Nghiên cứu kiểu Plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

vi khuẩn khác khi có sự trợ giúp của plasmid tiếp hợp. v Nhóm plasmid trung gian gọi là nhóm plasmid di chuyển được. Chúng chỉ mang các gen cần thiết cho việc di chuyển. Những plasmid này có thể chuyển với tần suất cao khi có mặt một plasmid tiếp hợp. Dựa vào chức năng chia làm 5 nhóm chính: v Plasmid giới tính, chúng mang nhân tố giới tính F (Fertility Factor). Sự vận chuyển DNA từ tế bào vi khuẩn này sang tế bào vi khuẩn khác nhờ vào các sợi nhung mao hình ống trên bề mặt của vỏ tế bào vi khuẩn, do plasmid F hình thành (Trần Thị Thanh, 2000). v Plasmid mang tính kháng (Resistance-(R) plasmid), mang các gen có khả năng kháng lại các thuốc kháng sinh hay chất độc. v Col-plasmid, chứa các gen mã hóa cho sự tổng hợp colchicine, một protein có thể giết chết các vi khuẩn khác. v Plasmid phân hủy, giúp phân hủy các chất lạ như toluene hay salicylic acid. v Plasmid mang độc tính, làm cho sinh vật trở thành sinh vật gây bệnh. 2.6.2 Plasmid tham gia vào cơ chế tái tổ hợp gen nội bào Khi plasmid nhân đôi nó sẽ tạo ra những vòng dính liền nhau như một chuỗi nhẫn (cấu trúc này gọi là caten). Các caten sẽ đức đoạn, đưa các plasmid về dạng thẳng và nếu như bên cạnh có nhiễm sắc thể của vi khuẩn đang sinh sản cũng bị đức ra thì các đoạn thẳng của plasmid và nhiễm sắc thể của vi khuẩn có thể gắn lại với nhau tạo thành một thể thống nhất. Như vậy, các plasmid của vi khuẩn có thể lọt vào trong phân tử DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn và ngược lại. Những thông tin như vậy sẽ nhân lên và truyền lại cho tế bào con cháu, có thể không giống mẹ nó ở một điểm nào đó. Chính nhờ cơ chế tái tổ hợp gen nội bào này mà ta có thể giải PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 14 thích tại sao xảy ra sự biến đổi tính chất kỳ lạ của vi khuẩn, sự phản ứng tức thì của chúng đáp ứng lại những thay đổi của môi trường ngoài hay khả năng sống sót mãnh liệt của chúng… (Trần Thị Thanh, 2000). 2.6.3 Plasmid có khả năng vận chuyển gen Plasmid có thể làm “vật chủ trung gian” - vector, là những cấu trúc có khả năng tự sinh sản, có khả năng gắn kết vào mình những gen lạ và chuyển giao những gen lạ này cho một tế bào khác. Cùng với việc chuyển giao thông tin di truyền với các cơ thể khác, các plasmid còn truyền cho các tế bào nhận những đặc điểm quan trọng của mình như: tính đề kháng với các chất kháng sinh, kim loại nặng (Hg, Cd…) và tia cực tím. Đặc tính tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp vào quá trình sinh tổng hợp một số chất kháng sinh, trong đó có cả những kháng sinh bị đề kháng bởi chính vi khuẩn đó. Đặc điểm sử dụng nguồn cacbon khó đồng hóa như: Campor, octane, cồn octane… làm nguồn dinh dưỡng (Trần Thị Thanh, 2000). 2.6.4 Ý nghĩa sinh học của plasmid Các tính trạng đọc mã bởi plasmid thường cung cấp cho tế bào chủ ưu thế sinh trưởng và nhờ đó mà các tế bào này thu được ưu thế chọn lọc. Plasmid kháng: Đáng chú ý là các vi khuẩn thể hiện tính đa kháng thuốc được truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua tiếp xúc tế bào đơn giản. Ngày nay ta đã biết các gen của plasmid-R giúp cho vi khuẩn chủ kháng với sunphonamit, streptomixin, chloramphenicol, kanamixin và tetraxiclin. Một số plasmid-R cho tính kháng với 8 kháng sinh, số khác kháng với kim loại nặng, độc. Các plasmid-R thường là tiếp hợp hoặc có thể huy động. Có 2 cơ chế kháng kháng sinh: kháng do plasmid đọc mã và kháng do nhiễm sắc thể đọc mã. Chẳng hạn, tính kháng streptomycin do nhiễm sắc thể dựa vào sự thay đổi của hạt riboxom 30S. Trái lại, tính kháng streptomycin do plasmid lại dựa vào sự biến đổi chất kháng sinh này nhờ enzim (streptomycin bị adenyl hóa). Một đặc tính khác của vi khuẩn cũng do plasmid đọc mã là vi khuẩn có thể tạo thành các protein có khả năng giết chết hoặc kìm hãm sinh trưởng của các loài thân thuộc, các protein có tác dụng đặc biệt này được gọi là bacterioxin (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2007). 2.7 Plasmid và sự kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila Majumdar et al (2007), cho biết việc tồn tại của R-plasmid trong A. hydrophila sẽ ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc bề mặt, sự phát triển và tính độc của chúng khi được cảm nhiễm vào vật chủ. Và R-plasmid này quyết định đến sự phát sinh dịch PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 15 bệnh do A. hydrophila. Ngoài ra, sự hiện hiện hay không R-plasmid của A. hydrophila còn quyết định tính kháng hay mẫn cảm với một loại kháng sinh mà nó đã kháng trước đó. Theo Meyer (1964), vi khuẩn Aeromonas hydrophila được khống chế bởi oxytetracycline. Tuy nhiên, đến năm 1988 trong nghiên cứu của Aoki đã phát hiện một loại plasmid của vi khuẩn này với trọng lượng trung bình 20-30 MDa kháng lại oxytetraxycyline, sự kháng thuốc này hầu như phát triển rộng rãi trong các ao nuôi kể cả ao nuôi lươn và nó có tiềm năng có thể phủ nhận lợi ích của một số chất chống vi khuẩn (Aoki và Egusa, 1971; Toranzo et al., 1983). Aoki (1988) cảnh báo plasmid-R sẽ được tìm thấy trong một vài chủng loài mầm bệnh ở cá không liên quan nhau gồm: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, và Edwardsiella tarda. Bên cạnh đó, Aeromonas hydrophila cũng kháng thụ động lại nhiều kháng sinh như: ampicillin, chloramphenicol, erythromycin, nitrofurantoin, novobiocin, streptomycin, sulphonamides và tetracycline (Aoki, 1988 và De Paola et al., 1988). Cụ thể, có khoảng trên 38% vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ các ao nuôi cá da trơn bệnh kháng lại oxytetracycilne (Trích dẫn bởi B. Austin và D. Austin, 1986). Bên cạnh đó, theo Mitchell & Plumb (1980); Aoki & Egusa (1971) cũng cho thấy R-plasmid là nguyên nhân của việc đa kháng với hầu hết các kháng sinh chloramphenicol, oxytetracycline (Meyer, 1964) and sulphamerazine (Seaman, 1951) đã sử dụng trị các bệnh nhiễm khuẩn do aeromonad (Ansary et al., 1991; Chang & Bolton, 1987. Trích dẫn bởi Inglis et al., 1993). Ngoài ra, từ kết quả nghiên cứu của Saitanu et al (1994), việc chuyển đổi R- plasmid đã được phát hiện từ những chủng A. hydrophila kháng thuốc phân lập trên cá ở Thái Lan. Hầu hết, những R-plasmid được phát hiện đã đọc mã kháng lại kháng sinh chloramphenicol (CP), sulfamonomethoxine (SA), tetracycline (TC). Đặc biệt, việc chuyển R-plasmid ở vi khuẩn phân lập từ Nhật Bản và Đài Loan thì mã hóa kháng lại TC, SA, CP và Streptomycin (SM) (Aoki et al, 1971; Akashi and Aoki 1986). Thêm nữa, trong nghiên cứu này của ông cũng cho thấy hầu hết vi khuẩn kiểm tra kháng với 19 loại kháng sinh mà ông thử nghiệm. Ông còn cho biết kháng sinh TC và SA được sử dụng rất thường trong việc trị bệnh cho cá. Và hầu hết những chủng kháng với TC, SA có chứa R-plasmid (Saitanu et al,1994). