Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan vanda và bước đầu khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO TỪ PHÔI CÂY LAN VANDA NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MYCORRHIZA TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LAN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG QUÂN Thành phố Hồ Chí Minh -2007- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO TỪ PHÔI CÂY LAN VANDA NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MYCORRHIZA TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LAN Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS.TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN HOÀNG QUÂN ThS.TỪ THỊ MỸ THUẬN Thành phố Hồ Chí Minh -2007- ii LỜI CẢM ƠN Thành kính khắc ghi công ơn cha mẹ đã tận tụy suốt đời vì con để con có được ngày hôm nay. Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thị Dung và ThS. Từ Thị Mỹ Thuận đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm - Quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm - Quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học. Đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn này. Xin gởi lời cảm ơn đến: KS Nguyễn Thị Thu Hằng, KS Lê Hồng Thuỷ Tiên cùng tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học và Phòng Thực Tập Bệnh Cây trường Đại Học Nông Lâm, cùng tất cả bạn bè trong và ngoài lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài. TP. Hồ Chí Minh, Ngày 25 tháng 8 năm 2007 Sinh viên Nguyễn Hoàng Quân iii TÓM TẮT NGUYỄN HOÀNG QUÂN, sinh viên bộ môn Công Nghệ Sinh Học khoá 29, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2007 ĐỀ TÀI: NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO TỪ PHÔI CÂY LAN VANDA. NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MYCORRHIZA TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LAN Giảng viên hƣớng dẫn: TS. TRẦN THỊ DUNG ThS. TỪ THỊ MỸ THUẬN Đề tài đƣợc tiến hành tại Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học- Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, thời gian thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 5 nghiệm thức, lặp lại 3 lần. Kết quả thu đƣợc ở nồng độ 30 g/l cho vỏ hạt nhân tạo tròn, đều, đẹp và tỷ lệ nẩy mầm cao. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 4 nghiệm thức, lăp lại 3 lần Kết quả thu đƣợc ở môi trƣờng dinh dƣỡng ½ MS, hạt nhân tạo c ủa phôi lan Vanda cho tỷ lệ sống sót và nẩy mầm cao. iv Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 6 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Môi trƣờng MS bảo quản hạt tốt nhất, cho hạt nhân tạo có tỷ lệ nẩy mầm cao nhất sau khi bảo quản. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 3 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên bông gòn cao nhất (khoảng 100%) Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan Kết quả khảo sát cho thấy mycorrhiza có các dạng sau: -Sợi nấm ăn màu xanh, phân nhiều nhánh ăn xuyên qua nhiều lớp tế bào -Sợi nấm cuộn tròn trong 1 tế bào -Sợi nấm là các cuộn tròn nằm ở các tế bào, nối với nhau bằng sợi nấm Giữa các giống lan trồng, tỷ lệ hiện diện của mycorrhiza có sự khác nhau do nguồn gốc của giống v SUMMARY NGUYEN HOANG QUAN, student of Biotechnological faculty chronology 29, Nong Lam University of Ho Chi Minh City, 8 -2007. TOPIC: CONTENT 1: RESEACHING TECHNOLOGY DOES ARTIFICIAL SEED FROM SOMATIC EMBRYONIC VANDA ORCHID. CONTENT 2: EXAMINING PRESENCE OF MYCORRHIZA ON SOME ORCHID GENUS Supervisor: TRAN THI DUNG, ph.D TU THI MY THUAN, M.D Topic was doen at Biotechnological Centre- Nong Lam University of Ho Chi Minh City, doen from 3-2007 to 8-2007. CONTENT 1: RESEACHING TECHNOLOGY DOES ARTIFICIAL SEED FROM SOMATIC EMBRYONIC VANDA ORCHID. Experiment 1: Examining sodium alginate strength influenced artificial seed formation. Experimentation was set quite accident one factor, include 5 assays, 3 times repetition. Resulting in 30 g/l strength gave full, nice artificial seed shell and ratio of germination highly Experiment 2: Examining influence of nutritional environment do artificial seed. Experimentation was set quite accident one factor, include 4 assays, 3 times repetition. vi Resulting in ½ MS nutritional environment gave ratio of life and germination highly, consist with artificial seed from embryonic Vanda. Experiment 3: Examining maintainable environment arfiticial seed. Experimentation was set quite accident one factor, include 6 assays, 3 times repetition. MS environment maintained seed better, gave germinant ratio higher after maintenance. Experiment 4: Examining germination of arfiticial seed on different substances. Experimentation was set quite accident one factor, include 3 assays, 3 times repetition. Ratio of germinant arfiticial seed on the silk- coton was highest. CONTENT 2: EXAMINING PRESENCE OF MYCORRHIZA ON SOME ORCHID GENUS. Resulting in mycorrhiza had forms: - The hyphae was dyed with blue, divided many branches across root cells. - The hyphae scrolled in one cell. - Hypha cirumvolutions entered into cells, allyed each other by the hyphae. The present ratio of mycorrhiza had difference among orchid genus because of growing simulant origin. vii MỤC LỤC Trang Trang tựa .......................................................................................................... i Lời cảm ơn ....................................................................................................... ii Tóm tắt ............................................................................................................. iii Summary .......................................................................................................... v Mục lục ............................................................................................................. vii Danh sách các bảng .......................................................................................... x Danh sách các biểu đồ ...................................................................................... xi Danh sách các hình ........................................................................................... xii 1 GIỚI THIỆU ................