Nghiên cứu kỹ thuật vi ghép cây bưởi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT VI GHÉP CÂY BƢỞI (Citrus grandis) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: HÀ THANH VÕ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT VI GHÉP CÂY BƢỞI (Citrus grandis) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: HÀ THANH VÕ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ:  Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng.  TS Trần Thị Dung đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.  KS Trần Ngọc Tống đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực tập tốt nghiệp.  Cử nhân Trần Thị Bích Chiêu, Kỹ sƣ Nguyễn Thị Thu Hằng, cử nhân Lƣu Phúc Lợi đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.  Ông Nguyễn Văn Hòa, bác Ba Lắm, ông Phạm Văn Y cùng các nhà vƣờn đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.  Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27, các sinh viên đàn em K28, K29 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ trong thời gian thực tập tốt nghiệp. iv TÓM TẮT HÀ THANH VÕ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT VI GHÉP CÂY BƢỞI (Citrus grandis)”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. TRẦN THỊ DUNG Ở nƣớc ta hiện nay dịch bệnh vẫn đang tiềm ẩn và khó phòng ngừa trên cây thuộc họ cam quýt. Đặc biệt là bệnh do nòi virus tristeza với tác nhân truyền bệnh do các loại côn trùng chích hút và bệnh vàng lá gân xanh do vi khuẩn Liberobacter asiaticum đã gây thiệt hại rất lớn cho các nhà vƣờn ở khắp nƣớc ta. Vì vậy, nhu cầu có đƣợc cây sạch virus và có khả năng kháng bệnh tốt là yêu cầu cần thiết phải làm của công tác giống. Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng là các giống bƣởi khác nhau, bƣởi dùng làm gốc ghép gồm hai giống: bƣởi Xim Vang ở Đồng Nai và bƣởi Bồng ở Huế. Chồi ghép là các giống bƣởi khác nhau: bƣởi Năm Roi, bƣởi Da Xanh và bƣởi Đƣờng Lá Cam. Mỗi chồi ghép đƣợc ghép lên một loại gốc ghép và mỗi cặp gốc ghép và chồi ghép đƣợc ghép với ba kiểu ghép khác nhau (ghép chữ T ngƣợc (T), ghép mặt cắt (M), ghép hàm ếch (E)). Kết quả đạt đƣợc: Tỷ lệ sống của gốc ghép là bƣởi Bồng (77,03%) cao hơn tỷ lệ sống của gốc ghép là bƣởi Xim Vang (60%). Chồi ghép Năm Roi (77,78%) và Da Xanh (72,22%) cho tỷ lệ sống cao hơn chồi ghép là bƣởi Đƣờng Lá Cam (55,55%). Cách ghép hàm ếch (E) cho tỷ lệ sống 75.55% tƣơng đồng với cách ghép chữ T ngƣợc (71,11%) và cao hơn với cách ghép mặt cắt (58,89%). Tỷ lệ sống của các cây ghép có gốc ghép là bƣởi Bồng, chồi ghép Năm Roi và cách ghép chữ T ngƣợc tƣơng đồng với cây ghép có gốc ghép là bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh và cách ghép hàm ếch và đạt cao nhất (93,33%) so với các loại cây ghép còn lại. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .......................................................................................................................... iii Tóm tắt ............................................................................................................................... iv Mục lục ...............................................................................................................................v Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................... viii Danh sách các hình .............................................................................................................x Danh sách các bảng .......................................................................................................... xii Danh sách các biểu đồ ...................................................................................................... xiii 1. GIỚI THIỆU ...................................................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề .....................................................................................................................1 1.2 Mục đích - yêu cầu .......................................................................................................1 1.2.1 Mục đích ............................................................................................................1 1.2.2 Yêu cầu .............................................................................................................1 1.3 Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................................................2 1.4 Phạm vi nghiên cứu ......................................................................................................2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................................3 2.1 Giới thiệu về cây bƣởi ..................................................................................................3 2.1.1 Nguồn gốc và phân loại .................................................................................... 3 2.1.1.1 Nguồn gốc ..............................................................................................3 2.1.1.2 Phân loại ................................................................................................4 2.1.2 Đặc điểm hình thái của cây bƣởi .......................................................................4 2.1.3 Các giống bƣởi dùng trong thí nghiệm .............................................................6 3.1.3.1 Các giống bƣởi dùng làm chồi ghép ......................................................6 3.1.3.2 Các giống bƣởi dùng làm gốc ghép .......................................................7 2.2 Các loại bệnh virus và môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt ...................8 2.2.1 Các loại bệnh do virus .......................................................................................8 2.2.1.1 Citrus Tristeza virus (CTV) ...................................................................8 vi 2.2.1.2 Citrus tatter leaf virus ( CTLV) .............................................................9 2.2.1.3 Citrus exocortis virus (CEV) ................................................................10 