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 16 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 05/2009 đến tháng 07/2009 Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản – Khoa Thủy sản – Đại học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn Aeromonas hydrophila được phân lập trên cá tra bệnh xuyết huyết, tất cả vi khuẩn đều đã được định danh tới loài và được trữ ở điều kiện -800C trong glycerol 25% gồm các chủng: TN1.1T, TN2.1G, CA1.3TT, CA1.2T, TN2.4TT, CAF2, SĐ2.1T, CS2.3T. 3.2.2 Dụng cụ - Đĩa petri, chai nấu môi trường 500ml, que trãi thủy tinh, cốc thủy tinh 100ml. - Micropipet 1ml và 5ml, ống nghiệm, hộp đầu col, ống eppendorf, que cấy, đèn cồn, bình xịch cồn, hộp quẹt, lame, lamella, viết lông dầu, găng tay, v.v…. 3.2.3 Thiết bị - Cân điện tử, máy khuấy từ, nồi khử trùng áp suất (autoclave), kính hiển vi. - Tủ sấy khô, tủ cấy vi khuẩn, tủ lạnh, tủ ấm, tủ đông, máy so màu quang phổ. - Máy vortex, bồn điện di, máy li tâm, lò vi sóng… 3.2.4 Hóa chất và môi trường Hóa chất - Nước cất, cồn đốt, cồn tuyệt đối, NaCl, BaCl2 1%, H2SO4 1%. - Đĩa thuốc kháng sinh thương mại (sản phẩm của Biorad) gồm: Ciprofloxacin (CIP, 5mg), Amoxycillin (AMX, 25mg), Colistin (CS, 50mg), Doxycycline (DO, 30mg), Florfenicol (FFC, 30mg), Oxolinic acid (OA, 2mg), Streptomycin (S, 10mg), Norfloxacin (NOR, 10mg) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 17 - Hóa chất nhuộm gram: + Dung dịch 1: crystal violet, ethanol 95%, ammonium oxalate, nước cất. + Dung dịch 2: potassium iodide, iodine, nước cất. + Dung dịch 3: 95% ethanol : 5% acetone. + Dung dịch 4: safranin, ethanol 95%, nước cất. - Tris, EDTA, glucose, sodium hydroxide, SDS, potassium acetate, glacial acetic acid, isopropanol, ethanol, agarose, Ethidium bromide, Loading die. Môi trường - Môi trường nuôi cấy chung TSA (Triptone Soya Agar), nutrient agar (NA): nuôi cấy vi khuẩn. - Môi trường mueller hinton agar (MHA): lập kháng sinh đồ. - Môi trường lỏng nuôi vi khuẩn NB (Nutrient Broth; Merck). 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phục hồi và tách ròng vi khuẩn Theo tài liệu hướng dẫn thực tập chuyên đề bệnh học thủy sản, 2008. Vi khuẩn được lấy từ tủ -800C, rã đông. Sau đó được phục hồi trên môi trường NA và ủ sau 24 giờ ở 28-390C. Quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nếu khuẩn lạc đã rời rạc và đồng nhất thì tiến hành nhuộm gram vi khuẩn để kiểm tra tính thuần. Kết quả nhuộm gram đã thuần thì tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ cũng như xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC và ly trích plasmids. 3.3.2 Phương pháp kiểm tra kháng sinh đồ Theo tài liệu hướng dẫn thực tập chuyên đề bệnh học thủy sản, 2008. Sử dụng ống McFarland số 3 (0,3 ml BaCl2 1% + 9,7 ml H2SO4 1%), khi đó mật độ vi khuẩn tương đương 9x108 CFU/ml (Ống McFarland phải giữ trong bóng tối, nhiệt độ 2-80C và không quá 6 tháng). Dùng que cấy tiệt trùng nhặt một ít khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 5ml nước muối sinh lý tiệt trùng, lắc trộn đều. So sánh độ đục giữa ống nghiệm có chứa vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 18 khuẩn với ống nghiệm chuẩn, điều chỉnh độ đục bằng nước muối sinh lý cho bằng với ống nghiệm chuẩn. Dùng pipet tiệt trùng hút 0,1ml dung dịch vi khuẩn trong ống nghiệm cho lên đĩa môi trường, dùng que trải thủy tinh tiệt trùng trải đều, đậy đĩa petri lại và ủ khoảng 1-2 phút cho mặt thạch tương đối khô. Sau đó dùng pel tiệt trùng dán các đĩa kháng sinh vào đĩa môi trường vi khuẩn. Mỗi đĩa thạch dán tối đa 6 đĩa kháng sinh, các đĩa kháng sinh được dán sao cho khoảng cách giữa 2 đĩa là 24mm, khoảng cách giữa đĩa kháng sinh và mép đĩa petri là 10-15mm. Tất cả đĩa được ủ trong tủ ấm (28-300C) và đọc kết quả sau 24-48 giờ. Đọc kết quả Quan sát trên đĩa petri xuất hiện các vòng tròn vô trùng (không có vi khuẩn phát triển trong vòng tròn) và chỉ có một vòng vô trùng cho một đĩa kháng sinh thì tiến hành đọc kết quả. Kiểm tra kết quả của chủng vi khuẩn chuẩn, nếu các kết quả đúng với các nghiên cứu trước đây thì tiến hành đọc kết quả các chủng vi khuẩn cần xác định kháng sinh đồ, ngược lai thì thí nghiệm cần phải lặp lại. Nếu kết quả cho chủng chuẩn đúng thì dùng thước đo đường kính của các vòng vô trùng (đơn vị tính là mm). Kiểm tra kết quả đo được với bảng đường kính chuẩn của một số loại thuốc kháng sinh (Bảng 3.2), để xác định tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh có thể ở 1 trong 3 cấp độ là kháng, trung bình hoặc nhạy. Bảng 3.1: Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ Kháng sinh ( công ty Biorad) Chuẩn đường kính vòng vô trùng Kháng Trung bình Nhạy Amoxycillin (AMX, 25mg) ≤13 14 - 17 ≥18 Ciprofloxacin (CIP, 5mg) ≤15 16-20 ≥21 Colistin (CS, 50mg) ≤8 9-10 ≥11 Doxycycline (DO, 30mg) ≤12 13-15 ≥16 Florfenicol (FFC, 30mg) ≤16 17-19 ≥20 Oxolinic acid (OA, 2mg) ≤10 - ≥11 Streptomycin (S, 10mg) ≤11 12-14 ≥15 Norfloxacin (NOR, 10mg) ≤12 13-16 ≥17 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 19 3.3.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Phương pháp xác định MIC của thuốc lên vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng (Geert Huys, 2002. Trích dẫn bởi Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008). Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị dụng cụ cần thiết và nuôi vi khuẩn Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường NA ở 280C, ủ qua đêm. Kiểm tra độ thuần của khuẩn lạc, sau đó dùng que cấy tiệt trùng lấy 5 hoặc nhiều hơn các khuẩn lạc (đã kiểm tra tính thuần) nuôi trong 10ml NB, ủ ở 280C, nuôi qua đêm. Các bước thực hiện Chuẩn bị 2 nồng độ kháng sinh gốc từ nguồn kháng sinh nguyên liệu (ống thứ nhất có hàm lượng 1024ppm và ống thứ hai 265ppm). Thuốc phải được pha bằng dung môi phù hợp (theo hướng dẫn của nhà sản xuất). Pha loãng các nồng độ kháng sinh từ nồng độ kháng sinh gốc, bằng cách giảm 1/2 lần nồng độ từ nồng độ 1024ppm đến 4ppm. Hàm lượng thuốc 512ppm và 256ppm được pha từ ống thứ nhất (1024ppm). Hàm lượng thuốc 128ppm, 64ppm,...,4ppm được pha từ ống gốc thứ 2 (256ppm) bằng cách thêm nước muối sinh lý. Mật độ vi khuẩn được xác định bằng máy so màu quang phổ và hiệu chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường NB cho đạt OD = 0,1 ± 0,02, mật độ vi khuẩn đạt khoảng 108 cfu/ml. Cho 2ml dung dịch vi khuẩn đã được hiệu chỉnh ở mật độ 108 cfu/ml vào 2ml dung dịch kháng sinh với các nồng độ khác nhau. Khi đó ở mỗi nồng độ thuốc sẽ giảm đi một nửa (Bảng 3.3). Mỗi nhóm MIC có 1 ống đối chứng âm (2ml NB + 2ml nước muối sinh lý), 1 ống đối chứng dương (2ml dung dịch nuôi vi khuẩn + 2ml nước muối sinh lý). Mỗi chủng vi khuẩn sau khi điều chỉnh mật độ phải được cấy trên môi trường NA để kiểm tra sự thuần chủng và phải được ủ trong cùng điều kiện với các ống MIC ở 28-300C trong 24 giờ (hoặc khi vi khuẩn trong ống đối chứng dương phát triển). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 20 Đọc kết quả Trước tiên phải kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn trên đĩa NA. Nếu phát hiện có sự tạp nhiễm thì không đọc kết quả MIC. Xác định kết quả bằng cách so sánh độ đục của mỗi ống MIC với ống đối chứng âm (đối chứng âm không bị nhiễm) và đối chứng dương. Các ống phát triển không liên tục nên loại bỏ. MIC được xác định ở nồng độ kháng sinh thấp nhất mà vi khuẩn không phát triển. Trường hợp vi khuẩn phát triển ở tất cả các nồng độ thì giá trị MIC được xác định ở ống nghiệm có hàm lượng thuốc mà sự phát triển của vi khuẩn giảm khoảng 80% so với ống trước đó. Bảng 3.2: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho một chủng) Số MIC Hàm lượng cuối cùng (ppm) Thể tích dung dịch thuốc (ml) Thể tích vi khuẩn (ml) 1 512 2 (1024ppm; ống 1) 2 2 256 2 (512ppm; ống 2) 2 3 128 2 (256ppm; ống 3) 2 4 64 2 (128ppm; ống 4) 2 5 32 2 (64ppm; ống 5) 2 6 16 2 (32ppm; ống 6) 2 7 8 2 (16ppm; ống 7) 2 8 4 2 (8ppm; ống 8) 2 9 2 2 (4ppm; ống 9) 2 3.3.4 Phương pháp ly trích plasmid DNA vi khuẩn Theo phương pháp ly trích plasmid DNA vi khuẩn của Bartie (2004) Ly trích plasmid vi khuẩn - Vi khuẩn Aeromonas hydrophila được nuôi trong môi trường NB trên máy lắc 180 r.p.m. - Cho 1.5ml dung dịch vi khuẩn vào ống eppendofl đem li tâm trong 2 phút ở 14000 vòng, ở 4oC. Bỏ phần dịch nổi, thêm 1,5ml dung dịch vi khuẩn và đem ly tâm. Lấy phần viên. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 21 - Cho vào 1ml dung dịch STE lạnh. Vortex. Ly tâm 14000 vòng trong 2 phút. Thu lấy phần viên. - Cho vào 250µl dung dịch 1 + 10µg/ml RNase A lạnh. Vortex để viên vi khuẩn tan - Thêm vào 250µl dung dịch 2, lắc nhẹ. - Thêm 300µl dung dịch 3 lạnh. - Ủ hỗn hợp trên trong nước đá 5 phút. - Ly tâm ở 14000 vòng trong 10 phút . - Cho phần dịch nổi ở trên sang ống eppendofl mới . - Cho isopropanol vào với thể tích bằng với thể tích dịch nổi thu được. Ly tâm ở 14000 vòng trong 10 phút. Thu lấy phần viên. - Rửa phần viên với 500µl ethanol 70%. Phơi khô phần viên trong 10 phút. - Hòa tan phần viên trong 20µl-50µl TE và trữ lạnh. Chạy điện di Chuẩn bị bản gel 0,8% trong dung dịch đệm 1X TAE: cho 0,8g agarose + 100ml 1X TAE vào chai 250ml đun nóng cho đến khi agarose tan hòan toàn. Khi nhiệt độ khoảng 550C cho vào gel 0,25µg/ml Ethidium bromide và cho gel vào khuôn. Load mẫu: Dùng pipette cho 15µl mẫu và 5µl glycerol cho vào mỗi giếng Tiến hành diện di ở dòng điện 60V ở 40C, khi mẫu chạy được khoảng 1 giờ tiến hành chụp hình gel và khi chạy được 1,5 giờ thì chụp hình lần nữa. Đọc kết quả Sử dụng E.coli 39R861 (147kb), và E.coli V517 (54kb) làm thang plasmid chuẩn. Sự hiện diện vạch của trọng lượng phân tử plasmid, cho thấy phương pháp ly trích thành công. Nếu vạch trọng lượng phân tử plasmid hiện không rõ ràng thì thực hiện lại phương pháp ly trích plasmid. Nếu trọng lượng plasmid không hiện thì lặp lại phương pháp ly trích plasmid ít nhất hai lần để xác định mẫu không có plasmid. 3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng các phần mềm Microsoft word, Microsoft excel để viết báo cáo cũng như tính toán và xử lý số liệu. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 22 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ với vi khuẩn Aeromonas hydrophila Tổng cộng có 8 chủng A. hydrophila (CA1.2T, CA1.3TT, CS2.3T, TN1.1T, TN2.4TT, SĐ2.1T, CAF2, TN2.1G) được phục hồi và nuôi cấy trên môi trường thạch NA (Hình 4.1). Sau đó xác định tính thuần của vi khuẩn thông qua kết quả nhuộm Gram (Hình 4.2). Sau khi vi khuẩn đã được kiểm tra tính thuần, thì được nuôi trong môi trường NB trong 24 giờ và tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ với 8 loại kháng sinh gồm: Amoxicillin (AMX, 25mg), ciprofloxacin (CIP, 5mg), colistin (CS, 50mg), florfenicol (FFC, 30mg), doxycycline (DO, 30mg), oxolinic acid (OA, 2mg), streptomycin (S, 10mg), norfloxacin (NOR, 10mg) (Bảng 4.1). Hình 4.1: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên môi trường NA Hình 4.2: Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Aeromonas hydrophila PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 23 Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ Kháng sinh Đường kính trung bình vòng vô trùng (mm) CAF2 TN1.1T CA1.3 TT TN2.4T T CA1.2 T CS2.3 T TN2.1 G SĐ2.1 T Amoxycillin (AMX, 25mg) R 0 9 9 9 8 9 10 I S 18 Ciprofloxacin (CIP, 5mg) R 0 I S 21 23 23 29 22 25 25 Colistin (CS, 50mg) R I 10 10 S 12 11 11 12 11 12 Doxycycline (DO, 30mg) R 9 I S 26 30 26 30 25 26 32 Florfenicol (FFC, 30mg) R 10 I S 30 34 30 31 20 31 35 Oxolinic acid (OA, 2mg) R 0 0 0 I S 19 18 19 20 19 Streptomycin (S, 10mg) R 0 I S 17 20 18 18 16 17 21 Norfloxacin (NOR, 10mg) R 0 I 15 S 20 23 21 25 22 23 Ghi chú: R-Kháng, I-Trung bình, S-Nhạy S FFC AMX CIP Hình 4.3: Kết quả kháng sinh đồ với vi khuẩn Aeromonas hydrophila PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 24 Từ kết quả trên cho thấy, kháng sinh amoxycillin kháng với hầu hết các chủng nghiên cứu, chỉ duy nhất 1 chủng (CS2.3T) khảo sát mẫn cảm với kháng sinh này (với đường kính vòng vô trùng là 18mm). Điều này cho thấy Aeromonas hydrophila gần như kháng hoàn toàn với amoxicillin. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) với vi khuẩn A. hydrophila đã cho kết quả kháng với amoxicillin. Bên cạnh đó, theo Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc (2006) thì Aeromonas cũng đã kháng với amoxicillin. Theo kết quả khảo sát của Phan trọng Duy (2007) và Châu Hồng Thúy (2008) thì kháng sinh amoxycillin được người nuôi sử dụng rộng rãi (có trên 70% số hộ khảo sát). Đây có thể là nguyên nhân gây nên hiện tượng kháng amoxicillin ở vi khuẩn này. Đối với các kháng sinh ciprofloxacin, doxycycline, florfenicol, streptomycin, colistin và norfloxacin, đều cho kết quả nhạy với hầu hết các chủng nghiên cứu. Trong đó, có 1/8 chủng nhạy trung bình với norfloxacin và 2/8 chủng với colistin. Tuy nhiên, các kháng sinh này (ngoại trừ colistin) thì gần như bị kháng hoàn toàn bởi chủng CAF2. Điều này cũng đã được Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) kết luận chủng CAF2 đã kháng với doxycycline. Như vậy, các kháng sinh ciprofloxacin, doxycycline, florfenicol, streptomycin, colistin và norfloxacin vẫn có thể sử dụng để trị bệnh trên cá do vi khuẩn A. hydrophila. Cụ thể, theo hướng dẫn của Từ Thanh Dung và ctv (2005), Bùi Quang Tề (2008) thì doxycycline và streptomycin có thể dùng để trị bệnh do A. hydrophila gây ra. Gần đây, từ kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) và Nguyễn Minh Nhí (2007) trên vi khuẩn A. hydrophila cũng cho kết quả mẫn cảm với các kháng sinh norfloxacin, oxolinic acid, amoxicillin, colistin, streptomycin, và doxycycline. Bên cạnh đó, theo kết quả nghiên cứu của Saitanu et al., (1994) trên 68 chủng A. hydrophila phân lập trên cá nuôi ở Thái Lan cũng cho kết quả hầu hết nhạy với các kháng sinh norfloxacin, ciprofloxacin, streptomycin. Riêng kháng sinh oxolinic acid lại cho thấy việc sử dụng chúng để trị bệnh do A. hydrophila là cần phải cân nhắc. Bởi từ kết quả thu được có 3/8 chủng sử dụng cho kết quả kháng hoàn toàn, 5/8 chủng nhạy ở mức khá cao (dao dộng từ 18- 20mm) và nhiều kết quả nghiên cứu khác như: Jitkasem (1994) A. hydrophila kháng với oxolinic acid, Cao Tuấn Anh và ctv (2006) thì vi khuẩn này lại bị khống chế bởi oxolinic acid (Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 25 Bên cạnh đó, thì kết quả kháng sinh đồ còn cho thấy xuất hiện hiện tượng đa kháng thuốc ở vi khuẩn (một chủng vi khuẩn kháng đồng thời từ 2 loại kháng sinh trở lên). Biểu hiện ở các chủng: CA1.3TT và SĐ2.1T kháng với AMX+OA, CAF2 kháng với 7/8 loại kháng sinh (AMX, OA, S, CIP, NOR, FFC, DO) thử nghiệm. Hiện tượng đa kháng thuốc trên vi khuẩn phân lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở ĐBSCL cũng được Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2005) đề cập với khoảng 59% dòng vi khuẩn (trong 196 dòng) nghiên cứu kháng với 4 hay loại kháng sinh thử nghiệm. Từ đó, ta có thể thấy việc kháng thuốc của vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản là một vấn đề cần phải quan tâm. Bởi cùng một loại kháng sinh nhưng lại cho kết quả kháng sinh đồ khác nhau rất nhiều trong cùng một loài cũng như trong các nghiên cứu với nhau. Sự khác biệt trên có thể do phương thức và mức độ sử dụng thuốc trong quá trình nuôi của người dân giữa các vùng là khác nhau. Chẳng hạn, ở một ao nuôi nào đó thường xuyên sử dụng nhóm quinolones để trị bệnh do A. hydrophila thì nguy cơ vi khuẩn này kháng với các kháng sinh thuộc nhóm quinolones là rất cao. Nhưng với ao nuôi khác không sử dụng kháng sinh nhóm quinolones thì khả năng kháng các kháng sinh thuộc nhóm này là rất thấp. Trong nghiên cứu của Saitanu et al (1994) trên A. hydrophila, cũng đã cho thấy trong 19 kháng sinh sử dụng có 2 kháng sinh: sulfamonomethoxine (SA) và tetracycline (TC) kháng hoàn toàn với 68 chủng nghiên cứu, thì 2 kháng sinh này được sử dụng thường xuyên trong quá trình nuôi. Mặc khác, việc kháng thuốc của vi khuẩn còn có thể do người nuôi sử dụng thuốc bừa bãi, không đúng quy tắc sử dụng thuốc an toàn và chưa nắm vững những tác hại của việc phối hợp thuốc không đúng cách trong điều trị. Hàng loạt các kết quả khảo sát của Nguyễn Thị Phương Nga (2004), Phạm Thanh Tuấn (2004), Nguyễn Chính (2005), Phan Trọng Duy (2007), và Nguyễn Tấn Duy Phong (2008) cũng cho thấy đa phần các hộ được điều tra cho biết việc sử dụng thuốc để trị bệnh cá, tôm là do kinh nghiệm cá nhân. Còn về nguồn gốc của thuốc thì không rõ ràng, không nhãn mác của nhà sản xuất và liều lượng sử dụng cũng là do kinh nghiệm, mà một số kháng sinh họ dùng là kháng sinh nguyên liệu hoặc dựa vào sự mô tả của người nuôi thì các cửa hàng kinh doanh thuốc cũng kê đơn. Thêm nữa, thời gian điều trị không đúng, cũng như thời gian ngưng thuốc cũng không đúng và đặc biệt việc sai quy tắc về phối hợp kháng sinh cũng không nằm ngoài những nguyên nhân gây nên vi khuẩn kháng thuốc, ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng sức khỏe cộng đồng mà đa phần các hộ nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL đang mắc phải. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 26 Không riêng về kháng sinh vi khuẩn đã kháng mà tất cả các kháng sinh, khi dùng để trị bệnh cho động vật thủy sản đều cần đến hướng dẫn của cán bộ chuyên môn. Một mặt để tránh việc điều trị gặp nhiều khó khăn do vi khuẩn kháng thuốc, mặt khác nhằm bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng. Bởi theo Wegener et al., (1999) và Inglis (2000) thì các chất diệt khuẩn trong đó có kháng sinh có thể đưa vào môi trường nước qua thức ăn, từ thức ăn thừa có trộn thuốc hoặc từ sản phẩm bài tiết của vật nuôi. Những yếu tố đặc biệt nguy hiểm cho sự hình thành tính kháng thuốc là việc sử dụng thuốc ở mức độ thấp hơn liều dùng để chữa trị và sự kết hợp một cách bất hợp lý các loại thuốc kháng sinh (Wegener et al., 1999; Inglis, 2000; Threlfall et al., 2000. Trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng và ctv 2005) Cụ thể, theo kết quả nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng và ctv (2005) cho thấy phần lớn các dòng (196 dòng) vi khuẩn thí nghiệm có thể kháng với nhiều loại kháng sinh, trong đó có 59% dòng vi khuẩn kháng với 4 hay 5 loại kháng sinh. Đại diện cho nghiên cứu này là chủng CAF2 có 7/8 kháng sinh sử dụng bị kháng. Từ những lý do trên, ta có thể hiểu rõ hơn việc khác biệt trong những nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn. Để có kết quả tốt trong điều trị, phải cần đến sự hướng dẫn của cán bộ thú y, càng tốt nếu trước khi sử dụng kháng sinh để trị bệnh cá ta tiến hành lập kháng sinh đồ với phương pháp chuẩn, nhằm biết rõ loại kháng sinh có thể sử dụng cho ao cá tôm của mình, sẽ mang lại hiệu quả cao hơn khi tự ý sử dụng và tránh được những điều đáng tiết có thể xảy ra. Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2005), Từ Thanh Dung và ctv (2005) và Từ Thanh Dung (2008), cũng khuyến cáo nên sử dụng thuốc đúng thời điểm, đúng bệnh và đúng cách, thêm nữa là khi cá vừa mới chớm bệnh (phát hiện bệnh sớm) thì kết quả điều trị sẽ rất tốt. Và với thời điểm hiện nay thì việc lập kháng sinh đồ khi sử dụng thuốc kháng sinh trị bệnh cá, tôm là rất cần thiết. 4.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Qua kết quả kháng sinh đồ chọn ra các loại kháng sinh mà vi khuẩn mẫn cảm để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh với vi khuẩn A. hydrophila. Do giới hạn của đề tài nên chỉ xác định giá trị MIC của streptomycin với vi khuẩn A. hydrophila. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 27 Kết quả xác định giá trị MIC của streptomycin với 8 chủng vi khuẩn A. hydrophila cho thấy có 7/8 chủng bị bức chế bởi streptomycin, có giá trị MIC dao động từ 4-16ppm và chỉ có 1/8 chủng cho kết quả kháng với giá trị MIC ở 256ppm (Hình 4.4). Hình 4.4: Kết quả MIC của streptomycin với vi khuẩn Aeromonas hydrophila Như vậy, trong 8 chủng nghiên cứu thì có 7 chủng cho kết quả nhạy và chỉ duy nhất một chủng (CAF2) kháng với streptomycin ở mức 256ppm. Kết quả MIC của chủng CAF2 hoàn toàn phù hợp với kết quả kiểm tra kháng sinh đồ trong đề tài và kết quả nghiên cứu kháng sinh đồ của Huỳnh Thị Phượng Quyên (2008) cũng cho thấy CAF2 kháng với streptomycin. Tuy nhiên, nhìn chung trong số vi khuẩn cho kết quả nhạy thì có 3/8 chủng có giá trị MIC khá cao (16ppm). Điều này có thể thấy ở kết quả kháng sinh đồ, thì kháng sinh streptomycin cho kết quả nhạy nhưng không cao (Bảng 4.1). Bên cạnh đó, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Minh Nhí (2007) trên vi khuẩn A. hydrophila cũng đã cho kết quả nhạy trung bình với streptomycin. Ngoài ra, theo Crumlish et al., (2006) vi khuẩn A. hydrophila phân lập trên cá tra nuôi ở ĐBSCL cũng mẫn cảm với streptomycin. Cũng từ kết quả nghiên cứu của Saitanu et al (1994), trong 68 chủng Aeromonas hydrophila phân lập trên cá nuôi từ Thái Lan thì tất cả được xác định là kháng với ampicillin. Có 14 chủng nhạy cảm với 18/19 loại kháng sinh sử dụng gồm: Cefazolin, chloramphenicol, kanamycin, furazolidone, sulfamonomethoxine, streptomycin, tetracycline, trimethoprim, Flumequine, miloxacin, nalidixic acid, 37.5% 0 4 8 8 8 16 16 16 256 0 50 100 150 200 250 300 CS2.3T CA1.2T TN2.4TT CA1.3TT TN1.1T SĐ2.1T SĐ2.1T CAF2 Chủng vi khuẩn G iá tr ị M IC (p pm ) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 28 oxolinic acid, piromidic acid, pipemidic acid, ciprofloxacin, enoxacin, norfloxacin and ofloxacin ngoại trừ ampicillin. Trong khi 54 chủng còn lại kháng với Cefazolin, chloramphenicol, streptomycin, tetracycline, sulfamonomethoxine, trimethoprim. Kết quả kiểm tra MIC trên 30 chủng A. hydrophila phân lập trên cá với streptomycin cho thấy có khoảng 25/30 chủng có giá trị MIC dao động từ 6- 25ppm (mg/ml) và 5 chủng có MIC dao động 50-100ppm. Ngoài ra, ông còn cho biết việc kháng một loại thuốc nào đó của vi khuẩn có thể là do việc sử dụng kháng sinh này thường xuyên trong quá trình nuôi trị bệnh do vi khuẩn gây ra. Từ đó, cho thấy kháng sinh streptomycin vẫn còn khả năng khống chế vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá. Mặc khác, chúng ta có thể nhận định rằng việc kháng một loại kháng sinh, hay giá trị MIC xác định của một loại kháng sinh nào đó có liên quan đến mức độ và việc thường xuyên sử dụng kháng sinh đó để trị bệnh cho đối tượng nuôi. Hình 4.5: Kết quả MIC ở nồng độ 256ppm (mũi tên) Ống 1: Đối chứng âm (-); ống 2: 2ppm; ống 3: 4ppm; ống 4: 8ppm; ống 5: 16ppm; ống 6: 32ppm; ống 7: 64ppm; ống 8: 128ppm; ống 9: 256ppm; ống 10: 512ppm; ống 11: Đối chứng dương (+) 4.3 Kết quả ly trích plasmid của vi khuẩn A. hydrophila Tương tự việc kiểm tra kháng sinh đồ và MIC, với quá trình ly trích plasmid vi khuẩn cũng được kiểm tra tính thuần và được nuôi trong ống nghiệm 10ml NB. Sau đó tiến hành ly trích plasmid và điện di xác định kiểu plasmid của vi khuẩn A. hydrophila (Hình 4.6). 1 2 3 4 5 6 7 8 2 9 10 11 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 29 Hình 4.6: Kết quả điện di trên 8 chủng Aeromonas hydrophila Giếng M: CAF9; Giếng 1: CAF2; giếng 2: TN1.1T; giếng 3: CA1.3TT; giếng 4: TN2.4TT; giếng 5: CA1.2T; giếng 6: CS2.3T; giếng 7: TN2.1G; giếng 8: SĐ2.1T Kết quả điện di trên cho thấy chỉ có sự hiện diện vạch plasmid của 2 chủng CA1.2T và CA1.3TT. Các chủng còn lại thì không xác định được vạch plasmid của chúng. Trong 2 chủng xác định plasmid thì chúng có kiểu plasmid khác nhau, thể hiện hai vạch plasmid không tương đương nhau. Trong đó vạch ở giếng số 3 (chủng CA1.3TT) không biểu hiện rõ như vạch ở giếng số 5 (chủng CA1.2T). Bên cạnh đó, trong kết quả kháng sinh đồ chủng CA1.3TT thể hiện tượng đa kháng thuốc (kháng với AMX và OA), trong khi chủng CA1.2T chỉ kháng 1 trong 8 loại kháng sinh đã thử nghiệm. Như thế, có thể giả thiết rằng việc biểu hiện vạch plasmid của chủng CA1.2T khi điện di là do vi khuẩn này có plasmid kháng thuốc bởi sự tác động của các loại kháng sinh khác (ngoài các loại kháng sinh đề tài đã sử dụng). Hoặc, cũng có thể do plasmid của chủng CAF2 có được không mang gen kháng thuốc. Mặc khác, trong khi các chủng còn lại cũng kháng với một loại kháng sinh (amoxicillin) nhưng không thể hiện vạch plasmid và chủng CAF2 đã kháng với 7/8 loại kháng sinh sử dụng cũng không cho kết quả vạch plasmid khi điện di. M 1 2 3 4 5 6 7 8 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 30 Điều này có thể do những chủng chỉ kháng 1 loại kháng sinh là bởi chúng không hình thành plasmid