Nghiên cứu khả năng ứng dụng biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ cơ quan bệnh phẩm mủ gan trên cá tra

hiệm. Đặc biệt phương pháp MTT có thể xác định mật số tế bào trong thể tích nuôi rất nhỏ. Cũng cùng nhận xét về ưu điểm của MTT, Zorrilla (2001) cho rằng phương pháp này giúp việc xác định số lượng và so sánh khách quan về nồng độ gây độc của các sản phẩm ngoại bào trên các vi sinh vật gây bệnh cho cá. Vì thế kết quả thu được chính xác hơn so với phương pháp đếm truyền thống với trypan blue. Ngoài những ưu điểm trên theo Caviedes (2002) sử dụng MTT để xác định sự mẫn cảm của kháng sinh còn giảm được giá thành trong quá trình tiến hành thí nghiệm; tác giả cho rằng kiểm tra khả năng đề kháng kháng sinh của mỗi chủng Mycobacterium tuberculosis cần 7,54$ nếu sử dụng Alamar Blue, nhưng với MTT giá thành giảm còn 5,04$. Ứng dụng những thành công trong các nghiên cứu trước đây về thí nghiệm MTT, Schrader (2006) cũng đã tiến hành thí nghiệm trên đĩa 96 giếng, tìm hiểu về khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá da trơn và Flavobacterium columnare. Tác giả nhận xét rằng trước đây các lọai thức ăn thủy sản thường được tẩm các kháng sinh như oxytetracycline, sulfadimethoxine/ormetoprim; đến năm 2005 florfenicol lại được xem như một loại kháng sinh có hiệu quả trong việc điều trị bệnh ESC trên cá trơn. Tuy nhiên do lạm dụng thuốc kháng sinh dẫn đến đã tồn lưu các chất độc hại ảnh hưởng đến môi trường nước và sức khỏe con người. Vì vậy MTT đựơc xem như hóa chất có thể đánh giá hiệu quả sử dụng kháng sinh cá da trơn, khi đó sự phát triển của vi khuẩn sẽ được đánh giá thông qua mật độ hấp thu. Sau khi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 12 cho MTT vào và ủ 24 giờ, Schrader đã dùng bước sóng 570nm để xác định mật độ tế bào tồn tại. Qua việc tạo tinh thể formazan đã xác định được giá trị MIC, MBC, IC50 nhờ vào các số liệu về khả năng hấp thu. Kết quả IC50 (24 giờ) từ thí nghiệm kết hợp kháng sinh được so sánh với đối chứng vi khuẩn chỉ sử dụng oxytetracycline , florfenicol. Cùng nhận xét như các tác giả trước đây, Schrader cho rằng phương pháp này thực hiện nhanh, chính xác và mang lại giá trị kinh tế do có thể thực hiện thí nghiệm được nhiều mẫu. Cũng vẫn trên nghiên cứu về MTT, Mashhadian (2007) cho rằng môt trong số những phương pháp sinh hóa xác định mật số tế bào sống trong môi trường nuôi cấy thì phương pháp MTT được sử dụng rộng rãi nhằm xác định hàm luợng độc tố trong tế bào. Trong nghiên cứu này, Mashhadian đã tiến hành trên kháng sinh rifampin được sử dụng trị bệnh lao phổi cho con người. Khác với những thí nghiệm trước đây, HepG2 (tế bào gây ung thư gan) được nuôi trong đĩa 96 giếng với mật độ 1000 tế bào/ giếng, ủ với 5% CO2 ở 37oC. Sau 24 giờ Rifampin được thêm vào cho đến khi đạt được nồng độ cuối cùng 5, 10, 2, 50 và 100µM; tiếp tục ủ 48 giờ. Trong thí nghiệm này lượng MTT dùng cao hơn , 20 µl (5mg/ml) cho mỗi giếng. Các giếng vẫn được ủ 4 giờ (37o C). Sau đó cho tiếp vào 200 µl dung môi DMSO (dimethylsulfoxide) và 20 µl glycine, ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Kết quả rifampin không làm giảm nhiều tế bào ở nồng độ 5µM nhưng lại làm giảm tế bào ở các nồng độ còn lại. Khi đó số lượng tế bào giảm 12,32%, 37,58%, 55,63% và 77,62% tương ứng ở các nồng độ 5, 10, 2, 50 và 100µM. Ngoài ra MTT còn được sử dụng khá phổ biến trong y học, theo nghiên cứu Trần Quang Tuấn và ctv (www.cimsi.org.vn, 18/11/2008) về mô hình và chiều hướng đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân sẩy thai liên tiếp, các tác giả đã sử dụng chứng nghiệm chuyển dạng lympho bào để đánh giá khả nǎng hoạt động của tế bào lympho cũng như khả nǎng và chiều hướng đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân. Trong nghiên cứu của Trần Quang Tuấn đã sử dụng nguyên lý đánh giá kết quả chuyển dạng lympho bào máu ngoại vi theo phương pháp MTT, áp dụng kỹ thuật tạo màu do Mosmann mô tả nǎm 1983 và cải tiến theo phương pháp của Denziot nǎm 1986 với nguyên lý: muối tetrazolium (MTT) màu vàng được chuyển hóa trong ti thể của tế bào sống tạo thành sản phẩm formazan, tạo ra tỉ lệ thuận giữa quá trình chuyển hóa tế bào và số lượng tế bào đang hoạt động. Tế bào lympho trong máu của bệnh nhân được nuôi cấy với mật độ 105 tế bào lympho trong 100ml môi trường không có mặt PHA hoặc có mặt PHA với nồng độ 7,5m g/ml. Sau 48 giờ thêm MTT để có nồng độ cuối cùng là PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 13 1mg/ml và ủ trong 3 giờ. Cuối giai đoạn ủ, loại bỏ môi trường bằng ly tâm. Sau đó cho vào mỗi giếng 50ml isopropanol, toàn bộ phiến được lắc mạnh để hòa tan toàn bộ chất màu formazan do tế bào tạo ra. Kết quả thu được (tính theo chỉ số OD) đã so sánh khả nǎng hoạt động của tế bào lympho giữa các nhóm nghiên cứu. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 14 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: từ tháng 1- 5/2009. - Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học & Bệnh thủy sản. 3.2 Nội dung thực hiện - Phục hồi vi khuẩn từ nguồn vi khuẩn liệt kê ở Bảng 3.1 - Thực hiện kháng sinh đồ 10 chủng vi khuẩn Bảng 3.1 (so sánh mật độ vi khuẩn với ống McFarland 1, mật độ vi khuẩn khoảng 3x108 cfu/ml) - Dùng MTT ước lượng mật độ vi khuẩn trong dịch huyền phù từ khuẩn lạc. - Dùng MTT ước lượng mật độ vi khuẩntrong dịch mô bệnh phẩm (cá bệnh). - So sánh hiệu quả sử dụng kháng sinh giữa phương pháp kháng sinh đồ và thí nghiệm MTT trên vi khuẩn và mô tươi (cá bệnh). 3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 3.3.1 Đối tượng thí nghiệm - Cá tra từ các đề tài nghiên cứu gây cảm nhiễm bệnh mủ gan. 3.3.2 Vật liệu - Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn. - Ống nghiệm, ống đong, đĩa petri, lame, lamella. - Chai nấu môi trường, bình tam giác. - Cá từ, , hộp đầu col, cối nghiền mẫu, cân, bộ tiểu phẫu. - Que trãi thủy tinh. 3.3.3 Thiết bị - Kính hiển vi. - Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy. - Bếp nấu môi trường, nồi thanh trùng. - Micropipette, microplate, máy microplate reader. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 15 3.3.4 Hóa chất - Cồn 70o, cồn 96o - NaCl, nước cất, H2SO4, BaCl2 . - Isopropanol, HCl, MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide). - Môi trường phục hồi và nuôi cấy vi khuẩn: Nutrient agar (NA). - Kháng sinh: ampicilin (AM), choramphenicol (CH) . - Đĩa kháng sinh: ampicillin, chloramphenicol. 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Chuẩn bị vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sử dụng nghiên cứu từ bộ sưu tập vi khuẩn Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sử dụng nghiên cứu từ bộ sưu tập vi khuẩn của Bộ môn Sinh học & Bệnh thủy sản. Vi khuẩn được cấy trên môi trường Nutrient Agar, ủ 48 giờ ở 28-300C. Cho vi khuẩn vào 3 ml nước muối sinh lý (0.85% NaCl). So sánh mật độ vi khuẩn với ống chuẩn McFarland 1 (mật độ 3x108 cfu/ml) tiến hành pha loãng vi khuẩn ở các mật độ 105, 106, 107và 108 cfu/ml (thí nghiệm MTT). Tương tự, cho vi khuẩn vào 2 ml nước muối sinh lý. So sánh mật độ vi khuẩn với ống chuẩn McFarland 1 (mật độ 3x108 cfu/ml) (kháng sinh đồ). Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài STT Mã PTN Địa điểm Cơ quan phân lập 1 3B3 Ô Môn- Cần Thơ Thận 2 E3 Ô Môn- Cần Thơ Thận 3 E8 4 CAF260 Châu Phú Thận 5 T8 Thốt Nốt- Cần Thơ Thận 6 A1 Hậu Giang Thận 7 CAF255 Châu Phú Thận 8 STL303 9 CAF258 Châu Phú Tỳ tạng 10 E223 Chủng tham khảo (Từ Thanh Dung, 2002) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 16 3.4.2 Kháng sinh đồ - Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường TSA và tách ròng để đạt được vi khuẩn thuần. - Kiểm tra độ thuần của vi khuẩn bằng cách nhuộm gram, sau đó cho khuẩn lạc vào 3ml dung dịch nước muối sinh lý sao cho mật độ vi khuẩn tương đương với ống chuẩn McFarland 1. - Cho 100 µl dung dịch vi khuẩn mật độ tương đương ống chuẩn McFland 1. - Dùng que trãi tiệt trùng trãi đều dung dịch trên mặt thạch, ủ khoảng 1-2 phút. - Dùng pel tiệt trùng dán các đĩa kháng sinh lên mặt thạch. Khoảng cách giữa các đĩa kháng sinh 24mm, giữa vành đĩa Petri và đĩa kháng sinh 10-15mm (Lila và Eleonor, 2004) - Ủ 24-48 giờ ở 28-300C. - Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô trùng (mm). - Đường kính vòng tròn vô trùng đuợc đo bằng mm, dòng vi khuẩn trên đĩa kháng sinh tương ứng sẽ đuợc xác định là kháng, nhạy hoặc trung bình dựa theo hướng dẫn của NCCLS (2002) Nếu đường kính vòng tròn vô trùng ≤ 11mm: kháng 12-15mm: trung bình ≥16mm: nhạy Bảng 3.2: Đường kính vòng tròn vô trùng một số loại thuốc kháng sinh Thuốc kháng sinh Kháng Trung bình Nhạy Ampicillin ≤ 13 mm 14-16mm ≥17mm Chloramphenicol ≤ 12mm 13-17mm ≥18mm Sulfamethoxazol/ Trimethoprim ≤10mm 11-15mm ≥16mm Enrofloxacin ≤ 16mm 17-22mm ≥23mm PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 17 Công thức xác định số lượng vi khuẩn tồn tại theo phương pháp kháng sinh đồ: Giả sử rằng sau khi trải dung dịch vi khuẩn lên đĩa thạch, khi đó số lượng vi khuẩn chứa trong đĩa là 100%. Từ đây ta sẽ tính được % vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh: [(S đĩa thạch-S đường kính vòng tròn vô trùng)/S đĩa thạch]*100 3.4.3 Thí nghiệm MTT (Raut et al. 2008) Trên vi khuẩn: - Cho 500 µl dung dịch kháng sinh vào 500 µl dung dịch vi khuẩn mật độ 105, 106 ,107 và 108 cfu/ml. Ủ các dung dịch trong 24 giờ. - Bố trí 100 µl dung dịch vi khuẩn mật độ 105, 106 ,107 v 108 cfu/ml lần lượt vào mỗi giếng (mỗi mật độ lặp lại 3 lần). - Tương tự bố trí 100 µl dung dịch vi khuẩn được ủ kháng sinh vào mỗi giếng (mỗi mật độ lặp lại 3 lần). - Mẫu control: 100 µl NB. - Cho 10 µl dung dịch MTT vào các giếng, ngoại trừ giếng blank. - Lắc đều mẫu và đem ủ 4 giờ ở 370C. - Cho 0.1N HCl/isopropanol vào và mix các dung dịch bên trong giếng, tiếp tục ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng. - Đọc kết quả bằng máy microplate reader (OD = 570nm). - Quá trình cho mẫu vào giếng 96 được thể hiện trong phụ lục bảng A. Bảng 3.3: Sơ đồ bố trí mẫu vi khuẩn vào 7 hàng đầu của đĩa 96 giếng. Sơ đồ được bố trí trên 2 chủng vi khuẩn trong đó: NB: mẫu đối chứng không có vi khuẩn 5, 6, 7, 8 tương ứng với các mật độ vi khuẩn 105, 106, 107, 108 (cfu/ml). AM: ampicillin CH: chloramphenicol Vk1: vi khuẩn 1 Vk2: vi khuẩn 2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 18 NB NB NB NB mtt NB mtt NB mtt 8 mtt vk1 8 mtt vk1 8 mtt vk1 6 mtt vk1 6 mtt vk1 6 mtt vk1 5 mtt vk1 5 mtt vk1 5 mtt vk1 7 mtt vk1 7 mtt vk1 7 mtt vk1 5 CH mtt vk1 5 CH mtt vk1 5 CH mtt vk1 6 CH mtt vk1 6 CH mtt vk1 6 CH mtt vk1 7 CH mtt vk1 7 CH mtt vk1 7 CH mtt vk1 8 CH mtt vk1 8 CH mtt vk1 8 CH mtt vk1 5 AM mtt vk1 5 AM mtt vk1 5 AM mtt vk1 6 AM mtt vk1 6 AM mtt vk1 6 AM mtt vk1 7 AM mtt vk1 7 AM mtt vk1 7 AM mtt vk1 8 AM mtt vk1 8 AM mtt vk1 8 AM mtt vk1 6 mtt vk2 6 mtt vk2 6 mtt vk2 8 mtt vk2 8 mtt vk2 8 mtt vk2 7 mtt vk2 7 mtt vk2 7 mtt vk2 5 mtt vk2 5 mtt vk2 5 mtt vk2 5 CH mtt vk2 5 CH mtt vk2 5 CH mtt vk2 6 CH mtt vk2 6 CH mtt vk2 6 CH mtt vk2 7 CH mtt vk2 7 CH vtt vk2 7 CH mtt vk2 8 CH mtt vk2 8 CH mtt vk2 8 CH mtt vk2 5 AM mtt vk2 5 AM mtt vk2 5 AM mtt vk2 6 AM mtt vk2 6 AM mtt vk2 6 AM mtt vk2 7 AM mtt vk2 7 AM vtt vk2 7 AM mtt vk2 8 AM mtt vk2 8 AM mtt vk2 8 AM mtt vk2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 19 Trên mô thận tươi: - Tổng số mẫu cá phân tích: 32 mẫu cá bệnh + 4 mẫu cá khỏe. - Giải phẫu cá bệnh mủ gan, quan sát dấu hiệu bệnh lý ở thận, gan và tỳ tạng. Phân lập mẫu vi khuẩn ở thận cá bệnh trên môi trường TSA/NA. - Cho 0.1g mẫu thận cá bệnh (cắt lát mỏng) + 1 ml nước muối sinh lý tiệt trùng vào ống efpendorf. Dung dịch mẫu mô được dùng cho thí nghiệm. - Cho 500 µl dung dịch kháng sinh vào 500 µl dung dịch mô và ủ trong 24 giờ. - Bố trí 100 µl dung dịch mẫu mô và kháng sinh đã được ủ trong 24 giờ vào mỗi giếng (mỗi mẫu lặp lại 3 lần) - Tương tự lần lượt cho 100 µl dung dịch mẫu mô thận tươi của cá bệnh, 100 µl cá khỏe vào mỗi giếng của đĩa 96 (mỗi mẫu lặp lại 3 lần) . - Mẫu control: 100 µl NB. - Cho 10 µl dung dịch MTT vào các giếng, ngoại trừ giếng blank. - Lắc đều mẫu và đem ủ 4 giờ ở 370C. - Cho 0.1N HCl/isopropanol vào và mix các dung dịch bên trong giếng, tiếp tục ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng. - Đọc kết quả bằng máy microplate reader (OD = 570nm). - Quá trình cho mẫu vào giếng 96 được thể hiện trong phụ lục bảng A. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 20 Bảng 3.4: Sơ đồ bố trí mẫu mô vào đĩa 96 giếng NB NB NB NB mtt NB Mtt NB mtt ck1 mtt ck1 mtt ck1 mtt ck2 mtt ck2 mtt ck2 mtt ck3 mtt ck3 mtt ck3 mtt ck4 mtt ck4 mtt ck4 mtt cb1 CH mtt cb1 CH mtt cb1 CH mtt cb2 CH mtt cb2 CH Mtt cb2 CH mtt cb3 CH mtt cb3 CH mtt cb3 CH mtt cb4 CH mtt cb4 CH mtt cb4 CH mtt cb1 mtt cb1 mtt cb1 mtt cb2 mtt cb2 mtt cb2 mtt cb3 mtt cb3 mtt cb3 mtt cb4 mtt cb4 mtt cb4 mtt cb1 AM mtt cb1 AM mtt cb1 AM mtt cb2 AM mtt cb2 AM Mtt cb2 AM mtt cb3 AM mtt cb3 AM mtt cb3 AM mtt cb4 AM mtt cb4 AM mtt cb4 AM mtt cb5 mtt cb5 mtt cb5 mtt cb6 mtt cb6 mtt cb6 mtt cb7 mtt cb7 mtt cb7 mtt cb8 mtt cb8 mtt cb8 mtt cb5 AM mtt cb5 AM mtt cb5 AM mtt cb6 AM mtt cb6 AM Mtt cb6 AM mtt cb7 AM mtt cb7 AM mtt cb7 AM mtt cb8 AM mtt cb8 AM mtt cb8 AM mtt cb5 CH mtt cb5 CH mtt cb5 CH mtt cb6 CH mtt cb6 CH Mtt cb6 CH mtt cb7 CH mtt cb7 CH mtt cb7 CH mtt cb8 CH mtt cb8 CH mtt cb8 CH mtt Ghi chú: NB: mẫu đối chứng không có vi khuẩn Ck: cá khỏe Cb: cá bệnh AM: ampicillin CH: chloramphenicol PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 21 3.4.4. Xử lý số liệu. Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm excell với phép xử lý thống kê T- test. % tế bào tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm MTT= (giá trị hấp thu mẫu sử dụng kháng sinh/giá trị hấp thu mẫu không sử dụng kháng sinh)*100. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 22 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thí nghiệm trên vi khuẩn 4.1.1. Kết quả kháng sinh đồ Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của 10 chủng vi khuẩn ở Bảng 3.1 được thể hiện trong Bảng 4.1 (số liệu chi tiết xem phụ lục Bảng B) Bảng 4.1: Đường kính trung bình vòng vô trùng (mm) của 10 chủng vi khuẩn KS VK (cfu/ml) Ampicillin Chloramphenicol 108 107 106 105 108 107 106 105 3B3 30,5 36 40 41 28 30 32 33 E3 22 25 27 31 24 28 29 32 E8 28 39 45 47 33 40 45,5 49 CAF260 28 30 33 37 29 32 36 38 T8 21 35 36 41 9 10 12 16 A1 43 44 45,5 46 58 58,5 59 60 CAF255 41 48 52 58 45 45,5 47 48 STL303 22 24,5 25 28 24 25 26 30 CAF258 9 15 17 18 36 39 42 45 E223 10 12 14 17 29 34 37 43 Qua kết quả Bảng 4.1 cho thấy đường kính trung bình vòng vô trùng của các chủng vi khuẩn 3B3, E3, E8, CAF260, A1, CAF255, STL303 ở các mật độ đều dao động từ 22-60mm. Vì thế theo hướng dẫn của NCCLS các chủng vi khuẩn đều mẫn cảm cao với 2 lọai kháng sinh Ampicillin và Chloramphenicol ngoại trừ các chủng T8, CAF258, E223 đã có hiện tượng kháng. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 23 Đối với Ampicillin, vi khuẩn mẫn cảm ở tất cả các mật độ (đường kính trung bình vòng vô trùng 21-58mm) ngoại trừ chủng vi khuẩn CAF258 kháng ở mật độ 108 (cfu/ml) với đường kính trung bình vòng vô trùng 9mm. Riêng chủng E223 lại kháng ở mật độ 108 (cfu/ml) có đường kính trung bình vòng vô trùng 10mm và chỉ còn mẫn cảm trung bình ở mật độ 107 (cfu/ml) đo được đường kính trung bình vòng vô trùng 12mm . Bên cạnh đó với chloramphenicol, đường kính trung bình vòng vô trùng vi khuẩn tương đối lớn từ 24-60mm. Do đó các chủng vi khuẩn đều mẫn cảm cao với chloramphenicol. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả khảo sát của Stock (2001) về sự nhạy cảm của 102 chủng Edwardsiella (41 chủng E. iIctaluri) với 71 loại kháng sinh cho rằng các chủng Edwardsiella đều có sự mẫn cảm tự nhiên đối với chloramphenicol, quinolon, nitrofurantoin, tetracycline, ngoại trừ chủng T8 có dấu hiệu kháng thuốc (đường kính trung bình vòng vô trùng từ 9-12mm) ở các mật độ 106-108 (cfu/ml) và nhạy trung bình ở mật độ 105 (cfu/ml) với đường kính vòng vô trùng 16mm. Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh. Bảng 4.2: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh qua phương pháp kháng sinh đồ. % VK Ampicillin+KSĐ Chloramphenicol+KSĐ 108 107 106 105 108 107 106 105 3B3 88,52 84,00 80,25 79,25 90,32 88,89 87,36 86,56 E3 94,03 92,28 91 88,14 92,89 90,32 89,62 87,36 E8 90,32 82,41 75,00 72,73 86,56 80,25 74,44 73,88 CAF260 88,89 87,75 86,56 83,10 89,62 88,89 87,36 86,56 T8 94,56 84,88 84,00 79,25 99,00 98,77 98,22 96,84 A1 77,17 76,10 74,44 73,88 58,47 57,75 57,02 55,56 CAF255 79,25 71,56 66,62 58,47 75,00 74,44 72,73 71,56 STL303 94,02 92,59 92,28 90,32 92,89 92,28 91,65 88,89 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 24 CAF258 98, 9 97,22 96,43 96,00 84 81,22 78,22 75 E223 98,77 98,22 97,58 96,43 89,62 85,73 83,1 77,17 Qua những số liệu bảng 4.2 nhận thấy rằng lượng vi khuẩn còn tồn tại sau khi dùng kháng sinh dao động khá lớn trong đó khoảng dao động của vi khuẩn sử dụng chloramphenicol tương đối rộng 55,56- 99% và ampicillin nhỏ hơn từ 58,47-98,9%. Bên cạnh đó, kết quả trên cũng cho biết được sau khi sử dụng ampicillin, lượng vi khuẩn giảm rất nhiều ở các chủng 3B3, E3, E8, CAF260, T8, A1, CAF255, STL303 chỉ còn 58,47-94,56% và theo kết quả đường kính vòng tròn vô trùng bảng 4.1 thì được xem là nhạy với ampicillin; trong đó chủng CAF255 nhạy với ampicillin nhất (58,47%) và nhạy thấp nhất là chủng E223(97,58%). Riêng mật độ vi khuẩn của E223 vẫn còn khá cao 96,43- 98,77% đối chiếu số liệu đường kính vòng vô trùng Bảng 4.1 thì xem như vi khuẩn E223 ở mật độ 107cfu/ml (98,22%) đã nhạy trung bình; kháng ở 108 cfu/ml (98,77%). Tương tự thế chủng CAF258 kháng ampcillin với lượng vi khuẩn còn lại 98,9%. 