rụng nhiều. H4.1 Phản ứng cây sau khi thí nghiệm Qua quan sát bên ngoài thì ta thấy các nghiệm thức hoá học có phản ứng mạnh với cây hơn so với các nghiệm thức vi sinh. điều này cũng đúng với các trường hợp khác. Vi phần lớn các chất có nguồn gốc hoá học cũng cho phản ứng mạnh và nhanh với cây hơn các chất có nguồn gốc từ sinh học. Ngược lại các nghiệm thức bằng sinh học tuy có tác dụng chậm nhưng có tác dung lâu dài và thân thiện với môi trương, không để lại dư lương hoá chất trong các sản phẩm Trầm hương sau này. 4.2. Kết quả hình thành Trầm hƣơng. Sau khi bố trí thí nghiệm từ 8 tháng đến 2 năm thì tiến hành cưa một số cây và khảo sát sự hình thành Trầm hương trong các nghiệm thức. Ở hầu hết các nghiệm thức đều làm các vùng gỗ bị biến bổi màu. Tuy nhiên sự biến đổi màu không đồng nhất giữa các mẫu. Có mẫu cho màu nâu đen, có mẫu cho màu đen, cũng có mẫu chỉ ngả màu vàng nhạt. Diện tích mặt cắt phần gỗ biến đổi m