Nghiên cứu khả năng tái sinh cây in vitro của một số giống đậu tương

ều cây khác nhau. Cũng trong năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA (Indol Acetic Acid), một hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục. Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công, như Napthyl Acetic Acid (NAA), 2,4 Dichlorphenoxy acetic acid (2,4D). Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4 D giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy. Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin – một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. Năm 1957, Skoog và Miler công bố kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nồng độ các chất auxin/ cytokinin trong môi trường phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi) của mô sẹo ở thuốc lá. Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin như: IAA/ kinetin 1 mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ. Tỷ lệ auxin/ cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh. Từ năm 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển. Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành các tế bào đơn bằng cách sử dụng máy lắc. Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật. Cũng trong năm này, Bergman công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được hầu hết tế bào đơn mà không dính cụm. Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh được tính toàn năng của tế bào. Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt. Đầu những năm 1970, Nagata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia, tạo nên quần thể tế bào trong môi trường lỏng. Năm 1972 Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N langsdorfi Năm 1978, Melcher và cộng sự đã tạo được cây lai soma cà chua – thuốc lá bằng dung hợp tế bào trần. Năm 1979, Marton và cộng sự đã xây dựng được quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng đồng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium. Từ năm 1980 đến 1992, nhiều thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật được công bố, hàng loạt các công trình chuyển gen ngoại lai vào nhiều họ thực vật. Khả năng nhân giống và phục tráng cây trồng được thể hiện rõ rệt trong những ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật. Morel (1960) đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng của các loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm. Khi chia cắt các protocorm và nuôi cấy tiếp thì thu được các protocorm mới. Khi nuôi trong các điều kiện nhất định protocorm có thể phát triển thành cây lan con, tạo ra các dòng vô tính không bị nhiễm virus. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với các cây như: khoai tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác. Năm 1993, Kranz và Lorz thực hiện thụ tinh invitro tạo ra và nuôi cấy phôi hợp tử ở ngô. Các quá trình phát triển và phân hoá của phôi sau đó đã được quan sát dưới kính hiển vi và phân tích biểu hiện của gen nhằm xác định các gen tham gia trong từng giai đoạn phát triển của phôi. Hiện nay, nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ trong việc nhân giống, chọn tạo giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô thực vật đã được đưa vào các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại (Nguyễn Văn Uyển, 1993) [8]. II..1.2.2. Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam Tại Việt Nam, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật bắt đầu từ năm 1975. Phòng nuôi cấy mô đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, Viện khoa học Việt Nam do Tiến Sĩ Lê Thị Muội đứng đầu. Nhận thức được triển vọng to lớn của nuôi cấy mô trong chọn giống và nhân giống cây trồng nông nghiệp, các cơ sở thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia Hà Nội, TP Hồ Chí Minh, một số đơn vị nghiên cứu thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Bộ Lâm nghiệp, Bộ Y tế, Viện nghiên cứu Hạt Nhân đã xây dựng các phòng nuôi cấy mô thực vật, từng bước xây dựng tiềm lực khoa học và đào tạo cán bộ nghiên cứu vào ngành này (Trần Văn Minh, 1999) [7]. Theo Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, 1993 nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã đạt một số thành tựu như sau [8]: - Nhân giống khoai tây (Solanum tuberosum L..) tại Viện Công Nghệ Sinh học. - Nhân giống vô tính cà Phê (họRubiaceae) Nguyễn Thị Quyền, Nguyễn Văn Uyển). - Nhân giống chuối (Mus a spp) - Nhân giống cây bắt ruồi ( Nepenthes madagascariens ) Đoàn Thị Ái Thuyền. - Nhân giống dứa Cayen và Queen Long An. - Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống mía đường (Sacharum offciarum), nhân giống cây Vani (Vanilla sp) bằng nuôi cấy mô (Vũ Mỹ Liên) II.1.3. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng [6]. Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm: - Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành. - Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh. - Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành - Nuôi cấy mô sẹo(callus). - Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào). - Nuôi cấy prôtplast: nuôi cấy tế bào trần. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa vào tính toàn năng của tế bào và dựa vào khả năng phân hoá – phản phân hoá của tế bào. II.1.3.1. Tính toàn năng của tế bào Năm 1902, Haberlandt đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cở thể sinhvật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh đó là tính toàn năng của tế bào [6]. Như vậy, tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào đã được biệt hoá (trừ một số tế bào đã được biệt hoá sâu như ống mạch, mao dẫn) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh mới. II.1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một nhóm chính thể thống bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục biến đổi thành tế bào chuyên hoá đặc biệt cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau. Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, mô dự trữ làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm chức năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất đi khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào. Qúa trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào được biểu diễn dưới sơ đồ sau: Phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Trong đó: + Tế bào hợp tử là tế bào ban đầu. + Tế bào phôi sinh là tế bào chưa có chức năng riêng biệt. +Tế bào chuyên hóa là các tế bào đã mang chức năng riêng biệt [15]. Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gene được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, còn một số gene khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng và phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hoà. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể bình thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của từng khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoá các gen của tế bào. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. * Các giai đoạn trong quá trình nhân giống in vitro +Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị tạo cây mẹ sạch bệnh và nuôi cấy khởi động. + Giai đoạn 2: Chọn mẫu cấy phù hợp cho việc tái sinh nhân nhanh cây. Khử mô nuôi cấy sau khi đã xác định được mẫu cấy bằng (HgCl2, NaOCl, H2O2). Lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp để mẫu phát sinh chồi bất định hoặc phôi vô tính. + Giai đoạn 3: Nhân nhanh. + Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh. + Giai đoạn 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm. II.1.4. Các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật invitro * Nuôi cấy phôi Năm 1921 Dieterich đã đưa ra kết luận là phôi nuôi cấy invitro hoàn toàn có thể nảy mầm không qua giai đoạn ngủ nghỉ dựa trên cơ sở các nghiên cứu của mình. Nhưng môi trường dinh dưỡng cho sự tạo cây ở phôi trưởng thành và phôi non là khác nhau, phôi non cần môi trường giàu dinh dưỡng hơn. * Nuôi cấy mô trong cơ quan tách rời Năm 1946 Wetmare đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi. Với các bộ phận khác nhau trên cây thì nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy cũng rất khác nhau. Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển mô của cơ quan nuôi cấy thì sau một khoảng thời gian nhất định ta phải cấy chuyển sang môi trường mới. Ứng dụng: Nghiên cứu các môi trường dinh dưỡng phù hợp với các bộ phận khác nhau của cây, tạo mô sẹo nhân cây in vitro. * Kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh Thường sử dụng là các mô đỉnh chồi và đỉnh cành có kích thước từ 0,1 mm đến 1,0 mm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành và các cành non. Khi sử dụng các mô phân sinh cần phải cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng. Ứng dụng: Tạo cây sạch virus, nhân giống in vitro tạo cây đa bội thông qua xử lý Conxixin [16]. * Nuôi cấy bao phấn Đã có rất nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp và gián tiếp trung gian qua mô sẹo và tạo cơ quan. Ứng dụng: Tạo các dòng thuần, biểu hiện các gen lặn, cây đơn bội thu được từ nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là nguồn nguyên liệu cho chọn dòng đột biến. * Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần Năm 1960 Cooking sử dụng enzim phân giải tế bào và đã tạo ra một số lượng lớn tế bào trần. Khi tách khỏi mô hoặc quần thể tế bào chúng được nuôi riêng rẽ. Ứng dụng: Là đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu những biến đổi di truyền ở thực vật bằng phương pháp dung hợp 2 loại tế bào trần để tạo các cây lai soma. * Nuôi cấy mô sẹo Các mô đã biệt hóa được tách ra dưới điều kiện thích hợp sẽ phản biệt hóa tạo thành mô sẹo. Có thể sử dụng bất kỳ bộ phận dinh dưỡng nào của cây: Mảnh lá, thân, rễ làm vật liệu nuôi cấy tạo mô sẹo hoặc có thể sử dụng hạt gieo trên môi trường thích hợp đến khi phát triển thân mầm, tiếp tục cắt thân thành những đọan nhỏ và đưa vào môi trường tạo mô sẹo (cà chua). Nên sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất bởi vì tế bào mô sau khi cấy chuyển nhiều lần dễ phát sinh đột biến. * Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dung dịch lỏng (suspension culture). Từ những năm 1959 Tulecke và Nickell đã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô thực vật ở qui mô lớn (134 l) bằng nuôi cấy chìm. Các nhà khoa học đã nuôi tế bào ở qui mô công nghiệp phục vụ sản xuất sikonin chọn tạo các dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp stukonin cao hơn. Công nghệ nuôi cấy tế bào trong các bioreactor dung tích lớn sản xuất sinh dược, thương mại hóa. * Công nghệ tế bào ứng dụng trong chuyển gen vào cây trồng Đưa những gen cần chuyển vào thực vật tạo cây mang những đặc tính mong muốn có thể chưa từng xuất hiện ở loài cây đó, thậm chí trong toàn bộ dòng họ. Những gen chuyển vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống nuôi cấy tái sinh tế bào thành cây invitro sau chuyển gen. Tạo những biến đổi sâu sắc có định hướng trong các tính trạng của cây thông qua biến đổi các protein chủ chốt của tế bào, điều khó đạt được trong phương pháp cổ điển. - Gen cần chuyển phải được di truyền cho thế hệ sau. - Gen cần chuyển phải được thể hiện đúng lúc đúng chỗ. 1.1.5. Thành phần môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy phải cung cấp các nguyên tố quan trọng và các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cây invitro. Sự lựa chọn hay phát triển môi trường nuôi cấy là một bước quan trọng trong bất cứ đề tài nuôi cấy mô tế bào nào. Thành phần môi trường sử dụng bao gồm các yếu tố sau: + Các muối khoáng đa lượng và vi lượng. + Vitamin. + Nguồn cacbon. + Chất hữu cơ. + Các chất điều hòa sinh trưởng (nhóm Auxin, Cytokinin). + Tác nhân làm đông (nếu môi trường nuôi cấy ở thể rắn). * Nguồn Cacbon Khi được nuôi cấy invitro thường thì các tế bào thực vật không có khả năng quang hợp. Do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn Cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào. Nguồn Cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là sucrose, một số trường hợp sử dụng Glucose