Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã táo

nhiều nƣớc, có vị ngọt. Các quả chín vào các khoảng thời gian khác nhau ngay cả khi chỉ trên một cây và có màu lục nhạt khi còn xanh và vàng nhạt khi chín. Kích thƣớc và hình dạng quả phụ thuộc vào các giống khác nhau trong tự nhiên cũng nhƣ loại đƣợc trồng. Quả đƣợc dùng để ăn khi đã chín hoặc ngâm rƣợu hay sử dụng để làm đồ uống. Nó là một loại quả giàu chất dinh dƣỡng và chứa nhiều vitamin C. Khi chƣa chín, lớp cùi thịt có màu trắng, giòn, nhiều nƣớc, vị từ chua tới ngọt, có tính chất làm se nhẹ, tƣơng tự nhƣ ở quả táo tây dại. Quả đã chín ít giòn hơn và chuyển dần sang dạng bột; quả quá chín nhăn nhúm, lớp cùi thịt có màu vàng sẫm, mềm, xốp và có mùi thơm. Lúc đầu hƣơng vị giống nhƣ quả táo tây và dễ chịu nhƣng nó trở thành có mùi xạ kỳ lạ khi đã chín kỹ. Quả chứa một hột cứng hình ôvan hay thuôn dài. Hột chứa 2 hạt hình elip, màu nâu, dài 6 mm. Táo là một trong những loại quả chứa rất nhiều chất dinh dƣỡng quý giá và giúp chữa rất nhiều bệnh nguy hiểm: giảm các bệnh đƣờng ruột, hạ lƣợng cholesterol trong máu, ngăn ngừa bệnh ung thƣ… Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 15 Hình 7: Trái táo (Ziziphus nummularia) Táo cũng giống nhƣ nhiều loại quả khác có rất nhiều pectin đặc biệt là phía trong lõi (Joshi, 2006), nên đƣợc chọn làm cơ chất để nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp PME. Bảng 3: Thành phần pectin của táo và một số loại trái cây Trái cây Pectin (% w/w) Loại pectinase pH Táo Chuối Sơri Cam 0,7 – 0,8 0,5 – 0,6 0,2 – 0,3 0,6 – 0,9 PE – PG PE – PG PE PE 3,5 3,2 3,0 2,2 Nguồn: Bollag, 1991 2.4.2 Giống vi sinh vật Enzyme pectinmethylesterase từ vi sinh vật đƣợc sản xuất dƣới nhiều dạng khác nhau nhƣ dạng thô, dạng tinh khiết, dạng tinh thể. Tuy nhiên, chúng đều đƣợc sản xuất bằng hai phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng rắn và trên môi trƣờng lỏng. PME có thể sản xuất từ nhiều nguồn nấm mốc và vi khuẩn, trong đó Aspergillus niger là một trong những chủng đƣợc sử dụng phổ biến (Schmitz, 2002). Aspergillus niger thuộc lớp nang khuẩn Ascomycetes, bộ cúc khuẩn Plectascales, họ Aspergillaceae. Khuẩn ty có vách ngăn. Trên đầu tế bào hình chai mọc các cuống sinh bào tử đính. Bào tử đính là tập hợp của những khuẩn ty cao xuất phát từ một tế bào lớn. Các nang quả phình to ở nang trên, chổ phình to có dạng hình cầu, hình bầu dục hoặc hình chùy đƣợc gọi là túi định. Xung quanh túi định có rất nhiều những mầm nhỏ gọi là thể bình mọc ra khắp mọi hƣớng, ở phần cuối của các mầm này gọi là các bào tử đính. Các bào tử đính xòe ra nhƣ những bông hoa cúc và mang màu sắc đặc trƣng cho từng loài. Aspergillus niger có bào tử đính màu đen. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 16 Hình 8: Hình dạng nấm mốc Aspergillus niger Nguồn: cialtyID=14 Pectinases từ nguồn nấm mốc, đặc biệt là A. niger, thƣờng đƣợc sử dụng phổ biến trong công nghệ chế biến nƣớc quả, kế đến là cellulases và hemicellilases với doanh số thu đƣợc từ 3 dạng enzyme này xấp xỉ 20% một triệu dollar Mỹ thu đƣợc hàng năm đối với các enzyme công nghiệp khác (Kashyap et al., 2001). Các enzyme này thƣờng đƣợc sử dụng trong sản xuất các loại nƣớc quả trong nhƣ nƣớc táo, lê, nho,… và một lƣợng nhỏ sử dụng trong chế biến các dạng nƣớc quả có độ đục ổn định nhƣ nƣớc chanh, nƣớc mận. A. niger sản xuất nhiều loại enzyme tác động trên phần homogalacturonan của phân tử pectin. Chúng bao gồm pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) và pectin acetylesterase (EC 3.1.1.6), endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15), exopolygalacturonase (EC 3.2.1.67), … Hoạt động của pectin methylesterase cần thiết để tạo ra pectin có độ methylester thấp (pectate), nguồn cơ chất cho polygalacturonase và pectate lyase. Trong khi đó pectin lyase có thể sử dụng cơ chất có độ methyl ester bất kỳ. Hệ enzyme pectinolytic từ A.niger có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và thức uống. Tuy nhiên, các enzyme này thƣờng ở dạng hỗn hợp, gây khó khăn cho việc ứng dụng chúng để tác động nhƣ các loại pectin công nghiệp, nhƣ trong các loại gel thực phẩm. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 17 2.4.3 Môi trƣờng nuôi cấy Quá trình nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger sản xuất enzyme PME có thể đƣợc thực hiện theo cả hai phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt với môi trƣờng rắn và lên men chìm. Trong đó, phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trƣờng hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm. Thông thƣờng, môi trƣờng dạng rắn với nguyên liệu chín là bột cám mì, bã củ cải, bột bắp nghiền, hạt thóc nẩy mầm, trấu và bổ sung thêm một số chất dinh dƣỡng khác (amonium sulfate, amonium chloride, amonium phosfate). Phƣơng pháp này phát triển rất mạnh từ những năm 1970 đến nay. Những ƣu điểm cơ bản của phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt: ­ Dễ thực hiện, quy tr ình công nghệ đơn giản ­ Lƣợng enzyme đƣợc tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thƣờng cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm ­ Sản phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng rắn khi nuôi cấy bằng phƣơng pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau: (i) Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài 10 ÷ 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy, lúc này bào tử bắt đầu trƣơng nở và hô hấp. Ở giai đoạn này có xảy ra nhiều biến đổi: ­ Nhiệt độ tăng rất chậm ­ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa ­ Thành phần dinh dƣỡng bắt đầu có sự thay đổi ­ Khối môi trƣờng còn rời rạc ­ Enzyme mới bắt đầu đƣợc hình thành. (ii) Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài khoảng 14 ÷ 18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: ­ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh, có thể nhìn rõ đƣợc sợi nấm ­ Môi trƣờng đƣợc kết lại khá chặt ­ Độ ẩm môi trƣờng giảm dần ­ Nhiệt độ môi trƣờng sẽ tăng nhanh có thể đạt đến 40 ÷ 45oC ­ Các chất dinh dƣỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hóa mạnh của nấm sợi ­ Các enzyme đƣợc hình thành và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ đƣợc tạo ra nhiều hơn ­ Lƣợng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải đƣợc thông khí mạnh là tốt nhất. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 18 (iii) Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài khoảng 10 ÷ 12 giờ. Lúc này nhiệt độ khối môi trƣờng sẽ giảm dần, cƣờng độ hô hấp giảm dần một cách rõ rệt. Màu sắc của sợi nấm bắt đầu thay đổi và thể hiện màu đặc trƣng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). 2.4.4 Thu nhận enzyme Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme. Chế phẩm này đƣợc gọi là chế phẩm thô vì ngoài thành phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trƣờng và nƣớc có trong môi trƣờng. Tùy theo mục đích sử dụng, có thể dùng chế phẩm thô này ngay không cần qua quá trình tinh sạch. Trong những trƣờng hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzyme. Khi enzyme đƣợc tách hết nƣớc, sinh khối vi sinh vật và thành phần môi trƣờng và chúng ở dạng tinh thể, ta thu đƣợc chế phẩm enzyme sạch. Để thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme PME tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải đƣợc trích ly bằng phƣơng pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối trung tính. Muối trung tính nhƣ amonium sulfate, natri chloride thƣờng đƣợc sử dụng để kết tủa enzyme vì độ hoà tan của muối rất cao, sự kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ, không làm biến tính enzyme, enzyme thu đƣợc có hoạt tính cao hơn so với các enzyme thu đƣợc bằng phƣơng pháp sử dụng dung môi hữu cơ. Tuy nhiên, khi sử dụng muối trung tính cũng có nhƣợc điểm là lƣợng dung dịch dùng gấp 5 ÷ 6 lần dịch chiết enzyme và không thể tái thu hồi đƣợc dung môi. Để đảm bảo chế phẩm enzyme thu đƣợc không mất hoạt tính nhanh, ngƣời ta thƣờng sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp. Độ ẩm cần đạt sau khi kết thúc quá trình sấy thƣờng nhỏ hơn 10 %. Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi, ta thƣờng sấy enzyme ở nhiệt độ 38 ÷ 40oC. Ở nhiệt độ này phần lớn enzyme ít bị biến đổi. Trong trƣờng hợp sấy ở nhiệt độ cao quá 40oC, enzyme rất dễ bị biến tính (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). 2.4.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tổng hợp PME 2.4.5.1 Ảnh hưởng của loại nguyên liệu Thành phần môi trƣờng là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh PME cũng nhƣ các enzyme khác tƣ̀ vi sinh vâṭ . Trong đó , thành phần pectin giữ vai trò rất quan troṇg (Patil, 2006). Hàm lƣợng pectin cao đƣơc̣ biế t đến nhƣ nguồn cơ chất thích hợp cho việc sản xuất pectinase nguồn gốc vi sinh . Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 19 2.4.5.2 Độ ẩm Độ ẩm cao ảnh hƣởng đến độ thoáng khí, thấp quá sẽ kìm hãm sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sợi cũng nhƣ khả năng tạo enzyme. Theo Nguyễn Đức Lƣợng (2004) trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trƣờng là 58 ÷ 60% và phải giữ cho độ ẩm của môi trƣờng ổn định trong quá trình nuôi. Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn độ ẩm thấp hơn 50  55% thì sẽ kiềm hãm sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật cũng nhƣ tạo enzyme (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Khi nuôi cấy trong điều kiện không đƣợc vô trùng tuyệt đối thì độ ẩm môi trƣờng sau khi cấy giống không đƣợc vƣợt quá 60%, vì cao hơn sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. 2.4.5.3 Nhiệt độ nuôi Nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm mốc, kéo theo sự giảm hoạt lực của enzyme. Nấm mốc Aspergillus niger phát triển thích hợp ở nhiệt độ 30oC (Schmitz, 2002). 2.4.5.4 Thời gian nuôi Thời gian nuôi để thu đƣợc lƣợng enzyme lớn thƣờng đƣợc xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tƣợng không mong muốn vì thƣờng làm giảm hoạt tính enzyme. Đối với nấm sợi Aspergillus niger, sự tạo enzyme cực đại thƣờng kết thúc khi nấm bắt đầu sinh đính bào tử (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). 2.4.5.5 pH Khi nuôi cấy bằng phƣơng pháp bề mặt thƣờng ít ảnh hƣởng do môi trƣờng có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi trong quá trình nuôi. Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trƣờng có ảnh hƣởng không nhỏ đến sự phát triển của nấm sợi và sự tạo thành enzyme. pH tối thích của enzyme có nguồn gốc vi sinh vật trong khoảng 4,5 ÷ 5,5 (Trần Xuân Ngạch, 2007). 2.5 MỘT SỐ KẾT QUẢ ĐÃ NGHIÊN CỨU Sun Zhong-Tao (2008) đã nghiên cứu sản xuất pectinase từ hai dòng Aspergillus niger đã đƣợc phân lập trên cơ chất bã táo (apple pomace). Nghiên cứu sản xuất PME từ Curvularia inaequalis trên cơ chất vỏ cam trong môi trƣờng rắn cũng đã đƣợc Afifi et al. (2002) nghiên cứu. Nhìn chung, đăc̣ điểm thành phần cơ chất giàu pectin và điều kiêṇ môi trƣờng là yếu tố chi phối maṇh đến hiêụ quả lên men sinh PME tƣ̀ vi sinh vâṭ. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 20 Với thành phần pectin trong haṭ hƣớng dƣơng là 21,36%, Patil và Dayanand (2006) đã xác nhận tính khả thi của việc sử dụng hạt hƣớng dƣơng trong sản xuất PME từ Aspergillus niger cho cả hai trƣờng hơp̣ lên men rắn và lên men chìm . PME đã đƣợc phân lập bằng việc lên men các dòng Aspergillus (Polizeli, 1991), đặc biệt là Aspergillus niger đã đƣợc khảo sát khá chi tiết với hai phƣơng thức lên men chìm và lên men nổi (Joshi et at., 2006) trên nhiều loại cơ chất khác nhau (Schmitz, 2002). Theo Trần Xuân Ngạch (2007), PME nấm mốc có nhiệt độ hoạt động tối thích trong khoảng từ 30 – 45oC và bị vô hoạt ở 55  62oC và đƣợc hoạt hóa bởi Ca2+ và Mg2+. Phƣơng pháp trích ly PME cũng đƣợc nghiên cứu (Contreras–Esquivel, 1999). Kết quả cho thấy dung dịch NaCl 0,5% và 0,1% đƣợc sử dụng trích ly PME từ vỏ quả chanh (Mexico lime) và vỏ quả lê (prickly pear) cho hiệu quả trích ly cao nhất. Sử dụng bã táo (apple pomace) nhƣ nguồn cơ chất cho sự phát triển của A. niger sinh PME cũng đã đƣợc chứng minh bởi Joshi (2005). Nghiên cứu của Joshi (2006) về việc sản xuất pectin methylesterase (PME) từ Aspergillus niger trên cơ chất bã táo cho thấy, nhiêṭ đô ̣ủ 25oC, điều kiêṇ pH phản ƣ́ng 4,0 và thời gian ủ là 96 giờ là điều kiêṇ tối ƣu cho viêc̣ lên men sinh PME ở cả môi trƣờng rắn (SSF) và cả môi trƣờng chìm (SmF). Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 21 CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 3.1.1 Thời gian địa điểm Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng - Trƣờng Đại học Cần Thơ . Thời gian thực hiện: từ ngày 02/02/2009 đến ngày 05/05/2009. 3.1.2 Dụng cụ - hóa chất 3.1.2.1 Dụng cụ - thiết bị ­ Máy xay sinh tố ­ Máy đo độ ẩm nhanh AD 50 MX ­ Máy đo quang phổ Spectrophotometer (CECIL, UK) ­ Tủ cấy, tủ ủ ­ Pipetman 1mL ­ Thiết bị thanh trùng ­ Máy khuấy từ ­ Bếp gia nhiệt ­ pH kế ­ Dụng cụ thủy tinh thông thƣờng ­ Một số dụng cụ khác 3.1.2.2 Hóa chất ­ NaCl 0,25M ­ Cồn 96° ­ Bromocresol green ­ Amonium sulfate (NH4)2SO4 ­ Pectin táo, DE 70 ÷ 75% (Fluka). 3.1.3 Nguyên liệu táo Táo ta quả tròn, đƣợc mua ở chợ Xuân Khánh để dùng cho các thí nghiệm. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 22 3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu Táo sau khi ép lấy nƣớc, phần bã còn lại đƣợc sấy khô một phần (10 ÷ 11% ẩm). Sau đó, bã đƣợc tách loại nƣớc ở nhiệt độ 60  1 oC đến khi độ ẩm còn 4  1%, trong khoảng 3 ÷ 4 giờ. Bã táo khô đƣợc nghiền thành bột và đóng gói trong bao PE để sử dụng cho các thí nghiệm. 3.2.2 Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng việc sử dụng phần mềm Statgraphic Plus 4.0. Sử dụng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai (ANOVA) để đƣa ra kết luận về sự sai biệt giữa các giá trị trung bình các nghiệm thức. Các số trung bình đƣợc so sánh bằng phƣơng pháp LSD. 3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng giữa tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nƣớc đến khả năng tổng hợp PME của A.niger 3.3.1.1 Mục đích Xác định cơ chất thích hợp và tỷ lệ pha loãng sử dụng cho việc trích ly PME có hoạt tính cao nhất. 3.3.1.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố A: tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nƣớc. A1 = 1: 2 A2 = 1: 3 A3 = 1: 4 A4 = 1: 5 A5 = 1: 6 Số nghiệm thức: 5 Số mẫu thí nghiệm: 5 x 3 = 15 mẫu 3.3.1.3 Tiến hành thí nghiệm Cân 5 g bột táo cho vào bình nón 100 mL, thêm nƣớc với các tỉ lệ khác nhau (1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5 và 1: 6) sau đó thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Làm mát, cho 2 mL huyền phù bào tử với mật số cố định là 103 cfu/mL vào mỗi bình cấy và ủ ở Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 23 nhiệt độ phòng trong thời gian 96 giờ. Đo độ ẩm đạt đƣợc của mỗi bình để làm thông số theo dõi. Tỉ lệ bột táo và nƣớc cho enzyme PME có hoạt tính cao nhất sẽ đƣợc chọn sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 9: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng giữa tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nƣớc đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc 3.3.1.4 Chỉ tiêu theo dõi Độ ẩm môi trƣờng và hoạt tính của PME (U/mL) tƣơng ƣ́ng với tƣ̀ng nghiêṃ thƣ́c thí nghiệm. 3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của thời gian ủ đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc Aspergillus niger 3.3.2.1 Mục đích Xác định thời gian ủ thích hợp cho nấm mốc phát triển sinh tổng hợp PME đạt hiệu suất và hoạt tính cao nhất. Môi trƣờng Pha loãng Làm nguội Nuôi cấy vi sinh vật Thu nhận enzyme Aspergillus niger Ủ Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase Thanh trùng A1 A2 A3 A4 A5 Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 24 3.3.2.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí có một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố B: Thời gian ủ ( giờ) B1= 48 giờ B2= 72 giờ B3= 96 giờ B4=120 giờ B5= 144 giờ Số nghiệm thức: 5 Số mẫu thí nghiệm: 5 x 3 = 15 mẫu 3.3.2.3 Tiến hành thí nghiệm Cân 5 g bột táo cho vào bình nón 100 mL, thêm nƣớc theo tỉ lệ tối thích ở thí nghiệm trên. Sau đó tiến hành thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Làm mát các bình này sau khi thanh trùng, kế đến cho 2 mL huyền phù bào tử (103 cfu/mL) vào mỗi bình. Các bình cấy đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo hoạt tính ở các mức thời gian khảo sát. Chọn thời gian tối ƣu nhất sử dụng cho các thí nghiệm sau. Hình 10: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc Môi trƣờng Pha loãng Làm nguội Thanh trùng Thu nhận enzyme Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase Aspergillus niger Nuôi cấy vi sinh vật Ủ B1 B2 B3 B4 B5 Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 25 3.3.2.4 Chỉ tiêu theo dõi Hoạt tính của PME (U/mL) tƣơng ƣ́ng với tƣ̀ng nghiêṃ thƣ́c thí nghiêṃ. 3.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc 3.3.3.1 Mục đích Xác định điều kiện môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp pectinmethylesterase là tốt nhất. 3.3.3.