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2 1.2.1 Mục đích .................................................................................................. 2 1.2.2 Yêu cầu .................................................................................................... 3 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 4 2.1 Khái quát về cây lan ................................................................................... 4 2.1.1 Phân loại thực vật học ............................................................................. 4 2.1.2 Lịch sử cây lan ....................................................................................... 4 2.1.3 Tình hình sản xuất lan ............................................................................. 5 2.1.4 Đặc điểm thực vật học của cây lan .......................................................... 6 2.1.4.1 Cơ quan dinh dƣỡng ............................................................................. 6 2.1.4.2 Cơ quan sinh dục của lan- tổ chức hoa ................................................ 7 2.1.5 Các điều kiện cơ bản cho cây lan ............................................................ 8 2.1.6 Các phƣơng pháp nhân giống lan ............................................................ 8 2.1.6.1 Gieo hột ................................................................................................ 8 2.1.6.2 Tách chiết ............................................................................................. 9 viii 2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy mô lan …………………………………………...10 2.2.1 Khái quát về lịch sử nuôi cấy mô ............................................................ 10 2.2.2 Các phƣơng pháp nuôi cấy ...................................................................... 10 2.2.3 Chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy in vitro .............................. 12 2.2.4 Các bƣớc nhân giống in vitro .................................................................. 14 2.2.5 Các yếu tố ảnh hƣởng nhân giống in vitro .............................................. 15 2.3 Công nghệ tạo hạt nhân tạo……………………………………….. 16 2.3.1 Khái niệm ................................................................................................ 16 2.3.2 Mục đích .................................................................................................. 16 2.3.3 Các nhân tố tạo hạt nhân tạo ................................................................... 17 2.3.3.1 Tạo phôi vô tính ................................................................................... 17 2.3.3.2 Cơ chế phát sinh phôi soma ................................................................. 18 2.3.3.3 Tạo vỏ bọc bằng sodium alginate ........................................................ 19 2.3.3.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo .................................................................... 21 2.4 Nấm rễ cộng sinh- mycorrhiza………………………………………….. 22 2.4.1 Khái niệm ................................................................................................ 22 2.4.2 Các dạng mycorrhiza ............................................................................... 23 2.4.2.1 Ectomycorrhiza ................................................................................... 23 2.4.2.2 Endomycorrhiza ................................................................................... 23 2.4.3 Tác động có ích của mycorrhiza ............................................................. 24 2.4.3.1 Mở rộng diện tích hấp thu của rễ cây ................................................... 24 2.4.3.2 Sự trao đổi dinh dƣỡng ......................................................................... 24 2.4.3.3 Sự hình thành chất kích thích sinh trƣởng mycorrhiza ........................ 24 2.4.3.4 Nâng cao sức chống chịu của cây ........................................................ 25 2.4.3.5 Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng ............................................ 25 2.4.4 Sự xâm nhập của mycorrhiza .................................................................. 25 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 26 3.1 Đối tƣợng thí nghiệm .................................................................................. 26 3.2 Thời gian thực hiện ..................................................................................... 26 3.3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 26 3.4 Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 27 ix 3.4.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu………………………………. 27 3.4.2 Mẫu sử dụng và điều kiện nuôi cấy………………………………….. 27 3.4.3 Môi trƣờng sử dụng……………………………………………… 27 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 28 3.5.1 Chuẩn bị môi trƣờng……………………………………………….. 28 3.5.2 Bố trí thí nghiệm ……………………………………………………29 3.6 Xử lý số liệu …………………………………………………………..32 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 33 4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan ............ 33 4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo .............................................................................. 36 4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo… 39 4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản……………………. 41 4.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng nẩy mầm của hạt……………. 43 4.2 Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza ở các giống lan........... 45 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 49 5.1 Kết luận ...................................................................................................... 49 5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 50 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 51 7 PHỤ LỤC ...................................................................................................... 