kháng thuốc (R-plasmid), mà việc kháng thuốc này được hình thành trong quá trình sử dụng thuốc của người nuôi. Riêng việc không cho kết quả vạch plasmid của chủng CAF2 trong khi chủng này thể hiện hiện tượng đa kháng thuốc, có thể do nhiễm sắc thể của vi khuẩn này đọc mã cho khả năng kháng thuốc trên. Theo Nguyễn Lân Dũng và ctv (2007), việc kháng thuốc ở vi khuẩn ngoài do plasmid của vi khuẩn đọc mã thì việc kháng thuốc còn do nhiễm sắc thể đọc mã, dựa vào sự thay đổi hạt riboxom 30S của chúng. Trái lại, tính kháng kháng sinh do plasmid lại dựa vào sự biến đổi chất kháng sinh này nhờ vào tác dụng của một enzim. Điển hình với kháng sinh streptomycin thì kháng sinh này sẽ bị adenyl hóa bởi enzim khi sự kháng thuốc ở vi khuẩn được plasmid đọc mã. Mặc khác, theo Nguyễn Hoàng Lộc và ctv (2007) việc hiện diện có hoặc không có vạch plasmid có thể do vi khuẩn có hay không có plasmid và có thể plasmid nằm trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn ở dạng tái tổ hợp với nhiễm sắc thể vi khuẩn. Bên cạnh đó, theo Majumdar et al., (2007), việc tồn tại của R-plasmid trong A. hydrophila sẽ ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc bề mặt, sự phát triển và tính độc của chúng khi được cảm nhiễm vào vật chủ. Và R-plasmid này quyết định đến sự phát sinh dịch bệnh do A. hydrophila. Ngoài ra, sự hiện diện R-plasmid hay không của A. hydrophila còn quyết định tính kháng hay mẫn cảm với một loại kháng sinh mà nó đã kháng trước đó. Cụ thể, trong nghiên cứu của ông trên vi khuẩn A. hydrophila (được ký hiệu là Wt-VB21) mang plasmid với trọng lượng khoảng 21kb (kilobazơ) thì chủng này đa kháng với hầu hết kháng sinh: gatifloxacin (5mg), ampicillin (10mg), erythromycin (15mg), cefuroxime (30mg), chloramphenicol (30mg) và tetracycline (30mg). Từ kết quả nghiên cứu của Saitanu et al., (1994), cho thấy việc chuyển đổi R- plasmid đã được phát hiện từ những chủng A. hydrophila kháng thuốc phân lập trên cá ở Thái Lan. Và trong nghiên cứu này tác giả cũng cho thấy hầu hết vi khuẩn kiểm tra kháng với 19 loại kháng sinh đã thử nghiệm. Ngoài ra, tác giả còn cho biết kháng sinh sulfamonomethoxine và tetracycline được sử dụng rất thường trong việc trị bệnh cho cá và hầu hết những chủng kháng với sulfamonomethoxine và tetracycline có chứa R-plasmid. Qua những nghiên cứu trên ta có thể hiểu rằng để hình thành R-plasmid trong vi khuẩn kháng thuốc thì chúng là những vi khuẩn đã kháng với nhiều loại kháng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 31 sinh (có thể kháng 8 loại kháng sinh) và thể hiện ở hầu hết các chủng có liên quan và sự thể hiện tính độc hại của nó trong việc gây bệnh cho một vật chủ nào đó. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 32 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Kết quả kháng sinh đồ cho thấy: A. hydrophila đã kháng với kháng sinh amoxycillin (87,5% số chủng). Riêng các kháng sinh ciprofloxacin, doxycycline, florfenicol, streptomycin vẫn còn nhạy với A. hydrophila (87,5% số chủng). Colistin và norfloxacin cho kết quả nhạy với 75% số chủng thử nghiệm và có 25% kháng và 25% trung bình nhạy. Kháng sinh oxolinic acid có 62,5% số chủng nhạy, 37,5% trung bình nhạy. Trong đó, có 12,5% số chủng (1 chủng) đa kháng với 7 kháng sinh, 25% (2 chủng) kháng 2 kháng sinh thử nghiệm. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của streptomycin trên 8 chủng, có 7 chủng nhạy nhưng với giá trị khá cao dao động từ 4-16ppm. Riêng 1 chủng ( CAF2) cho kết quả kháng với giá trị MIC 256ppm. Kết quả điện di plasmid A. hydrophila chỉ phát hiện được kiểu plasmid của 2 chủng: CA1.2T và CA1.3TT. Chúng có kiểu plasmid khác nhau với hai vạch không tương đương nhau. 5.2 Đề xuất Cần thử nghiệm trên nhiều loại kháng sinh để ứng dụng trong nghiên cứu cũng như điều trị nhằm đạt hiệu quả tốt hơn. Cần thực hiện nghiên cứu xác định phương pháp ly trích plasmid vi khuẩn chuẩn cho mỗi dòng vi khuẩn và xác định trọng lượng plasmid của chúng. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Austin, B and D. Austin., 1986. Bacterial fish pathogens disease in farmed and wild fish second edition. 2. Bùi Quang Tề, 2008. Bệnh thường gặp ở cá trắm cỏ và biện pháp phòng trị. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám, 1994. Những bệnh thường gặp của cá tôm nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và biện pháp phòng trị. NXB Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh. 4. Cao Tuấn Anh, 2005. Thành phần giống loài vi khuẩn và ký sinh trùng trên cá tra giống (Pangasius hypophthalmus) tại huyện Tân Châu Tỉnh An Giang. Luận văn tốt nghiệp Đại học-Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 5. Châu Hồng Thúy, 2008. Khảo sát tình hình xuất hiện bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra nuôi thâm canh ở tỉnh Trà Vinh. Luận văn tốt nghiệp cao học-Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 6. Crumlish, M., Thanh, P.C., Koesling, J., Tung, V., T. and Gravningen, K., 2006. Antibiotic sensitivity profles for bacteria from natural outbreaks of Edwardsiellosis and motile Aeromonas septicaemia in Vietnamese Pangasius hypophthalmus. www.pharmaq.no/Posters/DAAVI_2008_poster. 7. Dương Nhựt Long, 2003. Giáo trình kỹ thuật nuôi thủy sản nước ngọt. Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ. 8. Dương Võ Mỹ Hạnh, 2008. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila. Luận văn tốt nghiệp Đại học-Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 9. Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, Temdoung Somsiri, Supranee Chinabut, Fatimah Yussoff, Mohamed Shariff, Kerry Bartie, Geert Huys, Mauro Giacomini, Stefania Berton, Jean Swings and Alan Teale, 2005. Xác định tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Việt Nam. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học-Đại học Cần Thơ. 4:2005, 136-144. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 34 10. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội, 2004. Bệnh học thủy sản. Nhà xuất bản Nông nghiệp-TP. Hồ Chí Minh. 237 trang. 11. Ferguson, H.W, J.F. Turnbull, A. Shinn, K. Thompson, T.T. Dung and M. Crumlish, 2001. Bacillary necrosis in farmed the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 2001. 