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố C: giá trị pH của môi trƣờng. C1 = 3,5 C2 = 4,0 C3 = 4,5 C4 = 5,0 Số nghiệm thức: 4 Số mẫu thí nghiệm: 4 x 3 = 12 mẫu. Hình 11: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng của pH đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc Môi trƣờng Pha loãng Thu nhận enzyme Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase Aspergillus niger Làm nguội Nuôi cấy vi sinh vật Ủ Thanh trùng Dung dịch đệm citrate Chỉnh pH C1 C2 C3 C4 Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 26 3.3.3.3 Tiến hành thí nghiệm Cân 5 g bột bã táo cho vào bình nón 100 mL, pha loãng với dung dịch đệm citrate theo tỉ lệ tối thích ở thí nghiệm trên. Giá trị pH trung bình sau khi pha loãng đƣợc điều chỉnh về 3,5; 4,0; 4,5; 5. Đem thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau khi làm mát và cấy 2 mL huyền phù bào tử (103 cfu/mL), các bình đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng và thời gian tối thích ở thí nghiệm trên. 3.3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi Hoạt tính của PME (U/mL) tƣơng ƣ́ng với tƣ̀ng nghiêṃ thƣ́c thí nghiêṃ. Giá trị pH của dung dịch đệm cho hoạt tính PME cao nhất đƣợc chọn làm nhân tố cố định cho các thí nghiệm sau. 3.3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của tỉ lệ amonium sulfate (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng sinh PME từ nấm mốc A.niger 3.3.4.1 Mục đích Tìm ra tỉ lệ amonium sulfate bổ sung thích hợp nhất cho khả năng tổng hợp PME từ nấm mốc A.niger. 3.3.4.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố D: Tỉ lệ (NH4)2SO4 bổ sung (tính theo % nitơ) D1 = 0,1% D2 = 0,2 % D3 = 0,3 % Số nghiệm thức: 3 Số mẫu thí nghiệm: 3 x 3 = 9 mẫu. 3.3.4.3 Tiến hành thí nghiệm Cho vào mỗi bình nón 5 g bột bã táo, pha loãng theo tỉ lệ tối thích ở thí nghiệm 1 với dung dịch đệm citrate có pH tối thích ở thí nghiệm trên, và bổ sung amonium sulfate theo các tỉ lệ khảo sát, đem thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó làm mát và cấy 2 mL huyền phù bào tử (103 cfu/mL), đem ủ ở nhiệt độ phòng và thời gian tối thích nhất. 3.3.4.4 Chỉ tiêu theo dõi Hoạt tính của PME (U/mL) tƣơng ƣ́ng với tƣ̀ng nghiêṃ thƣ́c thí nghiêṃ. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 27 Hình 12: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng của amonium sulfate (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc Môi trƣờng Pha loãng Dung dịch đệm Bổ sung (NH4)2SO4 Thanh trùng Làm nguội Cấy vi sinh vật Thu nhận enzyme Aspergillus niger Ủ Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase E1 E2 E3 Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 28 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 ẢNH HƢỞNG CỦA TỈ LỆ PHA LOÃNG GIỮA CƠ CHẤT VÀ NƢỚC Tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc chiếm vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp PME từ nấm mốc. Tỉ lệ pha loãng thích hợp sẽ tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển tối ƣu để sinh PME. Do đó, thí nghiệm đƣợc tiến hành để khảo sát các tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất bã táo và nƣớc khác nhau (1: 2; 1: 3; 1: 4; 1: 5 và 1: 6) đến hiệu quả sinh PME từ A.niger. Ở thí nghiệm này, mật số nấm mốc đƣợc cố định là (103 cfu/mL), thời gian ủ 4 ngày ở nhiệt độ phòng. Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc đến khả năng sinh PME của nấm mốc đƣợc thể hiện qua bảng số liệu 4 và hình 13. Bảng 4: Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc đến khả năng sinh PME Tỉ lệ pha loãng Độ ẩm Hoạt tính (U/mL) 1: 2 1: 3 1: 4 1: 5 1: 6 51,61%  2,89 55,72%  2,50 63,45%  2,85 68,81%  2,61 74,16%  2,16 235,70 c  3,55 325,94 a  8,31 256,67 b  5,67 228,87 c  4,23 211,31 d  4,84 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% . Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại. Giá trị trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại. Từ kết quả của bảng 4 cho thấy, ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc có tác động lớn đến khả năng sinh PME của nấm mốc, thể hiện ở hoạt tính khác nhau. Kết quả cho thấy hoạt tính của A. niger PME tăng từ tỉ lệ pha loãng 1: 2 lên đến giá trị 1: 3 và sau đó lại giảm dần khi mức độ pha loãng tăng đến tỉ lệ 1: 6. Trong đó, tỉ lệ pha loãng 1: 3 cho hoạt tính PME đạt cực đại (325,94  8,31 U/mL) và khác biệt có ý nghĩa khi so sánh với các mức độ cao hay thấp hơn. Độ ẩm là một trong những yếu tố làm cho vi sinh vật tiếp nhận thức ăn dễ dàng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Vì vậy, nếu độ ẩm môi trƣờng không thích hợp thì vi sinh vật sẽ khó tiếp nhận thức ăn, nên không phát triển đƣợc làm kìm hãm sự tổng hợp enzyme. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 29 0 50 100 150 200 250 300 350 400 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 Tỉ lệ pha loãng H oạ t t ín h PM E (U /m L ) Hình 13: Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa nƣớc và cơ chất đến hoạt tính PME Theo Nguyễn Đức Lƣợng (2004) thì khi độ ẩm môi trƣờng cao (từ 60%) thì làm giảm mức độ thoáng khí và cũng tạo điều kiện cho một số vi khuẩn, nấm mốc khác phát triển. Ngƣợc lại, độ ẩm thấp (50%) làm môi trƣờng nuôi cấy khô, nấm mốc không có điều kiện thoáng khí để sinh bào tử, nên hoạt tính enzyme cũng thấp. Tƣơng ứng với tỉ lệ pha loãng của cơ chất bã táo: nƣớc là 1: 3, độ ẩm của môi trƣờng là 55,72 ± 2,50%, thích hợp cho nấm mốc phát triển tối ƣu để tổng hợp nhiều enzyme. Kết quả này trùng khớp với nghiên cứu của Joshi (2006) trên cơ chất bã táo ở tỉ lệ pha loãng 1: 3 là tối ƣu cho sự sinh tổng hợp PME và của Sun Zhong-Tao (2008) với độ ẩm môi trƣờng ban đầu là 55% thì sẽ tạo điều kiện tối ƣu cho nấm mốc phát triển sinh PME có hoạt tính cao. Chính vì thế, tỉ lệ pha loãng của bã táo: nƣớc là 1: 3 đƣợc lựa chọn làm nghiệm thức tối ƣu cho các nghiên cứu kế tiếp. Bên cạnh ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng lên men, các yếu tố khác nhƣ thời gian ủ, pH hay thành phần dƣỡng chất thích hợp cho hiệu quả sinh enzyme hoạt tính cao cũng cần đƣợc quan tâm. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 30 4.2 ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN ĐẾN KHẢ NĂNG SINH PME CỦA NẤM MỐC A. NIGER Thời gian nuôi cấy là một trong những nhân tố quyết định hoạt tính enzyme cao hay thấp do hoạt tính của enzyme phụ thuộc rất lớn vào sự phát triển của tế bào nấm mốc. Do đó, thí nghiệm đƣợc tiến hành để khảo sát thời gian nuôi cấy nấm mốc (48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ và 144 giờ), từ đó tìm ra đƣợc thời gian thích hợp cho nấm mốc phát triển tối ƣu để sinh PME. Trong nghiên cứu này, mật số nấm mốc vẫn đƣợc cố định (103 cfu/mL), tỉ lệ pha loãng của bã táo và nƣớc là 1: 3 để tiến hành khảo sát sự thay đổi hoạt tính PME sinh ra theo thời gian ủ ở nhiệt độ phòng. Kết quả đƣợc tính toán thống kê, thể hiện ở bảng 5 và hình 14. Bảng 5: Ảnh hƣởng của thời gian ủ đến hoạt tính của PME sinh ra từ A. niger Thời gian ủ, giờ Hoạt tính PME (U/mL) 48 72 96 120 144 72,15 e  6,36 139,49 d  6,36 313,45 a  7,73 222,06 b  14,69 202,82 c  9,11 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% . Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại. Giá trị trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại. 0 50 100 1 0 200 250 300 350 48 72 96 120 144 Thời gian (giờ) H oạ t t ín h PM E (U /m L) Hình 14: Ảnh hƣởng của thời gian ủ đến hoạt tính PME sinh ra Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 31 Từ kết quả ở bảng 5 và hình 14 cho thấy, hiệu quả thu nhận PME tăng dần theo thời gian ủ từ 48 giờ (72,15  6,36 U/mL) đến 96 giờ (313,45  7,73 U/mL), sau đó giảm dần. Ứng với thời gian ủ 48 giờ, nấm mốc A. niger ở giai đoạn này bắt đầu thích nghi với điều kiện môi trƣờng nên chúng chƣa gia tăng mật số đáng kể, quá trình sinh tổng hợp enzyme đang ở giai đoạn khởi đầu, dẫn đến hiệu suất và hoạt tính PME thu đƣợc khá thấp. Thời gian lên men phụ thuộc rất nhiều yếu tố nhƣ đặc tính môi trƣờng, giống nấm mốc, hàm lƣợng dƣỡng chất và điều kiện sinh lý quá trình ủ. Theo nghiên cứu của Aguilar và Huitron (1990); Galiotou-Panayotou và Kapantai (1993); Solis-Pereyra et al, (1993); Taragano et al, (1997) cho thấy, thời gian ủ tối ƣu cho quá trình lên men rắn A.niger sinh PME thay đổi trong khoảng 90 đến 120 giờ. Trong giai đoạn này nấm mốc đã hoàn toàn thích nghi với điều kiện môi trƣờng và gia tăng mật số rất nhanh, đồng thời với việc tổng hợp enzyme tăng mạnh. Đây chính là thời điểm tốt nhất để thu chế phẩm enzyme. Vì sau giai đoạn tăng trƣởng nấm mốc sẽ chuyển sang giai đọan suy vong, số bào tử chết đi nhiều hơn số bào tử mới hình thành trong điều kiện cơ chất đã cạn kiệt nên không thể tăng trƣởng đƣợc nữa (Lê Xuân Phƣơng, 2007). Do đó, nếu tiếp tục kéo dài thời gian nuôi cấy thì hoạt tính PME sẽ giảm xuống. Tóm lại, thời gian 96 giờ là thích hợp nhất để thu chế phẩm enzyme, đây cũng là thời gian ủ tối ƣu tƣơng đồng với nghiên cứu của Joshi (2006) trên cơ chất bã táo cũng nhƣ khảo sát của Patil và Dayanand (2006) khi khảo sát khả năng sinh PME từ A.niger với cơ chất là dầu hạt hƣớng dƣơng. 4.3 ẢNH HƢỞNG CỦA SỰ THAY ĐỔI pH MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH PME TỪ ASPERGILLUS NIGER Điều kiện pH của môi trƣờng cũng là một trong những nhân tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh PME của nấm mốc, ở giá trị pH thích hợp nấm mốc sẽ phát triển và gia tăng mật số nhanh chóng nên sinh tổng hợp đƣợc PME có hoạt tính cao hơn. Vì nấm mốc thích hợp trong môi trƣờng acid yếu (Lê Xuân Phƣơng, 2007) nên thí nghiệm đƣợc tiến hành để nghiên cứu ảnh hƣởng của việc thay đổi pH môi trƣờng (ở các mức thay đổi 3,5; 4,0; 4,5 và 5,0) đến khả năng sinh PME từ Aspergillus niger. Trong nghiên cứu này, mật số nấm mốc vẫn đƣợc cố định (103 cfu/mL), để ủ trong 96 giờ ở nhiệt độ phòng, tiến hành khảo sát sự thay đổi hoạt tính PME sinh ra theo pH của môi trƣờng. Kết quả đƣợc trình bày qua bảng số liệu 6 và hình 15. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 32 Bảng 6: Ảnh hƣởng của sự thay đổi pH môi trƣờng đến khả năng tổng hợp PME của A. niger pH dung dịch đệm pH môi trƣờng Hoạt tính PME (U/mL) Nƣớc cất 3,0 4,0 5,0 6,0 Đối chứng (4,8) 3,5 4,0 4,5 5,0 297,42 cd  7,35 331,89 b  8,67 365,56 a  6,36 304,63 c  6,05 286,20 d  8,67 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% . Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại. Giá trị trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 3.5 4 4.5 4.8 5 pH mẫu H oạ t t ín h PM E (U /m L) Hình 15: Ảnh hƣởng của pH đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc Từ số liệu ở bảng 6 và hình 15 cho thấy, tƣơng ứng với pH = 4,0 của môi trƣờng, enzyme PME thu đƣợc có hoạt tính cao hơn so với các pH môi trƣờng khác (365,56  6,36 U/mL). PME thu đƣợc khi lên men ở điều kiện pH môi trƣờng bằng 4,5 có hoạt tính không khác biệt ý nghĩa so với mẫu có pH = 4,8 (mẫu đối chứng) nhƣng lại có hoạt tính cao hơn mẫu có pH = 5. Nhƣ vậy, hoạt tính của enzyme giảm dần khi pH môi trƣờng tăng cao hơn 4,0. Điều này có thể giải thích do vai trò của ion hydro nằm trong thành phần môi trƣờng làm thay đổi trạng thái diện tích của thành tế bào. Tùy theo nồng độ của chúng mà làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu của tế bào nấm mốc (Lê Xuân Phƣơng, 2007). Vì vậy, ở một giá trị pH nhất định thì khả năng sinh trƣởng và phát triển của nấm mốc sẽ đạt tối ƣu. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 33 Ở giá trị pH trong khoảng 4,5 ÷ 5,0, tuy sự hình thành bào tử và giai đoạn tăng trƣởng của nấm mốc không bị ảnh hƣởng nhƣng sự tạo thành enzyme bị kìm hãm (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004) nên enzyme đƣợc tạo thành có hoạt tính không cao. Nghiên cứu của Sun Zhong-Tao (2008) trên cơ chất bã táo cũng cho thấy pH môi trƣờng bằng 4,0 là thông số tối ƣu cho việc sinh tổng hợp các enzyme pectinase của nấm mốc A. niger. Từ các kết quả đã nhận đƣợc qua khảo sát, điều kiện pH môi trƣờng nuôi cấy bằng 4,0 đƣợc chọn lựa là thông số thích hợp cho sự sinh tổng hợp PME từ Aspergillus niger. 