53 x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Sự phát triển của mô trên môi trƣờng nuôi cấy ....................................... 17 Bảng 4.1: Nồng độ alginate ảnh hƣởng lên hình thái vỏ hạt nhân tạo ..................... 36 Bảng 4.2: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate ................................ 38 Bảng 4.3: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khácnhau… .... 39 Bảng 4.4: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau… 40 Bảng 4.5: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các môi trƣờng dinh dƣỡng .............. 42 Bảng 4.6: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo ................... 42 Bảng 4.7: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo sau khi bảo quản .................................. 43 Bảng 4.8: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể ........................................... 44 Bảng 4.9: Sự hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan ..................................... 45 xi DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4-1: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau . 38 Biểu đồ 4-2: Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo ở môi trƣờng khác nhau .......... 40 Biểu đồ 4-3: Sự hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan ........................ 46 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2-1: Cấu tạo hoa lan ............................................................................... 8 Hình 2-2: Cấu tạo hạt nhân tạo ....................................................................... 16 Hình 2-3: Các giai đoạn phát sinh phôi soma ................................................. 19 Hình 2-4: Công thức hoá học của alginate ...................................................... 20 Hình 2-5: Các dạng phôi soma ............................................................................................ 21 Hình 2-6: Quy trình tạo hạt nhân tạo .............................................................. 22 Hình 4-1: Các dạng phôi vô tính ..................................................................... 33 Hình 4-2: Cấu trúc của phôi vô tính ................................................................. 34 Hình 4-3: Môi trƣờng tạo hạt nhân tạo ............................................................ 34 Hình 4-4: Các bƣớc tạo hạt nhân tạo................................................................ 35 Hình 4-5: Sự hình thành hạt nhân tạo ............................................................. 35 Hình 4-6: Cấu tạo vi thể của hạt nhân tạo ........................................................ 36 Hình 4-7: Hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate ............................................... 37 Hình 4-8: Hạt nhân tạo nẩy mầm .................................................................... 39 Hình 4-9: Hạt nhân tạo trên các môi trƣờng bảo quản .................................... 42 Hình 4-10: Hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể ......................................... 44 Hình 4-11: Vùng mô có mycorrhiza ................................................................ 47 Hình 4-13: Các dạng mycorrhiza .................................................................... 47 Hình 4-12: Dạng mycorrhiza cuộn tròn .......................................................... 48 1 CHƢƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay, xã hội chúng ta ngày càng phát triển và hiện đại. Cuộc sống thƣờng bị áp lực nặng nề từ công việc.Vì vậy nhu cầu giải trí và vui chơi lành mạnh là rất cần thiết đối với mỗi ngƣời. Trong đó chơi hoa, cây cảnh cũng là một thú vui tao nhã, giúp chúng ta hoà quyện vào thiên nhiên, nâng cao chất lƣợng đời sống, giúp ta sống lâu sống khoẻ. Hoa là biểu tƣợng cho vẻ đẹp và điều thánh thiện. Mỗi loài hoa có màu sắc, hƣơng thơm đặc trƣng cho từng loài, cho từng vùng, từng miền.Từng loài hoa lại tƣợng trƣng cho tính cách của mỗi ngƣời, mỗi biểu tƣợng trong cuộc sống, đại diện cho tình yêu, tình bạn, tình cảm con ngƣời. Hiện nay hoa đã trở nên phổ biến rộng rãi đối với tất cả mỗi ngƣời, là món quà, là thông điệp trao nhau trong những ngày lễ, ngày kỉ niệm, ngày họp mặt. Hoa cũng đƣợc xem nhƣ một vật trang trí trong nhà tăng vẻ mỹ quan, gần gũi với thiên nhiên. Nhiều lễ hội về hoa đã đƣợc tổ chức ở các quốc gia. Trong đó, hoa lan hiện đƣợc nhiều ngƣời rất quan tâm và không những cảm mến trƣớc vẻ đẹp của hoa mà còn thắc mắc, tìm hiểu cách sinh tồn của lan trong tự nhiên. Lan rất đa dạng phong phú về màu sắc, hƣơng thơm, chủng loại và đặc biệt là phân bổ rộng khắp thế giới. Ngƣời trồng lan thƣờng đƣợc ví nhƣ một nghệ nhân, còn ngƣời thƣởng thức vẻ đẹp của chúng đƣợc xem nhƣ là nghệ sĩ. Về mặt kinh tế, trồng và kinh doanh hoa lan là một ngành đem lại lợi nhuận cao. Giá trị sản lƣợng hoa lan thế giới ngày nay lên tới hàng tỷ đô la. Vì vậy các nƣớc Hà Lan, Đức, Thái Lan, Philippin, Malaysia… vốn đã nổi tiếng về nghề trồng lan thì nay họ phát triển hơn nữa quy trình sản xuất lan nhanh hiệu quả hơn. Đồng 2 thời, đẩy mạnh lai tạo giống để chọn ra những giống mới lạ, khả năng chịu đựng với hoàn cảnh khắc nghiệt của tự nhiên.Việt Nam chúng ta cũng nghiên cứu rất nhiều về lan, đặc biệt là kỹ thuật nhân giống nhanh bằng kĩ thuật nuôi cấy mô. Đặc biệt, cây lan rất khó gieo hạt ngoài tự nhiên, đa phần muốn nhân giống nhanh thƣờng áp dụng tách chiết hoặc nuôi cấy in vitro. Với sự phát triển của kỹ thuật tạo hạt nhân tạo, chúng ta có thể ứng dụng lấy phôi soma cho bọc vỏ nhân tạo có chứa môi trƣờng dinh dƣỡng, nhằm bảo quản phôi và tạo điều kiện cho hạt nhân tạo nẩy mầm. Với kỹ thuật này, thì khắc phục hạn chế nẩy mầm của hạt lan trong tự nhiên, và giúp nhân nhanh các giống lan trồng và các loài thực vật khó nẩy mầm trong tự nhiên. Trong hệ sinh thái nông nghiệp, rất nhiều nấm có lợi cho cây trồng, nấm cộng sinh với rễ là rất phổ biến, chúng giúp cây nhận đƣợc một số chất khoáng từ đất, nhất là tăng cƣờng hấp thụ photpho