Nghiên cứu phân lập và tác dụng gây độc của gossypol từ hạt bông (gossypium barbadense l) trên một số dòng tế bào ung thư

Mở đầu Ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu hiện nay ở Việt Nam. Theo thống kê của Hội Ung thư TP. Hồ Chí Minh, hàng năm Việt Nam có khoảng 200.000 bệnh nhân ung thư mắc mới với khoảng 150.000 bênh nhân tử vong vì căn bệnh này, trong đó thường gặp nhất là ung thư phổi, ung thư gan, ung thư dạ dày ở nam giới ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư phổi ở nữ giới. Phần lớn bệnh nhân được phát hiện đã ở giai đoạn muộn, tỷ lệ chữa khỏi bệnh thấp, chi phí điều trị bệnh cao và kéo dài. Các thuốc ung thư thế hệ mới thường có giá thành cao nên ít bệnh nhân có điều kiện tiếp cận trong khi các thuốc hoá trị liệu cổ điển mặc dù có giá thành hạ nhưng nhiều tác dụng phụ. Gossypol là một hợp chất polyphenol được tìm thấy trong hạt của các loài thuộc chi bông Gossypium, họ Malvaceae. Gossypol đã được biết điến với rất nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như tác dụng chống ôxy hoá, tránh thai nam, chống ký sinh trùng, chống HIV và chống ung thư. Gần đây, gossypol đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học với vai trò là một chất “mimetic BH3” (bắt chước BH3) trong tự nhiên, có khả năng ức chế các protein anti-apoptosis thuộc họ Bcl-2. Các protein này thường được biểu hiện quá mức ở một số loại tế bào ung thư, làm cho các tế bào ung thư không chết theo chương trình (apoptosis), trở nên kháng thuốc hoặc kém nhạy cảm với các thuốc hoá trị liệu. Gossypol (cũng như một số thuốc đang được thử nghiệm trên lâm sàng khác như ABT-263, obatoclax (GX15-070) có tác dụng ức chế các protein anti-apoptosis từ đó giúp cho các tế bào ung thư có thể chết theo chương trình, giảm sự kháng thuốc hoặc giúp cho các tế bào ung thư trở lên nhạy cảm hơn với các thuốc hoá trị liệu. Gossypol có 2 đồng phân quang học là (-)-gossypol và (+)-gossypol, trong đó (-)-gossypol được xem là có nhiều hoạt tính sinh học mạnh hơn (+)-gossypol như tác dụng chống ung thư, tránh thai nam, chống HIV. Hiện nay, (-)-gossypol là thuốc đầu tiên được sử dụng theo đường uống tác dụng đến đích Bcl-2 đang được thử nghiệm trên lâm sàng pha II tại Mỹ. Ở nước ta, bông vải là loại cây công nghiệp được trồng phổ biến, chủ yếu để cung cấp xơ bông phục vụ cho ngành công nghiệp dệt may. Hiện nay, diện tích bông vải được trồng tại Việt Nam ước đạt 8.500 ha, dự kiến đến năm 2020 diện tích bông vải tại Việt Nam lên đến 76.000 ha. Mặc dù nguồn nguyên liệu dồi dào và có nhiều tác dụng sinh dược học có giá trị nhưng gossypol từ hạt bông vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu ở nước ta đặc biệt là từ loài Gossypium barbadense L, thường được biết đến là loài có hàm lượng gossypol cao và có chứa nhiều (-)-gossypol, dạng đồng phân có hoạt tính sinh học mạnh hơn. Xuất phát từ thực tế nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC CỦA GOSSYPOL TỪ HẠT BÔNG (GOSSYPIUM BARBADENSE L.) TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ” Đề tài được thực hiện với những mục tiêu như sau: - Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và tinh chế gossypol từ hạt bông Gossypium barbadense L. - Nghiên cứu phương pháp tách đồng phân (-)-gossypol và (+)-gossypol từ hỗn hợp gossypol racemic. - Nghiên cứu độc tính tế bào của các sản phẩm (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol đã phân lập được trên 3 dòng tế bào ung thư người. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Chi Gossypium 1.1.1. Vài nét về cây bông hải đảo (Gossypium barbadense L.) và chi Gossypium Bông hải đảo (Gossypium barbadense L.) thuộc chi bông Gossypium, là loại cây ưa sáng, thích hợp với điều kiện khô hạn. Cây bụi cao 2-3 m. Thân cành có lông, màu tím, điểm chấm đen. Lá mọc so le hình tim rộng, 3-5 thuỳ hình trứng hoặc bầu dục, thuỳ giữa dài, thuỳ bên to. Hoa màu vàng nhạt, cuống hoa có màu đen, tiểu đài có 3 lá bắc hoặc nhiều hơn, hình trứng rộng, đài hình chén, có tuyến, tràng dài hơn tiểu đài. Quả nang hình bầu dục, hạt hình trứng nhọn, màu vàng nhạt, sợi trắng rất dễ rụng. Mùa hoa quả từ tháng 6 đến tháng 10 [4].