4.4 ẢNH HƢỞNG CỦA AMONIUM SULFATE (NH4)2SO4 BỔ SUNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH A. NIGER PME (NH4)2SO4 không chỉ cung cấp nitơ cho môi trƣờng nuôi cấy mà nó còn quyết định giá trị pH của môi trƣờng. Nguyễn Đức Lƣợng (2004) cho rằng khi ion amoni (NH4 +) đƣợc cơ thể vi sinh vật sử dụng, còn lại gốc anion vô cơ (SO4 2- ) sẽ gây acid hóa môi trƣờng. Do đó, việc chọn tỉ lệ (NH4)2SO4 bổ sung thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme có họat tính cao là điều đáng đƣợc quan tâm. Thí nghiệm khảo sát các tỉ lệ (NH4)2SO4 bổ sung (0,1; 0,2; 0,3) đến hiệu quả sinh PME. Trong thí nghiệm này, mật số nấm mốc vẫn đƣợc cố định (103 cfu/mL), cố định pH môi trƣờng là 4,0 để ủ trong 96 giờ ở nhiệt độ phòng để tiến hành khảo sát sự thay đổi hoạt tính PME sinh ra theo tỉ lệ (NH4)2SO4 đƣợc bổ sung vào trong môi trƣờng nuôi cấy. Kết quả thí nghiệm đƣợc ghi nhận ở bảng số liệu 7 và hình 16. Bảng 7: Ảnh hƣởng của tỉ lệ (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng tổng hợp PME của A. niger Tỉ lệ (NH4)2SO4, % Hoạt tính PME (U/mL) 0 (đối chứng) 355,14b  9,72 0,1 359,95 b  9,10 0,2 383,20 a  7,35 0,3 307,84 c  13,39 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% . Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại. Giá trị trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 34 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0% 0.1% 0.2% 0.3% (NH4)2SO4 H oạ t t ín h PM E (U /m L ) Hình 16: Ảnh hƣởng của tỉ lệ (NH4)2SO4 bổ sung đến hoạt tính của PME Việc bổ sung (NH4)2SO4 vào môi trƣờng có ảnh hƣởng đáng kể và làm tăng hoạt tính của pectinase (Sun Zhong-Tao, 2008). Kết quả thí nghiệm cho thấy bổ sung (NH4)2SO4 ở tỉ lệ 0,2% là tối ƣu nhất. Ở tỉ lệ bổ sung này nấm mốc sử dụng tối đa nguồn nitơ và tạo ra pH môi trƣờng thích hợp nên gia tăng mật số nhanh chóng và sinh tổng hợp nhiều enzyme. Ở tỉ lệ bổ sung 0,1% không khác biệt ý nghĩa so với mẫu không bổ sung (NH4)2SO4, có thể do tỉ lệ bổ sung quá ít nên nấm mốc không sử dụng đƣợc nhiều do đó sự gia tăng mật số không khác biệt so với mẫu không bổ sung. Trong khi đó, với tỉ lệ (NH4)2SO4 bổ sung là 0,3%, do hàm lƣợng nitơ khá cao, nấm mốc sử dụng nitơ để gia tăng mật số và phát triển nhanh chóng, nên ít sử dụng thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng, nên mặc dù nấm mốc phát triển nhanh chóng nhƣng chƣa tổng hợp đƣợc enzyme thì đã chuyển sang giai đoạn tử vong. Theo Sun Zhong-Tao (2008), khi hàm lƣợng NH4 + bổ sung quá nhiều dẫn đến hoạt tính của các enzyme pectinse giảm xuống đáng kể. Nghiên cứu của Joshi (2006) cũng cho kết quả tƣơng đồng, ở hàm lƣợng (NH4)2SO4 bổ sung vào trong môi trƣờng nuôi cấy A.niger là 0,2% cho hoạt tính PME sinh ra cao nhất. Vì vậy tỉ lệ bổ sung (NH4)2SO4 là 0,2% đƣợc lựa chọn cho sự sinh tổng hợp enzyme của nấm mốc. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 35 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN-KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Chế phẩm enzyme pectimethylesterase thu đƣợc sau nuôi cấy là chế phẩm ở dạng thô. Trong quá trình nuôi cấy Aspergillus niger thu chế phẩm PME, nếu điều kiện nuôi cấy không đảm bảo thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc sẽ làm giảm khả năng tổng hợp hoạt tính enzyme PME, hay kéo dài thời gian nuôi cấy cũng làm giảm năng suất sản xuất. Kết quả khảo sát cho thấy để nuôi cấy Aspergillus niger sản xuất enzyme pectinmethylesterase đạt hoạt tính cao nhất thì điều kiện môi trƣờng tối ƣu là tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc là 1: 3, điều chỉnh pH môi trƣờng 4,0, bổ sung (NH4)2SO4 theo tỉ lệ 0,2% và tiến hành cấy giống Aspergillus niger (10 3 cfu/mL) trong thời gian 96 giờ sẽ thu đƣợc enzyme pectinmethylesterase có hoạt tính cao nhất. Hoạt tính PME ƣớc đạt đƣợc là 383,20 (U/mL). 5.2 KIẾN NGHỊ Do thời gian nghiên cứu ngắn nên chế phẩm enzyme thu đƣợc là chế phẩm thô chƣa có điều kiện thử nghiệm vào thực tế và cũng chƣa thể khảo sát đầy đủ ảnh hƣởng của những yếu tố khác ngoài tỉ lệ bổ sung (NH4)2SO4 đến hoạt tính xúc tác của PME nên xin đề nghị thêm: Nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố: nhiệt độ, nồng độ pectin, các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ khác bổ sung, các muối khoáng và vitamin bổ sung đến khả năng sinh PME của nấm mốc A. niger. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Tấn Anh (2002). Giáo trình sinh học đại cƣơng A1, NXB: Bộ giáo dục và đào tạo. TP Cần Thơ. Lê Xuân Phƣơng (2007). Sinh lý đại cƣơng vi sinh vật. The VietNam Open Course Ware Project. Việt Nam. Nguyễn Đức Lƣợng (2004). Công nghệ enzyme. NXB: Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa (2002). Enzyme và ứng dụng. NXB: Giáo Dục. Hà Nội. Trần Xuân Ngạch (2007). Công nghệ enzyme, NXB: Đại học Bách Khoa Đà Nẵng. Việt Nam. Tiếng Anh Aehle, W. (2004). Enzyme in Industry – Production and Applications. ISBN 3–527–29592–5. Adams, B. and W. Kirk. (1991). Process for enzyme peeling of fresh citrus fruit. US Patent 5 000 967 Afifi, A. F., E. M. Fawzi., and M. A. Foaad. (2002). Purification and general properties of pectin methyl esterase from Curvularia inaequalis NRRL 13884 in solid state culture using orange peels as an inducer. Acta Microbiol Pol. 51(3): 237–245. Aguilar, G. and G. Huitron. (1990). Constitutive exo-pectinase produced by Aspergillus sp. CH–Y– 1043 on different carbon source. Biotechnology Letters 12, 655±660. Baker, R. A. and L. Wicker. (1996). Enzyme