2.2.2 Môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt ...........................................10 2.2.2.1 Rệp muội hại cây trồng .........................................................................10 2.2.2.2 Rệp sáp hại cây trồng ..........................................................................11 2.3 Các cách nhân giống của cây bƣởi ..............................................................................13 2.3.1 Nhân giống cổ điển ..........................................................................................13 2.3.1.1 Nhân giống bằng hạt .............................................................................13 2.3.1.2 Nhân giống bằng cách chiết cành .........................................................13 2.3.1.3 Nhân giống bằng cách giâm cành .........................................................14 2.2.1.4 Nhân giống bằng cách ghép ..................................................................15 2.3.2 Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô ...................................................19 2.3.2.1 Các yếu tố ảnh hƣởng đến vi ghép ........................................................20 2.3.2.2 Chuyển cây ra vƣờn ƣơm ......................................................................22 2.3.2.3 Lịch sử hình thành và phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật .............22 2.3.2.4 Một số kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật ..................................................23 2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về kỹ thuật vi ghép ...........................................24 2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc .....................................................................................24 2.4.2 Nghiên cứu ngoài nƣớc ....................................................................................25 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................28 3.1 Vật liệu ........................................................................................................................28 3.1.1 Trang thiết bị và dụng cụ .................................................................................28 3.1.1.1 Trang thiết bị .........................................................................................28 3.1.1.2 Dụng cụ .................................................................................................28 3.1.2 Mẫu cấy ............................................................................................................28 3.1.3 Môi trƣờng nuôi cấy .........................................................................................28 3.2 Điều kiện nuôi cấy .......................................................................................................29 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................................30 3.3.1 Bố trí thí nghiệm ..............................................................................................30 3.3.2 Chỉ tiêu theo dõi ...............................................................................................31 3.3.3 Xử lý số liệu .....................................................................................................31 3.3.4 Quy trình thí nghiệm ........................................................................................31 vii 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................................35 4.1 Tỷ lệ sống của cây vi ghép ..........................................................................................35 4.2 Khả năng hình thành chồi mới của cây vi ghép ..........................................................40 4.3 Chiều cao chồi của cây vi ghép ...................................................................................44 4.4 Số lá của cây vi ghép ...................................................................................................51 4.5 Nhận xét chung ............................................................................................................56 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................................57 5.1 Kết luận........................................................................................................................57 5.2 Đề nghị ........................................................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................58 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D: 2,4 – Dichlorophenoxyacetic Acid B: Bồng BNR: Bƣởi Năm Roi B-NR-E:Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Năm Roi và cách ghép hàm ếch. B-NR-T: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Năm Roi và cách ghép chữ T ngƣợc. B-NR-M: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Năm Roi và cách ghép mặt cắt. B-DX-E: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh và cách ghép hàm ếch. B-DX-T: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh và cách ghép chữ T ngƣợc. B-DX-M: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh và cách ghép mặt cắt. B-ĐLC-E: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Đƣờng Lá Cam và cách ghép hàm ếch. B-ĐLC-T: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Đƣờng Lá Cam và cách ghép chữ T ngƣợc. B-ĐLC-M: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Đƣờng Lá Cam và cách ghép mặt cắt. CEV: Citrus exocortis virus CTLV: Citrus tatter leaf virus CTV: Citrus tristeza virus DF: Độ tự do DNA: Acid desoxyribonucleic DX: Da Xanh ĐLC: Đƣờng Lá Cam E: Cách ghép hàm ếch F: Fitted values (giá trị lý thuyết) FAO: Food and Agrculture Organization FFTC: Food and fertilizer technology center IAA: Indol-3-Acetic Acid IBA: Indole – 3 - Butyric Acid M: Cách ghép mặt cắt MS: Mean square ix Mt MS: Môi trƣờng Murashige&Skoog NAA: α – Naphthaleneacetic Acid NR: Năm Roi P: Prob. Level SS: Sum of Squares T: Cách ghép chữ T ngƣợc XV: Xim Vang XV-NR-E: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Năm Roi và