Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan hồ điệp (Phalaenopsis sp.)

PAGE xlix  PAGE x BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***************** NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT PHÁT SINH PHÔI SOMA VÀ TẠO HẠT NHÂN TẠO Ở CÂY LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.) Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS.TRẦN THỊ DUNG LIÊU HỒNG PHÚ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 LỜI CẢM TẠ Để hoàn tất cuốn luận văn này tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giảng dạy, góp ý, giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè và gia đình. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: - Cha mẹ đã suốt đời tận tụy để con có được ngày hôm nay. - Các Thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học-trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. - TS.TRẦN THỊ DUNG, Trưởng Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. - Các kỹ sư ở trung tâm Công Nghệ Sinh Học-trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã gắn bó với tôi trong suốt 4 năm qua. TÓM TẮT LIÊU HỒNG PHÚ, Đại học Nông Lâm. Tháng 8/2005. “Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp. )” Giảng viên hướng dẫn: TS. TRẦN THỊ DUNG Thí nghiệm nghiên cứu tạo phôi và hạt nhân tạo lan Hồ Điệp được thực hiện tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của các chất kích thích tố sinh trưởng và các loại môi trường đến khả năng tạo mô sẹo, phát sinh phôi, tái sinh chồi và tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp. Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 13 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Kết quả: môi trường VW bổ sung 2,4-D 0.1mg/l + BA 0.01mg/l cho khả năng tạo mô sẹo cao nhất: 80% mẫu cấy hình thành mô sẹo (45NSC). Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 9 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Kết quả: môi trường VW bổ sung nước dừa 200ml/l + đường 40g/l cho khả năng tạo mô sẹo cao nhất: 80% mẫu cấy hình thành mô sẹo (45NSC). Thí nghiệm 3 : Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng TDZ trong điều kiện môi trường đặc, lỏng lắc đến khả năng hình thành phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro Bước 1: Tăng sinh khối mô sẹo Thí nghiệm 3a : môi trường đặc Thí nghiệm 3b : môi trường lỏng và lắc (100 vòng/phút) Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Kết quả: mô sẹo nuôi cấy trên môi trường đặc phát triển tốt, sinh khối tăng nhanh và khá đều nhau trên toàn bộ các nghiệm thức. Mô sẹo trong môi trường lỏng lắc lượng sinh khối tạo ra ít hơn, phần lớn có màu tối và khá chắc, trong đó nghiệm thức 4 với nồng độ TDZ 2mg/l có lượng sinh khối cao nhất và màu sáng hơn các môi trường còn lại (45NSC). Bước 2: Phát sinh phôi soma Mô sẹo thu được từ thí nghiệm 3 được tách thành những cụm nhỏ và cấy chuyền sang môi trường đặc ½ VW. Kết quả: các mô sẹo thu được từ môi trường VW bổ sung TDZ 2mg/l ở điều kiện lỏng lắc cho kết quả phát sinh phôi soma nhiều nhất: trung bình có 39.67 phôi/mẫu cấy (45NSC) Thí nghiệm 4 : Ảnh hưởng của các loại môi trường đến quá trình tái sinh cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 8 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Kết quả: môi trường VW+30g khoai tây+1g than là thích hợp nhất cho việc tái sinh lan Hồ Điệp từ phôi, với hệ số nhân chồi 11.34, số lá trung bình 1.38/chồi, số rễ trung bình 0.22/chồi, chiều dài lá trung bình 8mm, chiều dài rễ trung bình 4mm (75NSC) Thí nghiệm 5 : Ảnh hưởng của môi trường tạo vỏ hạt đến sự tái sinh cây con từ hạt nhân tạo Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 6 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Kết quả: môi trường 1/2MS là môi trường thích hợp nhất để làm vỏ bao hạt nhân tạo ở lan Hồ Điệp, với tỉ lệ nảy mầm cao nhất: 77,78% (60NSC) MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cảm tạ ii Tóm tắt iii Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt ix Danh sách các hình x Danh sách các bảng xi Danh sách các biểu đồ xii Phần 1. Mở đầu … 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích và yêu cầu 3 Phần 2. Tổng quan 4 2.1 Giới thiệu về cây lan Hồ Điệp 4 2.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố 4 2.1.2 Vị trí lan Hồ Điệp trên thị trường 5 2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 7 Khái niệm 7 Lịch sử phát triển 7 2.2.3 Ứng dụng… 8 2.2.4 Các phương pháp nuôi cấy in vitro 9 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy in vitro. 10 2.3.1 Chất điều hoà sinh trưởng. 