applications for agro-processing in developing countries: an inventory of current and potential applications. World Journal of Microbiology and Biotechnology, Volume 14, Number 5, October 1998 , Pp: 611–619(9). Brett, C. T. and K. Waldron. (1996). Physiology and biochemistry of plant cell walls. Springer. Berlin. Pp: 215–255. Bollag, D. M and S. J. Edelstein. (1991). Protein methods. Willey–LISS , inc. New York. Benen, J. A. E., G-J. W. M. Van Alebeek., A. G. J. Voragen and Visser. (2003a). Pectin esterases. In: Handbook of food Enzymology; Whitaker, J. R., A. G. J. Voragen. and D. W. S. Wong, Eds.; Marcel Dekker, Inc., New York. Pp: 849–856. Bordenave, M. (1996). Analysis of pectin methylesterases. In: Plant Cell Wall Analysis; Linskens, H. F., Eds.; Springer. Berlin. Pp: 165–180. Bordenave, M. and R. Goldberg. (1993). Purification and characterization of pectin methylesterases from mung bean hypocotyl cell walls. Phytochemistry, 33, 99–1003. Camardella, L., V. Carratore., M. A. Ciardiello., L. Servillo., C. Balestrieri., and A. Giovane. (2000). Kiwi protein inhibitor of pectin methylesterase amino-acid sequence and structural mportance of two disulfide bridges. European journal of biochemistry/FEBS 2000; 267(14): 4561–5. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 37 Contreras-Esquivel, J. C., C. Correa-Robles., C. N. Aguilar., J. Rodríguez., J. Romero., R. A. Hours. (1997). Pectinesterase extraction from Mexican lime (Citrus aurantifolia Swingle) and prickly pear (Opuntia ficus indica L.) peels. Food Chemistry 65 (1999). Pp: 153–156. D’Avino, R., L. Camardella., TMIE. Christensen., A. Giovane., L. Servillo. (2003). Tomato pectin methylestarase: Modelling, fluorescence, and inhibitor interaction studies-comparison with the bacterial (Erwinia chrysanthemi) enzyme. Proteins: structure, function, and genetics 53, 830–839. Duvetter, T. (2007). Understanding the role of fungal pectin methylesterase in fruit texture engineering, Docteraasproefschrift Nr. 729 aan de Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen van de KU. Leuven. Joshi, V. K., and R. C. Sharma. (2005). Processing. In: The Apple, K.L. Chadha, R.P. Awasthi (Eds.), Malhotra Publication, New Delhi, India. Pp: 445–498. Joshi, V. K., M. Parmar., and S. Rana. (2006). Pectin Esterase Production from Apple Pomance in Solid-State and Submerged Fermentation. Food Technology Biotechnology 44. 253–256. Giovane, A., L. Quagliuolo., L. Servillo., C. Balestrieri., B. Laratta., R. Loiudice., D. Castaldo. (1995). Purification and characterization of threeisozymes of pectin methylesterase from tomato fruit. Journal of Food Biochemistry 17 (5), 339–349. Kashyap, D. R., P. K. Vohra., S. Chopra., and R. Tewari. (2001). Commercial applications of pectinases: a review. Biores. Technol. 77: 215–227. Liners, F., J-F. Thibault., and P. Van Cutsem. (1992). Influence of the degree of polymerization of oligogalacturonates and of esterification pattern of pectin on their reconition by monoclonal antibodies. Plant Physiology 99. 1099–1104. Lineweaver, H. (1945) Acceleration by electrolytes of alkaline de-esterification by pectin. J. Amer. Chem. Soc. 67, 1292–3. Ly Nguyen, B. (2004). The combined pressure temperature stability of plant pectin methylesterase and their inhabitor. Docteraasproefschrift Nr. 630 aan de Faculteit Bio- iningenieurswetenschappen van de KU. Leuven. Markovic, O. and S. Janecek. (2004). Pectin methyl esterases: sequence-structural features and phylogenetic relationships. Carbohydrate Research 339: 2281–2295. Polizeli, M de L., J. A. Jorge., and H. F. Terenzi. (1991). Pectinase production by Neurospora crassa: purification and biochemical characterization of extracellular polygalacturonase activity. Journal of general microbiology 1991; 137(8): 1815–23. Rexova-Benkova, L. and O. Markovic. (1976). Pectin enzymes. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 33: 323–385. Ridley, B. L., A. Malcolm., O’Neill, D. Mohnen. (2000). Pectins: structure, biosynthesis, and oligogalacturonide-related signaling. Reinikainen, T., H. Kontkanen., M. Tenkanen., R. Fagerström. (2004). Characterisation of steryl esterase activities in commercial lipase preparations. Journal of biotechnology . 108(1): 51–9. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 38 Sajjaanantakul, T. and L. A. Pitifer. (1991). The chemistry and technology of pectin, ISBN 0–12– 733870–5, Academic Press Inc., Harcourt Brace Jovanovich, Publisher. Schmitz, H., H. W. Doerr., D. Kampa and A. Vogt. (2002). Solid-phase enzyme immunoassay for immunoglobulin M antibodies to cytomegalovirus. J. Clin Microbiol. 1977 June; 5(6): 629–634. Sun Zhong-Tao, Tian Lin-Mao and Liu Cheng. (2008). Bioconversion of apple pomace into a multienzyme bio-feed by two mixed strains of Aspergillus niger in solid state fermentation. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717–3458. Patil, S. R. and A. Dayanand. (2006). Production of pectinase from deseeded sun flower head by Aspergillus niger in submerged and solid-state conditions, Bioresource Technology 97. Pp: 2054–2058. Verlent, I., V. L. M. Ann., C. Smout., T. Duvetter., E. H. Marc., Ly-Nguyen B. (2004). Effect of intrinsic and extrinsic factors on the interaction of plant pectin methylesterase and its proteinaceous inhibitor from kiwi fruit. Journal of agricultural and food chemistry 2004; 52(26):8144–50. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang x PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: PHƢƠNG PHÁP TRÍCH LY VÀ PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PME P1 PHƢƠNG PHÁP TRÍCH LY PME Trích ly bằng muối NaCl Để trích ly enzyme, bổ sung dung dịch NaCl 0,25M với tỉ lệ 40 mL cho trung bình 100 g mỗi bình, khuấy gián đoạn trong khoảng 1 giờ. Sau đó lọc hỗn hợp bằng giấy lọc, khi đó dung dịch đƣợc xem là chiết xuất enzyme. P2 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PME P2.1 Xác định hoạt tính PME bằng phương pháp đo mật độ quang (Vilarino et al., 1993) Lấy 1 phần thể tích dung dịch BCG 0,017% (w/v) và 10 phần thể tích dung dịch pectin 0,5% (w/v) và điều chỉnh về pH = 5,1 bằng dung dịch NaOH 0,1M. Lấy 3ml dung dịch đã chỉnh pH cho vào cuvette và tiến hành đo độ hấp thụ bằng thiết bị Spectrophotometer với bƣớc sóng 617 nm, độ hấp thụ Ao đƣợc ghi nhận. Thêm 77L dịch trích enzyme cần đo hoạt tính vào cuvette trên, lắc đều, đo độ hấp thụ A1 sau 30 giây. ∆A617 = Ao – A1 Lƣợng galacturonic acid giải phóng (GA) đƣợc tính toán theo công thức: GA = ∆A617*0.162 Trong đó: GA đƣợc tính bằng mol Hoạt tính PME trong trƣờng hợp này đƣợc tính toán nhƣ sau: Hoạt tính PME = n V GA * 1000* Trong đó: V: Thể tích enzyme sử dụng (L) n: hệ số pha loãng Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xi P2.2 Cách pha dung dịch đệm citrate pH Citric acid 0,1M Natri citrate 0,1M pH Citric acid 0,1M Natri citrate 0,1M 3,0 18,6 1,4 5,0 8,2 11,8 3,2 17,2 2,8 5,2 7,3 12,7 3,4 16,0 4,0 5,4 6,4 13,6 3,6 14,9 5,1 5,6 5,5 14,5 3,8 14,0 6,0 5,8 4,7 15,3 4,0 13,1 6,9 6,0 3,8 16,2 4,2 12,3 7,7 6,2 2,8 17,2 4,4 11,4 8,6 6,4 2,0 18,0 4,6 10,3 9,7 6,6 1,4 18,6 4,8 9,2 10,8 Nguồn: Phạm Thị Trân Châu, 1998 Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xii PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ a Kết quả thống kê thí nghiệm 1 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng đến khả năng sinh PME ANOVA Table for Hoat tinh PME by Ti le pha loang Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 23835.9 4 5958.98 192.01 0.0000 Within groups 310.34 10 31.034 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 24146.3 14 Kiểm Định LSD về ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng đến khả năng sinh PME Multiple Range Tests for Hoat tinh PME by Ti le pha loang -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Ti le pha loangCount Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1:6 3 211.307 X 1:5 3 228.873 X 1:2 3 235.697 X 1:4 3 256.67 X 1:3 3 325.942 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1:2 - 1:3 *-90.245 10.1348 1:2 - 1:4 *-20.9733 10.1348 1:2 - 1:5 6.82333 10.1348 1:2 - 1:6 *24.39 10.1348 1:3 - 1:4 *69.2717 10.1348 1:3 - 1:5 *97.0683 10.1348 1:3 - 1:6 *114.635 10.1348 1:4 - 1:5 *27.7967 10.1348 1:4 - 1:6 *45.3633 10.1348 1:5 - 1:6 *17.5667 10.1348 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. b Kết quả thống kê thí nghiệm 2 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng của thời gian ủ đến khả năng sinh PME ANOVA Table for Hoat tinh PME by Thoi gian Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 98616.6 4 24654.1 280.38 0.0000 Within groups 879.3 10 87.93 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 99495.9 14 Kiểm Định LSD về ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng đến khả năng sinh PME Multiple Range Tests for Hoat tinh PME by Thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Thoi gian Count Mean Homogeneous Groups Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xiii -------------------------------------------------------------------------------- 48h 3 72.1533 X 72h 3 139.493 X 144h 3 202.823 X 120h 3 222.067 X 96h 3 313.453 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 120h - 144h *19.2433 17.0595 120h - 48h *149.913 17.0595 120h - 72h *82.5733 17.0595 120h - 96h *-91.3867 17.0595 144h - 48h *130.67 17.0595 144h - 72h *63.33 17.0595 144h - 96h *-110.63 17.0595 48h - 72h *-67.34 17.0595 48h - 96h *-241.3 17.0595 72h - 96h *-173.96 17.0595 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. c Kết quả thống kê thí nghiệm 3 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng của thời gian ủ đến khả năng sinh PME ANOVA Table for Hoat tinh PME by pH Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 12195.2 4 3048.79 54.15 0.0000 Within groups 562.995 10 56.2995 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 12758.1 14 Kiểm Định LSD về ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng đến khả năng sinh PME Multiple Range Tests for Hoat tinh PME by pH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD pH Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 5 3 286.197 X 4.8 3 297.423 XX 4.5 3 304.637 X 3.5 3 331.893 X 4 3 365.563 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 3.5 - 4 *-33.67 13.6505 3.5 - 4.5 *27.2567 13.6505 3.5 - 4.8 *34.47 13.6505 3.5 - 5 *45.6967 13.6505 4 - 4.5 *60.9267 13.6505 4 - 4.8 *68.14 13.6505 4 - 5 *79.3667 13.6505 4.5 - 4.8 7.21333 13.6505 4.5 - 5 *18.44 13.6505 4.8 - 5 11.2267 13.6505 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xiv d Kết quả thống kê thí nghiệm 4 Phân tích phƣơng sai ảnh hƣởng của thời gian ủ đến khả năng sinh PME NOVA Table for Hoat tinh PME by ti le % nito Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 8985.69 3 2995.23 29.18 0.0001 Within groups 821.107 8 102.638 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 9806.8 11 Kiểm Định LSD về ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng đến khả năng sinh PME Multiple Range Tests for Hoat tinh PME by ti le % nito -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD ti le % nito Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0.3% 3 307.843 X 0% 3 355.14 X 0.1% 3 359.95 X 0.2% 3 383.197 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0% - 0.1% -4.81 19.0753 0% - 0.2% *-28.0567 19.0753 0% - 0.3% *47.2967 19.0753 0.1% - 0.2% *-23.2467 19.0753 0.1% - 0.3% *52.1067 19.0753 0.2% - 0.3% *75.3533 19.0753 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.