dễ dàng, giúp cây tăng trƣởng nhanh, đồng thời cây lại cung cấp nguồn cacbon cho nấm, thƣờng đƣợc gọi là mycorrhiza. Nắm bắt đƣợc mối quan hệ đó, chúng ta có thể ứng dụng vào lĩnh vực sản xuất cây in vitro. Vì vậy, cần phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa về mycorrhiza, đặc biệt là trên rễ lan. Đƣợc sự đồng ý của bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng với sự hƣớng dẫn tận tình của TS Trần Thị Dung, ThS Từ Thị Mỹ Thuận, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này gồm hai nội dung: NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO TỪ PHÔI CÂY LAN VANDA NỘI DUNG 2: BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MYCORRHIZA TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LAN 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục đích -Bảo quản phôi soma hiệu quả và lƣu trữ giống dễ dàng hơn. -Tạo cơ sở cho việc phân lập mycorrhiza trên cây lan đồng thời thử nghiệm trong nuôi cấy in vitro. 3 1.2.2 Yêu cầu Theo dõi tỷ lệ sống, tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo. Thu thập mẫu rễ lan, nhuộm và quan sát mycorrhiza 4 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Khái quát về cây lan 2.1.1 Phân loại thực vật học Ngành: Angiospermae (hạt kín) Lớp:Monocotyledonae Bộ: Orchidales Họ: Orchidaceae Họ phụ: Orchidoideae 2.1.2 Lịch sử cây lan Ngƣời ta tƣởng rằng cây lan đƣợc biết đến trƣớc tiên ở châu Âu qua bản viết tay bằng tiếng Hy Lạp” Xem Xét Cây Cỏ” (Enquiry intoPlants) của Theophrastus (khoảng năm 370-285 TCN). Kỳ thực thì cây lan đã đƣợc biết đến đầu tiên ở phƣơng Đông: Khổng Tử (551-479 TCN) sau khi đi chu du thiên hạ, không đƣợc nƣớc nào sử dụng, nên về lại nƣớc Lỗ. Trên đƣờng về, ông thấy hoa lan mọc chen với cây cỏ ở rừng sâu bèn than rằng: “Ôi, hoa lan có mùi thơm vƣơng giả, nay tƣơi tốt một mình ở chốn sơn lâm, mọc xen lẫn với loài cỏ hoang dại, chẳng khác nào bậc hiền giả không gặp thời, đứng chung với bọn bỉ phu”, mà từ đó các bài thơ, phú, vịnh về hoa lan sau này của các thi nhân Trung Hoa đều bị ít nhiều ảnh hƣởng. Ở phƣơng Đông, lan đựơc chú ý đến vẻ đẹp duyên dáng của lá và hƣơng thơm tuyệt diệu của hoa. Vì vậy trên thực tế lan chủ yếu chiêm ngƣỡng trƣớc tiên là lá chứ không phải màu sắc của hoa. Ở phƣơng Tây, lan đƣợc biết đến trƣớc hết là công dụng về dƣợc liệu và sau đó là sức hấp dẫn của hoa cùng các đặc tính về thực vật của nó.Theophrastus đƣợc xem là ông tổ của thực vật học và là cha đẻ của ngành học về lan và đến năm 1836 John Lindley đặt tên cho họ lan là Orchidaceae. 5 Ở Việt Nam, năm 1789 Joanis Loureiro, nhà truyền giáo ngƣời Bồ Đào Nha lần đầu tiên mô tả trong cuốn”Flora Cochinchinesis” và chỉ đến khi ngƣời Pháp đến mới có nhiều công trình công bố. H.Lecomte mô tả 101 giống gồm 750 loài lan cho cả 3 nƣớc Đông Dƣơng. Năm 1993 Phạm Hoàng Hộ phát hiện và mô tả khoảng 653 loài. 2.1.3 Tình hình sản xuất lan Trên thế giới Châu Âu, Hà Lan là quốc gia duy nhất có công nghệ trồng lan xuất khẩu sớm, ứng dụng trồng trong nhà kính nên xuất khẩu đƣợc quanh năm, đặc biệt là lan Cymbidium. Còn Italia là quốc gia nhập khẩu lan nhiều nhất Châu Âu, chủ yếu từ các nƣớc: Thái Lan 64 triệu cành, Hà Lan 10 triệu cành vào năm 1993. Mỹ nhập từ Thái Lan 16,4 triệu cành, Singapore 289 ngàn cành Dendrobium vào năm 1994. Châu Á, đứng đầu thế giới về nhập khẩu lan vẫn là Nhật, chủ yếu là Dendrobium, Oncidium, Cymbidium, Phalaenopsis từ Malaysia, Singapore và Thái Lan là nhiều nhất Ở Việt Nam Do chúng ta ở vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa, vì vậy phong lan rất đa dạng. Bên cạnh các loại lan rừng nổi tiếng về màu sắc và hƣơng thơm còn có các giống lan nhập ngoại nhƣ Dendrobium, Vanda, Mokara, Phalaenopsis, Cattleya… còn phân bổ lan rừng thì khắp cả nƣớc: Vùng khí hậu lạnh: Cao Nguyên và các tỉnh phía Bắc có thể trồng đƣợc các loài lan nhƣ Dendrobium, Cymbidium, Phalaenopsis, Cattleya, Paphiopedilum…) Vùng khí hậu nóng ẩm nhƣ ở Nam và Trung Trung Bộ, nhất là miền Đông Nam Bộ có các loại lan nhƣ: Cattleya, Vanda, Mokara, Cymbidium, Ngọc Điểm… Tuy nhiên có những khó khăn của ngƣời trồng lan ở nƣớc ta: -Nông dân trồng lan còn nhỏ lẻ, thiếu quy hoạch chiến lƣợc, kỹ thuật so với nƣớc ngoài -Chƣa tạo đƣợc giống lan riêng biệt cho Việt Nam có thể cạnh tranh với các giống lan nhập ngoại, nhất là Thái Lan. 6 -Thị trƣờng tiêu thụ còn nhiều khó khăn, chƣa ổn định kinh tế lâu dài cho ngƣời trồng lan. Tuy nhiên, thành phố Hồ Chí Minh đã có nhiều chính sách, nguồn vốn đầu tƣ để xây dựng và mở rộng khu nông nghiệp cao, chuyển đổi đổi cơ cấu nông nghiệp cho phù hợp với tình hình và xu hƣớng phát triển của thành phố, trong đó cây lan cũng là cây chủ lực. 2.1.4 Đặc điểm thực vật học của cây lan 2.1.4.1 Cơ quan dinh dƣỡng a) Sự phát triển ở cây đa thân Trƣờng hợp lan Cau diệp (Spathoglottis plicata Bl.) Đây là loài địa lan, giả hành là một thân ngắn phù mập. Mỗi giả hành có một số lá bao che và mang rễ ở đáy. Đáy lá to ra tạo thành bẹ bao quanh giả hành. Ở nách của mỗi bẹ lá có thể có các chồi mà mỗi chồi có thể phát triển thành cành mang hoa (phát hoa) hay tạo ra cơ quan dinh dƣỡng mới (giả hành mới). Các chồi ở nách lá ấy đƣợc che chở bởi những lá ngắn không có phiến lá bên trên. Khi chồi bắt đầu phù to có dạng một giả hành sơ khởi thì các lá ló ra về phía đỉnh, sau đó các rễ mới xuất hiện ở về phía đáy. Cuối cùng các lá phát triển lớn lên, tích trữ dƣỡng chất về phía đáy làm cho giả hành lớn dần ra. Trƣờng hợp lan Bạch câu (Dendrobium crumenatum Sw.) Xuất hiện từ đồng bằng đến núi cao, phụ sinh sống bám trên cây hay trên hốc đá, rễ chúng không luôn bị ẩm ƣớt nhƣ ở trong đất nhƣ lan Cau diệp.Cành lan mới sinh ra từ gốc của cành cũ: Gồm gốc nhỏ mang rễ, tiếp là đoạn phù mập không rễ, không lá, kế trên là đoạn dài lỏng khỏng mang lá mọc xen hai hàng, trên cùng là đoạn dài nhỏ lỏng y nhƣ vậy nhƣng không có lá, tất cả gọi là giả hành. Nhƣ vậy Bạch câu sống nhiều năm (cây đa niên) nhờ các đơn vị nối tiếp nhau, chồi mới sinh ra từ chồi bên ở gốc của đơn vị trƣớc đó và cứ thế tiếp tục phát triển theo chiều ngang. 