4.1.2 Kết quả thí nghiệm MTT trên vi khuẩn a. Sự sai khác giữa vi khuẩn và vi khuẩn sử dụng kháng sinh. Vi khuẩn Bảng 3.1 được phục hồi và nuôi trong môi trường NB dến mật độ 108 cfu/ml (so với ống chuẩn McFarlant 1). Sau khi thực hiện các bước theo phương pháp nghiên cứu, cho mẫu vào giếng 96 như Bảng 4.3 và đo bằng máy microplate reader ở bước sóng 570nm thu được kết quả Bảng 4.4 (chi tiết được trình bày ở Phụ lục II Bảng C). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 25 Hình 4.1: Mẫu vi khuẩn &MTT Hình 4.2: Mẫu vi khuẩn &MTT sau khi ủ 4 giờ Ghi chú: NB: mẫu đối chứng không có vi khuẩn Vk1, vk2: vi khuẩn 1, vi khuẩn 2 AM: ampicillin CH: chloramphenicol vk2 vk2+CH vk2+AM NB vk1 vk1+CH vk1+AM PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 26 Bảng 4.3: Sự sai khác của vi khuẩn và vi khuẩn sử dụng kháng sinh qua thí nghiệm MTT Nghiệm thức 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tỉ lệ NB &10^8 + + + - + + + + + + 9+/10 NB&10^7 - + + - + + + + + + 8+/10 NB&10^6 + + + - + + + + + + 9+/10 NB&10^5 - - + - + + + + + + 7+/10 NB&10^8+AM - - - - + - - - + + 7-/10 NB&10^7+AM - - - - + - - - + + 7-/10 NB&10^6+AM - - - - - - - - - - 10-/10 NB&10^5+AM - - - - - - - - - - 10-/10 NB&10^8+CH - - - - + ND - - - - 8-/9 NB&10^7+CH - - - - + ND - - - - 8-/9 NB&10^6+CH - - - - + ND - - - - 8-/9 NB&10^5+CH - - - - + ND - - - - 8-/9 10^8&10^8+AM + + + - + + + + + + 9+/10 10^7&10^7+AM + + - + + + + + + + 9+/10 10^6&10^6+AM + + + + + + + + + + 10+/10 10^5&10^5+AM + + - + - + + + + + 8+/10 10^8&10^8+CH + + + + + + + + + + 10+/10 10^7&10^7+CH + + + + + + + + + + 10+/10 10^6&10^6+CH + + + + + + + + + + 10+/10 10^5&10^5+CH + + + + + + + + + + 10+/10 Ghi chú: NB: mẫu đối chứng không tồn tại vi khuẩn AM: ampicillin CH: chloramphenicol 10^8, 10^7, 10^6, 10^5: mật độ vi khuẩn (+): có ý nghĩa p<5% (-): không có ý nghĩa p>5% ND: không xác định (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10) lần lượt tương ứng với các chủng vi khuẩn 3B3, E3, E8, CAF260, T8, A1, CAF255, STL303, CAF258, E223 Qua bảng kết quả nhận thấy rằng khi sử dụng MTT trong 10 chủng vi khuẩn ở các mật độ 105-108 (cfu/ml) đã có 9/10 chủng sai khác có ý nghĩa với NB , vì PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 27 thế giúp đánh giá được sự chênh lệch giữa mức độ đục của NB và NB có vi khuẩn. Bên cạnh đó khi so sánh giữa NB và dung dịch vi khuẩn có sử dụng ampicillin thấy được rằng không có sự sai khác giữa 2 dung dịch ở mật độ 105 và 106 (cfu/ml) với xác suất rất cao 10/10 chủng vi khuẩn; tuy nhiên ở mật độ cao hơn là 107 và 108 (cfu/ml) chỉ có 7/10 chủng vi khuẩn sai khác không có ý nghĩa giữa NB và vi khuẩn dùng ampicillin, còn lại các chủng T8, CAF258, E223 có kết quả sai khác có ý nghĩa giữa NB và vi khuẩn sử dụng kháng sinh. Nguyên nhân có thể do vi khuẩn đã kháng với ampicillin nên có sự sai khác giữa NB và vi khuẩn sử dụng kháng sinh. Tương tự như thế có 8/10 chủng vi khuẩn không có sự sai khác giữa NB và vi khuẩn dùng choramphenicol. Qua đấy thể hiện rằng chloramphenicol vẫn còn nhạy cảm khá cao với 10 chủng vi khuẩn đã nêu trong Bảng 3.1. Trong đó đặc biệt chủng A1 rất nhạy cảm với chloramphenicol do sau khi sử dụng kháng sinh mật độ vi khuẩn giảm còn rất thấp, xấp xỉ với giá trị của NB. Riêng với chủng T8 có kết quả tương tự như CAF258, E223, T8 sử dụng ampicillin; có sự sai khác giữa NB và chủng T8 sử dụng chloramphenicol, vì thế nguyên nhân có thể do chủng T8 đã kháng chloramphenicol. Quan trọng hơn, bảng kết quả trên cũng cho thấy đã có sự sai khác giữa vi khuẩn và vi khuẩn sử dụng kháng sinh. Với kháng sinh chloramphenicol, qua thí nghiệm MTT tất cả (10/10) chủng vi khuẩn ở các mật độ 105-108 cfu/ml đều biệu hiện sự sai khác giữa vi khuẩn có và không có sử dụng kháng sinh; trong khi đó ở ampicillin bên cạnh sự sai khác có ý nghĩa của các chủng vi khuẩn vẫn có sự sai khác không có ý nghĩa của chủng E8 (107 cfu/ml và 105cfu/ml), CAF260 ( 108cfu/ml) và T8 (105cfu/ml). b. Định lượng vi khuẩn còn tồn tại sau khi sử dụng kháng sinh Bảng 4.4: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm MTT trên vi khuẩn. KS VK (%) Ampicillin+MTT Chloramphenicol+MTT 10^8 10^7 10^6 10^5 10^8 10^7 10^6 10^5 3B3 67,88 80,50 76,73 75,43 92,83 89,41 97,22 96,97 E3 42,56 49,81 79,08 80,44 67,30 75,85 71,87 66,74 E8 82,02 83,41 60,84 78,36 87,13 86,34 89,74 91,17 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 28 CAF260 67,05 75,78 72,99 75,42 65,32 74,52 71,78 70,05 T8 94,75 84,73 84,02 79,30 99,00 98,78 98,27 96,87 A1 77,80 76,19 74,02 73,28 57,94 57,58 56,87 53,85 CAF255 67,20 70,35 72,36 71,49 63,92 64,94 65,09 63,67 STL303 96,20 103,57 95,18 99,56 90,87 93,62 79,89 97,09 CAF258 75,90 76,70 72,86 81,63 72,79 74,41 71,37 77,45 E223 74,19 77,01 70,06 65,83 71,30 76,76 68,85 62,69 Qua kết quả trên cho thấy với thí ngiệm MTT đã xác định được luợng vi khuẩn tồn tại sau sử sụng kháng sinh đã giảm khá nhiều từ 42,56- 97,22% ngoại trừ các chủng T8, STL303 vẫn còn khá cao 79,89-99,56% và chủng STL303 (mật độ 107cfu/ml) lượng vi khuẩn lại rất cao 103,57%. Đồng thời bảng số liệu trên cho biết được sau khi sử dụng ampicillin hầu hết số lượng vi khuẩn đều giảm thấp nhất là 42,56% cho đến cao nhất chỉ còn 94,75%. Riêng chủng STL303 lượng vi khuẩn sau dùng kháng sinh vẫn còn tương đối cao, lớn hơn 94%. Kết quả này cho thấy rằng trong số các chủng vi khuẩn thí nghiệm chỉ có STL303 và T8 kháng ampicillin. Tuy tỉ lệ chiếm không cao nhưng qua đó đã thể hiện được do sử dụng thuốc không đúng liều lượng , không đúng cách dẫn đến hiện tượng kháng thuốc xảy ra. Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2005) cho rằng trong 196 dòng vi khuẩn thí nghiệm đã có 78% kháng ampicillin. Sau đó cũng cùng nghiên cứu về khà năng kháng kháng sinh trên vi khuẩn E. ictaluri, Nam Kha (2006) đã nhận xét vi khuẩn kháng ampicillin với mức độ khá cao trên 90%. Bên cạnh đó, với chloramphenicol lượng vi khuẩn cũng đã giảm đáng kể còn khoảng 53,85- 93,62%, điều này cho thấy rằng chloramphenicol mẫn cảm cao với E. ictaluri ; kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh (2005) trên 196 dòng vi khuẩn phân lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở ĐBSCL với 6 kháng sinh và kết quả kháng sinh đồ cho thấy số dòng chỉ kháng chloramphenicol chiếm tỉ lệ 2%. Ngoại trừ kháng ở chủng T8, STL303, 3B3 (>96%), nguyên nhân có thể do các chủng vi khuẩn này được phân lập từ các ao sử dụng nhiều chloramphenicol. Mặc dù chloramphenicol đã cấm sử dụng do những tổn hại đến môi trường và sức khỏe cộng đồng nhưng vì hiệu quả trị bệnh vẫn còn khá cao do đó ở một số vùng nuôi vẫn được dùng. Theo khảo sát của Nam Kha (2006) trên 101 chủng vi khuẩn phân lập từ nguồn cá trơn ở các PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 29 nông trại với 11 loại kháng sinh thì chloramphenicol đã kháng hoàn toàn (100%) với các vi khuẩn thu được. 4.1.3. So sánh số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh giữa phương pháp kháng sinh đồ và MTT. Mật độ vi khuẩn 108 cfu/ml 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 ST L3 03 E3 CA F2 60 T8 A1 CA F2 55 CA F2 58 E2 23 3B 3 E8 Vi khuẩn % 10^8+AM+MTT 10^8+AM+KSD Hình 4.3: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ Mật độ vi khuẩn 108 cfu/ml 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 ST L3 03 E3 CA F2 60 T8 A1 CA F2 55 CA F2 58 E2 23 3B 3 E8 Vi khuẩn % 10^8+CH+MTT 10^8+CH+KSD Hình 4.4: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ. Qua 2 biểu đồ trên nhận thấy ở mật độ 108 lượng vi khuẩn còn lại sau khi dùng kháng sinh trong thí nghiệm MTT đều thấp hơn so với phương pháp PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 30 kháng sinh đồ , ngoại trừ chủng A1 và T8 có giá trị tương đương. Bên canh đó 2 biểu đồ trên còn cho thấy khi sử dụng chloramphenicol hàm lượng vi khuẩn giảm nhiều hơn so với ampicillin. Mật độ vi khuẩn 107 cfu/ml 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 ST L3 03 E3 CA F2 60 T8 A1 CA F2 55 CA F2 58 E2 23 3B 3 E8 Vi khuẩn % 10^7+AM+MTT 10^7+AM+KSD Hình 4.5: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 107 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ. Mật độ vi khuẩn 107 cfu/ml 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 ST L3 03 E3 CA F2 60 T8 A1 CA F2 55 CA F2 58 E2 23 3B 3 E8 Vi khuẩn % 10^7+CH+MTT 10^7+CH+KSD Hình 4.6: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 107 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ. Dựa vào 2 biểu đồ trên nhận thấy ở mật độ 107 cfu/ml có nhiều giá trị tương đương về phần trăm vi khuẩn tồn tại sau dùng kháng sinh giữa 2 phương pháp hơn so với mật độ 108 cfu/ml; những chủng này tập trung vào chủ yếu là T8, A1, E8, 3B3. Trong khi đó chủng E3, CAF260, CAF255, CAF255, E223 ở thí PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 31 nghiệm MTT lại có số lượng vi khuẩn tồn tại thấp hơn so với phương pháp kháng sinh đồ. Tuy nhiên sự chênh lệch này không quá cao ở hầu hết các chủng trên, chỉ có trường hợp cao nhất ở chủng E3, CAF258 và E223 khi tác dụng với chloramphenicol. Ở mật độ này hàm lượng vi khuẩn tồn tại sau khi tác dụng với chloramphenicol cũng thấp hơn so với ampicillin tương tự như ở mật độ 108 cfu/ml . Mật độ vi khuẩn 106 cfu/ml 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 ST L3 03 E3 CA F2 60 T8 A1 CA F2 55 CA F2 58 E2 23 3B 3 E8 Vi khuẩn % 10^6+AM+MTT 10^6+AM+KSD Hình 4.7: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 106 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ. Mật độ vi khuẩn 106 cfu/ml 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 ST L3 03 E3 CA F2 60 T8 A1 CA F2 55 CA F2 58 E2 23 3B 3 E8 Vi khuẩn % 10^6+CH+MTT 10^6+CH+KSD Hình 4.8: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 106 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 32 Qua biểu đồ ở Hình 4.7 và 4.8 nhận thấy vẫn là chủng T8 và A1 không có sự chêch lệch về mật độ vi khuẩn tồn tại giữa 2 phương pháp MTT và kháng sinh đồ. Trong khi đó ở các chủng còn lại đều có phần trăm vi khuẩn ở thí nghiệm MTT thấp hơn so với kháng sinh đồ. Riêng chủng 3B3, E8 ở mật độ 107cfu/ml có giá trị tương đương thì sang mật độ 106 cfu/ml lại có lượng vi khuẩn sau sử dùng chloramphenicol ở phương pháp MTT cao hơn so với kháng sinh đồ. Mật độ vi khuẩn 105 cfu/ml 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 ST L3 03 E3 CA F2 60 T8 A1 CA F2 55 CA F2 58 E2 23 3B 3 E8 Vi khuẩn % 10^5+AM+MTT 10^5+AM+KSD Hình 4.9: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 105 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ. Mật độ vi khuẩn 105 cfu/ml 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 ST L3 03 E3 CA F2 60 T8 A1 CA F2 55 CA F2 58 E2 23 3B 3 E8 Vi khuẩn % 10^5+CH+MTT 10^5+CH+KSD Hình 4.10: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 105 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 33 Tương tự thế, ở mật độ 105 cfu/ml chủng 3B3, E8, STL303 có lượng vi khuẩn sau dùng Chloramphenicol ở phương pháp MTT cao hơn so với kháng sinh đồ; chủng T8 và A1 không có sự chêch lệch về mật độ vi khuẩn tồn tại giữa 2 phương pháp và các chủng còn lại đều có phần trăm vi khuẩn ở thí nghiệm MTT thấp hơn so với kháng sinh đồ. Riêng với Ampicillin hầu hết các chủng vi khuẩn đều có giá trị tương đương ở 2 phương pháp ngoại trừ CAF258 và E223 ngược lại. Qua các biểu đồ từ Hình 4.3-4.10 nhận thấy rằng việc sử dụng MTT để xác định mật độ vi khuẩn còn tồn tại sau sử dụng thuốc kháng sinh gần như tương đương với phương pháp kháng sinh đồ (T8, A1). Ở các chủng còn lại như CAF255, CAF258, 3B3, E8 tuy có sự chênh lệch nhưng ở mức độ không cao. Bên cạnh đó với thí nghiệm MTT, hàm luợng vi khuẩn tồn tại dưới tác dụng của kháng sinh được xác định thấp hơn so với phương pháp kháng sinh đồ. Mặt khác các biểu đồ còn cho thấy hầu hết 10 chủng vi khuẩn thí ngiệm vẫn còn nhạy cảm với 2 loại kháng sinh, trong đó Chloramphenicol còn mẫn cảm cao với vi khuẩn hơn Ampicillin. 