và fuctozose thay thế cho Sucrose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon đối với cây. Khi khử trùng chú ý không nên để quá lâu để tránh hiện tượng caramen hóa xảy ra làm cho môi trường chuyển sang màu vàng ức chế sự phát triển của tế bào. * Các muối khoáng đa và vi lượng. Với cây trồng thì các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng. Nguyên tố đa lượng gồm N, P, K, Mg, S và Ca. Các nguyên tố đa lượng này thường tồn tại ở dạng muối và tồn tại trong dung dịch. Đây là nguyên liệu để những tế bào hình thành nên cấu trúc của mình. Nguyên tố vi lượng điển hình thường sử dụng như các nguyên tố Fe, Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co. Nhờ các nguyên tố vi lượng này mà cây mới sinh trưởng và phát triển bình thường. Ngoài ra, chúng còn tham gia vào thành phần của enzym xúc tác cho phản ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào. * Các vitamin Ảnh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy invitro ở các loài khác nhau là khác nhau. Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có thể sinh trưởng tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và aminoacid. Trong các loại vitamin, B1 được xem là quan trọng cho sự phát triển của thực vật. Axit nicotinic (B3) và pyridoxune (B6) cũng có thể được bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy tăng cường sức sinh trưởng của mô. * Các chất bổ sung - Glutamin: - Asparagin: * Phytagel: 1.1.6. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính: auxin và Cytokinin, ngoài ra còn có nhóm gibberlin và etylen là nhóm chất điều tiết kích thích sự sinh trưởng phát triển, phân hóa cơ quan. * Nhóm Auxin Các auxin sử dụng có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp bao gồm( IAA, NAA, 2,4D, IBA) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ nhưng nếu sử dụng liều lượng quá cao dễ tạo ra các đột biến. Auxin thường hòa tan trong etanol hoặc NaOH pha loãng [15]. Vai trò: - Kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào. - IAA kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng chồi đỉnh. - IAA (3- irdole aceticacid) đóng vai trò kích thích sự phân hóa của các mô dẫn (xylem và phloem). IAA, IBA, NAA thường được sử dụng cho phát sinh rễ. - Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành dâm và phát sinh chồi phụ có ảnh hưởng khác nhau với sự rụng lá, sự ra hoa đậu quả, sự phát triển và chín của quả. - 2,4D sử dụng rộng rãi cho sự phát sinh mô sẹo. - Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus). - Kích thích tạo chồi bất định ở nồng độ thấp. IAA là Auxin tổng hợp dễ bị phân hủy sau vài ngày khi để ngoài ánh sáng, do đó nên pha dung dịch IAA sau mỗi tuần. * Nhóm Cytokinin - Các Cytokinin có tác dụng kích thích sự phân bào và phân hóa chồi. Trong môi trường nuôi cấy tỷ lệ Auxin/ Cytokinin quyết định sự phân chia tế bào, phân hóa chồi từ mô sẹo, tạo phôi vô tính. - Cytokinin gồm có kinetin, BAP, zeatin, 2iP. + Kinetin (6 - fafurolaminoprrine) hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ chế phẩm ADN có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi. + Zeatin (6 – hydoxy - 3 - methylbut - 2 enl amino purin) thực chất là một dẫn xuất của adenin có tác dụng kích thích sự tạo chồi nhưng giá quá đắt nên ít sử dụng. + BAP (6 - benzyl amino purine) có hoạt tính cao hơn kenitin và bền với nhiệt độ cao, hơn zeatin. + 2ip (Isopentenil- adenine) Chức năng chủ yếu của Cytokinin trong quá trình phân bào là kích thích sự phân chia tế bào, kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy, tăng diện tích phiến lá, tạo chồi bất định (nồng độ cao) ức chế quá trình già hóa, kích thích tạo diệp lục, ức chế sự kéo dài chồi, ức chế sự hình thành rễ, có thể làm tăng sự phát triển mật độ khí khổng ở một số loài [17]. Cytokinin được pha bằng dung dịch HCl loãng. * Gibberilin (GA3): là chất được sử dụng nhiều hơn cả trong nhóm gibberilin có hơn 20 chất. Thường ít thấy sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật bởi nó ức chế sự phát triển mô sẹo và hình thành rễ bất định, do hoạt động của mô sẹo chúng được sử dụng trong nghiên cứu về sự tạo hình. GA3 tan được trong nước nhưng trong môi trường axit, nhiệt độ cao thì GA3 mất họat tính sinh học. Trong môi trường kiềm, GA3 chuyển thành dạng điện phân không hoạt động. * Axit absisic (ABA) Tác dụng: Tạo phôi, kích thích sự chín phôi, kích thích sự phát chồi ở nhiều loài thực vật. Phát huy khả năng chống chọi của tế bào với ngoại cảnh bất thuận ( gây ra đóng khí khổng) sản sinh các yếu tố ức chế mất nước, nhiệt độ thấp. Dung dịch mẹ pha cao gấp 1000 lần (NaOH 1N), ABA khá ổn định với nhiệt độ nhưng rất nhạy với ánh sáng, được pha loãng bằng dung môi nước. * Ethylen Là chất ức chế sinh trưởng gây sự già hóa, rụng lá, quả, làm chín, kích thích nở hoa, sự lão hóa của hoa và lá. Với cây trồng thì các chất khoáng đa lượng và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng . II.2. Lịch sử nghiên cứu cây đậu tương II.2.1. Nguồn gốc lịch sử và phân bố cây đậu tương Cây đậu tương (đậu nành - Glycine max L) có nguồn gốc xa xưa từ Trung Quốc và được sử dụng làm cây thực phẩm phục vụ đời sống con người từ hơn 4000 năm trước. Vào thế kỷ thứ 11 trước công nguyên, người Trung Quốc đã bắt đầu sử dụng đậu tương. Hàng trăm năm sau khi Trung Quốc phát hiện ra những ứng dụng của đậu tương và thuần hóa chúng, các nước khác cũng đua nhau sử dụng đậu tương. Sau đó, khoảng thế kỷ thứ VIII người Nhật Bản đen về trồng trên đất nước mặt trời mọc, rồi tiếp tục được trồng ở một số nước châu Á như: Thái Lan, Malalysia, Hàn Quốc, Việt Nam, Indonesia, Philippines, Việt Nam, Malaysia, Miến Điện, Nepal và miền Bắc Ấn Độ đã bắt đầu sử dụng đậu tương. Đậu nành được sử dụng làm đậu phụ, tào phớ, ép lấy dầu... Trong khi đó, các nước châu Âu khác vẫn chưa biết đến việc sử dụng đậu nành. Cuối cùng, mãi đến thế kỷ thứ XVII, XVIII , đậu nành mới được trồng ở các nước châu Âu và Bắc Mỹ. Và lâu hơn nữa thì hạt đậu tương mới chạm được đến đất Mỹ. Ngày nay, quốc gia đứng đầu về đậu tương với 50% sản lượng toàn thế giới