Bên cạnh việc xác định khả năng nhạy của kháng sinh với vi khuẩn gần tương
đương phương pháp kháng sinh đồ, thì thí nghiệm MTT còn giảm được thời
gian khá nhiều.Nếu như trong nghiên cứu này, thời gian làm kháng sinh đồ
nhanh nhất là 3,5 ngày và chậm nhất 6 ngày thì thí nghiệm MTT trên mô tươi
chỉ còn 1,5 ngày. Ngoài ra sử dụng MTT để xác định tính nhạy của kháng sinh
còn giảm giá thành từ7-8 lần so với phương pháp kháng sinh đồ.
55 trang |
Chia sẻ: lylyngoc | Lượt xem: 3301 | Lượt tải: 4
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Nghiên cứu khả năng ứng dụng biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ cơ quan bệnh phẩm mủ gan trên cá tra, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
hiệm. Đặc
biệt phương pháp MTT có thể xác định mật số tế bào trong thể tích nuôi rất
nhỏ. Cũng cùng nhận xét về ưu điểm của MTT, Zorrilla (2001) cho rằng
phương pháp này giúp việc xác định số lượng và so sánh khách quan về nồng
độ gây độc của các sản phẩm ngoại bào trên các vi sinh vật gây bệnh cho cá.
Vì thế kết quả thu được chính xác hơn so với phương pháp đếm truyền thống
với trypan blue.
Ngoài những ưu điểm trên theo Caviedes (2002) sử dụng MTT để xác định sự
mẫn cảm của kháng sinh còn giảm được giá thành trong quá trình tiến hành thí
nghiệm; tác giả cho rằng kiểm tra khả năng đề kháng kháng sinh của mỗi
chủng Mycobacterium tuberculosis cần 7,54$ nếu sử dụng Alamar Blue,
nhưng với MTT giá thành giảm còn 5,04$.
Ứng dụng những thành công trong các nghiên cứu trước đây về thí nghiệm
MTT, Schrader (2006) cũng đã tiến hành thí nghiệm trên đĩa 96 giếng, tìm
hiểu về khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên
cá da trơn và Flavobacterium columnare. Tác giả nhận xét rằng trước đây các
lọai thức ăn thủy sản thường được tẩm các kháng sinh như oxytetracycline,
sulfadimethoxine/ormetoprim; đến năm 2005 florfenicol lại được xem như
một loại kháng sinh có hiệu quả trong việc điều trị bệnh ESC trên cá trơn. Tuy
nhiên do lạm dụng thuốc kháng sinh dẫn đến đã tồn lưu các chất độc hại ảnh
hưởng đến môi trường nước và sức khỏe con người. Vì vậy MTT đựơc xem
như hóa chất có thể đánh giá hiệu quả sử dụng kháng sinh cá da trơn, khi đó
sự phát triển của vi khuẩn sẽ được đánh giá thông qua mật độ hấp thu. Sau khi
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
12
cho MTT vào và ủ 24 giờ, Schrader đã dùng bước sóng 570nm để xác định
mật độ tế bào tồn tại. Qua việc tạo tinh thể formazan đã xác định được giá trị
MIC, MBC, IC50 nhờ vào các số liệu về khả năng hấp thu. Kết quả IC50 (24
giờ) từ thí nghiệm kết hợp kháng sinh được so sánh với đối chứng vi khuẩn
chỉ sử dụng oxytetracycline , florfenicol. Cùng nhận xét như các tác giả trước
đây, Schrader cho rằng phương pháp này thực hiện nhanh, chính xác và mang
lại giá trị kinh tế do có thể thực hiện thí nghiệm được nhiều mẫu.
Cũng vẫn trên nghiên cứu về MTT, Mashhadian (2007) cho rằng môt trong số
những phương pháp sinh hóa xác định mật số tế bào sống trong môi trường
nuôi cấy thì phương pháp MTT được sử dụng rộng rãi nhằm xác định hàm
luợng độc tố trong tế bào. Trong nghiên cứu này, Mashhadian đã tiến hành
trên kháng sinh rifampin được sử dụng trị bệnh lao phổi cho con người. Khác
với những thí nghiệm trước đây, HepG2 (tế bào gây ung thư gan) được nuôi
trong đĩa 96 giếng với mật độ 1000 tế bào/ giếng, ủ với 5% CO2 ở 37oC. Sau
24 giờ Rifampin được thêm vào cho đến khi đạt được nồng độ cuối cùng 5, 10,
2, 50 và 100µM; tiếp tục ủ 48 giờ. Trong thí nghiệm này lượng MTT dùng cao
hơn , 20 µl (5mg/ml) cho mỗi giếng. Các giếng vẫn được ủ 4 giờ (37o C). Sau
đó cho tiếp vào 200 µl dung môi DMSO (dimethylsulfoxide) và 20 µl glycine,
ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Kết quả rifampin không làm giảm nhiều
tế bào ở nồng độ 5µM nhưng lại làm giảm tế bào ở các nồng độ còn lại. Khi
đó số lượng tế bào giảm 12,32%, 37,58%, 55,63% và 77,62% tương ứng ở các
nồng độ 5, 10, 2, 50 và 100µM.
Ngoài ra MTT còn được sử dụng khá phổ biến trong y học, theo nghiên cứu
Trần Quang Tuấn và ctv (www.cimsi.org.vn, 18/11/2008) về mô hình và
chiều hướng đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân sẩy thai liên tiếp, các tác giả đã
sử dụng chứng nghiệm chuyển dạng lympho bào để đánh giá khả nǎng hoạt
động của tế bào lympho cũng như khả nǎng và chiều hướng đáp ứng miễn
dịch của bệnh nhân.
Trong nghiên cứu của Trần Quang Tuấn đã sử dụng nguyên lý đánh giá kết
quả chuyển dạng lympho bào máu ngoại vi theo phương pháp MTT, áp dụng
kỹ thuật tạo màu do Mosmann mô tả nǎm 1983 và cải tiến theo phương pháp
của Denziot nǎm 1986 với nguyên lý: muối tetrazolium (MTT) màu vàng
được chuyển hóa trong ti thể của tế bào sống tạo thành sản phẩm formazan,
tạo ra tỉ lệ thuận giữa quá trình chuyển hóa tế bào và số lượng tế bào đang hoạt
động. Tế bào lympho trong máu của bệnh nhân được nuôi cấy với mật độ 105
tế bào lympho trong 100ml môi trường không có mặt PHA hoặc có mặt PHA
với nồng độ 7,5m g/ml. Sau 48 giờ thêm MTT để có nồng độ cuối cùng là
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
1mg/ml và ủ trong 3 giờ. Cuối giai đoạn ủ, loại bỏ môi trường bằng ly tâm.
Sau đó cho vào mỗi giếng 50ml isopropanol, toàn bộ phiến được lắc mạnh để
hòa tan toàn bộ chất màu formazan do tế bào tạo ra. Kết quả thu được (tính
theo chỉ số OD) đã so sánh khả nǎng hoạt động của tế bào lympho giữa các
nhóm nghiên cứu.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
14
CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: từ tháng 1- 5/2009.
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học & Bệnh thủy sản.
3.2 Nội dung thực hiện
- Phục hồi vi khuẩn từ nguồn vi khuẩn liệt kê ở Bảng 3.1
- Thực hiện kháng sinh đồ 10 chủng vi khuẩn Bảng 3.1 (so sánh mật độ
vi khuẩn với ống McFarland 1, mật độ vi khuẩn khoảng 3x108 cfu/ml)
- Dùng MTT ước lượng mật độ vi khuẩn trong dịch huyền phù từ khuẩn
lạc.
- Dùng MTT ước lượng mật độ vi khuẩntrong dịch mô bệnh phẩm (cá
bệnh).
- So sánh hiệu quả sử dụng kháng sinh giữa phương pháp kháng sinh đồ
và thí nghiệm MTT trên vi khuẩn và mô tươi (cá bệnh).
3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
3.3.1 Đối tượng thí nghiệm
- Cá tra từ các đề tài nghiên cứu gây cảm nhiễm bệnh mủ gan.
3.3.2 Vật liệu
- Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn.
- Ống nghiệm, ống đong, đĩa petri, lame, lamella.