4.1.4 So sánh thời gian xác định tính nhạy của kháng sinh giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ. 0 1 2 3 4 5 6 7 ST L3 03 E3 CA F2 60 T8 A1 CA F2 55 CA F2 58 E2 23 3B 3 E8 Vi khuẩn N gà y KSĐ MTT Hình 4.11: Thời gian xác định sự nhạy cảm kháng sinh trên vi khuẩn giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ . Qua biểu đồ trên nhận thấy rằng thời gian xác định sự mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn nhờ vào thí nghiệm MTT đều thấp hơn so với phương pháp kháng sinh đồ (số liệu chi tiết xem Phụ lục II Bảng E). Thời gian tiến hành thí nghiệm bằng kháng sinh đồ nhanh nhất là 3,5 ngày và chậm nhất là 6 ngày; trong khi đó với MTT thời gian đã giảm đi ít nhất 7 giờ (chủng E3, T8) và PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 34 nhiều nhất 19 giờ ở các chủng vi khuẩn còn lại. Nguyên nhân do trong phương pháp kháng sinh đồ cần có thời gian để vi khuẩn phát triển sau khi đặt đĩa kháng sinh; riêng thí nghiệm MTT đã giảm được khoảng thời gian trên. Điều này cũng tương tự với các thí nghiệm trước đây khi sử dụng MTT nghiên cứu trên các sinh vật khác. Mshana (1998) khi nghiên cứu khả năng đề kháng rifampin của Mycobacterium tuberculosis cho rằng khi sử dụng MTT thời gian phát hiện sự nhạy cảm của M. tuberculosis với rifampin ít nhất 3 ngày, trong khi đó so với phương pháp đếm khuẩn lạc trước đây tốn ít nhất 4-5 tuần. 4.2 Kết quả thí nghiệm trên mô tươi. 4.2.1 Sự sai khác giữa mô bệnh và mô bệnh sử dụng kháng sinh. Mô thận tươi được cắt thành những lát mỏng và cho vào 1ml nước muối sinh lý. Sau đó dung dịch mô được thực hiện theo các bước trong phương pháp nghiên cứu và cho mẫu vào giếng 96 như hướng dẫn ở Bảng 4.6 và đo bằng máy microplate reader ở bước sóng 570nm thu được kết quả trình bày trong Bảng 4.7( số liệu chi tiết xem phụ lục II Bảng D) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 35 Hình 4.12: Mẫu mô & MTT Hình 4.13: Mẫu mô & MTT sau khi ủ 4 giờ Ghi chú: NB: mẫu đối chứng không có vi khuẩn Ck: cá khỏe Cb: cá bệnh AM: ampicillin CH: chloramphenicol cb ck cb+AM cb+AM cb+CH NB cb+CH cb PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 36 Bảng 4.5: Sự sai khác giữa mô bệnh và mô bệnh sử dụng kháng sinh . Nguồn gốc cá NB& ck NB& cb ck& cb ck& cb+AM ck& cb+CH cb& cb+AM cb& cb+CH 1 C1 + + + - - + + C2 + + + - - + + C3 + + + - - + + 2 C4 + + - - - + + C5 + + + - - + + C6 + + + - + + - C7 + + + + + + + C8 + + + + + + + 3 C9 + + + + - + + 2 C10 + + + - - + + C11 + + + + + + + C12 + + + + + + + C13 + + - + + + + C14 + + + + + + + C15 + + + + + + + C16 + + + + + + + C17 + + + + + + + C18 + + + + + + + 3 C19 + + - + + + + C20 + + + - - + + C21 + + + - - + + C22 + + + + + + + C23 + + + + + + + C24 + + + - + + + C25 + + + - - + + C26 + + + + + + + C27 + + + + + + + C28 + + + - - + + C29 + + + + + + + C30 + + + + + + + C31 + + + + + + + C32 + + + + + + + Tỉ lệ 32+/32 32+/32 29+/32 12-/32; 20+/32 11-/32; 21+/32 32+/32 31+/32 Ghi chú: 1,2 , 3 tương ứng với cá lấy từ nguồn cá cảm nhiễm A1, T8, CAF258 (+): có ý nghĩa với p5% PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 37 CH: chloramphenicol, AM: ampicillin NB: mẫu đối chứng không có vi khuẩn ck: cá khỏe, cb: cá bệnh Qua kết quả Bảng 4.7 thấy rằng cả cá khỏe và cá bệnh đều sai khác có ý nghĩa với NB tuy nhiên khi so sánh giữa cá khỏe và cá bệnh nhận thấy trong 32 mẫu cá thí nghiệm thì có 29/32 mẫu đã có sự sai khác giữa cá khỏe và cá bệnh. Điều này có thể giải thích rằng do trong mô bệnh ngoài mô ra còn có vi khuẩn vì thế dẫn đến sự chêch lệch khi so sánh hai giá trị này. Bên cạnh đó, khi so sánh giữa cá khỏe và cá bệnh có kháng sinh nhận thấy không có sự sai khác với 2 nghiệm thức chiếm tỉ lệ 12/32 (ampicillin), 11/32 (chloramphenicol). Qua đấy cho thấy rằng sau khi ủ với kháng sinh mật độ vi khuẩn trong mô đã giảm, dẫn đến giá trị giữa mô khỏe và mô bệnh tương đương nhau; còn lại sai khác có ý nghĩa giữa 2 nghiệm thức với tỉ lệ 20/32 (ampicillin), 21/32 (chloramphenicol) do kháng sinh đã giúp mật độ vi khuẩn trong mô giảm rất nhiều, vì thế dẫn đến sự sai khác khá lớn ở hai giá trị. Ngoài ra kết quả Bảng 4.7 còn thể hiện sự sai khác giữa cá bệnh và cá bệnh được sử dụng kháng sinh , trong 32 mẫu cá thì tất cả đều có sự sai khác giữa cá bệnh có và không sử dụng kháng sinh; ngoại trừ chloramphenicol được 31/32 mẫu có sự sai khác giữa 2 nghiệm thức trên. Điều này cũng cho thấy rằng qua thí nghiệm MTT đã xác định được ampicillin và chloramphenicol đều nhạy cảm với hầu hết 32 mẫu cá. Qua những nhận xét trên đã thấy được rằng có thể sử dụng MTT trong việc xác định mức độ nhạy của kháng sinh trên vi khuẩn E.ictaluri. Bên cạnh đó khi thực hiện trực tiếp thí nghiệm MTT trên mô tươi vẫn có thể xác định mức độ nhạy giữa kháng sinh và vi khuẩn có trong mô bệnh. Bảng 4.6: Số lượng (%) tế bào tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm MTT trên mô. Cá bệnh+AM+MTT Cá bệnh+CH+MTT Cá 1 62,50 54,10 Cá 2 58,94 62,84 Cá 3 71,46 64,46 Cá 4 93,21 87,13 Cá 5 87,20 80,09 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 38 Cá 6 88,41 98,02 Cá 7 91,54 87,82 Cá 8 91,61 82,84 Cá 9 96,02 90,27 Cá 10 93,21 87,13 Cá 11 85,69 75,73 Cá 12 114,33 112,64 Cá 13 90,63 85,64 Cá 14 89,27 86,54 Cá 15 83,00 82,23 Cá 16 88,27 85,59 Cá 17 83,78 76,24 Cá 18 83,96 82,08 Cá 19 77,70 68,92 Cá 20 76,03 75,32 Cá 21 81,48 83,85 Cá 22 65,59 77,93 Cá 23 85,54 79,79 Cá 24 78,31 88,32 Cá 25 86,07 81,31 Cá 26 83,96 82,99 Cá 27 76,95 68,65 Cá 28 85,00 88,77 Cá 29 64,68 75,79 Cá 30 74,64 69,35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 39 Cá 31 86,79 83,12 Cá 32 62,50 71,10 Dung dịch mô cá bệnh sẽ có 2 phần là mô và vi khuẩn gây bệnh. Giả sử rằng lượng mô tồn tại trong mỗi giếng là tương đương nhau (vì thí nghiệm trên cùng 0,1g thận với mỗi mẫu cá) và khả năng kháng sinh gây ảnh hưởng tế bào mô như nhau. Nhờ vào điều