cách ghép hàm ếch XV-NR-T: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Năm Roi và cách ghép chữ T ngƣợc. XV-NR-M: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Năm Roi và cách ghép mặt cắt. XV-DX-E: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Da Xang và cách ghép hàm ếch. XV-DX-T: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Da Xanh và cách ghép chữ T ngƣợc. XV-DX-M: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Da Xanh và cách ghép mặt cắt. XV-ĐLC-E: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Đƣờng Lá Cam và cách ghép hàm ếch. XV-ĐLC-T: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Đƣờng Lá Cam và cách ghép chữ T ngƣợc. XV-ĐLC-M: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Đƣờng Lá Cam và cách ghép mặt cắt. x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Quả bƣởi Đƣờng Lá Cam .................................................................. 6 Hình 2.2: Quả bƣởi Đƣờng Lá Cam xẻ dọc ...................................................... 6 Hình 2.3: Quả bƣởi Da Xanh ............................................................................. 7 Hình 2.4: Quả bƣởi Da Xanh xẻ dọc ................................................................. 7 Hình 2.5: Vƣờn cây bị tàn phá do virus tristeza (cành chết khô và không có trái) ........................................................ 8 Hình 2.6: Cây bƣởi bị nhiễm bệnh virus tristeza (cây lùn và lá bị vàng) .......... 8 Hình 2.7: Triệu chứng bệnh “nổ lá” .................................................................. 9 Hình 2.8: Gốc cây bị bệnh bong vỏ gốc thân .................................................... 10 Hình 2.9: Các môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt……………...11 Hình 2.10: Hạt bƣởi nảy mầm…………………………………………………13 Hình 2.11: Cách thực hiện chiết cành ............................................................... 14 Hình 2.12: Thân cây hai lá mầm ....................................................................... 16 Hình 2.13: Cách ghép áp ................................................................................... 17 Hình 2.14: Cách ghép cành ............................................................................... 17 Hình 2.15: Chồi nách trên thân cây ................................................................... 18 Hình 2.16: Cách ghép cửa sổ ............................................................................. 18 Hình 2.17: Cách ghép chữ T .............................................................................. 18 Hình 2.18: Cách ghép mắt dạng mảnh .............................................................. 19 Hình 3.1: Vi giâm cành bƣởi Da Xanh trên môi trƣờng MS ............................. 32 Hình 3.2: Cấu trúc chồi đỉnh…………………………………………………..32 Hình 3.3: Hạt bƣởi Bồng đã khử trùng………….……………………………..33 Hình 3.4: Gốc ghép với ba cách ghép mắt cắt, chữ T ngƣợc và ghép vào lỗ trên thân (hàm ếch)………………………………………....34 Hình 4.1: Cây vi ghép hình thành rễ mới sau 21 ngày ..................................... 36 Hình 4.2: Cây vi ghép ở tuần thứ 3 (XV-NR-M): gốc ghép Xim Vang, xi chồi ghép Năm Roi, cách ghép mặt cắt ............................................. 37 Hình 4.3: Chồi ghép bật mầm ở tuần 3 (B-NR-T): gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Năm Roi, cách ghép chữ T ngƣợc .................................... 41 Hình 4.4 Cây ghép B-DX-T: gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh, cách ghép chữ T ngƣợc……………………………………………..41 Hình 4.5: Cây ghép B-DX-M: gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh, cách ghép mặt cắt ở tuần 3………...………………………………..43 Hình 4.6: Gốc bƣởi Xim Vang (trái) và gốc bƣởi Bồng (phải) với chồi ghép Năm Roi và cách ghép chữ T ngƣợc ở tuần 1……………………....44 Hình 4.7: Cây ghép ở tuần 1……………………………………………………44 Hình 4.8: Chồi ghép Năm Roi trên gốc ghép bƣởi Bồng ở tuần 2 (trái) và tuần 3 (phải)..……………………………………..46 Hình 4.9: Lá chồi ghép Năm Roi trên gốc ghép bƣởi Bồng ở tuần 4………….52 Hình 4.10: Chồi ghép Da Xanh trên gốc ghép bƣởi Bồng ở tuần 2 (trái) và tuần 3 (phải)……………………………………………….53 Hình 4.11: Chồi ghép Da Xanh trên gốc ghép bƣởi Xim Vang ở tuần 1 (trái) và tuần 3( phải)……………………………………..54 xii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1 : Thành phần rệp hại cây trồng thuộc họ cam quýt chủ yếu ở Việt Nam…………………………………………………………12 Bảng 3.1: Thành phần môi trƣờng MS (Murashige & Skoog) .......................... 29 Bảng 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ..................................................................... 30 Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến tỷ lệ sống của cây vi ghép ..... 35 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến khả năng hình thành chồi mới của cây vi ghép ................................................ 40 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến chiều cao chồi của cây vi ghép ................................................................................ 45 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến số lá đƣợc hình thành của cây vi ghép ................................................................................ 51 xiii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Trang Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ sống của 18 nghiệm thức……………………..……………39 Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ chồi bật mầm của 18 nghiệm thức………………………...43 Biểu đồ 4.3: Chiều cao chồi của 18 nghiệm thứ.