- Chai nấu môi trường, bình tam giác.
- Cá từ, , hộp đầu col, cối nghiền mẫu, cân, bộ tiểu phẫu.
- Que trãi thủy tinh.
3.3.3 Thiết bị
- Kính hiển vi.
- Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy.
- Bếp nấu môi trường, nồi thanh trùng.
- Micropipette, microplate, máy microplate reader.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15
3.3.4 Hóa chất
- Cồn 70o, cồn 96o
- NaCl, nước cất, H2SO4, BaCl2 .
- Isopropanol, HCl, MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide).
- Môi trường phục hồi và nuôi cấy vi khuẩn: Nutrient agar (NA).
- Kháng sinh: ampicilin (AM), choramphenicol (CH) .
- Đĩa kháng sinh: ampicillin, chloramphenicol.
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Chuẩn bị vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sử dụng nghiên cứu từ bộ sưu tập vi khuẩn
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sử dụng nghiên cứu từ bộ sưu tập vi khuẩn của
Bộ môn Sinh học & Bệnh thủy sản. Vi khuẩn được cấy trên môi trường
Nutrient Agar, ủ 48 giờ ở 28-300C. Cho vi khuẩn vào 3 ml nước muối sinh lý
(0.85% NaCl). So sánh mật độ vi khuẩn với ống chuẩn McFarland 1 (mật độ
3x108 cfu/ml) tiến hành pha loãng vi khuẩn ở các mật độ 105, 106, 107và 108
cfu/ml (thí nghiệm MTT). Tương tự, cho vi khuẩn vào 2 ml nước muối sinh
lý. So sánh mật độ vi khuẩn với ống chuẩn McFarland 1 (mật độ 3x108 cfu/ml)
(kháng sinh đồ).
Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài
STT Mã
PTN
Địa điểm Cơ quan phân
lập
1 3B3 Ô Môn- Cần Thơ Thận
2 E3 Ô Môn- Cần Thơ Thận
3 E8
4 CAF260 Châu Phú Thận
5 T8 Thốt Nốt- Cần Thơ Thận
6 A1 Hậu Giang Thận
7 CAF255 Châu Phú Thận
8 STL303
9 CAF258 Châu Phú Tỳ tạng
10 E223 Chủng tham khảo (Từ Thanh Dung, 2002)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
3.4.2 Kháng sinh đồ
- Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường TSA và tách ròng để đạt được
vi khuẩn thuần.
- Kiểm tra độ thuần của vi khuẩn bằng cách nhuộm gram, sau đó cho
khuẩn lạc vào 3ml dung dịch nước muối sinh lý sao cho mật độ vi
khuẩn tương đương với ống chuẩn McFarland 1.
- Cho 100 µl dung dịch vi khuẩn mật độ tương đương ống chuẩn
McFland 1.
- Dùng que trãi tiệt trùng trãi đều dung dịch trên mặt thạch, ủ khoảng 1-2
phút.
- Dùng pel tiệt trùng dán các đĩa kháng sinh lên mặt thạch. Khoảng cách
giữa các đĩa kháng sinh 24mm, giữa vành đĩa Petri và đĩa kháng sinh
10-15mm (Lila và Eleonor, 2004)
- Ủ 24-48 giờ ở 28-300C.
- Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô trùng (mm).
- Đường kính vòng tròn vô trùng đuợc đo bằng mm, dòng vi khuẩn trên
đĩa kháng sinh tương ứng sẽ đuợc xác định là kháng, nhạy hoặc trung
bình dựa theo hướng dẫn của NCCLS (2002)
Nếu đường kính vòng tròn vô trùng
≤ 11mm: kháng
12-15mm: trung bình
≥16mm: nhạy
Bảng 3.2: Đường kính vòng tròn vô trùng một số loại thuốc kháng sinh
Thuốc kháng sinh Kháng Trung bình Nhạy
Ampicillin ≤ 13 mm 14-16mm ≥17mm
Chloramphenicol ≤ 12mm 13-17mm ≥18mm
Sulfamethoxazol/
Trimethoprim
≤10mm 11-15mm ≥16mm
Enrofloxacin ≤ 16mm 17-22mm ≥23mm
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
17
Công thức xác định số lượng vi khuẩn tồn tại theo phương pháp kháng
sinh đồ:
Giả sử rằng sau khi trải dung dịch vi khuẩn lên đĩa thạch, khi đó số lượng vi
khuẩn chứa trong đĩa là 100%. Từ đây ta sẽ tính được % vi khuẩn tồn tại sau
sử dụng kháng sinh:
[(S đĩa thạch-S đường kính vòng tròn vô trùng)/S đĩa thạch]*100
3.4.3 Thí nghiệm MTT (Raut et al. 2008)
Trên vi khuẩn:
- Cho 500 µl dung dịch kháng sinh vào 500 µl dung dịch vi khuẩn mật độ
105, 106 ,107 và 108 cfu/ml. Ủ các dung dịch trong 24 giờ.
- Bố trí 100 µl dung dịch vi khuẩn mật độ 105, 106 ,107 v 108 cfu/ml lần
lượt vào mỗi giếng (mỗi mật độ lặp lại 3 lần).
- Tương tự bố trí 100 µl dung dịch vi khuẩn được ủ kháng sinh vào mỗi
giếng (mỗi mật độ lặp lại 3 lần).
- Mẫu control: 100 µl NB.
- Cho 10 µl dung dịch MTT vào các giếng, ngoại trừ giếng blank.
- Lắc đều mẫu và đem ủ 4 giờ ở 370C.
- Cho 0.1N HCl/isopropanol vào và mix các dung dịch bên trong giếng,
tiếp tục ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Đọc kết quả bằng máy microplate reader (OD = 570nm).
- Quá trình cho mẫu vào giếng 96 được thể hiện trong phụ lục bảng A.
Bảng 3.3: Sơ đồ bố trí mẫu vi khuẩn vào 7 hàng đầu của đĩa 96 giếng.
Sơ đồ được bố trí trên 2 chủng vi khuẩn trong đó:
NB: mẫu đối chứng không có vi khuẩn
5, 6, 7, 8 tương ứng với các mật độ vi khuẩn 105, 106, 107, 108 (cfu/ml).
AM: ampicillin
CH: chloramphenicol
Vk1: vi khuẩn 1
Vk2: vi khuẩn 2
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
18
NB
NB NB NB
mtt
NB
mtt
NB
mtt
8
mtt
vk1
8
mtt
vk1
8
mtt
vk1
6
mtt
vk1
6
mtt
vk1
6
mtt
vk1
5
mtt
vk1
5
mtt
vk1
5
mtt
vk1
7
mtt
vk1
7
mtt
vk1
7
mtt
vk1
5
CH
mtt
vk1
5
CH
mtt
vk1
5
CH
mtt
vk1
6
CH
mtt
vk1
6
CH
mtt
vk1
6
CH
mtt
vk1
7
CH
mtt
vk1
7
CH
mtt
vk1
7
CH
mtt
vk1
8
CH
mtt
vk1
8
CH
mtt
vk1
8
CH
mtt
vk1
5
AM
mtt
vk1
5
AM
mtt
vk1
5
AM
mtt
vk1
6
AM
mtt
vk1
6
AM
mtt
vk1
6
AM
mtt
vk1
7
AM
mtt
vk1
7
AM
mtt
vk1
7
AM
mtt
vk1
8
AM
mtt
vk1
8
AM
mtt
vk1
8
AM
mtt
vk1
6
mtt
vk2
6
mtt
vk2
6
mtt
vk2
8
mtt
vk2
8
mtt
vk2
8
mtt
vk2
7
mtt
vk2
7
mtt
vk2
7
mtt
vk2
5
mtt
vk2
5
mtt
vk2
5
mtt
vk2
5
CH
mtt
vk2
5
CH
mtt
vk2
5
CH
mtt
vk2
6
CH
mtt
vk2
6
CH
mtt
vk2
6
CH
mtt
vk2
7
CH
mtt
vk2
7
CH
vtt
vk2
7
CH
mtt
vk2
8
CH
mtt
vk2
8
CH
mtt
vk2
8
CH
mtt
vk2
5
AM
mtt
vk2
5
AM
mtt
vk2
5
AM
mtt
vk2
6
AM
mtt
vk2
6
AM
mtt
vk2
6
AM
mtt
vk2
7
AM
mtt
vk2
7
AM
vtt
vk2
7
AM
mtt
vk2
8
AM
mtt
vk2
8
AM
mtt
vk2
8
AM
mtt
vk2
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
19
Trên mô thận tươi:
- Tổng số mẫu cá phân tích: 32 mẫu cá bệnh + 4 mẫu cá khỏe.