10 Ảnh hưởng của nguồn carbon 14 Ảnh hưởng của nước dừa 14 2.3.4 Ảnh hưởng của độ pH và Agar 14 2.3.5 Ảnh hưởng của than hoạt tính 14 2.3.6 Ảnh hưởng của các điều kiện vật lý 15 2.4 Nuôi cấy phát sinh mô sẹo 16 2.4.1 Sự hình thành mô sẹo 16 2.4.2 Sự phát triển của tế bào mô sẹo 18 2.4.3 Sự tái sinh chồi từ mô sẹo 19 2.5 Phôi vô tính 20 2.5.1 Lịch sử nghiên cứu 20 2.5.2 Khái niệm về phôi vô tính 20 2.5.3 Sự phát sinh hình thái của phôi vô tính 21 2.5.4 Những nhân tố ảnh hưởng đến sự hình thành phôi vô tính 23 2.5.5 Những vấn đề thường gặp 27 2.5.6 Ứng dụng của việc tạo phôi vô tính 28 2.5.7 Một số thành tựu tạo phôi vô tính 29 2.6 Công nghệ tạo hạt nhân tạo 31 2.6.1 Khái niệm về hạt nhân tạo 31 2.6.2 Mục đích của sự ra đời công nghệ hạt nhân tạo 32 2.6.3 Qui trình tạo hạt nhân tạo. 33 2.6.4 Các nhân tố cần thiết trong việc tổng hợp hạt nhân tạo 35 2.6.5 Nguyên tắc và điều kiện 35 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 37 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu  37 3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 37 3.2.1 Vật liệu 37 Phương pháp 38 3.2.2.1 Thiết kế thí nghiệm 38 3.2.2.2 Chỉ tiêu theo dõi 44 3.2.2.3 Xử lý số liệu 44 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 Các thí nghiệm tạo mô sẹo từ PLB (protocorm like body) 45 Thí nghiệm 1 : Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) 45 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) 49 Thí nghiệm phát sinh phôi soma từ mô sẹo 52 Thí nghiệm 3 : Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng TDZ trong điều kiện môi trường đặc, lỏng lắc đến khả năng hình thành phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) 52 Thí nghiệm tái sinh chồi từ phôi soma 58 Thí nghiệm 4 : Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình tái sinh chồi lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma 58 4.1 Ảnh hưởng của môi trường đến tỉ lệ mẫu chết và hệ số nhân chồi của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây. 60 4.1.1 Ảnh hưởng của môi trường đến tỉ lệ mẫu chết của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây. 4.1.2 Ảnh hưởng của môi trường đến hệ số nhân chồi của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây 60 4.2 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến các chỉ tiêu hình thái của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma 61 4.2.1 Ảnh hưởng của môi trường đến số lá và chiều dài lá của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma 61 4.2.1 Ảnh hưởng của môi trường đến số rễ và chiều dài rễ của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma. 62 Thí nghiệm tạo hạt nhân tạo 64 Thí nghiệm 5 : Ảnh hưởng của môi trường tạo vỏ hạt đến sự tái sinh cây con từ hạt nhân tạo (60 NSC) 65 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67 5.1 Kết luận 67 5.2 Đề nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 69 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 69 PHỤ LỤC 71 CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid ABA Abscisic acid BAP Benzylaminopurin GA3 Gibberellic acid MS Murashige và Skoog (1962) NAA α-naphthalene acetic acid Thidiazuron (TDZ) 1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea VW Vacin và Went (1949) NSC Ngày sau cấy DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Một số loài lan Hồ Điệp phổ biến. 6 Hình 2.2 Mô sẹo lan Hồ Điệp 16 Hình 2.3 Mô sẹo hoá nâu 18 Hình 2.4 Cây tái sinh từ mô sẹo lan Hồ Điệp 19 Hình 2.5 Phôi vô tính lan Hồ Điệp 20 Hình 2.6 Các giai đoạn phát sinh phôi vô tính 22 Hình 2.7 Phôi có hình dạng dị thường 28 Hình 2.8 Chồi tái sinh từ phôi 29 Hình 2.9 Hạt nhân tạo 31 Hình 4.1 Màu sắc của mô sẹo lan Hồ Điệp 46 Hình 4.2 Mô sẹo lan Hồ Điệp trên môi trường đặc TDZ 2mg/l 52 Hình 4.3 Mô sẹo lan Hồ Điệp trên môi trường TDZ lỏng lắc 53 Hình 4.4 Các giai đoạn phát sinh phôi ở lan Hồ Điệp 54 Hình 4.5 Phôi được tạo ra khi cấy chuyền mô sẹo lan Hồ Điệp từ thí nghiệm 3a sang môi trường đặc 1/2VW 56 Hình 4.6 Phôi được tạo ra khi cấy chuyền mô sẹo lan Hồ Điệp từ thí nghiệm 3b sang môi trường đặc 1/2VW.. 56 Hình 4.7 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ phôi soma 75 NSC 63 Hình 4.8 Hạt nhân tạo lan Hồ Điệp trên môi trường nảy mầm 65 Hình 4.9 Quá trình nảy mầm của hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 66 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến thời gian hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro 45 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) 48 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến thời gian hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro 50 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) 51 Bảng 4.5 Số phôi được tạo ra khi cấy chuyền mô sẹo lan Hồ Điệp từ thí nghiệm 3a và 3b sang môi trường đặc 1/2VW 56 Bảng 4.6 Sự phát sinh hình thái của phôi soma lan Hồ Điệp ở các loại môi trường (75NSC) 59 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình tái sinh cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma 75 NSC. 60 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến các chỉ tiêu hình thái của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma 61 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của môi trường tạo vỏ hạt đến sự tái sinh cây con từ hạt nhân tạo lan Hồ Điệp .65 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Thí nghiệm gia tăng sự phát sinh phôi lan Hồ Điệp 56 Biểu đồ 4.2 Hệ số nhân chồi của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây 61 Biểu đồ 4.3 Số lá và chiều dài lá của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma 62 Biểu đồ 4.4 Số rễ và chiều dài rễ của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma 63