Hình 1.1. Bông hải đảo (Gossypium barbadense L.) Chi Bông, Gossypium thuộc họ Malvaceae, bao gồm 39-40 loài khác nhau, trong đó các loài có giá trị thương phẩm được trồng phổ biến trên thế giới bao gồm: G. hirsutum, G. barbadense, G. arboreum và G. herbaceum. Ở Việt Nam, có 5 loài thuộc chi bông là G. hirsutum, G. barbadense, G. arboreum và G. herbaceum và G. acuminatum [1]. Cây bông là loại cây duy nhất trong tự nhiên được sử dụng vừa làm thực phẩm, vừa để cung cấp sợi. Cây bông được trồng ở vùng nhiệt đới hay á nhiệt đới ở khắp nơi trên thế giới. Trong liên vụ 2003-2004, sản lượng sợi bông trên toàn thế giới ước đạt 88 triệu kiện, trong đó đứng đầu là Trung Quốc, tiếp theo là Mỹ, Ấn Độ và Pakistan chiếm xấp xỉ 3/4 sản lượng bông của toàn thể giới [71]. Hạt bông là một trong các loại hạt có hàm lượng dinh dưỡng cao, chứa từ 16-24% protein và từ 13-24% dầu trong tổng khối lượng nhân hạt. Cùng với sợi bông thì dầu và các protein từ hạt bông là hai sản phẩm chủ yếu từ cây bông. Dầu ép từ hạt bông sau khi loại bỏ gossypol được dùng làm dầu ăn, dùng trong công nghiệp đồ hộp hoặc làm xà phòng. Dầu hạt bông gồm các acid béo không no (acid oleic 40-50%, linoleic 25-30%), các acid béo no (acid palmatic, stearic 20-25%). Hiện nay, trong nhóm các sản phẩm dầu từ hạt trên thế giới, dầu hạt bông đứng vị trí thứ 3 (50 triệu tấn) sau dầu đậu nành (242 triệu tấn) và dầu hạt cải (52 triệu tấn) [72]. Khô dầu hạt bông có hàm lượng protein cao (40-42%) được sử dụng làm thức ăn gia súc hay làm phân bón. Trong hạt bông còn có các flavonoid là các glucoside của quercetol và kaempferol và chất màu gossypol [4]. Ở Việt Nam, cây bông là cây công nghiệp quan trọng đã được nhà nước đưa vào chương trình phát triển chiến lược để hướng tới phục vụ cho ngành công nghiệp dệt may. Hiện nay, diện tích trồng bông tại Việt Nam tập trung chủ yếu ở Tây Nguyên (42%), vùng duyên hải miền Trung (33%), miền Bắc (20%) và Đông Nam bộ (5%). Diện tích trồng cây bông vải của nước ta liên vụ 2009-2010 ước đạt 8.500 ha, sản lượng hạt bông thu được ước đạt 10.000 tấn và sản lượng xơ bông ước đạt 3.500-3.700 tấn. Tuy nhiên, với sản lượng xơ bông nêu trên chỉ đáp ứng được khoảng 2% nhu cầu của ngành công nghiệp diệt may. Hiện nay, diện tích trồng cây bông vải nước ta vẫn đang được tiếp tục mở rộng, ước tính đến năm 2020 diện tích trồng bông tại Việt Nam sẽ tăng lên 76.000 ha [72]. 1.1.2. Sự tồn tại của gossypol trong chi Gossypium Gossypol là một hợp chất polyphenol đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh dược học có giá trị như tác dụng tránh thai, chống ung thư, chống virus ,... Trong hạt bông, gossypol tồn tại chủ yếu trong các tuyến chất mầu bên trong nhân. Hình 1.2 là lát cắt ngang của hạt bông cho thấy các tuyến chất mầu này phân bố dày đặc bên trong nhân hạt, kích thước của các tuyến này trong khoảng 50-100 µm. Gossypol chiếm 90% lượng sắc tố trong các tuyến, chiến khoảng 39-50% tổng khối lượng của tuyến và thông thường chiếm khoảng 0,4-1,7% khối lượng của nhân hạt [23].