là Hoa Kỳ [4]. II.2.2. Vị trí trong phân loại thực vật [9] Giới (Kingdom) : Plantae Nghành (Phylum) : Magnoliophyta Lớp (Classis) : Magnoliopsida Bộ (Ordo) : Fabales Họ (Familia) : Fabaceae Phân họ (Subfamilia) : Paboideae Chi (Genus) : Glycine Loài (Species) : G. max II.2.3. Vai trò của cây đậu đậu tương Cùng với thời gian, ngày nay cây đậu tương (Glycine Max (L) Merrill) còn gọi là đậu nành càng thể hiện được vai trò vô cùng quan trọng trên nhiều lĩnh vực. Khó có thể tìm thấy một loại cây trông nào có tác dụng nhiều mặt như cây đậu tương. Là cây trồng đã biết đến từ rất lâu, sản phẩm của nó làm thức ăn cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt. Bởi vậy nó được ví là loại "cây kỳ lạ", "vàng mọc từ đất", "cây thần diệu", "cây đỗ thần", "cây thay thịt" hay còn được gọi là "Ông Hoàng trong các loại cây họ đậu"… [5] Quả là đúng khi đánh giá về tầm quan trọng của đậu tương như vậy. Bởi những giá trị toàn diện mà cây đậu tương mang lại. Mà những giá trị kinh tế đó chủ yếu được quyết định bởi các thành phần chứa trong hạt. Hạt đậu tương gồm có protein, lipit, hydrat cacbon, các chất khoáng... Trong đó protein và lipit là hai thành phần quan trọng nhất chiếm khoảng 60% trọng lượng hạt. Theo giáo trình Cây công nghiệp thì trong hạt đậu tương hàm lượng protein chiếm khoảng 40-50% và lipit biến động từ 12-24% tuỳ theo giống và điều kiện khí hậu. Điều này thực sự cho thấy đây là loại hạt duy nhất mà giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả protein và lipit mà phải nói rằng so với một số thực phẩm, thịt hay một số loại hạt đậu đỗ khác thì hàm lượng protein rõ ràng là cao hơn hẳn.Bên cạnh hàm lượng lớn về protein và lipit, hạt đậu tương còn giàu nguồn sinh tố và muối khoáng và chứa nhiều loại axit amin trong đó có 8 axit amin không thay thế như: Arginin, Histidin, Lysin, Triptophan...Hàm lượng của các axit amin có chứa lưu huỳnh như Methionin, Sistein, Sixtin...trong đỗ tương rất gần với hàm lượng của các chất này ở trứng. Hàm lượng của Cazein, đặc biệt là của Lysin rất cao, gấp rưỡi của trứng. Điều này cho thấy đây là loại hạt mà có đầy đủ và cần đến của các loại axit amin cần thiết. Hơn nữa protein của đậu tương dễ tiêu hoá hơn thịt và không có Colesteron. Ngày nay, qua các thí nghiệm mới người ta còn biết thêm nó chứa chất Lexithin có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng thêm trí nhớ và tái sinh các mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể. Trong thời đại ngày nay khi chúng ta đang tìm nguồn dầu thực vật để thay thế việc phải dùng mỡ động vật thì có thể thấy rằng với hàm lượng lipit như đã nói ở trên có thể đủ cung cấp một lượng dầu thực vật khá lớn. Cho nên so với các loại đậu đỗ khác cây đậu tương được coi là cây lấy dầu thực vật quan trọng. Lipit của đậu tương chứa một tỷ lệ các axit béo chưa no có hệ số đồng hoá cao, mùi vị thơm ngon như: axit oleic (30-35%), axit lioleic (45-55%) và linonic (5-10%). Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ mỡ động mạch và có tác dụng tốt đối với sức khoẻ con người. Thành phần khá quan trọng trong hạt đậu tương nữa là các Vitamin. Hạt đậu tương chứa khá nhiều các loại Vitamin mà đặc biệt phải kể đến hàm lượng của các Vitamin B1, B2, ngoài ra là các loại Vitamin PP, A, E, K, D, C...và các loại muối khoáng khác. Theo tác giả Nguyễn Danh Đông, trong 100g hạt đậu tương có hàm lượng Vitamin B1 có thể cung cấp cho một nửa nhu cầu B1 của cơ thể trong một ngày. Đặc biệt hạt đậu tương ngâm hàm lượng Vitamin C tăng từ 8,7-354mg trong 100g hạt đậu tương. Nhân dân một số vùng như Cao Bằng, Bắc Kạn… đã dùng hạt đậu tương nảy mầm làm rau giá, đó là món ăn tốt và giàu Vitamin, protein. Ngoài ra đậu tương còn chữa được nhiều bệnh như đái đường, thần kinh suy nhược, suy dinh dưỡng.Bởi những thành phần như vậy mà từ lâu con người đã biết sử dụng hạt đậu tương vào việc chế biến thành thức ăn, thành các dạng thực phẩm khác nhau. Cho đến nay, người ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại thức ăn bằng các phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới các dạng tươi, khô, lên men...như giá đỗ, bột đậu tương, tương đậu phụ, đậu hũ, chao, tào phớ, sữa đậu nành, xì dầu...đến các sản phẩm cao cấp khác như cà phê đậu tương, socola đậu tương, bánh kẹo, pate, thịt, nhân tạo... được mệnh danh là “người đầu bếp của thế kỷ”. Đối với nhân dân ta có lẽ không ai biết rõ từ khi nào đậu tương đã được sử dụng làm thức ăn cung cấp một phần nhu cầu chất đạm cho con người và gia súc dưới dạng các món ăn cổ truyền [10 ]. Đối với con người, đậu tương còn là một vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là đậu tương hạt đen có tác dụng tốt cho tim, gan, thận, dạ dày và ruột. Đặc biệt đối với người mắc bệnh đái đường, thấp khớp, mới ốm dậy, lao động quá sức thì quả là loại thức ăn tốt. Ngày nay, bên cạnh việc sử dụng hạt đậu tương chín để làm thức ăn thì con người lại có xu hướng sử dụng đậu tương như một loại rau. Thực ra điều này cũng đã được con người chú ý đến. Ở nước ta các vùng nông thôn vẫn hay thu hoạch đậu tương sớm và luộc ăn nhưng chưa được xem như là một loại rau như những năm gần đây.Hạt đậu tương không những là thức ăn cho người mà nó còn góp phần cung cấp thức ăn cho chăn nuôi gia súc, gia cầm. Trong khi nhà nước ta đang có những biện pháp để tăng sự phát triển của ngành chăn nuôi thì đối với việc dùng đậu tương làm thức ăn cho gia súc đã giải quyết được một khâu quan trọng trong vấn đề tìm nguồn thức ăn. Để sử dụng đậu tương làm thức ăn cho gia súc có thể sử dụng trực tiếp hạt hay bã đậu tức là bột đậu tương sau khi ép lấy dầu, bã dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn tinh hỗn hợp giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm theo hướng công nghiệp. Thân lá cây đậu tương có thể dùng làm thức ăn gia súc, gia cầm rất tốt. Trong công nghiệp, dầu đậu tương còn được sử dụng làm xi, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, cao su nhân tạo, len nhân tạo, thuốc trừ sâu... Thực sự trong giai đoạn hiện nay phát triển nền nông nghiệp bền vững là điều mà mỗi