………………………………50 Biểu đồ 4.4: Số lá của 18 nghiêm thức………………………………………....55 1 Chƣơng 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Khí hậu Việt Nam là khí hậu nóng ẩm nhiệt đới rất thuận lợi cho các loại cây trồng khác nhau sinh trƣởng và phát triển. Trong nhiều loại cây trồng khác nhau ấy thì cây có múi là một chủng loại cây ăn trái chiếm vị thế quan trọng trên thế giới. Thật vậy, ngoài vai trò cung cấp một lƣợng vitamin dồi dào cho sức khỏe con ngƣời, cây có múi còn là loại cây mang lại giá trị kinh tế cao và làm tăng ngoại tệ đáng kể nhờ xuất khẩu. Việt Nam là một trong những nƣớc bản địa của vùng phát sinh cây có múi, và cho đến nay cây có múi giữ vị trí quan trọng trong ngành sản xuất trái cây. Tuy nhiên những năm gần đây, dịch bệnh vàng lá greening cùng nhiều loại bệnh truyền nhiễm khác đã lây lan mạnh làm suy yếu cây, từ đó làm giảm năng suất và phẩm chất quả. Để có giống tốt cung cấp cho các nhà vƣờn, công tác giống có vai trò rất quan trọng trong việc cung cấp giống cho các nhà vƣờn. Để có đƣợc giống sạch virus cũng nhƣ sạch các bệnh khác, thỏa mãn yêu cầu cấp thiết về chất lƣợng thì vi ghép cây là điều cần thực hiện trong sản xuất cây có múi hiện nay. Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật vi ghép cây Bƣởi (Citrus grandis)”. 1.2 Mục đích - yêu cầu 1.2.1 Mục đích Nghiên cứu các kỹ thuật vi ghép cây bƣởi nhằm tạo ra cây bƣởi in vitro sạch bệnh. 1.2.2 Yêu cầu  Theo dõi sự sinh trƣởng của cây bƣởi in vitro nuôi cấy từ hạt đƣợc dùng làm gốc ghép.  Theo dõi sự sinh trƣởng của cây bƣởi vi ghép sau khi ghép. 2 1.3 Đối tƣợng nghiên cứu Thực hiện vi ghép trên cây bƣởi với gốc ghép là cây bƣởi Bồng ở Huế và bƣởi Xim Vang ở huyện Vĩnh Cữu, tỉnh Đồng Nai. Cành ghép là các giống bƣởi cao sản đƣợc ƣa chuộng trên thị trƣờng hiện nay cụ thể là bƣởi Năm Roi ở Vĩnh Long, bƣởi Da Xanh ở Bến Tre, bƣởi Đƣờng Lá Cam ở Đồng Nai. 1.4 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây bƣởi Bƣởi là cây đặc sản quý, có giá trị dinh dƣỡng cao, ngoài chất đƣờng (8 – 10%, trong đó saccharose là chủ yếu), bƣởi đặc biệt rất giàu vitamine C (khoảng 40 mg/100g thịt quả), acid hữu cơ (0,2 – 1,0%), pectin (0,45 – 0,5%) có tác dụng tốt đối với sức khoẻ. Pectin của bƣởi có tác dụng chống nhiễm kim loại nặng và nhiễm phóng xạ, tham gia vào quá trình bài tiết cholesterol, chống xơ cứng động mạch và có tác dụng chữa bệnh đƣờng ruột [4]. Theo Đƣờng Hồng Dật (2000), ở Trung Quốc các thầy thuốc đã dùng vỏ quả cam quýt để phòng ngừa dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và bệnh chảy máu dƣới da. Bƣởi còn là loại quả có tiềm năng kinh tế cao, trọng lƣợng quả lớn, cây có thể cho thu hoạch quả đạt năng suất cao. Theo Nguyễn Văn Kế (1990), sản lƣợng bƣởi toàn cầu khoảng 5 triệu tấn trên tổng số 65 triệu tấn quả của họ cam quýt. Riêng tại Việt Nam, Nam Bộ có khoảng 2000 hecta trồng cây họ có múi. Theo FAO (Tổ chức an toàn lƣơng thực thế giới, 2002) thì diện tích trồng cam quýt và bƣởi trên toàn thế giới khoảng 7.330.000 ha với sản lƣợng 103.300.000 tấn/năm, mang lại giá trị khoảng 3 tỷ USD. Và cũng theo dự báo của FAO trong thời kỳ 2001 đến 2010, nhu cầu tiêu thụ cây cam quýt tăng cao hơn tốc độ tăng sản lƣợng, theo đó nhu cầu thị trƣờng tiêu thụ tăng bình quân 3,6%/năm. Trong khi sản lƣợng chỉ đạt 2,8%/năm (Viện nghiên cứu cây ăn quả miền nam, 2001). Ngoài ăn tƣơi, quả bƣởi còn có thể chế biến thành nhiều sản phẩm có giá trị kinh tế nhƣ các loại nƣớc giải khát, lấy tinh dầu từ vỏ và hạt. 2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 2.1.1.1 Nguồn gốc Alphonse de Candle (1886) cho rằng có một số giống bƣởi tại quần đảo Malaysia cho thấy nơi đây có nguồn gốc canh tác bƣởi lâu đời. Roxburgh (1983) cho rằng bƣởi đã đƣợc di thực đến Calcutta (Ấn Độ) từ quần đảo Java (Indonesia). 4 Theo Webber và ctv (1967), trong quần đảo Friendly và Fiji còn tồn tại rất nhiều giống bƣởi hoang dại, cho thấy đây có thể là vùng khởi nguyên của bƣởi. Tuy nhiên, Webber và ctv (1967) cũng cho rằng dựa trên các dữ liệu hiện có. Bƣởi cũng có thể là cây bản địa của quần đảo Malaysia và Indonesia, từ hai nơi này bƣởi đã lan truyền sang Trung Quốc, Ấn Độ rồi đến Iran, Palestin và vào Châu Âu. Theo Saunt (1990), bƣởi có nguồn gốc ở Miền Nam Trung Quốc nơi chúng đƣợc trồng rộng rãi và phân bố tới khắp các nƣớc Đông Nam Á, nơi đây có nhiều giống bƣởi đã và đang đƣợc phát triển. Jorgenson (1984) cho rằng bƣởi và nhóm cây có múi khác đã đƣợc mang đến vùng Đông Nam Á, bởi những ngƣời Trung Quốc đi lập nghiệp và do đó bƣởi đã trở thành tự nhiên hoá trong vùng. Theo Nguyễn Văn Kế (1997), bƣởi thuộc họ cam quýt có nguồn gốc Đông Nam Á (Thái Lan và Malaysia) sau đó lan rộng qua Ấn Độ, Trung Quốc, Iran. Tóm lại, bƣởi đƣợc trồng nhiều nơi trên thế giới, có khả năng sinh trƣởng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trải rộng từ 35 vĩ độ nam đến 35 vĩ độ bắc, từ đó phân bố rộng ra khắp thế giới. Và cho đến nay, ngƣời ta vẫn chƣa thể xác định chính xác nơi xuất xứ của cây bƣởi. 2.1.1.2 Phân loại Ngành hạt kín: Angiospermae Lớp hai lá mầm: Dicotyledones Bộ: Rutales Họ: Rutaceae Tên khoa học: Citrus grandis Osbeck 2.1.2 Đặc điểm hình thái của cây bƣởi Theo Nguyễn Văn Kế (1997), so với các cây khác trong họ cam quýt thì bƣởi là cây lớn nhất, có gai, có thể cao đến 15 m, lá to, xanh đậm với cành lá to hơn cam quýt. Thân và tán cây bƣởi: Bƣởi thuộc dạng thân gỗ, là loại cây cao to nhất trong họ citrus, cây cao 6 – 7 m, trong một năm có thể cho ra 3 – 4 đợt cành. Hình thái tán rất đa dạng: tán rộng, tán thƣa, tán hình cầu, hình tròn hay hình tháp. Phần lớn các giống bƣởi có tán xòe nhƣ bƣởi Chùm, bƣởi Chua, bƣởi Đƣờng…nhƣng cũng có tán đứng nhƣ bƣởi Thanh Trà, bƣởi Ổi. Khi còn nhỏ cành có gai và rụng khi lớn. 5 Lá bƣởi: Lá có cánh tiếp giáp hay chồng lên phiến lá, số lá trên cành có liên quan đến trọng lƣợng quả, ảnh hƣởng đến năng suất, kích thƣớc lá thay đổi tùy theo giống. Hoa bƣởi: Hoa lƣỡng tính mọc từ nách lá, hoa màu trắng, thơm có 5 cánh và 3 – 5 lá đài, 20 – 40 nhị đực hợp thành từng nhóm dính liền ở đáy, bao phấn có 4 ngăn, màu vàng mọc bằng hay nhô cao hơn đầu nƣớm nhụy cái. Đầu nƣớm nhụy cái to, bầu noãn có 8 – 15 ngăn dính liền nhau tại một trục ở giữa, thƣờng thì hoa tự thụ phấn, tuy nhiên hoa bƣởi cũng có khả năng thụ phấn chéo. Quả bƣởi: Thƣờng nặng từ 0.8 – 3.8 kg nhƣng thƣờng biến động từ 0.9 – 1.5 kg với nhiều dạng: da sần, da láng, quả tròn, quả dẹp, dạng quả lê, núm cao. Thịt quả từ trắng đến hồng, vàng, xanh vàng, quả bƣởi gồm có 3 phần:  Ngoại quả bì: Là phần vỏ ngoài của trái gồm có biểu bì, lớp cutin dày và các khí khổng. Bên dƣới lớp biểu bì là lớp nhu mô mỏng giàu lục lạp, nên khi trái còn xanh vẫn có thể quang hợp đƣợc. Giai đoạn chín diệp lục bị phân huỷ, nhóm sắc tố caroten trở nên chiếm ƣu thế, màu sắc trái thay đổi từ xanh sang vàng.  