Hình 1.2. Lát cắt ngang của hạt bông với các tuyến chất mầu Ngoài hạt bông, gossypol còn được tìm thấy bên trong một số bộ phận khác của cây bông như vỏ rễ của cây, lá, vỏ hạt và hoa. Mặt khác, hàm lượng gossypol cũng dao động lớn, phụ thuộc vào từng loài, giống bông, điều kiện khí hậu, đất đai của từng vùng, lượng nước và phân bón sử dụng. G. barbadense được biết đến là loài có hàm lượng gossypol cao, hàm lượng gossypol tổng số trong hạt của loài này trong khoảng 0,3-3,4% [42]. Do có hoạt tính sinh dược học khác biệt nên tỷ lệ hai đồng phân quang học (+)- và (-)-gossypol trong hạt của các loài bông khác nhau đã được nghiên cứu nhiều. Tỷ lệ (+)-gossypol : (-)-gossypol đã được báo cáo là rất khác nhau trong các giống và loài bông thương phẩm, dao động từ 95 : 5 đến 31 : 69, nhưng thông thường tỷ lệ này là 3 : 2 trong G. hirsutum trong khi ở G. barbadense là 2 : 3 . Tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol trong G. arboreum (77 : 23), G. barbadense (44 : 56) và G. herbaceum (68 : 32) [25]. Cass và cộng sự đã báo cáo tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol trong G. mustelinum (57 : 43 và 65 : 35), G. herbaceum (63 : 37) và giống lai giữa G. herbaceum và G. hirsutum (48 : 52) [11]. Tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol trong một giống bông nhất định gần như không thay đổi dưới tác động của môi trường. Nghiên cứu trên một số lượng lớn các giống G. hirsutum và G. barbadense thương mại cho thấy rằng với một giống cây trồng nhất định, môi trường có tác động đến lượng gossypol tổng số trong hạt nhưng không ảnh hưởng đến tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol [52]. Hơn nữa, tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol vẫn không đổi trong một cây nhất định bất chấp hạt đó được lấy từ quả thu hái từ đầu hay cuối vụ hoặc hạt từ quả đó ở gốc hay đỉnh của cây. 1.2. Đặc tính của gossypol 1.2.1. Đặc tính lý hoá học của gossypol Gossypol (1,1’6,6’,7,7’-hexahydroxy-5,5’-di-isopropyl-3,3’-dimethyl-(2,2’-binaphthalene)-8,8’-dicarboxaldehyde) là một hợp chất polyphenol mầu vàng, được tìm thấy chủ yếu trong các loài thuộc chi bông Gossypium họ Malvaceae. Ngoài ra, gossypol còn được tìm thấy trong vỏ và hoa của cây nhiệt đới Thespesia populinea, một loại cây phổ biến ở Châu Phi, Châu Á và các đảo ở Thái Bình Dương. Gossypol có cấu tạo gồm 2 khung naphtalene đối xứng, mỗi khung chứa 3 nhóm -OH và 1 nhóm -CHO (Hình 1.3).
Hình 1.3. Cấu tạo của gossypol Do có chứa các nhóm phân cực (6 nhóm hydroxyl và 2 nhóm aldehyde) nên gossypol tan trong nhiều dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, isopropanol, dioxane, diethyl ether, acetone, ethyl acetate, chloroform, carbon tetrachloride, phenol, pyridine, naphthalene nóng chảy, và dầu thực vật nóng. Nó ít tan trong glycerine, cyclohexane, benzene, gasoline và ete dầu. Tuy nhiên do sự có mặt của 2 nhóm dialkylnaphthalene làm cho nó không tan trong nước. Điểm chảy của tinh thể gossypol tinh sạch phụ thuộc vào dung môi dùng để kết tinh nó. Gossypol kết tinh trong diethyl ether có điểm chảy là 184ºC, trong chloroform có điểm chảy là 199ºC, trong ligroin có điểm chảy là 214ºC [27]. Gossypol tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học là R hay (-)-gossypol và S hay (+)-gossypol do sự giới hạn khả năng quay của cầu liên kết 2, 2’-binaphthyl (Hình 1.4). Cả hai dạng đồng phân này đều có nhiều trong hạt bông tuy nhiên tỷ lệ của chúng là khác nhau tùy theo từng giống và loài. Ví dụ trong các giống bông Gossypium barbadense, (-)-gossypol thường chiến ưu thế, trong khi đó đồng phân (+)-gossypol lại chiếm ưu thế hơn trong Gossypium hirsutum.