một quốc gia đều mong muốn. Chính vì vậy mà với chủ trương phát triển nền nông nghiệp bền vững thì vai trò của cây đậu tương trong hệ thống nông nghiệp là vô cùng quan trọng. Một điều khá đặc biệt đối với những cây thuộc họ đậu là chúng có khả năng tích luỹ đạm tự do trong không khí để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ vào sự cộng sinh với vi khuẩn nốt sần Rhizobium Japonicum ở bộ rễ và trong điều kiện thuận lợi các vi khuẩn nốt sần này có thể tích lũy được một lượng đạm tương đương với 20-25kg ure/ha. Rễ ăn sâu phân nhánh nhiều làm đất tơi xốp, thân lá được dùng làm phân xanh rất hiệu quả. Bởi vậy nên trồng đậu tương không những tốn ít phân đạm mà còn làm cho đất tốt lên, có tác dụng tích cực trong việc cải tạo và bồi dưỡng đất. Mặt khác, đậu tương là cây trồng ngắn ngày, các giống đậu tương ngắn ngày thì thời gian sinh trưởng chỉ có 70-75 ngày và với khả năng thích nghi trên nhiều loại đất khác nhau, ở nhiều vụ trong năm nên là cây trồng tốt trong việc luân canh, xen canh, gối vụ với nhiều loại cây trồng khác nhau. Do đó, trong điều kiện nhiệt đới ẩm của nước ta, đậu tương là cây trồng dễ đưa vào hệ thống luân canh tăng vụ hoặc trồng xen, vừa đem lại hiệu quả kinh tế, vừa tốt cho sự sinh trưởng phát triển của các cây trồng khác. Vì vậy chúng được xem là cây trồng quan trọng của Nông nghiệp Việt Nam. II.2.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam II.2.4.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới, đứng hang thứ 4 sau lúa mì, lúa nước và ngô. Do khả năng thích ứng rộng nên nó đã được tròng ở khắp năm châu lục, nhưng tập chung nhiều nhất ở châu Mỹ, tiếp đó là châu Á. Tình hình sản xuất đậu tương trong những năm gần đây được thể hiện ở bảng sau Bảng 1: Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới từ năm 2001 đến năm 2005 NămDiện tích (triệu ha)Năng suất (tạ/ ha)Sản lượng (triệu tấn)200176,07723,20176,761200279,16722,73108,907200383,60023,40188,929200491,44022,34204,266200591,38623,00209,532(Nguồn: FAOSTAT Database, 2006) [5]. Số liệu ở bảng 1 cho thấy diện tích gieo trồng và sản lượng trên thế giới tăng rất nhanh trong vòng 5 năm qua. Trên thế giới (tính đến tháng 4/ 2006), 78 nước trồng đậu tương với diện tích khoảng hơn 91 triệu ha với năng suất bình quân khá cao 22-23 tạ/ ha đã tạo ra một sản lượng đậu tương lớn gấp hơn 2 lần so với 20 năm về trước. Các nước trồng đậu tương đứng hàng đầu trên thế giới về diện tích và sản lượng là Mỹ, Braxin, Achentina và Trung Quốc [5]. NướcNăm 2003Năm 2004Năm 2005Diện tích (triệu ha)Năng suất (tạ/ ha)Sản lượng (triệu tấn)Diện tích (triệu ha)Năng suất (tạ/ ha)Sản lượng (triệu tấn)Diện tích (triệu ha)Năng suất (tạ/ ha)Sản lượng (triệu tấn)Mỹ29,3322,7766,7729,9328,685,74028,8428,7282,82Braxin18,5228,0852,0221,5223,1449,79322,8921,9250,10Achentina12,428,034,8814,0322,031,50014,0327,2833,30Trung Quốc9,3216,5315,399,7018,1417,6009,5017,7916,90 (Nguồn: FAOSTAT Database, 2006) [5] Qua bảng số liệu ta thấy Mỹ là nước đang dẫn đầu về sản lượng và diện tích. Bộ Nông nghiệp Mỹ ước tính sản lượng đậu tương trên thế giới năm 2010 đạt 242,07 triệu tấn. Tổng diện tích đậu tương dự báo đạt 99,72 triệu ha, năng suất đậu tương sẽ đạt bình quân 2,43 tấn/ha [1]. II.2.4.2. Tình hình sản xuất đậu tương ở trong nước Ở Việt Nam trong vòng hơn 20 năm qua (1985 - 2006) diện tích, năng suất và sản lượng đậu tương đã không ngừng tăng, đặc biệt trong những năm gần đây, cụ thể: năm 2000 diện tích trồng đậu tương là 124100 ha đến năm 2005 tăng lên 203600 ha, năng suất đạt từ 12000 tạ/ha năm 2000 lên đến 14300 tạ/ha năm 2005 và sản lương đạt từ 147300 tấn năm 2000 lên 290600 tấn năm 2005 [11]. Một số tài liệu cho rằng cây đậu tương được đua vào trồng ở nước ta từ thời vua Hùng và xác định nhân dân ta trồng cây đậu tương trước cây đậu xanh và cây đậu đen (Ngô Thế Dân & CS 1999). Ngày nay đậu tương đã trở nên quen thuộc với nhân dân ta. Các món ăn được chế biến từ đậu tương tở thành những món ăn phổ biến thường ngày. Tuy nhiên đậu tương được trồng ở nước ta chủ yếu là sử dụng làm thực phẩm mang tính tự cung tự cấp. Trong những năm gần đây, cây đậu tương đã phát triển khá nhanh về cả diện tích và năng suất góp phần tạo mặt hàng nội địa quan trọng. Tình hình sản suất đậu tương trong nước mấy năm trở lại đây được trình bày ở bảng 2: Bảng 2: Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam trong những năm gần đây ( 2001 – 2007 ) Chỉ tiêu Năm Diện tích (nghìn ha)Năng suất (tạ / ha)Sản lượng (nghìn tấn)2001140,312,4173,72002158,613,0205,62003165,613,3219,72004183,813,4245,92005204,114,3292,72006185,613,9258,12007187,414,7275,2(Nguồn: Tổng cục Thống kê, 2006) Hiện nay cây đậu tương được trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nước, do điều kiện sinh thái của mỗi vùng khác nhau nên có sự khác biệt khá rõ về diện tích, năng suất và sản lượng [11]. Bảng 3: Diện tích, năng suất và sản lượng đậu tương của 7 vùng năm 2005 Địa điểmDiện tích (nghìn ha)Năng suất (tạ/ ha)Sản lượng (nghìn tấn)Cả nước203,614,3291,5Đồng bằng Sông Hồng67,316,0107,5Vùng Đông Bắc48,410,450,2Vùng Tây Bắc25,011,528,7Vùng Bắc Trung Bộ6,512,27,9Tây Nguyên27,115,742,5Đông Nam Bộ5,310,65,6Đồng bằng Sông Cửu Long21,221,044,5 Bảng 3 cho thấy Tây Nguyên là vùng có diện tích trồng đậu tương lớn thứ 3 trong 7 vùng nông nghiệp trên cả nước. Cùng với sự tăng trưởng của các loại cây chính như: cao su, cà phê, hồ tiêu… thì đậu tương cũng đang được chú trọng và phát triển trên vùng đất này. Mặc dù sản lượng đậu tương ở nước ta vẫn tăng nhưng so với các nước trên thế giới và trong khu vực năng suất của ta vẫn còn thấp và đặc biệt trong những năm gần đây diện tích, năng suất và sản lượng đậu tương của nước ta giảm đi đáng kể. Năm 2005 diện tích từ 203,6 nghìn ha giảm xuống chỉ còn 185,6 nghìn ha và sản lượng giảm từ 290,6 nghìn tấn xuống còn 186,9 nghìn tấn năm 2006. Tuy nhiên, đánh giá về tình hình sản xuất và phát triển cây đậu tương trong nước thời gian qua (niên giám thống kê năm 2008) cho thấy: Tổng diện tích cây đậu tương đạt 204100 ha, sản lượng đạt 292000 tấn, năng suất