Nghiên cứu gen dreb5 mã hóa protein liên quan đến quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn ở cây đậu tương [glycine max (l.) merrill]

BÁO CÁO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HÓA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill] NGƯỜI THỰC HIỆN: NGUYỄN HIỆP HÒA NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. CHU HOÀNG MẬU ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NỘI DUNG Mở đầu 2. Tổng quan tài liệu 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 4. Kết quả và thảo luận 5. Kết luận và đề nghị 1. MỞ ĐẦU 1.1 Lí do chọn đề tài Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc cây họ đậu (Fabaceae), đây là một trong những cây lương thực có tầm quan trọng bậc nhất trên thế giới, tuy nhiên đậu tương thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Chính vì vậy vấn đề cải thiện tính chịu hạn của đậu tương có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc nâng cao năng suất. Prorein DREB là nhân tố phiên mã kích hoạt nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tương không phụ thuộc vào ABA, sản phẩm của gen DREB được tìm thấy nhiều khi cây gặp hạn, lạnh và mặn. Trong phân họ DREB ở đậu tương, việc nghiên cứu cấu trúc DREB5 vẫn còn mới mẻ cho đến nay mới có một công trình duy nhất của Chen M và cs (2007) Xuất phát từ các lí do trên chúng tôi đã tiến hànhđề tài luận văn thạc sĩ là: “Nghiên cứu gen DREB5 mã hóa protein liên quan đến quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn ở cây đậu tương [Glycine max (L.) Merrill]”. 1.2. Mục tiêu đề tài So sánh khả năng chịu hạn của các giống đậu tương và xác định đặc điểm về cấu trúc của gen DREB5 ở cây đậu tương. 1.3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương ở giai đoạn cây đậu tương non 3 lá chét; - Thu thập thông tin về gen DREB5, thiết kế mồi để nhân gen DREB5; - Tách chiết RNA tổng số, phiên mã ngược tạo cDNA và khuếch đại gen DREB5 bằng kỹ thuật PCR; - Tách dòng và đọc trình tự gen DREB5 ở cây đậu tương; - So sánh trình tự gen DREB5 của giống đậu tương nghiên cứu với trình tự đã công bố trên GenBank. 1.4. Ý nghĩa khoa học Là cơ sở cho việc thiết kết vector chuyển gen DREB5 ở đậu tương nhằm cải thiện tính chịu hạn. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU *Trong luận văn này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu 29 tài liệu và nhận thấy rằng: -Đậu tương là cây đứng hàng thứ 3 về tầm quan trọng đối với con người, sau lúa và ngô -Đậu tương thuộc nhóm cây chịu hạn kém -Protein của gen DREB tham gia tích cực vào quá trình chống chịu hạn ở thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng -DREB5 thuộc họ gen DREB5 vẫn còn ít được quan tâm nghiên cứu, cho đến nay chỉ có một công trình nghiên cứu duy nhất của Chen M (2007) 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu Bảng 3.1. Danh sách các giống đậu tương nghiên cứu 3.2. Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu Các loại hóa chất, máy móc phục vụ nghiên cứu phân lập gen do các hãng Invitrogen, Fermentas, Bioneer cung cấp. Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện KHSS - ĐHTN; Phòng thí nghiệm Di truyền và SHHĐ - Khoa Sinh - KTNN- Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN và Phòng Miễn Dịch học - Viện CNSH. 3.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng phương pháp gây hạn nhân tạo Phương pháp đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non được xác định theo Lê Trần Bình (1998) [1]. 