Hình 1.4. Các dạng đồng phân quang học của gossypol Hoạt tính sinh dược học của (-)-gossypol và (+)-gossypol khác nhau nên độ bền của các đồng phân quang học này rất được quan tâm nghiên cứu. Jaroszewski đã tiến hành thí nghiệm racemic hoá (+)-gossypol bằng nhiệt độ, sử dụng hệ dung môi nước : dioxane (1 : 3). Kết quả cho thấy không có quá trình racemic hoá xảy ra sau khi gia nhiệt kéo dài (15 giờ) ở 90ºC [25]. Do (-)-gossypol không thể trực tiếp phân lập từ nguồn nguyên liệu thực vật nên các phương pháp phân lập (-)-gossypol tinh khiết quang học được phát triển dựa trên phương pháp kết tinh [49] hay sắc ký các hỗn hợp racemic của gossypol sau khi đã tạo dẫn xuất diastereoisomer của gossypol, đặc biệt là dẫn xuất bazơ Schiff [26]. Gossypol tồn tại ở 3 dạng tautomeric khác nhau là: aldehyde, ketone và hemiacetal trong các dung môi khác nhau (Hình 1.5). Trong các hệ dung môi thông dụng, gossypol tồn tại chủ yếu ở dạng ketone, nhưng trong các loại dung môi trơ như chloroform, acetone, dioxane hay trong điều kiện acid, gossypol tồn tại chủ yếu ở dạng aldehyde. Trong các dung môi phân cực như dimethyl sulfoxide (DMSO) trong môi trường kiềm, gossypol tồn tại ở trạng thái cân bằng giữa các dạng hemiacetal, dạng aldehyde và dạng ketone. Vì vậy, gossypol thường được hòa tan trong DMSO khi nghiên cứu hoạt tính sinh học, khi đó các dạng tautomeric của gossypol có thể cùng đóng góp vào hoạt tính sinh học của nó.
Hình 1.5. Các dạng đồng phân tautomer của gossypol Marchlewski, người đầu tiên phân lập gossypol acetic acid (G-AA) cho thấy gossypol dễ bị ôxy hoá trong dung dịch kiềm, có mầu đỏ sáng với dung dịch H2SO4 đậm đặc, mầu xanh đậm trong FeCl3. Tính chất hoá học của gossypol chủ yếu là do các nhóm carbonyl, hydroxyl cũng như là cấu trúc cồng kềnh của khung binaphthlene quyết định. Gossypol có thể phản ứng với các hợp chất khác để tạo thành gossypol liên kết (bound gossypol). Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, phần lớn gossypol tồn tại ở dạng basơ Schiff bởi phản ứng giữa nhóm aldehyde của gossypol với nhóm amino của các protein trong quá trình chế biến hạt bông. Bên cạnh đó, gossypol có thể tạo phức càng cua với sắt trong các sản phẩm từ hạt bông để tạo thành phức kim loại không tan, nó cũng có thể bị ôxy hóa hoặc tạo thành dạng gossypol polymer. Các nhóm –OH phenol của gossypol có thể phản ứng với các acid carboxylic và các phenol khác trong hạt bông để tạo thành các este hoặc ether tương ứng [27]. 1.2.2. Đặc tính sinh dược học của gossypol 1.2.2.1. Tác dụng tránh thai cho nam Gossypol đã được nghiên cứu sâu với vai trò là một thuốc tránh thai trên các mô hình in vivo bao gồm chuột cống, chuột nhắt, khỉ, chuột đồng, thỏ, bò và cả trên người. Khi cho uống G-AA với liều 5-10 mg/kg thể trọng trong vòng 12 tuần thì gây vô sinh trên chuột đực. Trên thỏ đực, với liều từ 1,25-10 mg/kg thể trọng/ngày trong vòng 5-14 tuần làm giảm khả năng di động của tinh trùng nhưng không làm giảm số lượng tinh trùng. Khi cho khỉ đực trưởng thành uống G-AA với liều 5 hay 10 mg/kg thể trọng trong vòng 6 tháng cho thấy nồng độ và khả năng di động của tinh trùng giảm, mặc dù không có sự khác biệt về nồng độ testosterone trong máu [49]. Nghiên cứu cho thấy (-)-gossypol có hoạt tính tránh thai manh hơn (+)-gossypol. Sử dụng (+)-gossypol với liều 30 mg/kg theo đường uống trong vòng 14 ngày không những không có hoạt tính tránh thai mà còn gây độc trên chuột cống đực. Trong khi đó, (-)-gossypol với liều 30 mg/kg thể trọng theo đường uống trong vòng 7 ngày thể hiện rõ hoạt tính tránh thai trên chuột cống đực [61]. Thử nghiệm lâm sàng trên 10.000 người đàn ông tình