Trung quả bì: Giáp phần phía trong ngoại quả bì, lớp này gồm nhiều tầng tế bào hợp thành, có màu trắng, vàng nhạt hay hồng nhạt. Trái càng lớn thì phần mô này càng xốp.  Nội quả bì: Gồm có tâm bì hay múi đƣợc bao quanh bởi lớp vách mỏng trong. Bên trong vách là tép phát triển và chứa đầy dịch nƣớc, dịch nƣớc chứa đƣờng và acid (chủ yếu là acid citric). Phạm Hoàng Hộ (1992), đã phân biệt bƣởi ra 2 loài khác nhau: bƣởi và bƣởi chùm. Bƣởi: Citrus grandis (L.) Osb. var. grandis (Shaddock, Pumelo, Pamplemousse): Đại mộc cao vào khoảng 10 m; gai ngay dài đến 10 cm, ở thân rộng đến 1 cm. Lá có phiến to, dày, gân phụ 5 – 6 cặp, cũng có cánh rộng và có đốt gắn vào phiến. Chùm hoa ngắn, trục có lông, cánh hoa trắng, dài 2 – 3.5 cm; tiểu nhị nhiều, dính nhau. Bƣởi chùm, bƣởi đắng: Citrus grandis var. racemose (Roem) B. C. Stone - Citrus paradisi Mcf. (Grape fruit): Đại mộc dạng cũng nhƣ bƣởi, trái nhỏ hơn, vàng, to 6 Hình 2.1: Quả bƣởi Đƣờng Lá Cam Hình 2.2: Quả bƣởi Đƣờng Lá Cam xẻ dọc 10 – 14 cm, vỏ quả mỏng hơn 5 – 7 mm, múi không tróc dễ dàng, song chua và đắng, 2n = 28. Bƣởi này đƣợc trồng ở Đà Lạt, ngƣời xứ lạnh ƣa ăn bƣởi đắng này với đƣờng. 2.1.3 Các giống bƣởi dùng trong thí nghiệm 3.1.3.1 Các giống bƣởi dùng làm chồi ghép (a) Bƣởi Năm Roi: Lá lớn, phiến lá dạng trứng ngƣợc. Cánh lá to dạng tam giác, trái to (trọng lƣợng trung bình 1 kg/trái), dạng quả lê. Trái có 11 – 16 múi, vỏ trái màu xanh đến vàng nhạt, khá ráo nƣớc, còn tép bó chặt nhau, ngon ngọt, có vị chua ít, không đắng, tróc vỏ, múi tốt. Đặc biệt có dòng bƣởi năm roi đƣợc trồng hiện nay không hạt hoặc ít hạt. Bƣởi Năm Roi đƣợc trồng nhiều ở Bình Minh (Vĩnh Long) và Phú Hữu (Cần Thơ). Bƣởi Năm Roi có nhiều giống: bƣởi năm roi 01 (BNR01), BNR02, BNR25, BNR04. Riêng cá thể giống bƣởi năm roi 25 của ông Tô Văn Nho ở Mỹ Hoà - Bình Minh – Vĩnh Long đã đƣợc bộ Nông Nghiệp công nhận cho phép đƣa vào sản suất ở các tỉnh phía Nam, theo quyết định số 2767 NN-KHCN/QĐ vào ngày 29/10//1997 [16]. (b) Bƣởi Đƣờng Lá Cam: Bƣởi này có nguồn gốc ở Biên Hòa (Đồng Nai), hiện nay là một trong những giống bƣởi chủ lực trong các nhà vƣờn bƣởi miền Đông Nam Bộ, đƣợc trồng khá tập trung ở huyện Vĩnh Cữu và huyện Tân Uyên. Tán cây tròn đều, phân bố thấp, cành đều, lá xanh đậm, phiến hình mác, lá hình tim, bìa lá có khía tròn. Quả hình quả lê thấp, màu xanh vàng khi chín, vỏ láng, dễ bóc, tép quả rất dễ tróc, màu vàng nhạt hoặc đồng nhất. Nƣớc quả nhiều hƣơng vị thơm, rất ngon. Khối lƣợng quả 1.300 g. Năng suất 400 quả/cây. Đây là giống đã đƣợc hai giải thƣởng: giải I năm 1995 kỳ hội chợ Nông Nghiệp Quốc Tế tổ chức tại Cần Thơ và giải B trong kỳ hội thi “Cây có múi giống tốt” năm 1996 do VNCCAQMN tổ chức. Cá thể 7 Hình 2.3: Quả bƣởi Da Xanh Hình 2.4: Quả bƣởi Da Xanh xẻ dọc thuộc giống đƣờng lá cam mã số BC12 của ông Trần Văn Hoà ở Tân Bình - Vĩnh Cữu - Đồng Nai, đã đƣợc Bộ NNKH công nhận theo QĐ ngày 29/10/1997. Nhƣợc điểm của giống này là số hạt khá cao (trung bình 60 – 90 hạt/ trái). Giống bƣởi này dùng để lấy chồi ghép. (c) Bƣởi Da Xanh: Bƣởi có nguồn gốc ở tỉnh Bến Tre, đƣợc biết đến trong những năm gần đây do phẩm chất rất ngon nên đƣợc sự chú ý của nhà vƣờn và ngƣời tiêu dùng. Do mới phát triển nên diện tích còn khá nhỏ, chỉ tập trung ở xã Mỹ Thạnh An thuộc thị xã Bến Tre - tỉnh Bến Tre. Theo Phạm Ngọc Liễu (1998), trái của bƣởi Da Xanh dạng hình cầu, màu sắc vỏ khi chín vẫn xanh, còn tép tróc khỏi vách múi tốt, có màu hồng đến đỏ không đều, tép bó khá chắc, nƣớc quả khô, có vị ngon, ngọt và rất thơm. Năng suất vƣợt trội với cá thể khác. Nhƣợc điểm là số hạt trên trái cao hơn các giống khác. Giống bƣởi này dùng để lấy chồi ghép. 3.1.3.2 Các giống bƣởi dùng làm gốc ghép (a) Bƣởi Xim Vang: Phân cành thấp, kích thƣớc lá dài trung bình 3,0 cm chiều rộng 2.5 cm. Đây là giống có kích thƣớc quả khá cao so với các giống khác cao 24,5 cm. Hàm lƣợng vitamin C đứng hàng thứ 3, sau bƣởi Đƣờng Hồng và bƣởi Đƣờng Da Láng 37,8%, trọng lƣợng quả 1,999g. Hiện nay, bƣởi Xim Vang đƣợc trồng nhiều ở Đồng Nai (Nguyễn Văn Kế, 1995). (b) Bƣởi Bồng: Là giống bƣởi ở Huế, theo những nghiên cứu khác nhau thì đây là giống bƣởi lai, có hệ gen gần với chanh và quýt hơn là bƣởi. Do có khả năng chống chịu với điều kiện khắc nghiệt của thời tiết cũng nhƣ khả năng chịu ngập đứng hàng thứ ba sau bƣởi Ổi và bƣởi Hồng Đƣờng, khả năng chịu mặn đứng hàng thứ nhất trong 41 giống bƣởi ở Việt Nam nên giống bƣởi này dùng làm gốc ghép. 8 Hình 2.5: Vƣờn cây bị tàn phá do virus tristeza (cành chết khô và không có trái) Hình 2.6: Cây bƣởi bị nhiễm bệnh virus tristeza (cây lùn và lá bị vàng) 2.2 Các loại bệnh virus và môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt 2.2.1 Các loại bệnh do virus Loài virus citrus là loài rất nhỏ, chỉ có thể nhân lên trong tế bào sống, thƣờng là tế bào của citrus nhƣng nó cũng có thể nhân trong cơ thể của aphid hoặc một vài loài làm vector khác. Bệnh virus thì không chữa đƣợc, khi một cây nhiễm thì nó có thể tái nhiễm đến khi chết. Khi cây nhiễm, nó có thể là tác nhân nhiễm cho các cây khác. Bệnh virus thƣờng không lây qua hạt. Một vài loài virus chỉ nhiễm trên một vài loài citrus. Virus có thể nhiễm vài tháng hoặc vài năm trƣớc khi có một vài triệu chứng. Trong một vài trƣờng hợp, triệu chứng có thể nhanh chóng đƣợc phát hiện [27]. 