7 b) Sự phát triển ở cây đơn thân Ở kiểu phát triển độc trụ, nếu ta cắt một đoạn ở phía ngọn của thân thì đoạn bị cắt rời này vẫn phát triển về phía đỉnh. Còn nếu cắt đoạn thân của cây (đỉnh giả hành) thì đoạn cắt rời ấy không thể phát triển về phía đỉnh.Ví dụ nhƣ cây Vanda, Ngọc Điểm (Rhynchostys gigantea), Hồ Điệp (Phalaenopsis)… Lá có phiến hình trụ dài và có bẹ bọc kín thân. Thân luôn luôn mọc cao lên về phía đỉnh. Sự mọc dài của đỉnh không có giới hạn nên cây chỉ có một thân phát triển vô hạn. Sự phát triển ngừng lại khi đỉnh bị tổn thƣơng, lúc đó chồi bên sẽ xẻ rách bẹ lá để mọc dài ra thành nhánh, nhánh này cũng sinh trƣởng không giới hạn nhƣ đỉnh ban đầu. 2.1.4.2 Cơ quan sinh dục của lan- tổ chức hoa Hoa lan kiểu tam phân (chia 3): 3 lá đài, 3 cánh hoa, 3 tâm bì Phấn hoa dính lại thành phấn khối, ít khi rời từng hạt nhƣ ở các loài hoa khác Sự hiện diện của trụ là phần hợp nhất của bộ phận sinh dục đực và bộ phận sinh dục cái. Đó là đặc điểm quan trọng chỉ có ở hoa lan. Hình dạng, kích thƣớc của môi, cộng thêm vị trí của nhuỵ đực đã làm cho hoa lan không đều, có sự đối xứng hai bên rõ rệt. Tuy cấu trúc chung nhƣ vậy nhƣng trong chi tiết từng bông hoa lan cũng có những khác biệt mà từ đó ta chia chúng ra những giống loài khác nhau, chỉ cần đề cập đến cánh môi thôi cũng đã rất phong phú. Nhƣng 99% các cây lan có 1 nhuỵ đực thụ mà thôi số còn lại có 2-3 nhuỵ đực thụ (Nguyễn Thiện Tịch,1996). Về phái tính thì đại đa số cây lan là hoa lƣỡng tính, nhƣng ở giống Catasetum và Cycnoches hoa lại là đơn tính. Cánh môi: Ở một số loài thì rất lớn so với hai bên cánh, một số loài có cánh môi rất nhỏ. Hình dạng: Môi có thể nguyên hay có thuỳ, có rìa, có tua, cuộn hay nhăn…có cấu trúc rất kỳ lạ nhƣ có sọc, có sóng, có gai, có lông, trơn láng hay nhăn..có cựa, móc, túi ở đằng sau.. Màu sắc: Thƣờng khác hai bên, hoặc có sọc, điểm, những màu khác biệt 8 Hình 2-1: Cấu tạo hoa lan 2.1.5 Các điều kiện cơ bản cho cây lan Ẩm độ: Thông thƣờng tối thiểu là 70% thích hợp cho sự tăng trƣởng của nhiều loài. Tuy nhiên ẩm độ lý tƣởng vẫn là ẩm độ của vùng bản xứ pH của nƣớc: pH của nƣớc phù hợp cho lan tăng trƣởng là 5-6, nếu lên 7 hoặc trên 7 thì không nên tƣới nƣớc cho cây. Nhiệt độ: Tuỳ thuộc vào nhiệt độ của điều kiện địa lý, vùng cao độ thì sẽ có sự phân bổ giống lan phù hợp. Ánh sáng: Yếu tố quyết định cho sự quang hợp, hô hấp và nhất là cho sự trổ hoa.  Vanda lá tròn cần 100% ánh sáng  Vanda lá sắp thành hàng cần 70% ánh sáng  Dendrobium cần 70% ánh sáng  Cattleya cần 50% ánh sáng  Phalaenopsis cần khoảng 30% ánh sáng Độ thông gió: Lan có 2 nhóm chính là phong lan và địa lan, tốc độ gió khoảng 10-15 km/giờ, nghĩa là gió làm lá và các cành nhỏ hơi rung động, nếu trồng ở nơi thông gió và mát mẻ, cây lan sẽ tăng trƣởng nhanh và ít bị bệnh hơn (Nguyễn Minh Trực, 1996). 2.1.6 Các phƣơng pháp nhân giống lan 2.1.6.1 Gieo hột Trong thiên nhiên, sự thụ phấn ở lan do côn trùng thực hiện, do cấu trúc của hoa lan thích ứng với điều này. Có 2 phƣơng cách thụ phấn: 9 - Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa ở hoa này đƣợc rơi vào nuốm của chính hoa ấy, điều này không thể xảy ra ngoài tự nhiên đối với hoa lan đƣợc. - Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này đƣợc để vào nuốm của hoa khác trên cùng cây hay cùng một loài, hay khác loài, khác giống (chỉ con ngƣời mới làm đƣợc). Hạt lan quá nhỏ, không chứa chất dự trữ và chỉ có một phôi chƣa phân hoá nên không thể phát triển theo cách bình thƣờng mà việc làm cho hạt lan nẩy mầm thành cây lan trƣởng thành là vấn đề khó khăn. Năm 1844, Neumann- ngƣời Pháp- đã cho nẩy mầm thành công hạt lan khi ông liệng hạt lan quanh gốc cây lan lớn, nhƣng không hiểu vì sao. Năm 1899, Noel Bernard- ngƣời Pháp- đã khám phá bí mật đó, vì những hạt lan nẩy mầm đều bị nhiễm nấm. Năm 1904, ông cô lập các nấm rễ lan và cho nhiễm lên hạt lan thì 100% hạt nẩy mầm. Ngƣời ta đã khám phá ra 3 loài nấm giúp hạt lan nẩy mầm: - Rhizoctonia repens giúp hạt lan Cattleya, Laelia nẩy mầm. - Rhizoctonia mucoroides giúp hạt lan Vanda, Phalaenopsis nẩy mầm. - Rhizoctonia lanugiosa giúp hạt lan Oncidium, Miltonia nẩy mầm. Năm 1922, Knudson ở Mỹ, đã thành công khi gieo hạt lan trên môi trƣờng thạch có bổ sung dinh dƣỡng (thêm 2% đƣờng ) 2.1.6.2 Tách chiết a) Tách bụi Dùng cho các giống lan đa thân nhƣ Cattleya, Dendrobium….Ở gốc của mỗi giả hành có ít nhất một mắt ngủ nên có thể tách mỗi hàng giả hành thành một đơn vị để trồng, nhƣng để cây sau khi tách khoẻ hơn thì tốt nhất mỗi đơn vị có ít nhất hai giả hành, và có mắt ngủ. b) Tách cây con Ở Dendrobium, Thunia… thƣờng tạo ra cây con trên giả hành, khi cây con này khoẻ mạnh, có rễ tốt, có thể tách ra khỏi giả hành để trồng. 10 Ở Phalaenopsis có lúc cây con mọc trên cọng phát hoa đến khi có rễ tốt thì tách ra để trồng. Với những loài đơn thân nhƣ Vanda, Hồ Điệp, Ngọc Điểm… khoẻ mạnh, hoặc bị tổn thƣơng ở đỉnh ngọn, chúng sẽ sinh ra cây con từ chồi bên ở gần gốc, các chồi này có rễ dài ra, có thể tách ra để trồng riêng. 2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy mô lan 2.2.1 Khái quát về lịch sử nuôi cấy mô Năm 1838, hai nhà sinh vật học ngƣời Đức, Schleiden và Schwann đƣa ra thuyết tế bào và nêu rõ mọi cơ thể sinh vật có phức tạp tới đâu thì đều có cấu tạo đơn vị rất nhỏ là tế bào. Năm 1902, Haberlandt thực hiện nuôi cấy tế bào thực vật đầu tiên từ lá một số cây một lá mầm nhƣ: Errythronium, Orrnithogalum… Năm 1922, Kotte và Robins lập lại thí nghiệm của Haberlandt nhƣng trên đỉnh sinh trƣởng của rễ một cây hoà thảo, trên môi trƣờng lỏng có muối khoáng và glucose. Tuy nhiên sự sinh trƣởng này chỉ kéo dài trong thời gian ngắn. Năm 1934, White và Gautheret đã nuôi cấy thành công rễ cà chua trên môi trƣờng muối khoáng và dich chiết nấm men. Năm 1934, Nobecourt và Gautheret duy trì sự sinh trƣởng của mô sẹo cà rốt. Năm 1955, Các chất kích thích sự phân bào đƣợc Skoog đặt tên là kinetin, và gộp với các chất kích thích phân bào tự nhiên gọi là cytokinin. Năm 1956, Morel, học trò của Gautheret, áp dụng thành công nuôi cấy mô vào cây lan (Cymbidium) tạo ra các protocorm. Đến nay, hầu hết các giống lan đã đƣợc nhân giống nhanh bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô nhƣ: Cattleya, Hồ Điệp, Ngọc Điểm, ngay cả lan Hài nổi tiếng của Việt Nam (Câu lạc bộ học viên hoa lan, 1999) . 