nguyện Trung Quốc vào năm 1978, liều 20 mg/ngày, trong 75 ngày, sau đó với liều duy trì 50 mg/tuần cho thấy chỉ có một số ít trường hợp (0,75%) bị tăng kali huyết, và 10% số đàn ông dùng gossypol trên 1 năm không phục hồi được quá trình tạo tinh trùng. Một thử nghiệm quốc tế khác trên 151 đàn ông Brazil, Nigeria, Kenya và Trung Quốc cho thấy, khi dùng 15 mg gossypol/ngày trong 12 đến 16 tuần, sau đó dùng liều 7,5-10 mg/ngày trong vòng 40 tuần không gây triệu chứng tăng kali huyết và quá trình tạo tinh trùng được phục hồi sau khi dừng sử dụng gossypol [14]. 1.2.2.2. Hoạt tính chống virus, vi sinh vật và động vật nguyên sinh Lin và cộng sự (1989) đã báo cáo gossypol ức chế quá trình tái bản của virus HIV loại 1 (HIV-1) và ông nhận thấy rằng (-)-gossypol (IC50 = 5,2 µM) ức chế mạnh hơn (+)-gossypol (IC50 = 50,7 µM) [33]. Bên cạnh đó, gossypol cũng cho thấy khả năng chống lại các loại virus khác bao gồm virus herpes simplex loại 2 (HSV-2), virus cúm, và á cúm [57]. Đặc tính chống vi sinh vật của gossypol cũng đã được nghiên cứu. Gossypol có hoạt tính kháng nấm với giá trị LD50 khoảng từ 20-100 ppm và có tác dụng ức chế mạnh các vi sinh vật bao gồm bào tử trong không khí, lactobacilli và một số nấm. Vadehra và cộng sự (1985) đã nghiên cứu tác động của gossypol lên sự sinh trưởng của một số loại vi khuẩn, sự hình thành và nảy mầm của bào tử Bacillus cereus. Các tác giả đã nhận thấy rằng gossypol có tác dụng kháng các vi khuẩn gram dương (ví dụ: Streptococus spp, Bacillus spp, Staphylococus aureus) mạnh hơn so với các vi khuẩn gram âm như Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp, Shigela spp và Escherichia coli. Nhóm nghiên cứu cũng nhận thấy các loại nấm như Saccharomyces cereviseae, S. uvarum, S. diasticu cũng nhạy cảm với gossypol, sự sinh trưởng của chúng bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ 50 ppm gossypol [55]. Bệnh sốt rét ở người thường được gây ra bởi sự lây nhiễm của các ký sinh trùng như Plasmodium falciparum, P. malariae, P. ovale và P. vivax. Hàng năm có khoảng 350-500 triệu trường hợp lây nhiễm với hơn 1 triệu người chết vì bệnh sốt rét. Gossypol cho thấy khả năng kháng ký sinh trùng sốt rét P. falciparum với giá trị IC50 trong khoảng 7 đến 28 µM. Một số dẫn xuất của nó cũng cho thấy khả năng kháng ký sinh trùng sốt rét (IC50 trong khoảng 12 đến 83 µM), trong đó tác dụng mạnh nhất là dẫn xuất 1,1’ nitrile gossylic của nó với IC50 là 13 µM trên P. falciparum [44]. Hoạt tính chống sốt rét của gossypol và dẫn xuất thông qua sự ức chế LDH, một enzyme quan trọng nhất trong chu trình sống kỵ khí của P. falciparum. Nghiên cứu trên Entamobea histolytica cũng cho thấy gossypol có khả năng ức chế alcohol dehydrogenase và các malic enzyme, (-)-gossypol có hoạt tính mạnh hơn gossypol racemic và (+)-gossypol. (-)-Gossypol có hoạt tính ức chế malic enzyme mạnh hơn 3,6 và 13 lần so với gossypol racemic và (+)-gossypol. Tác dụng ức chế alcohol dehydrogenase của (-)-gossypol mạnh gấp 1,9 và 2,9 lần so với gossypol racemic và (+)-gossypol [45]. Gossypol cũng đã được báo cáo là có khả năng ức chế Trypanosome, một ký sinh trùng gây bệnh mãn tính được gọi là ốm ngủ (sleeping sickness) với IC50 khoảng 7,8 ppm sau 24 h xử lý với gossypol. Trên T. crizi gossypol ức chế các oxidoreductase như alpha-hydroxyacid và malate dehydrogenase, các enzyme liên kết với NAD và glutamate dehydrogenase, malic enzyme, glucose-6-phosphate dehydrogenase, các enzyme phụ thuộc vào NADP [16]. Theo đó, cơ chế chống ký sinh trùng của gossypol có thể là sự ức chế chọn lọc các enzyme thiết yếu của ký sinh trùng. 