3.3.2. Phương pháp sinh học phân tử Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Tách RNA bằng AccuZol kit (Bioneer – Hàn Quốc) Kỹ thuật RT-PCR Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng phương pháp gây hạn nhân tạo Phương pháp đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non được xác định theo Lê Trần Bình (1998) [1]. 2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Tách RNA bằng AccuZol kit (Bioneer – Hàn Quốc) Kỹ thuật RT-PCR Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR) Phương pháp tách chiết plasmid Phương pháp xác định trình tự nucleotit 2.3.3.Phương pháp xử lí số liệu Phương pháp thống kê bằng chương trình Excel Phương pháp xử lý trình tự gen 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân tích đặc điểm hình thái, khối lượng của một số giống đậu tương nghiên cứu 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích đặc điểm hình thái, khối lượng của các giống đậu tương nghiên cứu Bảng 3.1. Mầu sắc, khối lượng, kích thước hạt đậu tương nghiên cứu Theo bảng số liệu thì giống có kích thước và khối lượng lớn nhất là ĐT84 và nhỏ nhất là BD84 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.2. Đánh giá khả năng chịu hạn tương đối của các giống đậu tương Bảng 3.3. Chỉ số chịu hạn tương đối của các giống đậu tương Trước khi xử lí han 9 ngày xử lí hạn 15 ngày xử lí hạn 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.3. Kết quả phân lập gen DREB5 từ cây đậu tương 4.3.1. Tách chiết RNA từ lá mầm của các giống đậu tương Hình 4.5. Ảnh điện di RNA tổng số trên gel agarose 1%. Ghi chú : M: chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể l được cắt bằng HindIII. 1 : Xanh tiên đài 2 : ĐT84 3.4.2. Kết quả RT-PCR tạo DNA Hình 4.6 Ảnh điện di DNA sản phẩm của RT-PCR với cặp mồi DREBsoy5F và DREBsoy5R Ghi chú: M: chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể l được cắt bằng HindIII. 1 : Xanh tiên đài 2 : ĐT84 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.4. Kết quả phân lập gen DREB5 từ cây đậu tương 4.4.3. Kết quả dòng hóa sản phẩm gen DRED5 trong vector tách dòng Hình 4.7: Đĩa nuôi cấy xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh. 4.4.4. Kết quả tách plasmid Hình 4.8: Ảnh điện di sản phẩm tách plasmid M: marker Lamda cắt bằng Hind III Hai dòng 1 và 2 là DNA plasmid mang gen DREB5 có kích thước khoảng hơn 0,93kb 4.4.5. Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen DREB5 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.10. Trình tự gen DREB5 ở đậu tương Xanh Tiên Đài – Việt Nam Theo trình tự này gen DREB5 gồm 924bp trong đó mạch nghiên cứu có 207 T, 268 A, 190 G và 259 C 4.4.6. So sánh trình tự nucleotit giữa DREB5 của Xanh tiên đài Việt Nam và DREB5 của EF 583447 trong ngân hành gen có nguồn gốc từ Trung Quốc bằng phần mềm Bioedit 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 EF 583447 ATGCAATTCC CTCACCAATT TGGAACCACA ACAAACTCAC CTTTCCCTCA Xanhtiendai ATGCAATTCC CTCACCAATT TGGAACCACA ACAAACTCAC CTTTCCCTCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 EF 583447 CCCATCTTTC CAAAACCAGC AACACCAGAT GATATCATTT GGGTCTTCCC Xanhtiendai CCCATCTTTC CAAAACCAGC AACACCAGAT GATATCATTT GGGTCTTCCC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 EF 583447 AACAACATAA TAATCTCGCA TATCCACCCA TCATAGCCAG TGATTCTTCT Xanhtiendai AACAACATAA CAATCTCGCA TATCCACCAA