này qua kết quả Bảng 4.8 nhận thấy rằng lượng tế bào( mô và vi khuẩn) sau sử sụng kháng sinh giảm khá nhiều, trong 32 mẫu cá thí nghiệm đã có 31/32 mẫu đều thể hiện mật độ tế bào giảm sau dùng kháng sinh dao động từ 54,1-98,02%. Đối với cá bệnh sau khi sử dụng ampicillin, hàm lượng tế bào giảm còn thấp nhất ở cá 2 (58,94%) , cao nhất ở cá 9 (96,02%) còn phần lớn số mẫu cá còn lại đều dao động từ 75-93%. Những mẫu cá này lấy từ nguồn cá gây cảm nhiễm chủng A1, T8, CAF258 (xem phụ lục II bảng D) vì thế khi đối chiếu với kết quả phần trăm vi khuẩn còn tồn tại cả các chủng này theo phương pháp kháng sinh đồ (Bảng 4.2) và kết quả MTT trên vi khuẩn (Bảng 4.5) thấy rằng các giá trị tương đương nhau tuy rằng giá trị ở mô cá vẫn còn cao hơn (chẳng hạn trong thí nghiệm MTT ở cá 9 được lấy từ nguồn cá gây cảm nhiễm chủng CAF258 có mật độ vi khuẩn sau sử dụng kháng sinh 96,02%, khi so sánh với kết quả số lượng vi khuẩn Bảng 4.2 là 96% ). Nguyên nhân do mô cá được sử dụng trực tiếp vì thế trong quá trình thực hiện thí nghiệm vẫn còn mô lẫn trong dung dịch dẫn đến giá trị đo của mô thường cao hơn. Vì các giá trị gần tương đương nhau nên nhờ vào đó có thể xác định được cá còn nhạy hay kháng với ampicillin (như ở cá 9 khi các giá trị nêu trên xấp xỉ nhau đã cho thấy được cá vẫn còn nhạy với ampicillin tuy ở mức độ thấp). Ngoài ra qua bảng kết quả trên còn cho thấy số lượng tế bào tồn tại sau sử dụng chloramphenicol thấp hơn so với việc dùng ampicillin. Trong 32 mẫu cá có 24/32 mẫu có phần trăm tế bào tồn tại (mô và vi khuẩn) sau dùng chloramphenicol thấp hơn so với ampicillin và sự chênh lệch về số lượng tế bào tồn tại giữa 2 kháng sinh từ 1-10% (kết quả Bảng 4.8). Thông qua đó thấy rằng chloramphenicol đã phá hủy được các tế bào vi khuẩn tồn tại trong mô bệnh nhiều hơn so với ampicillin. Qua đây có thể nhận thấy sử dụng MTT tuy không xác định được chính xác mật số vi khuẩn trực tiếp trên mô bệnh sau khi sử dụng kháng sinh nhưng có thể so sánh được mức độ nhạy giữa các loại kháng sinh với nhau. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 40 Bên cạnh việc xác định khả năng nhạy của kháng sinh với vi khuẩn gần tuơng đương phương pháp kháng sinh đồ, thì thí nghiệm MTT còn giảm được thời gian khá nhiều. Nếu như trong nghiên cứu này, thời gian làm kháng sinh đồ nhanh nhất là 3,5 ngày và chậm nhất 6 ngày thì thí nghiệm MTT trên mô tươi chỉ còn 1,5 ngày. Ngoài ra sử dụng MTT để xác định tính nhạy của kháng sinh còn giảm giá thành từ 7-8 lần so với phương pháp kháng sinh đồ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 41 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận 5.1.1 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo kháng sinh đồ Các chủng vi khuẩn 3B3, E3, E8, CAF260, A1, CAF255, STL303 còn nhạy cảm với ampicillin và chloramphenicol. Riêng T8 kháng chloramphenicol; CAF258, E223 kháng ampicillin. Mức độ mẫn cảm của vi khuẩn trên chloramphenicol cao hơn so với ampicillin. 5.1.2 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo thí nghiệm MTT . Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh giữa thí nghiệm MTT và kháng sinh đồ tương đuơng nhau. Phần trăm vi khuẩn tồn tại sau sử dụng chloramphenicol thấp hơn vi khuẩn sử dụng ampicillin. 5.1.3 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên mô theo thí nghiệm MTT. Lượng tế bào tồn tại trong mô cá bệnh (mô và vi khuẩn) khi sử dụng chloramphenicol thấp hơn so với ampicillin. 5.2 Đề xuất Hạn chế sự tồn đọng mô trong dung dịch vi khuẩn được lấy từ mô bệnh. Thực hiện thí nghiệm MTT: trong các khoảng thời gian khác nhau. Nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn ở các nồng độ kháng sinh khác nhau bằng thuốc thử MTT. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Benbrook C. 2002. Antibiotic Drug Use in U. S. Aquaculture. IATP Report, 18pp. Caviedes L., J Delgado., R H Gilman. 2002. Tetrazolium Microplate Assay as a rapid and inexpensive Colorimetric method for determination of antibiotic susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. 40(5): 1873-1874. Crumlish M., T T Dung., J F Turnbull., N T N Ngọc. & H W Ferguson. 2002. Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvagel), cultured in the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Diseases. 25: 733-736. Dixon, B. 2007. Antibiotic resistance of bacterial fish pathogens. Journal of the World Aquaculure Society 25: 60-63. Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, T Somsiri, S Chinabut, F Yussoff, M Shariff, K Bartie, G Huys, M Giacomini, S Berton, J Swings & A Teale. 2005. Xác định tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phâ lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở Đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam. Tạp chí Nghiên cứu khoa học 2005:4 136-144. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội.2004. Bệnh học thủy sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội.423pp. Ferguson H. W, J. F Turnbull, A. Shin, K. Thompson, T.T Dung and M Crumlish. 2001. Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Disease 2001:509-513. Freimoser F M., C.A. Jakob, M. Aebi and U. Tuor. 1999. The MTT [3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay is a fast and reliable method for colorimetric determination of fungal cell densities. Applied and Environmental Microbiology. 3727-3729. Gibbs S G., C.F. Green, P.M. Tarwater, L.C. Mota, K.D. Mena and P.V. Scarpino. 2006. Isolation of antibiotic resistant bacteria from the air plume downwind of a swine confined or concentrated animal feeding operation. Environmental health Perspectives 114:1032–1037. Geert Huys, 2002. Antibiotic susceptibility testing of aquaculture associated bacteria with the dics diffusion method. Ghent University Belgium. Huỳnh Chí Thanh. 