2.2.2 Các phƣơng pháp nuôi cấy a) Nuôi cấy nốt đơn thân Sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn. Chồi này đƣợc kích thích tăng trƣởng, ra rễ tạo cây nguyên vẹn, nhiều chồi và lá 11 đƣợc hình thành, tiếp tục cấy chuyền trên môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp, phƣơng pháp này dùng nhân giống vô tính in vitro và có thể áp dụng đƣợc in vivo (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). b) Nhân chồi bên Giống nhƣ nuôi cấy nốt đơn thân về nguyên tắc nhƣng khác là nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi, thân và thƣờng không cần đến cytokinin để phát triển. Còn phƣơng pháp nhân chồi bên, chồi ngọn đƣợc cô lập trên môi trƣờng dinh dƣỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dƣới tác dụng của cytokinin nồng độ cao. Cytokinin có tác dụng hạn chế ƣu tính ngọn để các chồi bên phát triển (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). c) Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Chồi ngọn đƣợc rửa sạch và khử trùng bằng cồn, hypoclorite calcium. Sau đó dùng dao mổ tách rời đỉnh sinh trƣởng (gồm vùng mô phân sinh và cả phần dƣới ngọn) ra khỏi ngọn và cấy trên môi trƣờng tái sinh cây hoàn chỉnh. Với phƣơng pháp này, chúng ta tạo đƣợc cây sạch bệnh, sạch virus. d) Nuôi cấy mô sẹo Tạo mô sẹo đƣợc tiến hành lần đầu tiên vào năm 1920, mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hoá dƣới các điều kiện đặc biệt (vết thƣơng, xử lý hoá chất, tia phóng xạ...).Các tế bào của mô sẹo phải chịu sự phản phân hoá trƣớc lần phân chia đầu tiên (Halperin, 1969). Mô sẹo tăng trƣởng nhanh trên môi trƣờng có chất auxin và trong môi trƣờng không có chất kích thích thì mô sẹo có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Cụm mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, nhƣng khả năng bị biến dị tế bào soma lại cao hơn. e) Nuôi cấy huyền phù tế bào Huyền phù tế bào đƣợc tạo từ các mảnh mô sẹo nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng lắc liên tục. Trong môi trƣờng lỏng, mô sẹo phóng thích ra những tế bào riêng lẻ hay những cụm tế bào dính nhau để hấp thụ dinh dƣỡng. Sau đó tế bào đƣợc chuyển sang môi trƣờng đặc để tái sinh thành cây. 12 f) Nuôi cấy thể đơn bội Cây thể đơn bội mang bộ nhiễm sắc thể giảm đi một nửa, sử dụng những phần sau cho việc nuôi cấy in vitro: Túi phấn: Thu túi phấn từ chồi hoa thì chỉ khử trùng chồi hoa. Còn thu túi phấn của hoa đã nở thì phải khử trùng túi phấn. Hạt phấn: Đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng để tạo mô sẹo. Cụm hoa: Thƣờng nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng. g) Nuôi cấy protoplast( tế bào trần) Tế bào thực vật đƣợc xử lý bằng hoá lý để tách lớp vỏ cenlulose, nhƣng vẫn còn giữ chức năng của tế bào. Trong môi trƣờng thích hợp, protoplast có thể phân chia tế bào hay tái sinh thành cây (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) Với cách nuôi cấy này, ta có thể áp dụng để chuyển gene vào tế bào trần hay tạo cây đa bội bằng cách dung hợp hai tế bào trần với nhau. 2.2.3 Chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy in vitro Về nguyên tắc, mô thực vật nuôi cấy trong môi trƣờng in vitro cũng cần các chất dinh dƣỡng giống nhƣ cây trồng trên đất. a) Các chất vô cơ Chất vô cơ ở nồng độ lớn hơn 0,5 mM/l đƣợc xếp vào nhóm đa lƣợng, còn nồng độ thấp hơn 0,05 mM/l đƣợc xếp vào nhóm vi lƣợng. Nguồn đạm trong môi trƣờng in vitro đƣợc cung cấp ở hai dạng ion NH4 + và NO3 - . Lƣợng đạm tổng số cần trong khoảng từ 12-60 mM/l, trong đó có NH4 + biến thiên từ 6-20 mM/l và NO3 - từ 6-40 mM/l ( Bùi Bá Bổng, 1995). Phần lớn cây ƣa NO3 - hơn NH4 + nhƣng cũng có những trƣờng hợp ngƣợc lại. Lƣợng K+ cần trong môi trƣờng biến thiên từ 2-25 mM/l. Còn các ion khác Ca2+, H2PO4 - , SO4 2- , Mg 2+ , thƣờng thấp hơn khoảng 1-5 mM/l Khoáng vi lƣợng thƣờng đƣợc dùng ở nồng độ 0,1-100 µM/l b) Nguồn carbon Mô cấy trong môi trƣờng tự dƣỡng không có khả năng tự dƣỡng (autotrophic), do không tiến hành đƣợc quang hợp đầy đủ trong điều kiện không thuận lợi nhƣ 13 thiếu sự trao đổi khí bên trong chai và bên ngoài chai. Do đó nguồn carbon phải đƣợc cung cấp cho môi trƣờng nuôi cấy nhƣ các dạng đƣờng, chủ yếu là đƣờng sucrose, thƣờng chiếm khoảng 2-3%. c) Vitamin và amino acid Các vitamin thƣờng dùng là thiamine (B1), nicotinic acid (B3), pyridoxine (B6), calcium pentothenate (B5) và myo- inositol. Nồng độ từ 0,1 đến 10 mg/l. Các amino acid thƣờng dùng là L- asparagine (100 mM/l), L-glycine (2mM/l), L-arginine (10 mM/l), L-cysteine (10 mM/l). Khác với đạm vô cơ, các amino acid thƣờng đƣợc tế bào hấp thụ nhanh hơn. Tuy nhiên, có thể dùng các chất hữu cơ trong nuôi cấy nhƣ nƣớc dừa (5-20%), các chất trích từ khoai tây, cam, cà chua, chuối. d) Các chất điều hoà sinh trưởng Auxin: Các dạng auxin thƣờng dùng trong nuôi cấy in vitro là 2,4-D,NAA, IBA và IAA ở nồng độ 0,1-5 mg/l. NAA và IBA thƣờng dùng để cho ra rễ và dùng phối hợp với cytokinin trong sự nhân chồi. Còn 2,4-D rất hữu hiệu trong tạo ra mô sẹo.c Cytokinin: Có tác dùng trong sự phân chia tế bào, sự phân hoá chồi, sự nhân chồi. Các cytokinin thông dụng là kinetin, BAP, nồng độ khoảng 1-10 mg/l, kích thích sự ra chồi bên, làm giảm ảnh hƣởng ngọn và ức chế sự thành lập rễ. Gibberellin: Có khoảng 20 loại nhƣng GA3 là loại thông dụng nhất, có tác dụng làm tăng sự vƣơn lóng và sự phát triển của đỉnh sinh trƣởng hoặc chồi. Tuy nhiên gibberellin không đƣợc dùng phổ biến trong nuôi cấy mô e) Agar (thạch) Đƣợc bào chế từ rong biển, dùng làm chất nền cho môi trƣờng nuôi cấy, có nguồn gốc thực vật tự nhiên, không gây độc đối với cây. Agar hoà tan thành một thể keo có thể bám nƣớc và hấp thụ các hợp chất. Lƣợng agar thƣờng dùng từ 0,6- 0,8%, nếu nồng độ thấp (0,4%) môi trƣờng mềm loãng. Nồng độ cao (1%) môi trƣờng bị cứng, khó cấy và mô khó tiếp xúc với môi trƣờng. 