- Giải phẫu cá bệnh mủ gan, quan sát dấu hiệu bệnh lý ở thận, gan và tỳ
tạng. Phân lập mẫu vi khuẩn ở thận cá bệnh trên môi trường TSA/NA.
- Cho 0.1g mẫu thận cá bệnh (cắt lát mỏng) + 1 ml nước muối sinh lý tiệt
trùng vào ống efpendorf. Dung dịch mẫu mô được dùng cho thí
nghiệm.
- Cho 500 µl dung dịch kháng sinh vào 500 µl dung dịch mô và ủ trong
24 giờ.
- Bố trí 100 µl dung dịch mẫu mô và kháng sinh đã được ủ trong 24 giờ
vào mỗi giếng (mỗi mẫu lặp lại 3 lần)
- Tương tự lần lượt cho 100 µl dung dịch mẫu mô thận tươi của cá bệnh,
100 µl cá khỏe vào mỗi giếng của đĩa 96 (mỗi mẫu lặp lại 3 lần) .
- Mẫu control: 100 µl NB.
- Cho 10 µl dung dịch MTT vào các giếng, ngoại trừ giếng blank.
- Lắc đều mẫu và đem ủ 4 giờ ở 370C.
- Cho 0.1N HCl/isopropanol vào và mix các dung dịch bên trong giếng,
tiếp tục ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Đọc kết quả bằng máy microplate reader (OD = 570nm).
- Quá trình cho mẫu vào giếng 96 được thể hiện trong phụ lục bảng A.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
20
Bảng 3.4: Sơ đồ bố trí mẫu mô vào đĩa 96 giếng
NB
NB NB NB
mtt
NB
Mtt
NB
mtt
ck1
mtt
ck1
mtt
ck1
mtt
ck2
mtt
ck2
mtt
ck2
mtt
ck3
mtt
ck3
mtt
ck3
mtt
ck4
mtt
ck4
mtt
ck4
mtt
cb1
CH
mtt
cb1
CH
mtt
cb1
CH
mtt
cb2
CH
mtt
cb2
CH
Mtt
cb2
CH
mtt
cb3
CH
mtt
cb3
CH
mtt
cb3
CH
mtt
cb4
CH
mtt
cb4
CH
mtt
cb4
CH
mtt
cb1
mtt
cb1
mtt
cb1
mtt
cb2
mtt
cb2
mtt
cb2
mtt
cb3
mtt
cb3
mtt
cb3
mtt
cb4
mtt
cb4
mtt
cb4
mtt
cb1
AM
mtt
cb1
AM
mtt
cb1
AM
mtt
cb2
AM
mtt
cb2
AM
Mtt
cb2
AM
mtt
cb3
AM
mtt
cb3
AM
mtt
cb3
AM
mtt
cb4
AM
mtt
cb4
AM
mtt
cb4
AM
mtt
cb5
mtt
cb5
mtt
cb5
mtt
cb6
mtt
cb6
mtt
cb6
mtt
cb7
mtt
cb7
mtt
cb7
mtt
cb8
mtt
cb8
mtt
cb8
mtt
cb5
AM
mtt
cb5
AM
mtt
cb5
AM
mtt
cb6
AM
mtt
cb6
AM
Mtt
cb6
AM
mtt
cb7
AM
mtt
cb7
AM
mtt
cb7
AM
mtt
cb8
AM
mtt
cb8
AM
mtt
cb8
AM
mtt
cb5
CH
mtt
cb5
CH
mtt
cb5
CH
mtt
cb6
CH
mtt
cb6
CH
Mtt
cb6
CH
mtt
cb7
CH
mtt
cb7
CH
mtt
cb7
CH
mtt
cb8
CH
mtt
cb8
CH
mtt
cb8
CH
mtt
Ghi chú:
NB: mẫu đối chứng không có vi khuẩn
Ck: cá khỏe
Cb: cá bệnh
AM: ampicillin
CH: chloramphenicol
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
21
3.4.4. Xử lý số liệu.
Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm excell với phép xử lý thống kê T-
test.
% tế bào tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm MTT= (giá trị hấp
thu mẫu sử dụng kháng sinh/giá trị hấp thu mẫu không sử dụng kháng
sinh)*100.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
22
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thí nghiệm trên vi khuẩn
4.1.1. Kết quả kháng sinh đồ
Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của 10 chủng vi khuẩn ở Bảng 3.1 được thể
hiện trong Bảng 4.1 (số liệu chi tiết xem phụ lục Bảng B)
Bảng 4.1: Đường kính trung bình vòng vô trùng (mm) của 10 chủng vi
khuẩn
KS
VK
(cfu/ml)
Ampicillin Chloramphenicol
108 107 106 105 108 107 106 105
3B3 30,5 36 40 41 28 30 32 33
E3 22 25 27 31 24 28 29 32
E8 28 39 45 47 33 40 45,5 49
CAF260 28 30 33 37 29 32 36 38
T8 21 35 36 41 9 10 12 16
A1 43 44 45,5 46 58 58,5 59 60
CAF255 41 48 52 58 45 45,5 47 48
STL303 22 24,5 25 28 24 25 26 30
CAF258 9 15 17 18 36 39 42 45
E223 10 12 14 17 29 34 37 43
Qua kết quả Bảng 4.1 cho thấy đường kính trung bình vòng vô trùng của các
chủng vi khuẩn 3B3, E3, E8, CAF260, A1, CAF255, STL303 ở các mật độ
đều dao động từ 22-60mm. Vì thế theo hướng dẫn của NCCLS các chủng vi
khuẩn đều mẫn cảm cao với 2 lọai kháng sinh Ampicillin và Chloramphenicol
ngoại trừ các chủng T8, CAF258, E223 đã có hiện tượng kháng.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
23
Đối với Ampicillin, vi khuẩn mẫn cảm ở tất cả các mật độ (đường kính trung
bình vòng vô trùng 21-58mm) ngoại trừ chủng vi khuẩn CAF258 kháng ở mật
độ 108 (cfu/ml) với đường kính trung bình vòng vô trùng 9mm. Riêng chủng
E223 lại kháng ở mật độ 108 (cfu/ml) có đường kính trung bình vòng vô trùng
10mm và chỉ còn mẫn cảm trung bình ở mật độ 107 (cfu/ml) đo được đường
kính trung bình vòng vô trùng 12mm .
Bên cạnh đó với chloramphenicol, đường kính trung bình vòng vô trùng vi
khuẩn tương đối lớn từ 24-60mm. Do đó các chủng vi khuẩn đều mẫn cảm cao
với chloramphenicol. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả khảo sát của
Stock (2001) về sự nhạy cảm của 102 chủng Edwardsiella (41 chủng E.
iIctaluri) với 71 loại kháng sinh cho rằng các chủng Edwardsiella đều có sự
mẫn cảm tự nhiên đối với chloramphenicol, quinolon, nitrofurantoin,
tetracycline, ngoại trừ chủng T8 có dấu hiệu kháng thuốc (đường kính trung
bình vòng vô trùng từ 9-12mm) ở các mật độ 106-108 (cfu/ml) và nhạy trung
bình ở mật độ 105 (cfu/ml) với đường kính vòng vô trùng 16mm.
Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh.
Bảng 4.2: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh qua phương
pháp kháng sinh đồ.