24: 509-513. 12. Hà Văn và Bình Nguyên, 2006. Thông tin về tình trạng cá chết hàng loạt trên sông Tiền và sông Hậu: Tăng cường các biện pháp phòng ngừa cá chết do ô nhiễm nguồn nước. (Cập nhật ngày 02/01/2009). 13. Huỳnh Cẩm Tú, 2006. Khảo sát thành phần và mức độ cảm nhiễm ký sinh trùng trên cá tra giống (Pangasius hypophthalmus). Luận văn tốt nghiệp Đại học-Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 14. Huỳnh Chí Thanh, 2007. Xác định đặc điểm sinh hóa và bước đầu thử nghiệm điều trị bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) bằng kháng sinh. Luận văn tốt nghiệp Đại học- Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 15. Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008. Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila tại Khoa Thủy sản. Luận văn tốt nghiệp Đại học-Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 16. Huỳnh Văn Quang, 2008. Khảo sát tình hình nghề nuôi cá tra ao (Pangasianodon hypophthalmus) ở tỉnh Vĩnh Long. Luận văn tốt nghiệp Đại học-Khoa Thủy sản- Đại học Cần Thơ. 17. Inglis V., R.J Roberts and N.R Bromage., 1993. Bacterial diseases of fish. Institute of aquaculture. 18. Lê Thị Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, Nguyễn Thị Như Ngọc và Phạm Thanh Liêm, 2007. Thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản. Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 19. Lê Trung Tính, 2007. Độ nhạy và nồng độ diệt khuẩn của kháng sinh với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra giống (Pangasius PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 35 hypophthalmus). Thực tập tốt nghiệp Đại học-Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 20. Majumdar, T., S Datta., D Ghosh., S Dutta., A Chakraborty., R Goswami and S Mazumder, 2007. Role of virulence plasmid of Aeromonas hydrophila in the pathogenesis of ulcerative disease syndrome in Clarias batrachus. Indian Journal of Biochemistry & Biophysies. Vol. 44, October 2007, pp. 401-406. 21. Nguyễn Chung, 2008. Kỹ thuật sinh sản và nuôi cá tra. NXB Nông nghiệp. Tp. Hồ Chí Minh. 22. Nguyễn Chính, 2005. Đánh giá tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở An Giang và Cần Thơ. Luận văn thạc sĩ khoa học-Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 23. Nguyễn Hà Giang, 2008. Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila tại khoa thủy sản. Luận văn tốt nghiệp Đại học- Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 24. Nguyễn Ngọc Hải, 2007. Công nghệ sinh học trong thú y. NXB Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 25. Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ và Hà Thị Minh Thi, 2007. Giáo trình sinh học phân tử. NXB Đại học Huế, Huế. 217 Trang. 26. Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008. Điều tra hiện trạng bệnh, nuôi và tình hình sử dụng thuốc – hóa chất trong nuôi thâm canh cá tra ao. Luận văn tốt nghiệp Đại học-Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 27. Nguyễn Thị Phương Nga, 2004. Phân tích tình hình phân phối và sử dụng thuốc trong nuôi trồng thủy sản tại Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau. Luận án thạc sĩ Nuôi trồng thủy sản-Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 28. Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008. Tiêu chuẩn hóa phương pháp lập kháng sinh đồ trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila tại Khoa Thủy sản. Luận văn tốt nghiệp đại học- Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 29. Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005. Sưu tầm và thiết lập hệ thống lưu trữ các loại vi khuẩn phân lập trên tôm cá tại khoa thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ. Báo cáo khoa học. Đại học Cần Thơ – Bộ Giáo Dục và Đào Tạo. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 36 30. Nguyễn Thị Như Ngọc, 1997. Định loại vi khuẩn gây bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus) bước đầu thử nghiệm thuốc phòng trị. Luận văn tốt nghiệp Đại học-Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 31. Nguyễn Trọng Bình, 2008. Tác nhân gây bệnh đốm trắng trên gan, thận (bệnh gan, thận mủ) và hướng ngăn ngừa bệnh. Trung tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh. detail.php?id=19 (cập nhật ngày 07/01/2009). 32. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 2007. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo Dục. 33. Nguyễn Quang Hưng, 2001. Điều tra đánh giá mức độ cảm nhiễm bệnh ký sinh trùng và vi khuẩn trên cá tra giống ở ba tỉnh An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp. Luận văn tốt nghiệp Đại học-Khoa Nông nghiệp-Đại học Cần Thơ. 34. Nguyễn Minh Nhí, 2007. Hiệu lực một số loại kháng sinh đối với dòng vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra trên cá tra giống (Pangasius hypophthalmus). Thực tập tốt nghiệp-Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 35. Nguyễn Quốc Thịnh, 2004-2006. Điều tra tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi cá tra (Pangasus hypophthalmus). Đề tài cấp trường. Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 36. Nguyễn Quốc Thịnh, Từ Thanh Dung và Ferguson H.W., 2004. Nghiên cứu mô bệnh học cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh trắng gan. Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 2004: 120-125. 37. Phạm Thanh Tuấn, 2004. Khảo sát bước đầu về tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nghề nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở tỉnh Đồng Tháp. Luận văn tốt nghiệp Đại học-Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 38. Phan Trọng Duy, 2007. Khảo sát tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh cá ở các tỉnh Cần Thơ, An Giang. Thực tập tốt nghiệp Đại học. Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 39. Saitanu, K., A. Chongthaleong., M. Endo., T. Umeda., K. Takami., T. Aoki and T. Kitao., 1994. Antimicrobial Susceptibilities and detection of Transferable R-Plasmids from Aeromonas hydrophila in Thailand. Asian Fisheries Science 7(1994): 41-46. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 37 40. Sở Nông Nghiệp Vĩnh Long, 2008. Tình hình thực hiện công tác 9 tháng đầu năm 2008 và kế hoạch 3 tháng cuối năm 2008 của Chi Cục Thủy Sản. © Cổng Thông tin điện tử ngành Nông nghiệp và PTNT tỉnh Vĩnh Long. (cập nhật ngày 21/12/2008). 