14 f) Nước Nên sử dụng nƣớc cất để bảo đảm chất lƣợng nƣớc, chiếm khoảng 95% môi trƣờng nuôi cấy. Ngoài nƣớc cất có thể dùng nƣớc khử ion nhƣng không dùng nƣớc máy. g) Yêu cầu pH pH môi trƣờng cấy mô từ 5,0-6,5 và thƣờng đƣợc điều chỉnh để đạt khoảng 6,0. Môi trƣờng có pH thấp (thấp hơn 4,5) hoặc cao (cao hơn 7,0) ức chế sự phát triển của mô. Nếu pH bắt đầu khoảng 5,0-7,0, sau khi hấp sẽ giảm đi 0,3-0,5 đơn vị. 2.2.4 Các bƣớc nhân giống in vitro Bước 1: Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng. Mẫu cấy thƣờng là chồi, mắt lóng, đỉnh sinh trƣởng, lá, rễ... đem rửa sạch và khử trùng bằng cồn, natri hypochlorit, calci hypochlorit. Sau đó, mẫu đƣợc đƣa vào môi trƣờng tạo điều kiện phân chia và phân hoá mạnh. Đối với mẫu dễ bị hoá nâu, môi trƣờng thƣờng bổ sung than hoạt tính hoặc ngâm mẫu với ascorbic acid và citric acid (25-150 mg/l mỗi loại) trƣớc khi cấy (Bùi Bá Bổng, 1995). Bước 2: Tạo thể nhân giống in vitro Thể chồi (multiple shoot) và thể cắt đốt (cutting) cấy vào môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng (cytokinin, GA3...) để tạo mô sẹo, tạo cụm chồi. Bước 3: Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng nhất nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Sự nhân giống này tuỳ thuộc vào khả năng tạo chồi nách hoặc phát khởi chồi bất định từ những khối giống nhƣ callus dƣới gốc chồi, rồi ra rễ. Bước 4: Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Các chồi, callus hay mô sẹo sẽ đƣợc cấy vào môi trƣờng có auxin để tạo rễ, tạo thân, lá đầy đủ. Cây phải đƣợc nuôi cấy trong điều kiện giống nhƣ bên ngoài vƣờn ƣơm để thuần hoá cho đến khi cây con khỏe mạnh. 15 Bước 5: Chuyển cây in vitro ra vƣờn ƣơm Cây con phát triển tốt trong môi trƣờng in vitro đƣợc lấy ra và rửa sạch môi trƣờng nhân tạo bám ở gốc rễ, rồi đem trồng ra vƣờn ƣơm. Do thay đổi về điều kiện sống, cây con dễ bị tress, mất nƣớc và mau héo nên vƣờn phải mát, ẩm độ cao. 2.2.5 Các yếu tố ảnh hƣởng nhân giống in vitro a) Lựa chọn mẫu cấy Mô non (chồi đỉnh), chồi nách hay chồi bất định tái sinh tốt hơn so với mô già của cùng một cây. b) Môi trường nuôi cấy Môi trƣờng MS (Murashige và Skoog) cho kết quả tốt trong nhân giống cây ban đầu và nhân chồi tiếp theo. Để tạo chồi nách nồng độ auxin và cytokinin tƣơng đối thấp, còn tạo chồi bất định cần nồng độ cytokinin cao và auxin thấp; Còn tạo mô sẹo thì ngƣợc lại. Môi trƣờng rắn hay lỏng cũng ảnh hƣởng đến khả năng phát triển rễ. Agar giúp cây đứng vững và tăng khả năng thoáng khí tạo điều kiện hấp thu dƣỡng chất. Đối với cây tiết các độc tố nhƣ phenol thì cần thêm than hoạt tính hay PVP (polyvinyl pyrrolidone) để hấp thụ các chất này giúp cây tăng trƣởng tốt hơn. Môi trƣờng có thể bổ sung các chất ngăn cản sự oxyt hoá phenols nhƣ citric acid, ascorbic acid, thiourea hoặc L- cystine. Hoặc bổ sung thêm amino acid nhƣ glutamine, arginine và asparagine. Thƣờng xuyên cấy chuyền vào môi trƣờng mới nhằm tạo điều kiện dinh dƣỡng đầy đủ cho cây nuôi cấy in vitro sinh dƣỡng tốt. c) Ánh sáng và nhiệt độ Ánh sáng: Cƣờng độ ánh sáng phù hợp trong khoảng 1000-5000 lux. Thời gian chiếu sáng thƣờng 16 giờ sáng/8 giờ tối. Nhiệt độ: Ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây in vitro. Nhiệt độ tối ƣu khoảng 20-250C. 16 2.3 Công nghệ tạo hạt nhân tạo 2.3.1 Khái niệm Năm 1978, Murashige phát hiện đầu tiên về kỹ thuật hạt nhân tạo. Năm 1987, Redenbaugh và cộng sự đã phát triển thành công kỹ thuật tạo hạt nhân tạo. Về cơ bản, hạt nhân tạo giống hạt tự nhiên, có cấu tạo là phôi vộ tính đƣợc bọc bởi lớp áo bên ngoài bởi lớp gel và có khả năng nẩy mầm nhƣ hạt tự nhiên, nhƣng khác biệt là hạt nhân tạo không có phôi nhũ. Hình 2-2: Cấu tạo hạt nhân tạo Năm 1988, McKersie và cộng sự đã tạo thành công hạt nhân tạo cây cỏ linh lăng, 65% hạt biến đổi sau bƣớc làm khô. Năm 1985, Kitto và Janick bọc hạt nhân tạo cà rốt bằng polyxyethylene đạt tỷ lệ sống 3%. Janick (1988), tạo hạt nhân tạo thành công trên cần tây. Gray (1987) thành công trên nho và cây cỏ nón. Năm 1988, lúa mì đƣợc tạo hạt nhân tạo do Carman và cộng sự. 2.3.2 Mục đích Sự phát triển của công nghệ nuôi cấy in vitro, tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính, đã mở rộng phạm vi ứng dụng mới cho việc tạo hạt nhân tạo nhằm mục đích vận chuyển, bảo quản, lƣu trữ giống dễ dàng hơn. Trong điều kiện tối ƣu thì hạt sẽ nẩy mầm khỏi lớp vỏ nhân tạo còn không sẽ chuyển sang trạng thái ngừng sinh trƣởng cho đến khi gặp điều kiện thuận lợi. Ngoài ra, còn có nhiều lợi ích cho việc nhân giống nhanh những thực vật nhƣ: 17 - Không tạo đƣợc hạt - Hạt tạo thành nẩy mầm với một số lƣợng thấp - Khả năng hạt sống sót rất thấp sau khi bảo quản 2.3.3 Các nhân tố tạo hạt nhân tạo 2.3.3.1 Tạo phôi vô tính Phôi soma đƣợc hình thành không thông qua quá trình tạo mô sẹo đƣợc gọi là phôi vô tính, phôi vô tính có thể tái sinh cây hoàn chỉnh hoặc nhân sinh khối trực tiếp bằng hệ thống nuôi cấy phù hợp. Phôi soma khác với phôi hợp tử, phôi hợp tử thành lập do sự phối hợp giữa giao tử đực và giao tử cái, khởi đầu đƣợc thành lập có cấu trúc đơn cực nối liền với các mô mạch của mô sẹo. Con phôi soma thành lập từ mô tế bào , có cấu trúc lƣỡng cực và không có mạch nối liền với mô sẹo. Năm 1958, khi những tế bào phôi thực vật đầu tiên đƣợc thu nhận từ mô dinh dƣỡng của cây cà rốt (Daucus carota). Sau đó, hàng loạt các mô thực vật khác sử dụng để nuôi cấy tạo phôi (Triticum aestivum và Glycine max) Giai đoạn trƣớc khi hình thành tế bào soma gọi là tiền phôi (PEDC- preembryogenic determined cell) (Sharp và csv, 1980). Vì tế bào tiền phôi có thể phân chia để hình thành tế bào phôi trực tiếp, gọi là phát sinh phôi trực tiếp. Bảng 2.1: Sự phát triển của mô trên môi trƣờng nuôi cấy 18 Tuy có nhiều tế bào phát sinh tế bào phôi không cần các chất kích thích sinh trƣởng nhƣ tế bào cây cà rốt, đậu ván… nhƣng cũng có nhiều tế bào lại cần auxin để phân bào trƣớc khi phát sinh tế bào phôi (IEDC- induced embryonic determined cell) (Sharp và scv, 1980). Và có nhiều tế bào hình thành phôi từ mô sẹo, sự phát sinh phôi tiến hành gián tiếp. Ngoài ra, còn sử dụng tế bào phôi