%
VK
Ampicillin+KSĐ Chloramphenicol+KSĐ
108 107 106 105 108 107 106 105
3B3 88,52 84,00 80,25 79,25 90,32 88,89 87,36 86,56
E3 94,03 92,28 91 88,14 92,89 90,32 89,62 87,36
E8 90,32 82,41 75,00 72,73 86,56 80,25 74,44 73,88
CAF260 88,89 87,75 86,56 83,10 89,62 88,89 87,36 86,56
T8 94,56 84,88 84,00 79,25 99,00 98,77 98,22 96,84
A1 77,17 76,10 74,44 73,88 58,47 57,75 57,02 55,56
CAF255 79,25 71,56 66,62 58,47 75,00 74,44 72,73 71,56
STL303 94,02 92,59 92,28 90,32 92,89 92,28 91,65 88,89
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
24
CAF258 98, 9 97,22 96,43 96,00 84 81,22 78,22 75
E223 98,77 98,22 97,58 96,43 89,62 85,73 83,1 77,17
Qua những số liệu bảng 4.2 nhận thấy rằng lượng vi khuẩn còn tồn tại sau khi
dùng kháng sinh dao động khá lớn trong đó khoảng dao động của vi khuẩn sử
dụng chloramphenicol tương đối rộng 55,56- 99% và ampicillin nhỏ hơn từ
58,47-98,9%.
Bên cạnh đó, kết quả trên cũng cho biết được sau khi sử dụng ampicillin,
lượng vi khuẩn giảm rất nhiều ở các chủng 3B3, E3, E8, CAF260, T8, A1,
CAF255, STL303 chỉ còn 58,47-94,56% và theo kết quả đường kính vòng tròn
vô trùng bảng 4.1 thì được xem là nhạy với ampicillin; trong đó chủng
CAF255 nhạy với ampicillin nhất (58,47%) và nhạy thấp nhất là chủng
E223(97,58%). Riêng mật độ vi khuẩn của E223 vẫn còn khá cao 96,43-
98,77% đối chiếu số liệu đường kính vòng vô trùng Bảng 4.1 thì xem như vi
khuẩn E223 ở mật độ 107cfu/ml (98,22%) đã nhạy trung bình; kháng ở 108
cfu/ml (98,77%). Tương tự thế chủng CAF258 kháng ampcillin với lượng vi
khuẩn còn lại 98,9%.
4.1.2 Kết quả thí nghiệm MTT trên vi khuẩn
a. Sự sai khác giữa vi khuẩn và vi khuẩn sử dụng kháng sinh.
Vi khuẩn Bảng 3.1 được phục hồi và nuôi trong môi trường NB dến mật độ
108 cfu/ml (so với ống chuẩn McFarlant 1). Sau khi thực hiện các bước theo
phương pháp nghiên cứu, cho mẫu vào giếng 96 như Bảng 4.3 và đo bằng
máy microplate reader ở bước sóng 570nm thu được kết quả Bảng 4.4 (chi tiết
được trình bày ở Phụ lục II Bảng C).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
25
Hình 4.1: Mẫu vi khuẩn &MTT
Hình 4.2: Mẫu vi khuẩn &MTT sau khi ủ 4 giờ
Ghi chú:
NB: mẫu đối chứng không có vi khuẩn
Vk1, vk2: vi khuẩn 1, vi khuẩn 2
AM: ampicillin
CH: chloramphenicol
vk2
vk2+CH
vk2+AM
NB
vk1
vk1+CH
vk1+AM
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
26
Bảng 4.3: Sự sai khác của vi khuẩn và vi khuẩn sử dụng kháng sinh qua
thí nghiệm MTT
Nghiệm thức 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tỉ lệ
NB &10^8 + + + - + + + + + + 9+/10
NB&10^7 - + + - + + + + + + 8+/10
NB&10^6 + + + - + + + + + + 9+/10
NB&10^5 - - + - + + + + + + 7+/10
NB&10^8+AM - - - - + - - - + + 7-/10
NB&10^7+AM - - - - + - - - + + 7-/10
NB&10^6+AM - - - - - - - - - - 10-/10
NB&10^5+AM - - - - - - - - - - 10-/10
NB&10^8+CH - - - - + ND - - - - 8-/9
NB&10^7+CH - - - - + ND - - - - 8-/9
NB&10^6+CH - - - - + ND - - - - 8-/9
NB&10^5+CH - - - - + ND - - - - 8-/9
10^8&10^8+AM + + + - + + + + + + 9+/10
10^7&10^7+AM + + - + + + + + + + 9+/10
10^6&10^6+AM + + + + + + + + + + 10+/10
10^5&10^5+AM + + - + - + + + + + 8+/10
10^8&10^8+CH + + + + + + + + + + 10+/10
10^7&10^7+CH + + + + + + + + + + 10+/10
10^6&10^6+CH + + + + + + + + + + 10+/10
10^5&10^5+CH + + + + + + + + + + 10+/10
Ghi chú:
NB: mẫu đối chứng không tồn tại vi khuẩn
AM: ampicillin
CH: chloramphenicol
10^8, 10^7, 10^6, 10^5: mật độ vi khuẩn
(+): có ý nghĩa p<5%
(-): không có ý nghĩa p>5%
ND: không xác định
(1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10) lần lượt tương ứng với các chủng vi
khuẩn 3B3, E3, E8, CAF260, T8, A1, CAF255, STL303, CAF258, E223
Qua bảng kết quả nhận thấy rằng khi sử dụng MTT trong 10 chủng vi khuẩn ở
các mật độ 105-108 (cfu/ml) đã có 9/10 chủng sai khác có ý nghĩa với NB , vì
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
27
thế giúp đánh giá được sự chênh lệch giữa mức độ đục của NB và NB có vi
khuẩn. Bên cạnh đó khi so sánh giữa NB và dung dịch vi khuẩn có sử dụng
ampicillin thấy được rằng không có sự sai khác giữa 2 dung dịch ở mật độ 105
và 106 (cfu/ml) với xác suất rất cao 10/10 chủng vi khuẩn; tuy nhiên ở mật độ
cao hơn là 107 và 108 (cfu/ml) chỉ có 7/10 chủng vi khuẩn sai khác không có ý
nghĩa giữa NB và vi khuẩn dùng ampicillin, còn lại các chủng T8, CAF258,
E223 có kết quả sai khác có ý nghĩa giữa NB và vi khuẩn sử dụng kháng sinh.
Nguyên nhân có thể do vi khuẩn đã kháng với ampicillin nên có sự sai khác
giữa NB và vi khuẩn sử dụng kháng sinh.
Tương tự như thế có 8/10 chủng vi khuẩn không có sự sai khác giữa NB và vi
khuẩn dùng choramphenicol. Qua đấy thể hiện rằng chloramphenicol vẫn còn
nhạy cảm khá cao với 10 chủng vi khuẩn đã nêu trong Bảng 3.1. Trong đó đặc
biệt chủng A1 rất nhạy cảm với chloramphenicol do sau khi sử dụng kháng
sinh mật độ vi khuẩn giảm còn rất thấp, xấp xỉ với giá trị của NB. Riêng với
chủng T8 có kết quả tương tự như CAF258, E223, T8 sử dụng ampicillin; có
sự sai khác giữa NB và chủng T8 sử dụng chloramphenicol, vì thế nguyên
nhân có thể do chủng T8 đã kháng chloramphenicol.
Quan trọng hơn, bảng kết quả trên cũng cho thấy đã có sự sai khác giữa vi
khuẩn và vi khuẩn sử dụng kháng sinh. Với kháng sinh chloramphenicol, qua
thí nghiệm MTT tất cả (10/10) chủng vi khuẩn ở các mật độ 105-108 cfu/ml
đều biệu hiện sự sai khác giữa vi khuẩn có và không có sử dụng kháng sinh;
trong khi đó ở ampicillin bên cạnh sự sai khác có ý nghĩa của các chủng vi
khuẩn vẫn có sự sai khác không có ý nghĩa của chủng E8 (107 cfu/ml và
105cfu/ml), CAF260 ( 108cfu/ml) và T8 (105cfu/ml).
b. Định lượng vi khuẩn còn tồn tại sau khi sử dụng kháng sinh
Bảng 4.4: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí
nghiệm MTT trên vi khuẩn.