TCATAGCCCG AGATTCTTCT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 EF 583447 TCACTTCTAC ATCAACATCA TCATCATCAA CAGCAGCATC AGCAGCACCA Xanhtiendai TCACTTGTAC ATCATCATCA TCAACAACAA CAACAGCATC AGC------- ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 EF 583447 GCAGCAACTT CTTCAGTATT GGAGTGACGC GTTGAATCTA AGTCCAAGAG Xanhtiendai --AGCAACTT CTTCAGTATT GGAGTGGCGC GTTGAATCTA AGTCCAAGAG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300 EF 583447 GAATGTTAAC AAGATTGGGA CCAGATGGAA GGCCATTGTT TAGGCTTCCA Xanhtiendai GAATGTTAAC AAGGTTGGGG CCAGATGGAA GGCCATTGTT TAGTCCTCCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 EF 583447 ACACAGCCCA TAAACACAAC AAAACTCTAT AGAGGAGTGA GGCAACGCCA Xanhtiendai ACACAGCGCA TAAACACAAC AAAACTCTAT AGGGGAGTGA GGCAACGCCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 360 370 380 390 400 EF 583447 TTGGGGGAAA TGGGTCGCTG AAATCCGTCT TCCACGAAAC AGAACGCGTC Xanhtiendai TTGGGGCAAA TGGGTCGCTG AAATCCGTCT TCCACGAAAC AGAACGCGTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 410 420 430 440 450 EF 583447 TCTGGCTAGG CACATTTGAC ACGGCCGAAG ACGCCGCCAT GGCCTACGAC Xanhtiendai TCTGGCTAGG CACATTTGAC ACGGCCGAAG ACGCCGCCAT GGCCTACGAC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 460 470 480 490 500 EF 583447 CGAGAAGCCT TCAAGCTACG AGGAGAGAAT GCTAGACTCA ATTTCCCAGA Xanhtiendai CGCGAAGCCT TCAAGCAACG AGGAGAGAAT GCAAGGCTCA ATTTCCCCGA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 510 520 530 540 550 EF 583447 ATTGTTCCTC AACAAGGACA AAAAAGAAGA ACAACAACAA CAAGAACAAG Xanhtiendai ATTGTTCTTC AACAAGGACA AAAAAG---- -----AACAA GGAGAAGAAG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 560 570 580 590 600 EF 583447 AAGCTTCTTC GCCAGTTCTT TCAGCTATTG CAAAGCAGCA TGAGCCTTCT Xanhtiendai AAGCTTCTTC GCCGGTTCTT TCGGCTATTG CAAAGCAGAA TGAACCTCCT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 610 620 630 640 650 EF 583447 AGTG---AAC ACCGTGACGT CCCCATAGAA GAGTCTAATG AGAATGATTC Xanhtiendai CCTGCCCACC ACCGTGACGT CACGATAGAA GAGTCTAACG AAAATGACTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 660 670 680 690 700 EF 583447 GGGTGACGCC ACGGTGAGCG ATGA---CCA GGTTCATGCT ACTACTGAGA Xanhtiendai AGGTGACGCC ACCGTGAGCG ACGAGGTTCA TGCTCCTGCT GCTACAGCGA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 710 720 730 740 750 EF 583447 GTTCCGAAGG AGTTTCTCAG GAAATGGTTT GGGGAGAAAT GTCTGCATGG Xanhtiendai GTTCCGAAGG GGTTTCTCAG GAACTGGTTT GGGGAGAAAT GTCTGCATGG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 760 770 780 790 800 EF 583447 TTCAATGCTA TTCCTGCTGC TTGGGGTCCT GGTAGTCCCA TGTGGGATGA Xanhtiendai TTCAATGCTA TTCCTGCTGC TTGGGGTCCT GGTAGTCCCA TGTGGGATGA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 810 820 830 840 850 EF 583447 TTTGGATGCC ACCAATAATC TTCTTTGCCA ATCACACATT CCTTTTTCCA Xanhtiendai TTTGGATGCC ACCAATAATC TTCTTTGCCA ATCACACATT CCTTTTTCCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 860 870 880 890 900 EF 583447 ATCCCAATCA ACAAGAACTC AATGATGCTG A--------- GAGACAAGAA Xanhtiendai ATCCCAATCA ACAACAGTTC AATGATGCTG ATGATGCTCA GAGACAGGAA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| .. 