41. Trần Anh Dũng, 2005. Khảo sát các tác nhân gây bệnh trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở tỉnh An Giang. Luận văn thạc sĩ khoa học-Đại học Cần Thơ. 42. Trần Thị Thanh, 2000. Công nghệ vi sinh. NXB Giáo Dục. 43. Trần Kiều Lan Phương, 2008. Khảo sát tình hình nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) trong ao ở hai tỉnh Cần Thơ và Hậu Giang. Luận văn tốt nghiệp Đại học-Khoa thủy sản-Đại học Cần Thơ. 44. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thi Tuyết Hoa, 2005. Giáo trình bệnh học Thủy sản. Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 45. Từ Thanh Dung, 2008. Giáo trình bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sinh. Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ. 46. Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thụy Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 2004: 137-142. 47. Vũ Văn Dũng, 2007. Tồn tại và giải pháp phát triển bền vững nghề nuôi cá tra, basa ở các tỉnh ĐBSCL. Tạp chí thủy sản. 7:13-16. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 38 PHỤ LỤC Phụ lục I A. Pha dung dịch nhuộm gram Dung dịch 1 Crystal violet 2g Ethanol (95%) 20ml Ammonium oxalate 0,8g Nước cất 80ml Hòa tan crystal violet trong ethanol, hòa tan ammonium oxalate trong nước cất. Trộn dung dịch lại, để yên sau 24 giờ, sau đó tiến hành lọc. Dung dịch 2 Iodine 1g Potassium iodide 2g Nước cất 300ml Hòa tan potassium iodide trong 200ml nước cất. Cho thêm iodine vào và để yên qua đêm. Sau đó thêm thể tích nước còn lại. Dung dịch 3 Pha dung dịch theo tỉ lệ: 95% ethanol : 5% acetone. Dung dịch 4 Safranin 0,25g Ethanol (95%) 10ml Nước cất 90ml Hòa tan safranin trong ethanol, sau đó cho nước cất vào. B. Pha nước muối sinh lý (0,85% NaCl) NaCl 8,5g Nước cất 1000ml Hòa tan 0,85g NaCl vào 100ml nước cất. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 39 C. Pha ống chuẩn McFarland Ống McFarland 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BaCl2 1% (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 H2SO4 1% (ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0 Mật độ vi khuẩn khoảng (x 108 cfu/ml) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 D. Pha môi trường TSA (triptic soy agar) 40g Nước cất 1000ml NA (nutrient agar) 20g Nước cất 1000ml MHA (muller hinton agar) 38g Nước cất 1000ml Hòa tan hàm lượng môi trường (NA, TSA và MHA) tương ứng vào nước cất, sau đó tiệt trùng ở nhiệt độ 1210=C trong 15 phút. Để nhiệt độ hạ xuống khoảng 500C, tiến hành đổ môi trường ra đĩa Petri với độ dày khoảng 4mm. E. Pha NB (nutrient broth) NB 18g Nước cất 1000ml Hòa tan hàm lượng môi trường NB cần sử dụng vào nước cất, sau đó tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. F. Nhuộm Gram vi khuẩn Nhỏ một giọt nước cất lên lame, dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn trãi đều lên giọt nước cất. Để lame khô ở nhiệt độ phòng, sau đó hơ lướt lame qua đèn cồn để cố định vi khuẩn và để nguội, sau đó tiến hành nhuộm với các dung dịch nhuộm. Các bước nhuộm Gram: - Nhỏ dung dịch crystal violet (dung dịch 1) lên lame, để yên 1 phút. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 40 - Rửa lame dưới vòi nước cho hết màu tím trên lame ( rửa khoảng 2 giây). - Nhỏ dung dịch iodine (dung dịch 2) trong 1 phút. - Lật nghiêng lame cho hết dung dịch iodine trên lame. - Rửa bằng dung dịch 3: để tẩy màu, bằng cách lật nghiêng lame nhỏ từ từ dung dịch 3 cho đến khi giọt nước cuối cùng trên lame không còn màu tím (khoảng 2-3 giây). Rửa và vảy cho ráo nước. - Nhỏ dung dịch safranin (dung dịch 4) lên lame. Để khoảng 2 phút, rửa và vảy cho ráo nước. Để khô ở nhiệt độ phòng. - Quan sát dưới kính hiểm vi ở vật kính 40X, 100X (có dầu soi kính). Đọc kết quả: - Vi khuẩn gram dương (G+) có màu tím xanh. - Vi khuẩn gram âm (G-) có màu hồng đỏ. Phụ lục II Kết quả MIC ở các mức nồng độ khác nhau Nồng độ (ppm) SĐ2.1T CS2.3T CA1.2T CAF2 TN2.4TT TN2.1G TN1.1T CA1.3TT 2 + + + + + + + + 4 + - + + + + + + 8 + - + - + + - 16 - + - - 32 + 64 + 128 + 256 - 512 Ghi chú: (+): Có vi khuẩn phát triển (-): Không có vi khuẩn phát triển Phụ lục III A. STE buffer 0,1 M NaCl 10 mM Tris PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 41 1 mM EDTA pH 8 Để pha 100ml STE cần : 0,585g NaCl, 1ml Tris 1M, 0,1ml EDTA 1M B. Dung dịch 1 50 mM glucose 25 mM Tris 10 mM EDTA Để pha 100ml Solution I cần: 0,9g glucose, 2,5ml Tris 1M, 1ml EDTA 1M C. Dung dịch 2 0,2N NaOH 1% SDS Để pha 100ml Solution II cần : 0,4g NaOH, 10ml SDS 10% D. Dung dịch 3 Thể tích 5M CH3COOK 60ml Glacial acetic acid 11,5ml Nước cất tiệt trùng 28,5ml E. Ehanol 70% Ethanol 7ml Nước cất hai lần tiệt trùng 3ml Cho 3ml nước cất hai lần tiệt trùng vào 7ml ethanol F. TE 10mM Tris 1mM EDTA 10ml TE cần : 0,1ml Tris 1M, 0,02ml EDTA 0,5M G. 50 x TAE M Tris acetate 50 mM EDTA (pH8.0) H. Glycerol loading buffer (X6) 0,25% bromocresol purple 50% glycerol X6 TAE pH 8.0 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 42 Phụ lục VII Bảng : Kết quả kháng sinh đồ Kháng sinh Vi khuẩn Đường kính vòng vô trùng AMX CIP CS DO FFC OA S NOR CAF2 L1 0 0 13 9 11 0 0 0 L2 0 0 11 9 10 0 0 0 TB 0 0 12 9 10.5 0 0 0 TN2.4TT L1 9 23 10 26 31 18 18 21 L2 9 23 11 27 30 19 18 22 TB 9 23 10.5 26.5 30.5 18.5 18 21.5 TN2.1G L1 9 25 11 25 32 20 18 22 L2 10 25 11 27 31 18 17 22 TB 9.5 25 11 26 31.5 19 17.5 22 TN1.1T L1 9 20 10 25 30 19 18 20 L2 9 22 10 27 30 19 17 20 TB 9 21 10 26 30 19 17.5 20 CS2.3T L1 19 21 12 25 21 20 16 15 L2 17 23 12 25 19 20 16 15 TB 18 22 12 25 20 20 16 15 CA1.2T L1 8 30 10 30 30 18 19 25 L2 8 28 12 30 32 20 17 25 TB 8 29 11 30 31 19 18 25 CA1.3TT L1 10 23 10 30 35 0 21 23 L2 8 23 12 30 34 0 19 23 TB 9.5 23 11 30 34.5 0 20 23 SĐ2.1T L1 10 25 11 32 35 0 21 23 L2 10 25 13 32 35 0 21 23 TB 10 25 12 32 35 0 21 23 Ghi chú: L1: Lần kiểm tra thứ nhất L2: Lần kiểm tra thứ hai TB: Trung bình giữa hai lần kiểm tra Kháng sinh: AMX: amoxicillin (25mg); CIP: ciprofloxacin (5mg); CS: colistin (50mg); DO: doxycycline (30mg); FFC: florfenicol (30mg); OA: oxolinic acid (2mg); S: streptomycin (10mg); NOR: norfloxacin (10mg). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version