KS
VK
(%)
Ampicillin+MTT Chloramphenicol+MTT
10^8 10^7 10^6 10^5 10^8 10^7 10^6 10^5
3B3 67,88 80,50 76,73 75,43 92,83 89,41 97,22 96,97
E3 42,56 49,81 79,08 80,44 67,30 75,85 71,87 66,74
E8 82,02 83,41 60,84 78,36 87,13 86,34 89,74 91,17
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
28
CAF260 67,05 75,78 72,99 75,42 65,32 74,52 71,78 70,05
T8 94,75 84,73 84,02 79,30 99,00 98,78 98,27 96,87
A1 77,80 76,19 74,02 73,28 57,94 57,58 56,87 53,85
CAF255 67,20 70,35 72,36 71,49 63,92 64,94 65,09 63,67
STL303 96,20 103,57 95,18 99,56 90,87 93,62 79,89 97,09
CAF258 75,90 76,70 72,86 81,63 72,79 74,41 71,37 77,45
E223 74,19 77,01 70,06 65,83 71,30 76,76 68,85 62,69
Qua kết quả trên cho thấy với thí ngiệm MTT đã xác định được luợng vi
khuẩn tồn tại sau sử sụng kháng sinh đã giảm khá nhiều từ 42,56- 97,22%
ngoại trừ các chủng T8, STL303 vẫn còn khá cao 79,89-99,56% và chủng
STL303 (mật độ 107cfu/ml) lượng vi khuẩn lại rất cao 103,57%.
Đồng thời bảng số liệu trên cho biết được sau khi sử dụng ampicillin hầu hết
số lượng vi khuẩn đều giảm thấp nhất là 42,56% cho đến cao nhất chỉ còn
94,75%. Riêng chủng STL303 lượng vi khuẩn sau dùng kháng sinh vẫn còn
tương đối cao, lớn hơn 94%. Kết quả này cho thấy rằng trong số các chủng vi
khuẩn thí nghiệm chỉ có STL303 và T8 kháng ampicillin. Tuy tỉ lệ chiếm
không cao nhưng qua đó đã thể hiện được do sử dụng thuốc không đúng liều
lượng , không đúng cách dẫn đến hiện tượng kháng thuốc xảy ra. Theo Đặng
Thị Hoàng Oanh (2005) cho rằng trong 196 dòng vi khuẩn thí nghiệm đã có
78% kháng ampicillin. Sau đó cũng cùng nghiên cứu về khà năng kháng
kháng sinh trên vi khuẩn E. ictaluri, Nam Kha (2006) đã nhận xét vi khuẩn
kháng ampicillin với mức độ khá cao trên 90%.
Bên cạnh đó, với chloramphenicol lượng vi khuẩn cũng đã giảm đáng kể còn
khoảng 53,85- 93,62%, điều này cho thấy rằng chloramphenicol mẫn cảm cao
với E. ictaluri ; kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng
Oanh (2005) trên 196 dòng vi khuẩn phân lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở
ĐBSCL với 6 kháng sinh và kết quả kháng sinh đồ cho thấy số dòng chỉ kháng
chloramphenicol chiếm tỉ lệ 2%. Ngoại trừ kháng ở chủng T8, STL303, 3B3
(>96%), nguyên nhân có thể do các chủng vi khuẩn này được phân lập từ các
ao sử dụng nhiều chloramphenicol. Mặc dù chloramphenicol đã cấm sử dụng
do những tổn hại đến môi trường và sức khỏe cộng đồng nhưng vì hiệu quả trị
bệnh vẫn còn khá cao do đó ở một số vùng nuôi vẫn được dùng. Theo khảo sát
của Nam Kha (2006) trên 101 chủng vi khuẩn phân lập từ nguồn cá trơn ở các
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
29
nông trại với 11 loại kháng sinh thì chloramphenicol đã kháng hoàn toàn
(100%) với các vi khuẩn thu được.
4.1.3. So sánh số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh giữa
phương pháp kháng sinh đồ và MTT.
Mật độ vi khuẩn 108 cfu/ml
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
ST
L3
03 E3
CA
F2
60 T8 A1
CA
F2
55
CA
F2
58
E2
23 3B
3 E8
Vi khuẩn
%
10^8+AM+MTT
10^8+AM+KSD
Hình 4.3: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml còn tồn tại sau khi
sử dụng ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ
Mật độ vi khuẩn 108 cfu/ml
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
ST
L3
03 E3
CA
F2
60 T8 A1
CA
F2
55
CA
F2
58
E2
23 3B
3 E8
Vi khuẩn
%
10^8+CH+MTT
10^8+CH+KSD
Hình 4.4: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml còn tồn tại sau khi
sử dụng chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh
đồ.
Qua 2 biểu đồ trên nhận thấy ở mật độ 108 lượng vi khuẩn còn lại sau khi
dùng kháng sinh trong thí nghiệm MTT đều thấp hơn so với phương pháp
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
30
kháng sinh đồ , ngoại trừ chủng A1 và T8 có giá trị tương đương. Bên canh đó
2 biểu đồ trên còn cho thấy khi sử dụng chloramphenicol hàm lượng vi khuẩn
giảm nhiều hơn so với ampicillin.
Mật độ vi khuẩn 107 cfu/ml
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
ST
L3
03 E3
CA
F2
60 T8 A1
CA
F2
55
CA
F2
58
E2
23 3B
3 E8
Vi khuẩn
%
10^7+AM+MTT
10^7+AM+KSD
Hình 4.5: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 107 cfu/ml còn tồn tại sau khi
sử dụng ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ.
Mật độ vi khuẩn 107 cfu/ml
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
ST
L3
03 E3
CA
F2
60 T8 A1
CA
F2
55
CA
F2
58
E2
23 3B
3 E8
Vi khuẩn
%
10^7+CH+MTT
10^7+CH+KSD
Hình 4.6: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 107 cfu/ml còn tồn tại sau khi
sử dụng chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh
đồ.
Dựa vào 2 biểu đồ trên nhận thấy ở mật độ 107 cfu/ml có nhiều giá trị tương
đương về phần trăm vi khuẩn tồn tại sau dùng kháng sinh giữa 2 phương pháp
hơn so với mật độ 108 cfu/ml; những chủng này tập trung vào chủ yếu là T8,
A1, E8, 3B3. Trong khi đó chủng E3, CAF260, CAF255, CAF255, E223 ở thí
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
31
nghiệm MTT lại có số lượng vi khuẩn tồn tại thấp hơn so với phương pháp
kháng sinh đồ. Tuy nhiên sự chênh lệch này không quá cao ở hầu hết các
chủng trên, chỉ có trường hợp cao nhất ở chủng E3, CAF258 và E223 khi tác
dụng với chloramphenicol.
Ở mật độ này hàm lượng vi khuẩn tồn tại sau khi tác dụng với
chloramphenicol cũng thấp hơn so với ampicillin tương tự như ở mật độ 108
cfu/ml .
Mật độ vi khuẩn 106 cfu/ml
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
ST
L3
03 E3
CA
F2
60 T8 A1
CA
F2
55
CA
F2
58
E2
23 3B
3 E8
Vi khuẩn
%
10^6+AM+MTT
10^6+AM+KSD
Hình 4.7: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 106 cfu/ml còn tồn tại sau khi
sử dụng ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ.
Mật độ vi khuẩn 106 cfu/ml
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
ST
L3
03 E3
CA
F2
60 T8 A1
CA
F2
55
CA
F2
58
E2
23 3B
3 E8
Vi khuẩn
%
10^6+CH+MTT
10^6+CH+KSD
Hình 4.8: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 106 cfu/ml còn tồn tại sau khi
sử dụng chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh
đồ.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
32
Qua biểu đồ ở Hình 4.7 và 4.8 nhận thấy vẫn là chủng T8 và A1 không có sự
chêch lệch về mật độ vi khuẩn tồn tại giữa 2 phương pháp MTT và kháng sinh
đồ. Trong khi đó ở các chủng còn lại đều có phần trăm vi khuẩn ở thí nghiệm
MTT thấp hơn so với kháng sinh đồ. Riêng chủng 3B3, E8 ở mật độ 107cfu/ml
có giá trị tương đương thì sang mật độ 106 cfu/ml lại có lượng vi khuẩn sau sử
dùng chloramphenicol ở phương pháp MTT cao hơn so với kháng sinh đồ.