1.2.2.3. Hoạt tính chống ôxy hoá Giống như nhiều hợp chất phenolic khác như coumaric acid, gallic acid, quercetin, myricetin, catechin, gallocatechin, gossypol cũng là một chất chống ôxy hoá tự nhiên hiệu quả. Ví dụ, gossypol có khả năng bảo vệ caroten chống lại các peroxide béo in vitro. Các sản phẩm từ hạt bông chứa gossypol có khả năng ức chế quá trình phân huỷ và ôi của carotene in vitro. Gossypol cũng có thể đóng vai trò là chất chống ôxy hoá bảo vệ caroten in vivo. Gossypol có khả năng ức chế quá trình peroxy hoá các vi thể gan chuột khi ủ với ferric/ascorbate (IC50 < 0,1 µM) [28]. Gossypol còn có tác dụng làm bền dầu biodiesel hạt bông. Với nồng độ 0,1% gossypol, chỉ số bền với quá trình ôxy hoá (oxidation stability indices) của dầu biodiesel hạt bông tăng từ 4,15 h lên đến 17,2 h ở 110ºC [18]. Hoạt tính chống ôxy hoá của các dẫn xuất bazơ Schiff của gossypol như gossypol-urê, gossypol-benzene-thiol và gossypol glycineindicate cũng có hoạt tính chống ôxy hoá tương đương với gossypol. Ngược lại, khi thay đổi các nhóm –OH phenol của gossypol lại làm giảm hoạt tính chống ôxy hoá, khả năng thu dọn gốc tự do, lực khử và khả năng ngăn cản sự phá huỷ ADN của gossypol. [64, 65]. Điều này đã chứng tỏ rằng các nhóm hydroxyl đóng vai trò quyết định hoạt tính chống ôxy hoá của gossypol. Ví dụ, 6-methoxy gossypol có hoạt tính thu dọn gốc tự do tương tự như 6, 6’-dimethoxy gossypol, trong khi đó gossypol có hoạt tính thu dọn gốc tự do mạnh hơn các dẫn xuất methyl hoá của nó. Tác dụng của gossypol và các dẫn xuất methyl hoá của nó chống lại sự phá huỷ ADN gây bởi tia cực tím và hydrogen peroxyde cũng phù hợp với tác dụng chống ôxy hoá của chúng. Điều này đã chỉ ra rằng tác dụng bảo vệ ADN của gossypol một phần nào đó là do quá trình dập tắt các gốc tự do, từ đó làm giảm bớt stress ôxy hoá. Trong một nghiên cứu trước đây cũng chứng minh gossypol có tác dụng phụ thuộc theo liều, bảo vệ ADN plasmid siêu xoắn khỏi bị phá huỷ dưới tác động của Fe3+/ascorbate [30]. 1.2.2.4. Tác dụng chống ung thư Tác dụng chống ung thư của gossypol lần đầu tiên được Tuszinsky và Cossu phát hiện vào năm 1984. Họ đã tiến hành nghiên cứu tác động của gossypol lên sự sinh trưởng của một số dòng tế bào ung thư của người như melanoma (WM9, WM56, WM164), ung thư biểu mô ruột kết (SW407, SW1084, SW1116), dòng erythroleukemia (K562), adenocarcioma (HT3) và trên dòng nguyên bào sợi bình thường của phổi phôi thai (WI38). Kết quả cho thấy các dòng tế bào melanoma và ung thư biểu mô ruột kết của người nhạy cảm với gossypol nhất, với giá trị IC50 vào khoảng 5 µM. Trong khi đó các dòng tế bào ung thư khác và dòng nguyên bào sợi bình thường chỉ nhạy cảm với gossypol ở nồng độ trên 20 µM. Mặc dù gossypol có độc tính tế bào cao trên môi trường nuôi cấy nhưng liều gây chết của nó lại khá cao (LD50 = 2400 mg/kg) trên chuột cống, điều này đã chỉ ra rằng gossypol có độc tính thấp in vivo trên các mô bình thường. Với độc tính thấp của gossypol trên in vivo cùng với tác dụng đặc hiệu của nó trên một số dòng tế bào ung thư làm cho gossypol rất có tiềm năng làm thuốc điều trị ung thư [53]. Kể từ đó đã có rất nhiều báo cáo về tác dụng chống ung thư in vitro của gossypol trên các tế bào ung thư khác nhau như ung thư buồng trứng (IC50 từ 1,5-3,8 µM) [66], ung thư tiền liệt tuyến (IC50 = 10 µM) [68], ung thư vú ( MCF-7, IC50 = 3,4-24 µM) [7, 24, 64], ung thư dạ con (IC50 = 2,9-14 µM) [29], ung thư tuyến thượng thận (IC50 = 1,3-2,9 µM) [29], ung thư phần tuỷ tuyến giáp (IC50 = 18,9 µM) [29], ung thư phổi (IC50 = 0,5 µM trên A549 và 30 µM trên H69) [13, 51], ung thư ruột (IC50 =17 µM) [64], ung thư máu (IC50 = 8,3-15 µM) [51, 38], ung thư