2.2.1.1 Citrus Tristeza virus (CTV) Virus gây bệnh này có nguồn gốc từ nhiều năm trƣớc ở Trung Quốc. Tristeza là bệnh tàn phá rất lớn trên citrus ở Bắc và Nam Mỹ, mặc dù có khoảng phân bố rất rộng trên thế giới. Bệnh hiện không còn ở Argentina, Brazil và Uruguay, đây cũng là bệnh nguy hiểm ở Nhật Bản. Bệnh cũng đƣợc xác định là có hiện diện ở nƣớc ta [27]. Bệnh do virus dạng sợi dài (2 x 10 – 11 nm), tập trung và làm hỏng mạch dẫn nhựa libe trong cây, xuống rễ và làm suy dinh dƣỡng nhƣ rụng lá, chết đọt, lùn cây và thƣờng thối rễ. Bệnh có thể lộ ra ở cây con mới trồng hay ở cây lớn bị 9 Hình 2.7: Triệu chứng bệnh “nổ lá” suy dinh dƣỡng. Cây có mang mầm bệnh có thể vẫn thấy khỏe mạnh trong liếp ƣơm nhƣng sớm lộ triệu chứng ngay sau khi trồng. Cây mang bệnh mãn tính sẽ bị lùn, phù gốc do mắt tháp phát triển quá khổ. Hầu hết các giống cam quýt đều có triệu chứng sọc lõm ở gỗ thân và cành (stem pitting). Một dạng đặc trƣng của bệnh là triệu chứng tổ ong khi dùng cam chua làm gốc ghép: khi tách vỏ ở vùng bên dƣới mắt tháp sẽ thấy nhiều lỗ nhỏ xếp cụm trong gỗ [27]. Bệnh đƣợc truyền bởi một loài aphid có tên là Toxoptera citricida Kirkaldy. Ngƣời ta kiểm tra thấy rằng nếu 5 aphid tấn công cây thì 50% cây sẽ bị nhiễm và nếu 15 aphid tấn công cây thì 70% sẽ bị nhiễm. Ngƣời ta cũng nhận thấy rằng các type khác nhau của virus này đều gây bệnh đƣợc [27]. CTV nhiễm trên tất cả các loài (nhân giống và tháp ghép) của cây citrus. Nó đƣợc tìm thấy trên toàn thế giới và có nhiều giống khác nhau, trong các type khác nhau đó có các type tàn phá rất lớn. Bệnh chịu ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng, các dạng khác nhau của cây citrus và các nòi virus khác nhau. Khi cây đƣợc ghép trên gốc kháng thì cây có khả năng phục hồi lại sau đó [27]. 2.2.1.2 Citrus tatter leaf virus ( CTLV) CTLV đƣợc phát hiện đầu tiên 1962, trên cây chanh Mayer thuộc Trung Quốc. Sau đó một vài loài virus cũng đƣợc phát hiện trên giống chanh đó ở Australia và ở phía Nam châu Phi [27]. Bệnh do virus dạng sợi tóc và truyền bệnh bằng côn trùng hoặc các vector khác. Con đƣờng chủ yếu là lây qua nhân giống và tồn tại ở chồi. Loại virus này đƣợc truyền qua nhựa cây, có thể truyền khi cắt cành và công cụ làm vƣờn khi cắt cây bệnh trƣớc [7]. Hầu hết các loài citrus khi nhân từ giống có chứa loài virus này không thấy triệu chứng. Tuy nhiên, cây nhiễm đều bị lùn, chậm tăng trƣởng, lá biến dạng và nổi u (sƣng tấy), cành non thì ngoằn ngèo. Ảnh hƣởng rõ ràng nhất là chồi vàng (khi chồi non ghép trên gốc ghép) [27]. 10 Hình 2.8: Gốc cây bị bệnh bong vỏ gốc thân 2.2.1.3 Citrus exocortis virus (CEV) CEV đƣợc phát hiện đầu tiên năm 1948, ở Australia và bây giờ nó có ở khắp nơi trên thế giới. Bệnh làm chậm tăng trƣởng trên cam. Bệnh rất dễ lây qua ghép, ở các chồi ghép và không thấy triệu chứng khi nhân giống. Thể viroid truyền qua cơ giới công cụ cắt và tỉa cành [27]. Mầm bệnh do một loài viroid của virus, viroid làm chết vỏ, khô, vỡ ra và có thể bóc vỏ đƣợc dễ dàng. Nhựa thì không có dƣới lớp vỏ của cây nhƣ vậy. Bệnh có thể nhiễm ở hầu hết loài citrus khi nhân giống và luôn tiềm ẩn trong cây [27]. 2.2.2 Môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt Đối với cây thuộc họ cam quýt thì nguyên nhân truyền bệnh do công cụ làm cắt tỉa cành trong vƣờn, do các loại côn trùng truyền bệnh mà trong đó rệp là tác nhân chủ yếu. Rệp sống chủ yếu bằng cách hút nhựa và chất kích thích sinh trƣởng ở các bộ phận non của cây do đó thƣờng làm cho cây giảm quang hợp, nếu tấn công trên trái thì làm trái nhỏ sẽ bị rụng, bị đen, kích thƣớc trái nhỏ, dị dạng, giảm chất lƣợng quả từ đó làm giãm giá trị thƣơng mại. Đồng thời, rệp còn là tác nhân truyền bệnh virus gây hại rất lớn cho các cây thuộc họ cam quýt nói riêng và nhiều loại cây trồng khác nói chung. Phân của các loài rệp này thải ra quyến rũ nấm bồ hống đến cộng sinh làm giảm khả năng quang hợp của cây, do phân của chúng chứa một lƣợng đƣờng rất cao. Đồng thời phân của chúng còn có thể hấp dẫn các loài kiến khác nhau đến tha chúng đi nơi khác để tiếp tục gây hại cho cây trồng [3, 7]. Rệp hại cây trồng đƣợc phân ra làm hai nhóm chủ yếu là nhóm rệp muội hay còn gọi là rầy mềm, nhóm thứ hai là nhóm rệp sáp. 2.2.2.1 Rệp muội hại cây trồng Nhóm rệp này chỉ có một họ duy nhất là Aphididae thuộc bộ cánh đều, có thân mềm, dài từ 1 – 2 mm, dạng hình quả lê, trần trụi, cuối bụng có phiến đuôi và hai ống bụng hai bên. Có thể có cánh hoặc không có cánh tuỳ theo điều kiện sinh sống (thời 11 Hình 2.9: Các môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt A: Rệp muội xanh Aphis citricola B: Rệp muội nâu Toxoptera citricidus C: Rệp muội đen Toxoptera aurantii A B C tiết và dinh dƣỡng, nếu không thích hợp thì số có cánh sẽ nhiều hơn và di chuyển đi nơi khác sinh sống) [3]. Trên cam quýt có ba dạng rệp chủ yếu sau và cũng là tác nhân thuyền bệnh virus tristeza:  Rệp muội xanh Aphis citricola  Rệp muội nâu Toxoptera citricidus  Rệp muội đen Toxoptera aurantii 2.2.2.2 Rệp sáp hại cây trồng  Gồm có 5 họ với 91 loài khác nhau phân bố rộng khắp các vƣờn cây ăn trái. Asterolecaniidae có 2 loài Coccidae với 19 loài (rệp sáp) Diaspididae với 53 loài (rệp sáp vảy và rệp sáp dính) Margarodidae với 3 loài (rệp sáp trắng và sáp bông) Pseudococcidae với 14 loài (rệp sáp giả) 12  Thành phần rệp hại cây trồng đã đƣợc thống kê tại Việt Nam Bảng 2.1 : Thành phần rệp hại cây trồng thuộc họ cam quýt chủ yếu ở Việt Nam Tên khoa học Họ Hình ảnh minh họa theo họ Toxoptera aurantii Aphididae Toxoptera citricidus Aphididae Toxoptera citricola Aphididae Icerya purchasi Margarodidae Planocuccus citri Pseudococcidae Planococcus citriculus Pseudococcidae Chloropulvinaria aurantii Coccidae Saissetia coffeae Coccidae Anonidiella aurantii Diaspididae Chrysonphalus aonidium Diaspididae (Theo Nguyễn Mạnh Chinh, 2002). 13 Hình 2.10: Hạt bƣởi nảy mầm 2.3 Các cách nhân giống của cây bƣởi Để nhân giống các cây cam quýt nói chung và cây bƣởi nói riêng ta có thể sử dụng các cách nhân giống khác nhau nhƣ gieo hạt, chiết cành, giâm cành, ghép. 2.3.1 Nhân giống cổ điển 2.3.1.1 Nhân giống bằng hạt Đây là cách nhân giống đƣợc bắt đầu khi loài ngƣời biết trồng cây ăn quả. Đây là quá trình tạo cây con từ hạt, hạt đƣợc hình thành do sự thụ tinh của tế bào hạt phấn và tế bào noãn, cây mới mọc mang đặc tính của cả bố và mẹ hoặc nghiêng hẳn về bố hoặc mẹ. Cách nhân giống này áp dụng chủ yếu để lấy cây con làm gốc ghép. Rất ít vùng dùng cây con làm giống vì phải 8 – 10 năm mới có thể cho quả đƣợc [6 – 12].  Các yêu cầu khi chọn hạt làm gốc ghép để nhân giống:  Chọn những hạt mẩy không sâu bệnh từ quả tốt để làm giống.  