910 920 930 940 EF 583447 CAAAACACTG GACCAGGTTA CTTGTGGAAG GATCAGGATT GA Xanhtiendai CAAAACACAG GACCAGGTTA CCTGTGGAAG GATCAGGATT GA Hình 4.11. So sánh trình tự gen DREB5 của giống đậu tương Xanh Tiên Đài của Việt Nam và EF 583447 có trong ngân hàng gen quốc tế từ giống đậu tương của Trung Quốc Theo hình 3.11 chúng tôi xác định được những vị trí khác nhau về trình tự nucleotit như sau: - Gen DREB5 Xanh Tiên Đài của Việt Nam đã không có nucleotit ứng với vị trí từ 193 đến 202 (AGCACCA GC)và từ vị trí 527 đến 535 (AAGA ACAAC)so với EF583447 - EF583447 của Trung Quốc không có nucleotit ứng với vị trí từ 605 đến 607 (CCC) 675 đến 677 (GGT)và từ 882 đến 890 (TGATGCTCA) Theo kết quả này chúng tôi đã xác định được sự tương đồng về trình tự gen DREB5 của hai giống đạt 90,4% ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 EF 583447 MQFPHQFGTT TNSPFPHPSF QNQQHQMISF GSSQQHNNLA YPPIIASDSS Xanhtiendai MQFPHQFGTT TNSPFPHPSF QNQQHQMISF GSSQQHNNLA YPPIIARDSS ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 EF 583447 SLLHQHHHHQ QQHQQHQQQL LQYWSDALNL SPRGMLTRLG PDGRPLFRLP Xanhtiendai SLVHHHH--- QQQQQHQQQL LQYWSGALNL SPRGMLTRLG PDGRPLFSPP  ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 EF 583447 TQPINTTKLY RGVRQRHWGK WVAEIRLPRN RTRLWLGTFD TAEDAAMAYD Xanhtiendai TQRINTTKLY RGVRQRHWGK WVAEIRLPRN RTRLWLGTFD TAEDAAMAYD ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 EF 583447 REAFKLRGEN ARLNFPELFL NKDKKEEQQQ QEQEASSPVL SAIAKQHEPS Xanhtiendai REAFKQRGEN ARLNFPELFF NKDKKE--Q- GEEEASSPVL SAIAKQNEPP  ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 EF 583447 -SEHRDVPIE ESNENDSGDA TVSDD-QVHA TTESSEGVSQ EMVWGEMSAW Xanhtiendai PAHHRDVTIE ESNENDSGDA TVSDEVHAPA ATASSEGVSQ ELVWGEMSAW ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300 EF 583447 FNAIPAAWGP GSPMWDDLDA TNNLLCQSHI PFSNPNQQEL N---DAERQE Xanhtiendai FNAIPAAWGP GSPMWDDLDA TNNLLCQSHI PFSNPNQQQF NDADDAQRQE ....|....| ... 310 EF 583447 QNTGPGYLWK DQD Xanhtiendai QNTGPGYLWK DQD Hình 4.12. So sánh trình tự axit amin của DREB5 ở giống đậu tương Xanh Tiên Đài Việt Nam và giống đậu tương có mã số EF 583447.1 của Trung Quốc có trong ngân hàng gen quốc tế Theo kết quả này Xanh tiên đài của Việt Nam đã không có axit amin ở các vị trí từ 58-60 (ứng với HHQ ), 177,178, 180 (ứng với EQQ). EF 583447 Trung Quốc không có axit amin ở các vị trí 201(ứng với P), 292-294 (ứng với DAD). Sự tương đồng của hai giống về trình tự axit amin đạt 87,8% 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Các giống đậu tương nghiên cứu rất đa dạng về đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng hạt. Hạt của giống địa phương thường có kích thước nhỏ, đa dạng về hình dạng, mầu sắc hạt cũng như mầu rốn hạt, các giống đậu tương lai thường có kích thước lớn hơn. -Các giống đậu tương địa phương có khả năng chịu hạn tốt hơn các giống lai, chỉ số chịu hạn tương đối của giống đậu tương DB là cao nhất (41,03), nhỏ nhất là ĐT84 (21,22). - Đã thiết kế, tổng hợp cặp mồi DREBsoy5F-DREBsoy5R và khuếch đại thành công gen DREB5 từ mRNA của giống đậu tương Xanh Tiên Đài, tách dòng và xác định trình tự gen DREB5 từ giống đậu tương Xanh Tiên Đài, gen có kích thước 924bp - Trình tự nucleotit của gen DREB5 của giống đậu tương Xanh Tiên Đài Việt Nam và trình tự gen DREB 5 có mã số EF 583447.1 của giống đậu tương Trung Quốc có độ tương đồng đạt 90,4%. Trình tự axit amin của protein của hai gen này có độ tương đồng đạt 87,8%. 5.2. Đề nghị Tiếp tục phân tích so sánh trình tự gen DREB5 của giống đậu tương thuộc nhóm chịu hạn tốt với nhóm chịu hạn kém để xác định mối liên quan giữa sự thay đổi trong cấu trúc gen DREB5 với khả năng chịu hạn của cây đậu tương. 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