tụy (IC50 = 3 µM) [7], ung thư da tế bào hình vảy (IC50 = 2,5-10 µM) [40] và melanoma (IC50 = 2,4-5 µM) [24]. Ở Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Đăng Quân và cộng sự cho thấy hỗn hợp gossypol racemic phân lập từ hạt bông Gossypium hirsutum trrồng tại Việt Nam có tác dụng ức chế phân bào trên hai dòng tế bào ung thư người là dòng tế bào ung thư cơ RD (Rhabdomyosarcoma) và dòng tế bào ung thư biểu bì HEp2 (Epidermoid carcinoma). Tuy nhiên các tác giả không đưa ra giá trị IC50 của hỗn hợp gossypol racemic trên 2 dòng tế bào được khảo sát [3]. Một số nghiên cứu đã chứng minh (-)-gossypol có độc tính tế bào mạnh hơn so với (±)-gossypol và (+)-gossypol. Nghiên cứu cho thấy (-)-gossypol có độc tính tế bào mạnh hơn 2-14 lần so với (+)-gossypol trên các dòng tế bào người [7]. Đặc biệt hoạt tính chống ung thư của (-)-gossypol cũng đã được so sánh với các thuốc thường dùng để điều trị cho bênh nhân melanoma, ung thư phổi và ung thư máu. (-)-Gossypol có hoạt tính cao hơn cisplatine, melphalan, dacarbazine trên 2 dòng melanoma, cisplatine và daunorubicin trên dòng ung thư phổi, (-)-gossypol cũng có hoạt tính mạnh hơn hydroxyure và busulphan trên một số dòng ung thư máu [50]. Gossypol cũng có tác dụng chống lại các dòng tế bào ung thư kháng với các thuốc chống ung thư đã được sử dụng trên lâm sàng như adriamycin, vinblastine, cisplatine [24]. Điều đáng lưu ý là (-)-gossypol thể hiện độc tính tế bào một cách chọn lọc được thể hiện bằng liều gây độc của nó trên các dòng tế bào thường cao hơn so với các dòng tế bào ung thư. (-)-Gossypol có hoạt tính chống tăng sinh gấp 5-10 lần trên các dòng tế bào ung thư khi so sánh với các tế bào gan bình thường trên môi trường nuôi cấy [6]. Trong nghiên cứu của Oliver và cộng sự, (-)-gossypol ức chế sự sinh trưởng của 10 dòng tế bào ung thư biểu mô hình vảy ở đầu và cổ với IC50 trong khoảng 2.5-10 µM, trong khi đó giá trị này trên nguyên bào sợi bình thường cao gấp 2-10 lần và trên keratinocyte cao gấp 2-3 lần [41]. Cơ chế gây độc tế bào của gossypol cũng đã được nghiên cứu. Gossypol đã được biết đến từ những năm 1990 với vai trò là một chất ức chế các enzyme trong tế bào chất và ty thể có liên quan đến quá trình tạo năng lượng của tế bào [58], ức chế các enzyme liên quan đến quá trình tái bản và sửa chữa ADN bao gồm ADN-polymerase α, topoisomerase II và làm cản trở quá trình tổng hợp ADN. Với nồng độ 10 µM, gossypol đã được báo cáo là đã có tác dụng ức chế quá trình tổng hợp ADN bằng cách cản trở checkpoint G1/S trên MCF-7 sau 24 h [32]. Gossypol có thể điều hoà chu trình tế bào bằng cách điều biến protein điều khiển chu trình tế bào Rb và cyclin D1 và quá trình phosphoryl hoá Rb. Xử lý tế bào Ramos với gossypol không chỉ gây dừng chu trình tế bào ở pha G0/G1 mà còn làm tăng quá trình apoptosis và ức chế sinh trưởng của tế bào gây ra bởi etoposide (VP-16), doxorubicin hydrocloride (ADM), vincristine (VCR), và paclitaxel (Taxol) [31]. Gossypol cũng đã được chứng minh là gây ra apoptosis trên nhiều dòng tế bào ung thư như các tế bào ung thư ruột kết [67], ung thư máu [17], ung thư tiền liệt tuyến [67], ung thư bàng quang [34]. Trong các nghiên cứu này, tác dụng gây apoptosis của gossypol đã được chứng minh thông qua sự điều hoà biểu hiện các thành viên trong họ protein Bcl-2, một họ protein ở màng ngoài ty thể, có vai trò quan trọng trong quá trình hoạt hoá các caspase. Trên dòng tế bào ung thư bàng quang là UM-UC2 (dòng nhạy cảm với thuốc) và UM-UC9 (dòng kháng thuốc), (-)-gossypol làm giảm biểu hiện của các protein anti-apoptosis trong họ Bcl-2 là Bcl-2, Bcl-xL và Mcl-1, thường được biểu hiện cao trong