Chọn cây thích hợp với điều kiện tự nhiên của địa phƣơng có năng suất cao, phẩm chất tốt.  Chọn cây là những cây ổn định về mặt sinh trƣởng, có từ 6 – 7 năm tuổi trở lên.  Chọn cây sinh trƣởng khỏe, có bộ rễ phát triển mạnh, cành phân tán cân đối, lá tƣơi tốt, không sâu bệnh. 2.3.1.2 Nhân giống bằng cách chiết cành Cây có múi nói chung đều dễ nhân giống bằng phƣơng pháp chiết nhánh bó bầu. Nguyên liệu nhân giống là cành đã có búp sinh trƣởng, chỉ cần bóc một khoảnh vỏ bó đất, khi cành ra rễ mới cắt khỏi cây mẹ. Ƣu điểm của phƣơng pháp là vì chƣa cắt khỏi cây mẹ nên cành đƣợc nuôi một phần bằng nhựa cây mẹ nên cành dễ sống hơn [14, 15]. 14  Bó chổ cắt bằng rêu ẩm  Dùng bọc và dây buột chặt lại Hình 2.11: Cách thực hiện chiết cành Cách thực hiện gồm các bƣớc chủ yếu sau đây:  Chọn cành dài khoảng 15 – 30 cm, cũng có thể làm vào mùa hè lúc đó vỏ cây còn cứng. Sau đó, cắt lột bỏ lớp một lớp vỏ và cạo bỏ lớp vỏ cứng bên ngoài một cách nhẹ nhàng, có thể bổ sung indolebutyric acid lên bề mặt lát cắt (là một loại hormon tạo rễ). 2.3.1.3 Nhân giống bằng cách giâm cành Phƣơng pháp này dựa trên khả năng hình thành rễ phụ (rễ bất định) của các đoạn cành đã cắt rời khỏi thân mẹ (hoặc các đoạn rễ). Ngày nay, phƣơng pháp này đƣợc ứng dụng rộng rãi nhằm nhân giống các cây công nghiệp, cây lâm nghiệp. Ở nƣớc ta, việc nhân giống chanh bằng phƣơng pháp giâm cành rất phổ biến nhằm tạo cây lùn, nhanh thu hoạch quả và chu trình kinh doanh khai thác ngắn nhƣng hiệu quả cao [15]. Nhà giâm cành nói chung phải thoáng mát, kín gió, trao đổi không khí tốt. Cành để thực hiện nhân giống là những cành bánh tẻ, phần lớn là những cành ra trong năm, có khi ra cùng trong vụ xuân hoặc hè. Nguyên tắc chung là chọn những cành lƣng chừng tán, ngoài bìa tán và những cành ở cấp cành cao (những cành không mang hoa, quả và những cành ổn định sinh trƣởng chƣa lâu). Cắt cành giống vào thời gian không có nắng trong ngày: sáng sớm hay chiều tối vì cành lá sẽ mất nƣớc đột ngột, tỉ lệ ra rễ kém. Cành cắt xong cần đƣợc phun nƣớc cho ƣớt lá rồi dựng đứng vào trong xô hoặc thùng có chứa nƣớc sạch, đậy lại bằng vải màu tối đã thấm ƣớt. 15 Cành sau đó đƣợc xử lý lại, đối với cành dễ ra rễ có thể cắm thẳng vào nền giâm, hoặc xử lý hóa chất ra rễ ở nồng độ thấp (NAA, IAA hay IBA). Phải thƣờng xuyên duy trì độ ẩm từ lúc cắm cành cho đến lúc ra rễ. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo rễ ở cây ăn quả là 21 – 26oC. Khi rễ của cành giâm mọc đủ dài, hơi chuyển từ màu trắng sang màu vàng và dẻo thì phải ra ngôi kịp thời trong vƣờn ƣơm hay túi polymer. 2.2.1.4 Nhân giống bằng cách ghép Ghép là phƣơng pháp đem cành hay mầm nhánh của cây mẹ có nhiều ƣu điểm nhƣ phẩm chất tốt, năng suất cao… gắn sang gốc một loại cây khác để tạo thành một thể mới thống nhất [12].  Ƣu điểm  Cây sau khi ghép giữ đƣợc đặc tính của cây mẹ, mau cho trái, tuổi thọ cao.  Nhân đƣợc nhiều cây giống.  Cây có bộ rễ ăn sâu, chống đƣợc gió bão va chạm tốt hơn so với giâm cành, chiết cành.  Sử dụng đƣợc các đặc tính tốt của cây mẹ làm gốc ghép nhƣ chịu hạn, chịu úng, chịu lạnh …..  Cây cao có thể làm thấp xuống nhờ ghép.  Áp dụng đƣợc với những cây không hạt.  Phục tráng cho những cây già, quý hiếm.  Thay đổi đƣợc tính trạng đực khi ghép cây cái lên cây đực.  Nhƣợc điểm  Kỹ thuật ghép tiến hành phức tạp hơn giâm cành, chiết cành.  Cần phải có kiến thức nhất định về cây tiến hành ghép.  Cần phải nghiên cứu khi ghép khác họ khác loài.  Có khoảng 30 loại bệnh lây lan qua đƣờng ghép do mycoplasma, virus, viroid, vi khuẩn. 16 Biểu bì Nhu mô Cƣơng mô Libe Tƣợng tầng Nhu mô tủy Thân cây hai lá mầm Mộc Hình 2.12: Thân cây hai lá mầm (a) Cơ sở kết hợp của gốc ghép và cành ghép Cấu trúc thân cây cắt ngang có ba phần chính: lớp vỏ ngoài cùng có nhiệm vụ dẫn nhựa luyện từ lá xuống rễ, phần gỗ phía trong dẫn nhựa nguyên từ gốc lên cành lá, phần giữa gỗ và vỏ là tƣợng tầng mô phân sinh rất mỏng, có khả năng phân chia nhanh, tạo nên gỗ bên trong và vỏ bên ngoài. Việc kết hợp giữa gốc và cành ghép gồm 4 bƣớc nhƣ sau:  Áp sát phần tƣợng tầng của gốc với cành ghép.  Lớp tế bào tƣợng tầng ngoài của gốc và cành ghép tạo ra những tế bào nhu mô dính lại với nhau gọi là mô sẹo.  Các tế bào nhu mô của mô sẹo phân hoá thành những tế bào tƣợng tầng mới, kết hợp với tƣợng tầng nguyên thủy của gốc và cành ghép.  Các tế bào tƣợng tầng mới tạo ra những mô mạch mới, gỗ bên trong và libe bên ngoài, hình thành sự kết hợp mạch giữa gốc và cành ghép giúp dinh dƣỡng và nƣớc đƣợc vận chuyển qua lại. (b) Điều kiện để ghép cành Để đảm bảo việc ghép cành thành công cần phải lƣu ý một số yếu tố sau [12, 14, 15]:  Các cây ghép với nhau phải cùng một họ để có khả năng kết hợp cao, tốt nhất là cùng loài, cùng thứ.  Gốc ghép, cành ghép cần có mức sinh trƣởng tƣơng đƣơng nhau để có khả năng kết hợp tốt.  Hai bộ phận ghép phải đƣợc áp chặt nhau để tăng khả năng kết dính, chỗ ghép không đƣợc dơ, nóng hay bị ẩm ƣớt. 17 Cành ghép Gốc ghép Cài hai lƣởi gà vào với nhau Dùng kẹp kẹp lại Cắt rời cành ghép khỏi gốc ghép Hình 2.13: Cách ghép áp A : Gốc ghép B : Tạo lƣỡi gà cho gốc ghép C : Cành ghép cũng đƣợc tạo lƣỡi gà D : Áp cành ghép và gốc ghép lại E : Dùng dây quấn chặt cành ghép vào gốc ghép. Hình 2.14: Cách ghép cành  Muốn cho cành ghép tiếp hợp vào gốc ghép, nhất thiết phải có một bộ phận của mô phân sinh ở cành ghép tiếp xúc tƣơng đối chặt với một bộ phận tƣợng tầng của gốc ghép. (c) Các phƣơng pháp ghép  Ghép áp Khi gốc ghép và cành ghép có đƣờng kính tƣơng đƣơng nhau ta đem chúng lại gần nhau và áp lại với nhau. Dùng dao vát một miếng nhỏ để lộ tƣợng tầng ở gốc ghép và cành ghép, buộc chặt cành ghép và gốc ghép lại với nhau theo vị trí vết cắt. Sau 40 – 50 ngày vết cắt sẽ liền sẹo, cắt bỏ ngọn gốc ghép và cắt rời gốc cành ghép. Phƣơng pháp này cho tỷ lệ sống rất cao (90 – 95%) nhƣng rất công phu và hệ số nhân thấp [12, 15].  Ghép cành Ghép cành là một phƣơng pháp khá phổ biến trong nhân giống cây ăn quả, áp dụng trong các trƣờng hợp cây khó lấy mắt hoặc trong những thời vụ mà nhiệt độ và ẩm độ thấp, sự chuyển động của nhựa trong cây kém. Nhiều khi kết hợp giữa ghép đoạn cành và ghép mắt để tận dụng cành ghép [12, 15]. 