2007. Xác định đặc điểm sinh hóa và bước đầu thử nghiệm điều trị bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (Pangasius PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 43 hypophthalmus) bằng kháng sinh. Luận văn tốt nghiệp đại học. Khoa Thủy Sản. Đại học Cần Thơ. Lê Th ị Kim Liên và Nguyễn Th ị Như Ngọc. 2002. Bài giảng thuốc & hóa chất dùng trong thủy sản. Đạ i học Cần Thơ. Lila R and Eleonor A. T. 2004. Laboratory manual of standardized methods for antimicrobial sensitivity tests for bacteria isolated from aquatic animals and environment. Aquaculture Extension Manual 37, 35pp. Mashhadian N V., M R Jaafari., A Nosrati. 2007. Differential toxicity of Rifampin on HEPG2 and HELP2 cells using MTT test and Electron microscope. Pharmacologyonline 3: 405-413. Mshana, R.N., G. Tadesse, G. Abate and H. Miorner. 1998. Use of 3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide for Rapid Detection of Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. 36:1214-1219. Mosmann T.1983.: Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunol Methods. 65:55-63. National Animal Health Monitoring System (NAHMS). 1997. Catfish 97 Study. APHIS/USDA. Washington, D. C. NCCLS. 2002. Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals; Approved standard- second edition. NCCLS document M31- A2 (ISBN 1- 56238-461-9). Nguyễn Chính. 2005. Đánh giá tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh tại An Giang- Cần Thơ. Luận văn cao học, Khoa Thủy Sản, Đạ i học Cần Thơ. Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan. 2007. Phân lập và khảo sát đặc điểm kháng sinh của Edwardsiela ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra, Pangasius hypophthalmus, nuôi thâm canh. Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp, số 1&2/2007. Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh, Từ Thanh Dung và Lê Xuân Sinh. 2005. Bacterial resistance to antimicrobials use in shrimp and fish farms in the Mekong Delta, Vietnam. Proceeding of the international workshop on: Antibiotic Resistance in Asian Aquaculture Environments. Nguyễn Thị Thúy Hằng. 2008. Tiêu chuẩn hóa phương pháp lập kháng sinh đồ trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila tại khoa Thủy sản. Luận văn tốt nghiệp đại học. Khoa Thủy Sản. Đại học Cần Thơ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 44 Raut U., P Narang., DK Mendiratta., R Narang & V Deotale. 2008. Evaluation of rapid MTT tube method for detection of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to rifampicin and isonizad. Indian Journal of Medical Microbiology. 26(3): 222-27. Ribeiro, M O., M.D.S. Gomes, S.G. Senna, M.L.R. Rossetti and L.D.S Fonseca. 2004. Evaluation of rapid microplate assays using cellularviability indicators to determine patterns of susceptibility to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis strains.The Microbiology Institute. Ricki L. 1995. The rise of antibiotic- resistant infections. FDA consumer magazine September 1995. Schrade K., Harries M D. 2006. A rapid bioassay for bactericides against the catfish pathogens edwardsiella ictaluri and flavobacterium columnare. Aquaculture Research. 37(9): 928-937. Shotts, E.B., V.S. Blazer & W.D. Waltman. 1986. Pathogenesis of expermental Edwardsiella ictaluri infections in channel catfish (Ictalurus punctatus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 43:36-42. Stock I., B Wiedemann. 2001. Natural antibiotic susceptibilities of Edwardsiella tarda, E. Ictaluri and E.hoshinae. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45(8): 2245-2255. Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn bệnh học thủy sản 1. 2008. Bộ môn Sinh học & Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần thơ. Tiết Ngọc Trân. 2007. So sánh khả năng gây bệnh của hai dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) và cá nheo mỹ (ictalurus punctatus). Luận văn đại học. Khoa Thủy Sản. Trường Đại học Cần Thơ. Trần Anh Dũng. 2005. Khảo sát tác nhân gây bệnh trong ao nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở An Giang và Cần Thơ. Luận văn cao học. Khoa Thủy Sản. Trường Đại học Cần Thơ. Trần Thị Thu Hằng. 2006. Dược lực học. Nhà xuất bản Phương Đông. trang 629-699. Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh. và Đặng Thụy Mai Thy. 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 2004: 137-142. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 45 Valerie I., J.R. Ronald and R.B. Niall. 1993. Bacterial diseases of fish. Institute of aquaculture. 312p. Zorrilla I., M.C. Balebona and M.A. Morinigo. 2001. Adaptation of an [3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyl tetrazolium bromide] assay to evaluate the cytotoxicity of the extracellular products of micro-organisms pathogenic to fish. Letters in Applied Microbiology 33: 329-333. www.atpvietnam.com, 8/11/2008 www.nafiquaved.gov.vn, 14/11/2008 www.cimsi.org.vn, 18/11/2008 1/12/2008 _mang,_trang_gan_tren_ca_tra,_ca_ba_sa_nuoi_o_An_Giang.html , 1/12/2008 1/12/2008 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 46 PHỤ LỤC I A. Môi trường Môi trường NA NA (nutrient agar) 20g Nước cất 1000ml Hòa tan môi trường NA vào nước cất, sau đó tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút. Để nhiệt độ hạ xuống khỏang 50oC tiến hành đổ môi trường ra đĩa với độ dày khoảng 4mm (khỏang 20ml/ đĩa Petri). Đặt đĩa vào tủ ấm 28-30oC trong 24 giờ để kiểm tra sự nhiễm khuẩn hoặc giữ trong điều kiện nhiệt độ phòng có thể sử dụng đĩa trong 7 ngày. B. Nước muối sinh lý (0,85% NaCl) NaCl 8,5g Nước cất 1000ml Hòa tan 0,85g NaCl vào 100ml nước cất, cho 3ml nuớc muối sinh lý vào từng ống nghiệm thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. C. Ống chuẩn McFarland số 1 (3 x 108 cfu/ml) Ống McFarland 1 3 1% H2SO4 (ml) 9,9 9,7 1% BaCl2 (ml) 0,1 0,3 Mật đổ vi khuẩn khoảng (x108cfu/ml 3 9 D. Dung dịch MTT 10 µl dung dịch MTT ( hòa tan 5mg/ml MTT trong phosphate buffered saline ở pH 7,2) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version