Mật độ vi khuẩn 105 cfu/ml
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
ST
L3
03 E3
CA
F2
60 T8 A1
CA
F2
55
CA
F2
58
E2
23 3B
3 E8
Vi khuẩn
%
10^5+AM+MTT
10^5+AM+KSD
Hình 4.9: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 105 cfu/ml còn tồn tại sau khi
sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ.
Mật độ vi khuẩn 105 cfu/ml
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
ST
L3
03 E3
CA
F2
60 T8 A1
CA
F2
55
CA
F2
58
E2
23 3B
3 E8
Vi khuẩn
%
10^5+CH+MTT
10^5+CH+KSD
Hình 4.10: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 105 cfu/ml còn tồn tại sau khi
sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh
đồ.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
33
Tương tự thế, ở mật độ 105 cfu/ml chủng 3B3, E8, STL303 có lượng vi khuẩn
sau dùng Chloramphenicol ở phương pháp MTT cao hơn so với kháng sinh
đồ; chủng T8 và A1 không có sự chêch lệch về mật độ vi khuẩn tồn tại giữa 2
phương pháp và các chủng còn lại đều có phần trăm vi khuẩn ở thí nghiệm
MTT thấp hơn so với kháng sinh đồ. Riêng với Ampicillin hầu hết các chủng
vi khuẩn đều có giá trị tương đương ở 2 phương pháp ngoại trừ CAF258 và
E223 ngược lại.
Qua các biểu đồ từ Hình 4.3-4.10 nhận thấy rằng việc sử dụng MTT để xác
định mật độ vi khuẩn còn tồn tại sau sử dụng thuốc kháng sinh gần như tương
đương với phương pháp kháng sinh đồ (T8, A1). Ở các chủng còn lại như
CAF255, CAF258, 3B3, E8 tuy có sự chênh lệch nhưng ở mức độ không cao.
Bên cạnh đó với thí nghiệm MTT, hàm luợng vi khuẩn tồn tại dưới tác dụng
của kháng sinh được xác định thấp hơn so với phương pháp kháng sinh đồ.
Mặt khác các biểu đồ còn cho thấy hầu hết 10 chủng vi khuẩn thí ngiệm vẫn
còn nhạy cảm với 2 loại kháng sinh, trong đó Chloramphenicol còn mẫn cảm
cao với vi khuẩn hơn Ampicillin.
4.1.4 So sánh thời gian xác định tính nhạy của kháng sinh giữa thí nghiệm
MTT và phương pháp kháng sinh đồ.
0
1
2
3
4
5
6
7
ST
L3
03 E3
CA
F2
60 T8 A1
CA
F2
55
CA
F2
58
E2
23 3B
3 E8
Vi khuẩn
N
gà
y KSĐ
MTT
Hình 4.11: Thời gian xác định sự nhạy cảm kháng sinh trên vi khuẩn giữa
thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ .
Qua biểu đồ trên nhận thấy rằng thời gian xác định sự mẫn cảm kháng sinh
của vi khuẩn nhờ vào thí nghiệm MTT đều thấp hơn so với phương pháp
kháng sinh đồ (số liệu chi tiết xem Phụ lục II Bảng E). Thời gian tiến hành thí
nghiệm bằng kháng sinh đồ nhanh nhất là 3,5 ngày và chậm nhất là 6 ngày;
trong khi đó với MTT thời gian đã giảm đi ít nhất 7 giờ (chủng E3, T8) và
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
34
nhiều nhất 19 giờ ở các chủng vi khuẩn còn lại. Nguyên nhân do trong phương
pháp kháng sinh đồ cần có thời gian để vi khuẩn phát triển sau khi đặt đĩa
kháng sinh; riêng thí nghiệm MTT đã giảm được khoảng thời gian trên. Điều
này cũng tương tự với các thí nghiệm trước đây khi sử dụng MTT nghiên cứu
trên các sinh vật khác. Mshana (1998) khi nghiên cứu khả năng đề kháng
rifampin của Mycobacterium tuberculosis cho rằng khi sử dụng MTT thời gian
phát hiện sự nhạy cảm của M. tuberculosis với rifampin ít nhất 3 ngày, trong
khi đó so với phương pháp đếm khuẩn lạc trước đây tốn ít nhất 4-5 tuần.
4.2 Kết quả thí nghiệm trên mô tươi.
4.2.1 Sự sai khác giữa mô bệnh và mô bệnh sử dụng kháng sinh.
Mô thận tươi được cắt thành những lát mỏng và cho vào 1ml nước muối sinh
lý. Sau đó dung dịch mô được thực hiện theo các bước trong phương pháp
nghiên cứu và cho mẫu vào giếng 96 như hướng dẫn ở Bảng 4.6 và đo bằng
máy microplate reader ở bước sóng 570nm thu được kết quả trình bày trong
Bảng 4.7( số liệu chi tiết xem phụ lục II Bảng D)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
35
Hình 4.12: Mẫu mô & MTT
Hình 4.13: Mẫu mô & MTT sau khi ủ 4 giờ
Ghi chú:
NB: mẫu đối chứng không có vi khuẩn
Ck: cá khỏe
Cb: cá bệnh
AM: ampicillin
CH: chloramphenicol
cb
ck
cb+AM
cb+AM
cb+CH
NB
cb+CH
cb
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
36
Bảng 4.5: Sự sai khác giữa mô bệnh và mô bệnh sử dụng kháng sinh .
Nguồn
gốc cá
NB&
ck
NB&
cb
ck&
cb
ck&
cb+AM
ck&
cb+CH
cb&
cb+AM
cb&
cb+CH
1
C1 + + + - - + +
C2 + + + - - + +
C3 + + + - - + +
2
C4 + + - - - + +
C5 + + + - - + +
C6 + + + - + + -
C7 + + + + + + +
C8 + + + + + + +
3 C9 + + + + - + +
2
C10 + + + - - + +
C11 + + + + + + +
C12 + + + + + + +
C13 + + - + + + +
C14 + + + + + + +
C15 + + + + + + +
C16 + + + + + + +
C17 + + + + + + +
C18 + + + + + + +
3
C19 + + - + + + +
C20 + + + - - + +
C21 + + + - - + +
C22 + + + + + + +
C23 + + + + + + +
C24 + + + - + + +
C25 + + + - - + +
C26 + + + + + + +
C27 + + + + + + +
C28 + + + - - + +
C29 + + + + + + +
C30 + + + + + + +
C31 + + + + + + +
C32 + + + + + + +
Tỉ lệ 32+/32 32+/32 29+/32
12-/32;
20+/32
11-/32;
21+/32 32+/32 31+/32
Ghi chú:
1,2 , 3 tương ứng với cá lấy từ nguồn cá cảm nhiễm A1, T8, CAF258
(+): có ý nghĩa với p5%
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
37
CH: chloramphenicol, AM: ampicillin
NB: mẫu đối chứng không có vi khuẩn
ck: cá khỏe, cb: cá bệnh
Qua kết quả Bảng 4.7 thấy rằng cả cá khỏe và cá bệnh đều sai khác có ý nghĩa
với NB tuy nhiên khi so sánh giữa cá khỏe và cá bệnh nhận thấy trong 32 mẫu
cá thí nghiệm thì có 29/32 mẫu đã có sự sai khác giữa cá khỏe và cá bệnh.
Điều này có thể giải thích rằng do trong mô bệnh ngoài mô ra còn có vi khuẩn
vì thế dẫn đến sự chêch lệch khi so sánh hai giá trị này.
Bên cạnh đó, khi so sánh giữa cá khỏe và cá bệnh có kháng sinh nhận thấy
không có sự sai khác với 2 nghiệm thức chiếm tỉ lệ 12/32 (ampicillin), 11/32
(chloramphenicol). Qua đấy cho thấy rằng sau khi ủ với kháng sinh mật độ vi
khuẩn trong mô đã giảm, dẫn đến giá trị giữa mô khỏe và mô bệnh tương
đương nhau; còn lại sai khác có ý nghĩa giữa 2 nghiệm thức với tỉ lệ 20/32
(ampicillin), 21/32 (chloramphenicol) do kháng sinh đã giúp mật độ vi khuẩn
trong mô giảm rất nhiều, vì thế dẫn đến sự sai khác khá lớn ở hai giá trị.