18 A : Gốc ghép đƣợc cắt chữ T B : Lấy mắt ghép từ cành ghép C : Mắt ghép đã sẵn sàng để ghép D : Mắt ghép đƣợc ghép vào vết cắt E : Buộc chặt mắt ghép vào gốc ghép Hình 2.17: Cách ghép chữ T Mắt Hình 2.15: Chồi nách trên thân cây  Ghép mắt Ngƣời ta bóc lấy một mắt ở nách lá trên một cành bánh tẻ của cây mẹ và một mảnh vỏ trên gốc ghép. Áp mắt ghép vào chỗ đã bóc vỏ trên gốc ghép rồi buột lại. Khi mắt ghép nảy mầm sẽ tạo một cây ghép. Ghép mắt có ƣu điểm là hiệu suất lao động cao, thao tác đơn giản. Ghép mắt gồm các phƣơng pháp ghép chủ yếu sau:  Ghép cửa sổ    Ghép chữ T B C D A: Gốc ghép B: Gốc ghép đƣợc tạo “cửa sổ” C: Mắt ghép đƣợc đặt vào “cửa sổ” D: Dùng dây buộc chặt mắt ghép vào gốc ghép Hình 2.16: Cách ghép cửa sổ A 19 A B C A : Gốc ghép đƣợc lấy một mảnh cả vỏ và thân B : Mắt ghép cũng đƣợc lấy một mảnh tƣơng tự C : Áp mắt ghép vào gốc ghép và buộc dây Hình 2.18: Cách ghép mắt dạng mảnh  Ghép mắt dạng mảnh Ƣu điểm nhất của phƣơng pháp này là thao tác đơn giản, không cần bóc vỏ cành ghép và gốc ghép, nhƣng nếu cây chuyển nhựa tốt thì tỷ lệ sống cao hơn. Dùng dao cắt hai lát trên gốc ghép lấy đi một mảnh cả gỗ và vỏ thêm hai lát ở cành ghép để lấy mắt có cả cuống lá, lắp vừa khít vào gốc ghép, buộc chặt bằng dây. Sau một thời gian nhất định ta có thể mở dây ra và cắt ngọn gốc ghép [12, 15]. 2.3.2 Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô Trong trƣờng hợp cây ăn quả lâu năm, kỹ thuật ghép đang chiếm vị trí hàng đầu trong nhân giống vì kết hợp đƣợc khả năng chống chịu của gốc hoang dã với mắt ghép có ƣu điểm năng suất và phẩm chất tốt. Tuy nhiên trong lúc ghép theo kỹ thuật truyền thống, do thời gian trồng gốc ghép kéo dài và kích thƣớc mắt ghép khá lớn nên bệnh virus có thể truyền lây. Để khắc phục nhƣợc điểm trên, kỹ thuật ghép đỉnh sinh trƣởng gọi tắt là vi ghép đƣợc thử nghiệm và mang lại kết quả tốt. Về nguyên tắc, vi ghép là nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng nhƣng qua dinh dƣỡng của gốc ghép. Đỉnh sinh trƣởng làm mắt ghép có kích thƣớc từ 0,2 – 0,5 mm, đƣợc tách từ búp non đang sinh trƣởng mạnh của cây mẹ trƣởng thành, gốc ghép là cây mới nảy mầm từ hạt của giống hoang dại, toàn bộ cây ghép đƣợc nuôi dƣỡng trong điều kiện ống nghiệm vô trùng. Những cây ghép thu đƣợc 20 bằng phƣơng pháp này hoàn toàn sạch bệnh và mang đặc điểm di truyền của cây mẹ cho mắt ghép [14]. 2.3.2.1 Các yếu tố ảnh hƣởng đến vi ghép  Chất điều hòa sinh trƣởng Sẽ có lợi hơn nếu các chồi ghép đƣợc đặt nuôi cấy trong môi trƣờng MS có chứa chất điều hòa sinh trƣởng. Jonal và ctv (1983) đã chứng minh, thêm Cytokinin vào môi trƣờng nuôi cấy (0,1 mg Zeatin/l nếu chồi nuôi cấy trong 48 giờ; 0,01 mg Zeatin/l nếu nuôi thêm 48 – 240 giờ) có hiệu quả đặc biệt kích thích sự tiếp hợp nhanh chóng của gốc ghép và chồi ghép. Để mỗi lần ghép thành công, có một cách là nuôi chồi ghép trong môi trƣờng nuôi cấy có chất điều hòa sinh trƣởng trong một thời gian ngắn trƣớc khi ghép 5 – 10 phút trong môi trƣờng 10 mg/l 2,4 D hoặc 1 mg/l BAP làm tăng tỷ lệ thành công đối với cây có múi (Edriss và Burger, 1984). Starratino và Caruso (1998), đạt tỷ lệ cây ghép sống khá cao khi nhúng chồi ghép và mặt cắt gốc ghép vào môi trƣờng có 0,5 mg/l BAP trong 20 phút trƣớc khi cả hai ghép lại với nhau.  Sự hóa nâu và khô dần của chồi ghép. Chồi khô dần là nguyên nhân dẫn đến sự thất bại của kỹ thuật. Để ngăn cản quá trình này, Piego Alfaro và Murashige (1987) đã dùng lớp vỏ mỏng môi trƣờng dinh dƣỡng có agar để liên kết nơi ghép. Agar sẽ làm tăng sự phát triển của chồi và chất dinh dƣỡng từ khối agar đƣợc tiết ra nuôi chồi trong suốt tuần thứ nhất đến tuần thứ ba sau khi ghép; nếu không sẽ có kết quả là cây ghép rất yếu. Chồi bị hóa nâu nguyên nhân do các chồi ghép quá nhỏ hay thao tác quá chậm, có thể hạn chế bằng cách ngâm chồi trong dung dịch chống oxy hóa 2g/l Sodium Diethyldithiocarabamate (DIECA) hoặc nhỏ một giọt dung dịch lên trên mặt cắt của gốc ghép ngay trƣớc khi ghép chồi lên. Theo Navarro (1988) thì thao tác nhanh kỹ thuật ghép nhanh sẽ ngăn cản quá trình oxy hóa phenol và có hiệu quả hơn những chất chống oxy hóa. Với 0,5 mg/l NAA đã làm tăng đáng kể tỷ lệ sống của tổ hợp ghép (37,5%) cao hơn rất nhiều so với môi trƣờng không có NAA (10,43%) Hơn nữa khi có NAA thì không cần thƣờng xuyên khử chồi phụ so với khi không có NAA phải khử chồi phụ mỗi tuần hoặc 15 ngày một lần vì NAA ức chế sự hình thành 21 và phát triển của các chồi phụ nhƣng kích thích gốc ghép mọc nhiều rễ phụ và phát triển rất tốt. Khi kết hợp NAA và Kinetin với nồng độ trên, chồi ghép mau liền sẹo và phát triển tốt, sau 3 tuần kích thƣớc chồi đạt 8 mm. Tuy nhiên gốc có hiện tƣợng hình thành mô sẹo và không hình thành rễ cho dù ta cấy chuyền sang môi trƣờng không có chất điều hoà sinh trƣởng sau 2 tuần. Với 3 mg/l Adenin cây ghép có tác dụng ngƣợc lại. Hiện tƣợng mắt ghép bị nâu đen hay bị khô đều thấy ở tất cả độ tuổi gốc ghép  Tuổi của gốc ghép Thí nghiệm với gốc ghép ở độ tuổi khác nhau 15, 21, và 60 ngày cho thấy gốc già, cứng nên khó cắt và dễ bị dập nơi vết cắt nhƣng ngƣợc lại do vỏ dầy cứng nên giữ đƣợc mắt ghép khi ta đặt vào, mắt ghép ít bị rơi khỏi nơi ghép và dễ liền sẹo sau khi ghép. Tuy nhiên chú ý phải nhẹ nhàng khi đặt mắt ghép vào tránh kẹp chặt làm tổn thƣơng cành ghép. Tuổi gốc ghép còn nhỏ thì nơi ghép dễ bị mô sẹo hoá và tốt nhất là gốc ghép ở độ tuổi 15 ngày sau nảy mầm. Các tác giả đã chứng minh rằng: Gốc ghép non, mắt ghép dễ bị mô sẹo hóa, khả năng nảy chồi thấp. Gốc già, mắt ghép khó liền, tỷ lệ mắt ghép nâu đen cao. Thích hợp nhất là từ 14 – 16 ngày tuổi của gốc ghép sau khi hạt nảy mầm. Kết quả cụ thể tính theo % ghép thành công là: 15,2; 16,6; 40,0; 37,1; 36,6; và 14,3% với tuổi gốc ghép tƣơng ứng là 10; 12; 14; 16; 18 và 20 ngày (17).  Độ lớn của mắt ghép Chồi ghép có thể lấy trực tiếp hoặc nuôi cấy một thời gian ngắn trƣớc khi ghép. Tỷ lệ ghép thành công sẽ cao hơn khi nuôi lớn những đỉnh sinh trƣởng độc lập cho đến khi