hợp tử để tạo phôi, ngoại trừ hạt đƣợc tạo trong quá trình thụ phấn mà kiểu di truyền không xác định. 2.3.3.2 Cơ chế phát sinh phôi soma Những quan sát chi tiết về quá trình phát sinh phôi phát hiện có 4 pha : 0, 1, 2 và 3, đƣợc nhận thấy trong giai đoạn đầu của tiến trình phát sinh phôi trong hệ thống nuôi cấy nói trên (Fujimura và Komamine, 1979). Ở pha 0, những tế bào đơn (giai đoạn 0) hình thành những cụm tế bào có khả năng phát sinh phôi (giai đoạn 1) trên môi trƣờng có auxin. Trong suốt giai đoạn này, những cụm tế bào hình thành từ những tế bào đơn có khả năng tạo phôi khi môi trƣờng nuôi cấy không có auxin, để hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1. Sau đó, pha 1 xuất hiện khi cấy chuyển những cụm tế bào giai đoạn 1 qua môi trƣờng không có auxin. Trong suốt pha 1, những cụm tế bào tăng sinh chậm và dƣờng nhƣ không biệt hóa. Sau pha 1 sự phân bào xuất hiện nhanh trên một phần của những cụm tế bào, dẫn đến việc hình thành những tế bào phôi hình cầu. Pha này đƣợc gọi là pha 2. Pha tiếp theo sau, pha 3, cây con in vitro phát triển từ những phôi hình cầu qua phôi hình tim và phôi hình thủy lôi. 19 Hình 2-3: Các giai đoạn phát sinh phôi soma 2.3.3.3 Tạo vỏ bọc bằng sodium alginate Có rất nhiều tác nhân tạo gel đƣợc sử dụng làm vỏ bọc cho phôi. Đó có thể là agar, alginate, polyco 2133 (Bordon Co.), carboxyl methyl cellulose, carrageenan, gelrite (Kelko. Co.), guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum … những hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi đƣợc cho vào môi trƣờng có chất điện phân thích hợp nhƣ đồng sulphate, calcium chloride hoặc ammonium chloride nhờ vào những liên kết ion. Phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phôi đó là sử dụng sodium alginate (Bajaj, 1995; Jeon và csv, 1986; Redenbaugh và csv, 1993). Alginate đƣợc sử dụng nhiều do nó có những đặc tính rất thuận lợi nhƣ tính dính vừa phải, không gây độc cho phôi sinh dƣỡng, có các đặc tính tƣơng hợp sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để đƣợc lâu, độ cứng của gel vừa phải để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ đƣợc phôi khỏi những tổn thƣơng bên ngoài. 20 Hình 2-4: Công thức hoá học của alginate Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nƣớc, muối của acid alginic, là một polyuronic bao gồm -D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 -L-guluronate (G) (Aoyagi và csv, 1998). Nguyên tắc chính trong quá trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi nhỏ vào trong hỗn hợp NaCl2.2H2O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na + có trong hỗn hợp sodium alginate với Ca2+ có trong hỗn hợp CaCl2.2H2O. Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào số lƣợng ion Na+ trao đổi với ion Ca2+. Do đó nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium alginate và CaCl2.2H2O, và thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ƣu để có thể tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng thích hợp nhất. Không nhƣ phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dƣỡng bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh dƣỡng, chất điều hòa tăng trƣởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối đa cho tăng trƣởng và sống sót của phôi (Gray, 1990; Gray và Purohit, 1991; Redenbaugh và Walker, 1990). Ngoài ra nhằm tránh cho phôi bị mất nƣớc, hay các tổn thƣơng cơ học, tăng sức đề kháng cho phôi ngƣời ta có thể thêm vào chất nền gel chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật. Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate cho thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, vẫn còn nhiều vấn đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dƣỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao (Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh và csv, 1993)… Đã có một số đề nghị cho rằng, việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng 21 cao khả năng sống sót, phát triển của phôi vô tính hơn. Nguyên nhân là do than hoạt tính tăng cƣờng khả năng hô hấp của phôi, và nó giữ lại những chất dinh dƣỡng nhiều hơn trong vỏ bọc, phóng thích chúng rất chậm dùng cho sự phát triển của phôi. 2.3.3.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo Hình cầu Hình tim Hình thuỷ lôi Hình lá mầm Hình 2-5: Các dạng phôi soma Bƣớc 1: Dùng dao cắt chồi (shootbud) có kích thƣớc 2-3 mm từ cây nuôi cấy in vitro. Sau đó, dùng dao tách rời các phôi hình tim. Bƣớc 2: Dùng pipette hay ống tiêm hút dung dịch sodium alginate rồi cho nhỏ từng giọt rơi xuống. Bƣớc 3: Dùng pince gắp chồi hay phôi đƣa vào trong giọt alginate đƣợc nhỏ xuống dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM trong 15 phút. Bƣớc 4: Dùng pince gắp hạt cho vào nƣớc cất vô trùng trong 5 phút để làm sạch lƣợng CaCl2.2H2O còn sót lại. 22 Hình 2-6: Quy trình tạo hạt nhân tạo 2.4 Nấm rễ cộng sinh- mycorrhiza 2.4.1 Khái niệm Các loài thực vật khai thác từ đất trồng từ sự giúp ích của vi sinh vật có lợi đƣợc gọi là mycorrhiza (nấm vùng rễ). Các sợi nấm len lõi giữa các hạt đất, phát triển bên trong chất hữu cơ, thậm chí chúng còn xâm nhập vào vỏ côn trùng chết, từ đó sử dụng các dƣỡng chất hữu cơ và photphorus, sau đó trả lại cho cây trồng. Nhƣ vậy, có sự kết hợp cao độ giữa nấm đất và rễ cây trồng trong đó các nấm tạo nên mycorrhiza thƣờng là một số nấm Basidiomycetes, Ascomycetes, và Zygomycetes (theo Harley & Smith 1983, Kendrrick 1992, Brundrett 1992) Nấm rễ là một thuật ngữ đƣợc Frank sử dụng lần đầu vào năm 1885 khi phát hiện mối liên hệ giữa sợi nấm và rễ trên cây thông và một số cây lá rộng, đƣợc lấy từ chữ Hy Lạp “Mykes” và “Rhiza”. Sau đó ghép từ tiếng Anh “Myco” vào thành từ “Mycorrhiza” Ngƣời ta dự đoán, trên thế giới ngày nay có 1000 chi 200 họ thực vật có nấm rễ. Theo thống kê của Trappe năm 1962 có 535 loài nấm thuộc 81 chi 30 họ 10 bộ nấm có thể cộng sinh với trên 1500 loài cây gỗ khác nhau. Dung dịch sodium alginate Đƣa phôi/chồi vào giọt sodium alginate Rửa hạt trong nƣớc cất 5 phút để sạch CaCl2.2H2O Ngâm trong dung dịch CaCl2.7H2O 100 mM trong 15 phút 23 2