đạt 1,43 tỉ tấn /ha (năng suất cao nhất trong khối Asean và bằng 58% so với bình quân thế giới). Thực tế, sản lượng đậu tương của nước ta chỉ đáp ứng được khoảng 15% nhu cầu tại chỗ. Mặt khác, nhu cầu đậu tương của thế giới ngày càng tăng, chỉ tính riêng Trung Quốc nhu cầu hàng năm là 25-30 triệu tấn/ năm. Do vậy, việc tăng sản lượng đậu tương là vấn đề chiến lược của Nông nghiệp nước ta, trong đó công tác cải tạo giống đóng vai trò quan trọng trong tình hình hiện nay [1]. II.3. Lịch sử nghiên cứu nuôi cấy mô cây đậu tương Đã có nhiều nghiên cứu về việc tái sinh cây đậu tương thông qua nuôi cấy các cơ quan như: Lá mầm, mắt thật đầu tiên (Barwale và Cs 1986, Kim và Cs 1990), lá thật đầu tiên của cây non (Wright và Cs 1987), phôi soma (Lazzeri và Cs 1985, Rouch và Cs, 1985). Một trong những phương pháp hiệu quả nhất để tái sinh cây đậu tương là thông qua phôi vô tính từ các mô nuôi đậu tương. Năm 1983, Christinanson & Cs đã công bố công trình đầu tiên về nuôi cấy mô đậu tương. Sau đó có nhiều bài báo công bố tiếp theo (Lippmann, 1984; Lazzeri et al, 1985; Ranch et al, 1986; Parrott et al, 1988) [10] Hầu hết các mẫu nuôi cấy ban đầu là lá mầm, thân mầm, trụ dưới lá mầm, lá thật đầu tiên để tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô. Các phôi nhanh chóng phân hoá thành các chồi hay bất cứ bộ phận nào cũng đều có ý nghĩa trong quy trình tái sinh cây [11]. Cây đậu tương được coi là cây trồng khó tái sinh trong quá trình nuôi cấy. Đặc biệt là các callus có nguồn gốc từ lá mầm, từ chồi, phôi,… Và có thể không tái sinh từ callus (Hu and Wang, 1999). Người ta cho rằng có hai yếu tố then chốt đẫn tới thành công trong quá trình nuôi cấy. Một là, phản ứng của kiểu gen đối với môi trường nuôi cấy. Hai là, tuổi thọ và bộ phận của cây đem vào nuôi cấy. Tất cả hai yếu tố này đều ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến khả năng tái sinh cây đậu tương. PHẦN BA: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU III.1. Vật liệu nghiên cứu: * Các giống đậu tương DT84 và DT2001 do Bộ môn Đột biến và Ưu thế lai – Viện Di truyền Nông Nghiệp Việt Nam cung cấp. * Bộ phận lấy mẫu: Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chủ yếu là đỉnh sinh trưởng làm nguyên liệu cho nuôi cấy mô. Hạt đậu tương sau khi nảy mầm 3-5 ngày được tách đỉnh sinh trưởng làm vật liệu nghiên cứu. Các giống đậu tương trên đều là giống năng suất cao, thời gian sinh trưởng trung bình hoặc ngắn ngày, có thể thâm canh tối đa 3 vụ/ năm. III.2. Nội dung nghiên cứu Nội dung nghiên cứu của đề tài là: (1) Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu trước khi đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy. (2) Ảnh hưởng của BAP tới khả năng tạo thể protocorm từ đỉnh sinh trưởng. (3) Ảnh hưởng của Zeatin tới khả năng tái sinh chồi từ protocorm và khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng. III.3. Phương pháp nghiên cứu III.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu Cách tiến hành: Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chủ yếu các hoá chất là: HgCl2, H2O2, cồn 70°. Trước tiên, hạt đâụ tương được rửa bằng cồn 70° trong 30 giây để sơ loại các mầm bệnh và tăng hiệu quả khử trùng. Sau khi ngâm trong 30 giây, đổ bỏ cồn và rửa lại bằng nước cất vô trùng 2 lần. Sau đó mẫu được ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1% hoặc H2O2 20% trong 10 phút. Cuối cùng, rửa lại mẫu 5 lần bằng nước cất vô trùng. Sau khi rửa sạch mẫu, tiến hành cấy vào môi trường cơ bản – môi trường Murashige Skoog (MS). Các bình nuôi cấy được chuyển vào phòng nuôi cấy mô trong điều kiện chiếu sáng 10h/ ngày, cường độ chiếu sáng 2000 lux, ở nhiệt độ 28°C Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, nhắc lại 3 lần. Tỷ lệ mẫu nảy mầm (%) =Tổng số mẫu sốngx 100%Tổng số mẫu cây Tỷ lệ mẫu chết (%) =Tổng số mẫu chếtx 100%Tổng số mẫu cây Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =Tổng số mẫu nhiễmx 100%Tổng số mẫu câyIII.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BAP lên khả năng tạo thể protocorm. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên các môi trường sau: MSP1: MS – B5+ 1,0 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3% phytagel MSP2: MS – B5+ 1,5 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3% phytagel MSP3: MS – B5+ 2,0 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3% phytagel MSP4: MS – B5+ 2,5 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3% phytagel Hạt đậu tương sau khi vào mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS từ 5-7 ngày, chúng tôi cắt bỏ 2 lá mầm, trụ dưới lá mầm (cách lá mầm 5-6 mm) lấy phần đỉnh sinh trưởng gắn liền với phần trụ dưới lá mầm khoảng 5-6 mm cấy trên môi trường có bổ sung BAP với nồng độ khác nhau cấy chuyển vào môi trường MS đã chuẩn bị sẵn và được đưa vào phòng nuôi cấy mô. Để đánh giá mức độ phù hợp của môi trường, chúng tôi tiến hành theo dõi tỷ lệ phần trăm protocorm được tạo ra. Tỷ lệ protocorm được tạo ra =Số protocorm được tạo rax 100%Tổng số đỉnh sinh trưởng được cấy vàoIII.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của Zeatin lên khả năng tái sinh chồi từ thể protocorm. Chúng tôi sử dụng 5 công thức môi trường sau: MSZ1: MS – B5+ 0,5 mg/l Zeatin+ 0,2 mg/l GA3+ 30 mg/l Glutamin+ 25 mg/l Asparagin+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 3% phytagel MSZ2: MS – B5+ 1,0 mg/l Zeatin+ 0,2 mg/l GA3+ 30 mg/l Glutamin+ 25 mg/l Asparagin+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 3% phytagel MSZ3: MS – B5+ 1,5 mg/l Zeatin+ 0,2 mg/l GA3+ 30 mg/l Glutamin+ 25 mg/l Asparagin+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 3% phytagel MSZ4: MS – B5+ 2,0 mg/l Zeatin+ 0,2 mg/l GA3+ 30 mg/l Glutamin+ 25 mg/l Asparagin+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 3% phytagel Các chồi/ cụm protocorm được cấy chuyển vào môi trường tái sinh chồi để theo dõi ảnh hưởng của Zeatin tới sự hình thành chồi của một số giống đậu tương. Để đánh giá sự phù hợp của môi trường tái sinh chồi, chúng tôi tiến hành theo dõi hệ số nhân chồi của hai giống. Hệ số tạo chồi =Số protocorm có chồi tạo thànhx 100%Tổng số protocorm được cấy vào môi trường III.4. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học với phần mềm Excel và IRRISTAT trên máy vi tính. Kết quả thống kê được trình bày tại các bảng. PHẦN BỐN: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả xác định khử trùng mẫu Đưa mẫu từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao và tốc độ sinh trưởng nhanh. Vì vậy, mô thực vật trước khi đưa vào nuôi cấy cần phải trải qua giai đoạn khử trùng để đảm bảo yêu cầu vô trùng trong nuôi cấy mô, tránh để nấm, khuẩn làm hỏng mô cấy. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh. Như vậy, có thể thấy giai đoạn khử trùng có ý nghĩa quyết định và nâng cao hiệu quả kinh tế của kỹ thuật nuôi cấy. Các hoá chất thường được sử dụng để khử trùng mô nuôi cấy là: Ca(OCl)2, HgCl2 và H2O2. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng các loại hoá chất khử trùng: - HgCl2 nồng độ 0,1% - H2O2 nồng độ 20% - Cồn nồng độ 700 Chúng tôi đã sử dụng hai giống đậu tương: DT84, DT2001. Hạt đậu tương được rửa bằng cồn 700 trong 30 giây để sơ loại các mầm bệnh và tăng hiệu quả khử trùng. Sau khi ngâm trong 30 giây, đổ bỏ cồn và rửa lại bằng nước cất vô trùng 2 lần. Sau đó mẫu được ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1% hoặc dung dịch H2O2 trong 10 phút. Cuối cùng, rửa lại mẫu 5 lần bằng nước cất vô trùng. Các dụng cụ như panh, kẹp đều được khử trùng bằng ngọn lửa đèn cồn và toàn bộ quá trình khử trùng được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Sau khi rửa bằng nước cất các hạt giống được cấy vào môi trường Murashige Skoog (MS). Tất nhiên, môi trường MS đã chuẩn bị trước và được loại bỏ mầm bệnh bằng nồi khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Các bình nuôi cấy được chuyển vào phòng nuôi cấy mô ở nhiệt độ 28oC, cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10h/ ngày. Trong điều kiện phòng nuôi cấy mô, chúng tôi giữ ổn định về nhiệt độ, cường độ chiếu sáng và độ ẩm không khí để theo dõi khả năng khử trùng của hoá chất ở các thời gian khác nhau đối với hai giống đậu tương nghiên cứu. Kết quả khử trùng được thể hiện ở bảng 1: Bảng 1: So sánh hiệu quả khử trùng hạt đậu tương bằng hoá chất ở thời gian khác nhau: GiốngHoá chấtSố mẫu đưa vàoTỷ lệ mẫu nhiễm (%)Tỷ lệ nảy mầm (%)DT84HgCl21002,392,3H2O2 1004,794,7DT2001HgCl21001,794,3H2O21003,397 Để đánh giá hiệu quả các công thức khử trùng đối với từng giống đậu tương chúng tôi dựa trên các chỉ tiêu sau: tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ nảy mầm cao, mầm cây khoẻ, sức sống tốt được sử dụng. Với mỗi giống đậu tương nghiêm cứu đều thử nghiệm cả hai loại hoá chất khử trùng để xác định được hiệu quả khử trùng của mỗi loại đối với từng giống đậu tương khác nhau. Những giống đậu tương khác nhau sẽ có những phản ứng khác nhau tuỳ thuộc vào từng hoá chất khử trùng. Hiệu quả khử trùng tốt nhất nếu có tỷ lệ nảy mầm cao, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp. Kết quả khử trùng được minh hoạ cụ thể ở bảng 1 và các biểu đồ 1, 2: Biểu đồ 1: Kết quả khử trùng giống DT84 Biểu đồ 2: Kết quả khử trùng giống DT2001 Đối với giống đậu tương DT84: qua biểu đồ 1 ta thấy, sử dụng HgCl2 cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp hơn (2,3%); tuy nhiên nếu sử dụng H2O2 để khử trùng thì lại có tỷ lệ nảy mầm rất cao (94,7%) trong khi tỷ lệ mẫu nhiễm không cao (4,7%). Tương tự, đối với giống DT2001 từ biểu đồ 2 cho thấy, sử dụng H2O2 để khử trùng sẽ cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao (97%); đồng thời có tỷ lệ mẫu nhiễm không đáng kể (4,3%). Mục đích chủ yếu của các phương pháp khử trùng là cho tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao, tuy nhiên bên cạnh đó chúng ta cũng cần quan tâm tới tỷ lệ nảy mầm để đảm bảo có đủ vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo trong quy trình nuôi cấy mô. Nếu sử dụng H2O2 để khử trùng thì cách tiến hành sẽ đơn giản hơn, ít tốn kém và không độc hại cho con người cũng như môi trường. Chính vì vậy, trong quy trình nuôi cấy mô đậu tương chúng tôi sử dụng phương pháp khử trùng mẫu bằng H2O2 để đem lại hiệu quả hơn và phù hợp với thực tiễn. Như đã trình bày ở trên, với mỗi giống đậu tương khác nhau sẽ có phản ứng không giống nhau đối với từng phương pháp khử trùng được áp dụng. Sự phản ứng khác nhau thể hiện ở tỷ lệ hạt nảy mầm (%) và tỷ lệ mẫu nhiễm (%). So sánh tỷ lệ nảy mầm của các giống đậu tương khác nhau khhi sử dụng hai loại hoá chất khử trùng là HgCl2 và H2O2 (biểu đồ 3 và biểu đồ 4) cho thấy hhiệu quả khử trùng của các hoá chất khác nhau tới hai giống đậu tương nghiên cứu. Biểu đồ 3: Tỷ lệ nhiễm (%) khi xử lý khử trùng bằng HgCl2 và H2O2 Biểu đồ 4: Tỷ lệ nảy mầm (%) khi xử lý khử trùng bằng HgCl2 và H2O2 Về tỷ lệ mẫu nhiễm: Với cùng một loại hoá chất khử trùng (HgCl2 và H2O2): tỷ lệ mẫu nhiễm ở giống đậu tương DT84 cao hơn so với giống đậu tương DT2001. Đối với hai giống đậu tương ta thấy: Nếu dùng HgCl2 để khử trùng thì luôn cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tức là có tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao. Tuy nhiên, nếu dùng H2O2 để khử trùng tuy không tốt bằng hóa chất HgCl2, nhưng tỷ lệ mẫu nhiễm vẫn ở mức chấp nhận được. Về tỷ lệ nảy mầm: Sử dụng hóa chất khử trùng là H2O2 tỷ lệ nảy mầm là cao nhất ở giống đậu tương DT2001 (97%), tỷ lệ nảy mầm thấp hơn ở giống đậu tương DT84 (94,7%). Tương tự như vậy, khử trùng bằng HgCl2 thì ở giống DT2001 có tỷ lệ nảy mầm cao hơn (94,3%) so với giống DT84 (92,3%) Mặt khác đối với hai giống đậu tương nghiên cứu, chúng tôi thấy rằng hạt đậu tương được xử lý qua H2O2 thường có tỷ lệ nảy mầm cao hơn so với hạt đậu tương qua xử lý bằng HgCl2 (biểu đồ 4) Nhận xét: Rửa qua bằng cồn 700, sau đó ngâm hạt trong dung dịch H2O2 20% trong 10 phút là phương pháp khử trùng đem lại hiệu quả cao đối với hai giống đậu tương DT84 và DT2001. 2. Kết quả xác định ảnh hưởng của BAP lên khả năng tạo protocorm Cytokinin là một nhóm chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân chia và ức chế sự già hóa của tế bào. Trong nhóm cytokinin, BAP là chất được sử dụng nhiều nhất với mục đích khác nhau. Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng BAP để tạo thể protocorm. Hạt đậu tương sau khi vào mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS từ 5-7 ngày, chúng tôi cắt bỏ 2 lá mầm, trụ dưới lá mầm (cách lá mầm 5-6 mm) lấy phần đỉnh sinh trưởng gắn liền với phần trụ dưới lá mầm khoảng 5-6 mm cấy trên môi trường có bổ sung BAP với nồng độ khác nhau, sau đó được đưa vào phòng nuôi cấy mô. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả thu được ở bảng 2 cho thấy: Bảng 2: Ảnh hưởng của BAP lên khả năng tạo thể protocorm sau 4 tuần GiốngMôi trườngNồng độ BAP (mg/ l)Số mẫu đưa vàoTỷ lệ tạo protocorm (%)Tỷ lệ tạo chồi (%)Ghi chú DT84MSP10,5450100Chồi đơnMSP21,04521,579,3Chồi đơnMSP31,54583,718,5Chồi đơnMSP42,04561,539,3Chồi đơn DT2001MSP10,5450100Chồi đơnMSP21,04523,776,3Chồi đơnMSP31,54587,412,6Chồi đơnMSP42,04565,134,9Chồi đơn Biểu đồ 5: Tỷ lệ protocorm sau 4 tuần nuôi cấy của giống DT84 Biểu đồ 6: Tỷ lệ protocorm sau 4 tuần nuôi cấy của giống DT2001 Như ta thấy ở cả hai giống đậu tương nghiên cứu, tỷ lệ tạo thể protocorm từ đỉnh sinh trưởng khi tăng nồng độ từ 0,5 mg/l tới 2,0 mg/l thì khả năng tạo thể protocorm cao nhất ở cả hai giống DT84 và DT2001 là ở môi trường MSP3 (bổ sung 1,5 mg/l BAP). Cụ thể tỷ lệ tạo protocorm tối ưu ở giống DT84 là 83,7% (MSP3); giống DT2001 là 87,4% (MSP3) Với mỗi loại môi trường nhất định thì khả năng tạo protocorm của các giống khác nhau là không giống nhau. Ở hầu hết các môi trường nghiên cứu giống DT2001 có tỷ lệ tạo protocorm cao nhất; trong khi giống DT84 cho tỷ lệ tạo protocorm thấp hơn. Với môi trường MSP1 (0,5 mg/l BAP) thì ở cả hai giống DT84 và DT2001 đều không tạo protocorm mà chỉ phát triển thành chồi đơn. Rõ ràng, các giống khác nhau sẽ có nguồn gốc, đặc tính di truyền không giống nhau. Vì vậy, chúng sẽ có những phản ứng khác nhau (thể hiện bằng tỷ lệ tạo thể protocorm) đối với mỗi môi trường không giống nhau. Điều này là hoàn toàn hợp với các quy luật sinh học. Vấn đề là cần nghiên cứu để tìm ra môi trường phù hợp nhất cho tỷ lệ tạo protocorm cao nhất. Nhận xét: Đối với hai giống đậu tương DT84 và DT2001 sử dụng môi trường MSP3 (bổ sung 1,5 mg/l BAP) là tốt nhất để tạo thể protocorm từ đỉnh sinh trưởng. 3. Kết quả xác định ảnh hưởng của Zeatin lên khả năng tái sinh chồi từ thể protocorm Đã có một số nghiên cứu thành công khi tái sinh chồi từ lá mầm non và trục phôi non của cây đậu tương (Samoylow & CS, 1988), cây đậu (Witfrikysely & Hans-jory Jacobsen, 1989), cây đậu mỏ két (Settu & Kanji thakumari, 1999) và đậu đũa (Prem Anand & CS, 2001)… trên môi trường có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng như BAP, NAA, Zeatin… Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng sử dụng Zeatin ở các nồng độ khác nhau, nhưng có bổ sung thêm GA3, Glutamin, Asparagin và MES. Zeatin thuộc nhóm cytokinin, là dẫn xuất của adenin. Chúng có tác dụng kích thích sự phân bào và tái sinh chồi mạnh mẽ từ mô nuôi cấy nói riêng, từ mô chưa biệt hóa nói chung. Vì đậu tương là cây khó tái sinh do đó trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Zeatin để kích thích hình thành chồi từ thể protocorm. Các chồi/ cụm protocorm được cấy chuyển vào môi trường tái sinh chồi với các các nồng độ Zeatin khác nhau để theo dõi ảnh hưởng của Zeatin tới sự hình thành chồi của hai giống đậu tương. Sau 5 tuần nuôi cấy kết quả thu được ở bảng 3: Bảng 3:Ảnh hưởng của Zeatin lên khả năng tạo chồi của thể protocorm GiốngMôi trườngNồng độ zeatin (mg/ l)Số mẫu đưa vàoTỷ lệ tạo chồi (%)Số chồi/ cụm protocormGhi chú DT84MSZ10,11521Chồi phát triển kémMSZ20,51526,72,8Chồi phát triển kémMSZ31,01564,610,8Chồi xanh, phát triển tốtMSZ41,51546,74,4Chồi phát triển kémMSZ52,01531,33,7Chồi phát triển kém DT2001MSZ10,1154,61Chồi phát triển kémMSZ20,51535,33,12Chồi phát triển kémMSZ31,01586,712,4Chồi xanh phát triển tốtMSZ41,51571,35,6Chồi phát triển kémMSZ52,01544,44,2Chồi phát triển kém Biểu đồ 7: Tỷ lệ tái sinh chồi từ thể protocorm sau 5 tuần nuôi cấy của giống DT84 Biểu đồ 8: Tỷ lệ tái sinh chồi từ thể protocorm sau 5 tuần nuôi cấy của giống DT2001 Qua bảng số liệu ta thấy ở nồng độ 0,1 mg/l Zeatin, tỷ lệ tạo chồi cao nhất ở giống DT2001 (86,7%) và giống DT84 (64,6%), với số chồi/ cụm protocorm rất cao ở giống DT2001 là 12,4 và giống DT84 là 10,8 chồi, chồi xanh, khoẻ, dài. Và khả năng tái sinh chồi thấp nhất ở nồng độ 0,1 mg/l Zeatin, chỉ đạt 4,6% đối với giống DT2001 và 2% đối với giống DT84, chồi phát triển kém và chỉ có chồi đơn. PHẦN NĂM: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận Từ những klết quả nghiên cứu thu được chúng tôi rút ra một số kết luận sau: Đã tái sinh được đậu tương từ mẫu cấy là đỉnh sinh trưởng đối với hai giống DT84 và DT2001: Môi trường MSP3 (bổ sung 1,5 mg/l BAP) phù hợp để tạo protocorm từ đỉnh sinh trưởng ở hai giống DT84 và DT2001. MSP3: MS – B5+ 2,0 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3% phytagel. Cho tỷ lệ tạo protocorm cao nhất là 83,7% đối với giống DT84 và 87,4 đối với giống DT2001 Tỷ lệ tái sinh chồi từ protocorm nguồn gốc đỉnh sinh trưởng của giống đậu tương DT2001 là cao hơn so với giống đậu tương DT84 Tỷ lệ tạo chồi cao nhất là 84,6% đối với giống DT2001 64,6% đối với giống DT84 ở môi trường MS-B5 + 1mg/l zeatin + 0,2 mg/l GA3 + 30 mg/l Glutamin + 25 mg/l Asparagin + 600 mg/l MES + 3% đường saccaroza + 0,3% phytagel, với số chồi/cụm protocorm là 12,4 chồi ở giống DT2001 và 10,8 chồi ở giống DT84. 2. Đề nghị 1. Tiếp tục nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ callus. 2. Tiếp tục khảo sát khả năng tái sinh chồi từ thể protocorm đối với một số giống đậu tương khác. 3. Tiếp tục nghiên cứu môi trường ra rễ của chồi đã tạo từ thể protocorm của các giống đậu tương. 4. Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô các giống đậu tương khác để làm phong phú thêm nguyên liệu cho công tác nhân in vitro và bảo tồn nguồn gen đặc biệt là phục vụ cho công tác chuyển gen.