Ngoài ra kết quả Bảng 4.7 còn thể hiện sự sai khác giữa cá bệnh và cá bệnh
được sử dụng kháng sinh , trong 32 mẫu cá thì tất cả đều có sự sai khác giữa
cá bệnh có và không sử dụng kháng sinh; ngoại trừ chloramphenicol được
31/32 mẫu có sự sai khác giữa 2 nghiệm thức trên. Điều này cũng cho thấy
rằng qua thí nghiệm MTT đã xác định được ampicillin và chloramphenicol
đều nhạy cảm với hầu hết 32 mẫu cá.
Qua những nhận xét trên đã thấy được rằng có thể sử dụng MTT trong việc
xác định mức độ nhạy của kháng sinh trên vi khuẩn E.ictaluri. Bên cạnh đó
khi thực hiện trực tiếp thí nghiệm MTT trên mô tươi vẫn có thể xác định mức
độ nhạy giữa kháng sinh và vi khuẩn có trong mô bệnh.
Bảng 4.6: Số lượng (%) tế bào tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí
nghiệm MTT trên mô.
Cá bệnh+AM+MTT Cá bệnh+CH+MTT
Cá 1 62,50 54,10
Cá 2 58,94 62,84
Cá 3 71,46 64,46
Cá 4 93,21 87,13
Cá 5 87,20 80,09
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
38
Cá 6 88,41 98,02
Cá 7 91,54 87,82
Cá 8 91,61 82,84
Cá 9 96,02 90,27
Cá 10 93,21 87,13
Cá 11 85,69 75,73
Cá 12 114,33 112,64
Cá 13 90,63 85,64
Cá 14 89,27 86,54
Cá 15 83,00 82,23
Cá 16 88,27 85,59
Cá 17 83,78 76,24
Cá 18 83,96 82,08
Cá 19 77,70 68,92
Cá 20 76,03 75,32
Cá 21 81,48 83,85
Cá 22 65,59 77,93
Cá 23 85,54 79,79
Cá 24 78,31 88,32
Cá 25 86,07 81,31
Cá 26 83,96 82,99
Cá 27 76,95 68,65
Cá 28 85,00 88,77
Cá 29 64,68 75,79
Cá 30 74,64 69,35
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
39
Cá 31 86,79 83,12
Cá 32 62,50 71,10
Dung dịch mô cá bệnh sẽ có 2 phần là mô và vi khuẩn gây bệnh. Giả sử rằng
lượng mô tồn tại trong mỗi giếng là tương đương nhau (vì thí nghiệm trên
cùng 0,1g thận với mỗi mẫu cá) và khả năng kháng sinh gây ảnh hưởng tế bào
mô như nhau. Nhờ vào điều này qua kết quả Bảng 4.8 nhận thấy rằng lượng tế
bào( mô và vi khuẩn) sau sử sụng kháng sinh giảm khá nhiều, trong 32 mẫu cá
thí nghiệm đã có 31/32 mẫu đều thể hiện mật độ tế bào giảm sau dùng kháng
sinh dao động từ 54,1-98,02%.
Đối với cá bệnh sau khi sử dụng ampicillin, hàm lượng tế bào giảm còn thấp
nhất ở cá 2 (58,94%) , cao nhất ở cá 9 (96,02%) còn phần lớn số mẫu cá còn
lại đều dao động từ 75-93%. Những mẫu cá này lấy từ nguồn cá gây cảm
nhiễm chủng A1, T8, CAF258 (xem phụ lục II bảng D) vì thế khi đối chiếu
với kết quả phần trăm vi khuẩn còn tồn tại cả các chủng này theo phương pháp
kháng sinh đồ (Bảng 4.2) và kết quả MTT trên vi khuẩn (Bảng 4.5) thấy rằng
các giá trị tương đương nhau tuy rằng giá trị ở mô cá vẫn còn cao hơn (chẳng
hạn trong thí nghiệm MTT ở cá 9 được lấy từ nguồn cá gây cảm nhiễm chủng
CAF258 có mật độ vi khuẩn sau sử dụng kháng sinh 96,02%, khi so sánh với
kết quả số lượng vi khuẩn Bảng 4.2 là 96% ). Nguyên nhân do mô cá được sử
dụng trực tiếp vì thế trong quá trình thực hiện thí nghiệm vẫn còn mô lẫn trong
dung dịch dẫn đến giá trị đo của mô thường cao hơn. Vì các giá trị gần tương
đương nhau nên nhờ vào đó có thể xác định được cá còn nhạy hay kháng với
ampicillin (như ở cá 9 khi các giá trị nêu trên xấp xỉ nhau đã cho thấy được cá
vẫn còn nhạy với ampicillin tuy ở mức độ thấp).
Ngoài ra qua bảng kết quả trên còn cho thấy số lượng tế bào tồn tại sau sử
dụng chloramphenicol thấp hơn so với việc dùng ampicillin. Trong 32 mẫu cá
có 24/32 mẫu có phần trăm tế bào tồn tại (mô và vi khuẩn) sau dùng
chloramphenicol thấp hơn so với ampicillin và sự chênh lệch về số lượng tế
bào tồn tại giữa 2 kháng sinh từ 1-10% (kết quả Bảng 4.8). Thông qua đó thấy
rằng chloramphenicol đã phá hủy được các tế bào vi khuẩn tồn tại trong mô
bệnh nhiều hơn so với ampicillin. Qua đây có thể nhận thấy sử dụng MTT tuy
không xác định được chính xác mật số vi khuẩn trực tiếp trên mô bệnh sau khi
sử dụng kháng sinh nhưng có thể so sánh được mức độ nhạy giữa các loại
kháng sinh với nhau.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
40
Bên cạnh việc xác định khả năng nhạy của kháng sinh với vi khuẩn gần tuơng
đương phương pháp kháng sinh đồ, thì thí nghiệm MTT còn giảm được thời
gian khá nhiều. Nếu như trong nghiên cứu này, thời gian làm kháng sinh đồ
nhanh nhất là 3,5 ngày và chậm nhất 6 ngày thì thí nghiệm MTT trên mô tươi
chỉ còn 1,5 ngày. Ngoài ra sử dụng MTT để xác định tính nhạy của kháng sinh
còn giảm giá thành từ 7-8 lần so với phương pháp kháng sinh đồ.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
41
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1 Kết luận
5.1.1 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo kháng sinh đồ
Các chủng vi khuẩn 3B3, E3, E8, CAF260, A1, CAF255, STL303 còn nhạy
cảm với ampicillin và chloramphenicol. Riêng T8 kháng chloramphenicol;
CAF258, E223 kháng ampicillin. Mức độ mẫn cảm của vi khuẩn trên
chloramphenicol cao hơn so với ampicillin.
5.1.2 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo thí nghiệm MTT .
Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh giữa thí nghiệm MTT và
kháng sinh đồ tương đuơng nhau.
Phần trăm vi khuẩn tồn tại sau sử dụng chloramphenicol thấp hơn vi khuẩn sử
dụng ampicillin.
5.1.3 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên mô theo thí nghiệm MTT.
Lượng tế bào tồn tại trong mô cá bệnh (mô và vi khuẩn) khi sử dụng
chloramphenicol thấp hơn so với ampicillin.
5.2 Đề xuất
Hạn chế sự tồn đọng mô trong dung dịch vi khuẩn được lấy từ mô bệnh.
Thực hiện thí nghiệm MTT: trong các khoảng thời gian khác nhau.
Nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn ở các nồng độ kháng sinh khác nhau
bằng thuốc thử MTT.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Benbrook C. 2002. Antibiotic Drug Use in U. S. Aquaculture. IATP Report,
18pp.
Caviedes L., J Delgado., R H Gilman. 2002. Tetrazolium Microplate Assay as
a rapid and inexpensive Colorimetric method for determination of antibiotic
susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. 40(5): 1873-1874.
Crumlish M., T T Dung., J F Turnbull., N T N Ngọc. & H W Ferguson. 2002.
Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish,
Pangasius hypophthalmus (Sauvagel), cultured in the Mekong Delta,
Vietnam. Journal of Diseases. 25: 733-736.
Dixon, B. 2007. Antibiotic resistance of bacterial fish pathogens. Journal of
the World Aquaculure Society 25: 60-63.
Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, T Somsiri, S Chinabut, F
Yussoff, M Shariff, K Bartie, G Huys, M Giacomini, S Berton, J Swings & A
Teale. 2005. Xác định tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phâ lập từ các
hệ thống nuôi thủy sản ở Đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam. Tạp chí
Nghiên cứu khoa học 2005:4 136-144.
Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội.2004.
Bệnh học thủy sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội.423pp.
Ferguson H. W, J. F Turnbull, A. Shin, K. Thompson, T.T Dung and M
Crumlish. 2001. Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus
(Sauvage) from the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Disease
2001:509-513.
Freimoser F M., C.A. Jakob, M. Aebi and U. Tuor. 1999. The MTT [3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay is a fast and
reliable method for colorimetric determination of fungal cell densities.
Applied and Environmental Microbiology. 3727-3729.
Gibbs S G., C.F. Green, P.M. Tarwater, L.C. Mota, K.D. Mena and P.V.
Scarpino. 2006. Isolation of antibiotic resistant bacteria from the air plume
downwind of a swine confined or concentrated animal feeding operation.
Environmental health Perspectives 114:1032–1037.
Geert Huys, 2002. Antibiotic susceptibility testing of aquaculture associated
bacteria with the dics diffusion method. Ghent University Belgium.
Huỳnh Chí Thanh. 2007. Xác định đặc điểm sinh hóa và bước đầu thử nghiệm
điều trị bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (Pangasius
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
43
hypophthalmus) bằng kháng sinh. Luận văn tốt nghiệp đại học. Khoa Thủy
Sản. Đại học Cần Thơ.
Lê Th ị Kim Liên và Nguyễn Th ị Như Ngọc. 2002. Bài giảng thuốc
& hóa chất dùng trong thủy sản. Đạ i học Cần Thơ.
Lila R and Eleonor A. T. 2004. Laboratory manual of standardized methods
for antimicrobial sensitivity tests for bacteria isolated from aquatic animals
and environment. Aquaculture Extension Manual 37, 35pp.
Mashhadian N V., M R Jaafari., A Nosrati. 2007. Differential toxicity of
Rifampin on HEPG2 and HELP2 cells using MTT test and Electron
microscope. Pharmacologyonline 3: 405-413.
Mshana, R.N., G. Tadesse, G. Abate and H. Miorner. 1998. Use of 3-(4,5-
Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide for Rapid Detection
of Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical
Microbiology. 36:1214-1219.
Mosmann T.1983.: Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunol
Methods. 65:55-63.
National Animal Health Monitoring System (NAHMS). 1997. Catfish 97
Study. APHIS/USDA. Washington, D. C.
NCCLS. 2002. Performance standards for antimicrobial disk and dilution
susceptibility tests for bacteria isolated from animals; Approved standard-
second edition. NCCLS document M31- A2 (ISBN 1- 56238-461-9).
Nguyễn Chính. 2005. Đánh giá tình hình sử dụng kháng sinh trong
nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh tại An Giang-
Cần Thơ. Luận văn cao học, Khoa Thủy Sản, Đạ i học Cần Thơ.
Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan. 2007. Phân lập và khảo sát đặc
điểm kháng sinh của Edwardsiela ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra,
Pangasius hypophthalmus, nuôi thâm canh. Tạp chí KHKT Nông Lâm
Nghiệp, số 1&2/2007.
Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh, Từ Thanh Dung và Lê Xuân
Sinh. 2005. Bacterial resistance to antimicrobials use in shrimp and fish farms
in the Mekong Delta, Vietnam. Proceeding of the international workshop on:
Antibiotic Resistance in Asian Aquaculture Environments.
Nguyễn Thị Thúy Hằng. 2008. Tiêu chuẩn hóa phương pháp lập kháng sinh đồ
trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila tại khoa Thủy
sản. Luận văn tốt nghiệp đại học. Khoa Thủy Sản. Đại học Cần Thơ.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
44
Raut U., P Narang., DK Mendiratta., R Narang & V Deotale. 2008. Evaluation
of rapid MTT tube method for detection of drug susceptibility of
Mycobacterium tuberculosis to rifampicin and isonizad. Indian Journal of
Medical Microbiology. 26(3): 222-27.
Ribeiro, M O., M.D.S. Gomes, S.G. Senna, M.L.R. Rossetti and L.D.S
Fonseca. 2004. Evaluation of rapid microplate assays using cellularviability
indicators to determine patterns of susceptibility to isoniazid and rifampin in
Mycobacterium tuberculosis strains.The Microbiology Institute.
Ricki L. 1995. The rise of antibiotic- resistant infections. FDA consumer
magazine September 1995.
Schrade K., Harries M D. 2006. A rapid bioassay for bactericides against the
catfish pathogens edwardsiella ictaluri and flavobacterium columnare.
Aquaculture Research. 37(9): 928-937.
Shotts, E.B., V.S. Blazer & W.D. Waltman. 1986. Pathogenesis of expermental
Edwardsiella ictaluri infections in channel catfish (Ictalurus punctatus).
Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 43:36-42.
Stock I., B Wiedemann. 2001. Natural antibiotic susceptibilities of
Edwardsiella tarda, E. Ictaluri and E.hoshinae. Antimicrobial Agents And
Chemotherapy. 45(8): 2245-2255.
Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn bệnh học thủy sản 1. 2008.
Bộ môn Sinh học & Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần thơ.
Tiết Ngọc Trân. 2007. So sánh khả năng gây bệnh của hai dòng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) và cá
nheo mỹ (ictalurus punctatus). Luận văn đại học. Khoa Thủy Sản. Trường Đại
học Cần Thơ.
Trần Anh Dũng. 2005. Khảo sát tác nhân gây bệnh trong ao nuôi cá tra
(Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở An Giang và Cần Thơ. Luận văn cao
học. Khoa Thủy Sản. Trường Đại học Cần Thơ.
Trần Thị Thu Hằng. 2006. Dược lực học. Nhà xuất bản Phương Đông. trang
629-699.
Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh.
và Đặng Thụy Mai Thy. 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá
tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 2004:
137-142.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
45
Valerie I., J.R. Ronald and R.B. Niall. 1993. Bacterial diseases of fish.
Institute of aquaculture. 312p.
Zorrilla I., M.C. Balebona and M.A. Morinigo. 2001. Adaptation of an [3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyl tetrazolium bromide] assay to evaluate the
cytotoxicity of the extracellular products of micro-organisms pathogenic to
fish. Letters in Applied Microbiology 33: 329-333.
www.atpvietnam.com, 8/11/2008
www.nafiquaved.gov.vn, 14/11/2008
www.cimsi.org.vn, 18/11/2008
1/12/2008
_mang,_trang_gan_tren_ca_tra,_ca_ba_sa_nuoi_o_An_Giang.html , 1/12/2008
1/12/2008
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
46
PHỤ LỤC I
A. Môi trường
Môi trường NA
NA (nutrient agar) 20g
Nước cất 1000ml
Hòa tan môi trường NA vào nước cất, sau đó tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong
15 phút. Để nhiệt độ hạ xuống khỏang 50oC tiến hành đổ môi trường ra đĩa với
độ dày khoảng 4mm (khỏang 20ml/ đĩa Petri). Đặt đĩa vào tủ ấm 28-30oC
trong 24 giờ để kiểm tra sự nhiễm khuẩn hoặc giữ trong điều kiện nhiệt độ
phòng có thể sử dụng đĩa trong 7 ngày.
B. Nước muối sinh lý (0,85% NaCl)
NaCl 8,5g
Nước cất 1000ml
Hòa tan 0,85g NaCl vào 100ml nước cất, cho 3ml nuớc muối sinh lý vào từng
ống nghiệm thanh trùng ở 121oC trong 15 phút.
C. Ống chuẩn McFarland số 1 (3 x 108 cfu/ml)
Ống McFarland 1 3
1% H2SO4 (ml) 9,9 9,7
1% BaCl2 (ml) 0,1 0,3
Mật đổ vi khuẩn khoảng
(x108cfu/ml
3 9
D. Dung dịch MTT
10 µl dung dịch MTT ( hòa tan 5mg/ml MTT trong phosphate buffered saline
ở pH 7,2)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- lv_ttd_thanh_6593.pdf