các dòng tế bào ung thư kháng thuốc và làm tăng biểu hiện của các protein pro-apoptosis trong họ này như Bim, Puma. Do đó (-)-gossypol làm cho các dòng tế bào ung thư bàng quang đã kháng với các thuốc hoá trị liệu như carboplatin, gemcitabine và paclitaxel trở nên nhạy cảm trở lại [34]. (-)-Gosssypol cũng đã được chứng minh là đã đánh bại được sự kháng apoptosis do sự biểu hiện quá mức của Bcl-2 và Bcl-xL trên tế bào ung thư máu Jurkat T. Apoptosis gây bởi (-)-gossypol có liên quan đến sự hoạt hoá Bak và giải phóng cytochrome c từ ty thể, điều này cho thấy rằng cơ chế apoptosis này liên thông qua con đường ty thể. Hơn nữa việc xử lý (-)-gossypol trên ty thể tinh sạch từ các tế bào có biểu hiện quá mức Bcl-2 thì kết quả cũng cho thấy có sự giải phóng cytochrome c, chứng tỏ có sự tác động trực tiếp lên Bcl-2 có mặt trên màng ngoài của ty thể [41]. Nghiên cứu gần đây đã chứng minh (-)-gossypol hoạt động như một chất bắt chước domain BH3 (mimetic BH3), liên kết với các domain BH3 của các thành viên anti-apototic trong họ Bcl-2 như Bcl-2, Bcl-xL, từ đó gây ra apoptosis [59] Một nghiên cứu trên in vivo đã cho thấy (-)-gossypol làm tăng cường hoạt tính chống ung thư khi chiếu xạ tia X, tác dụng này theo cơ chế ức chế cả hai protein anti-aposis Bcl-2/Bcl-xL [63]. Sử dụng kết hợp docetaxel và (-)-gossypol làm tăng cường hoạt tính chống ung thư tiền liệt tuyến PC-3 của docetaxel cả in vitro và in vivo (mô hình xenograft trên chuột nhắt). Tác dụng chống ung thư của (-)-gossypol thông qua sự ức chế protein anti-apoptosis Bcl-xL cùng với sự tăng cường biểu hiện các protein pro-apoptosis là Noxa và Puma [37]. Đặc biệt, đã có nhiều thử nghiệm lâm sàng về tác dụng chống ung thư của gossypol trong những năm gần đây. Một trong những thử nghiệm lâm sàng đầu tiên vào năm 1993 sử dụng gossypol theo đường uống với liều 30-70 mg trên 21 bệnh nhân ung thư thượng thận di căn, 30% trong số bệnh nhân này có phản ứng tốt với liệu pháp, trong đó có 3 bệnh nhân giảm trên 50% kích thước khối u sau 6 tuần điều trị [19]. Một thử nghiệm lâm sàng khác, pha I/II, trên 20 phụ nữ bị mắc ung thư vú di căn với liều 30-50 mg gossypol/ngày theo đường uống cho thấy có 1 bệnh nhân ít đáp ứng với thuốc, 2 bệnh nhân giảm trên 50% các marker ung thư trong huyết thanh. Các tác dụng phụ bao gồm buồn nôn, mệt mỏi, thay đổi vị giác, tiêu chảy. Độc tính trên da đã giới hạn liều sử dụng gossypol, liều dung nạp tối đa là 40 mg/ngày [56]. AT-101 là đồng phân (-)-gossypol đã được công ty dược Ascente Therapeutics thử nghiệm lâm sàng pha I trên bệnh nhân ung thư để xác định liều dung nạp tối đa và phác đồ điều trị của thuốc này khi sử dụng đơn lẻ [46]. Thử nghiệm lâm sàng pha I để đánh giá thuốc khi sử dụng phối hợp với cisplatine và etoposite trên bệnh nhân ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC) cũng đang được tiến hành [69]. Một thử nghiệm lâm sàng khác ở pha I/II cũng đang được tiến hành tại Mỹ trên bênh nhân ung thư tiền liệt tuyến. Hai mươi ba bệnh nhân nam bị mắc ung thư tiền liệt tuyến mới sử dụng hoá trị liệu nhưng có PSA (Prostate-Specific-Antigen) tăng được uống 30 mg (-)-gossypol trong 21 ngày trong chu trình điều trị 28 ngày, sau 20-24 tuần điều trị cho thấy giảm chỉ số PSA trong một số trường hợp. 5 trong số 23 bệnh nhân không thể tiếp tục sử dụng thuốc do tác dụng phụ trên đường ruột. Gần đây nhất, ngày 28 tháng 10 năm 2009, (-)-gossypol được thử nghiệm lâm sàng pha I/II dùng phối hợp với Lenalidomide trong điều trị bệnh bạch cầu lympho bào mãn tính (CLL) trên 45 bệnh nhân [69]. Tóm lại, gossypol là một hợp chất polyphenol trong tự nhiên có rất nhiều hoạt tính sinh dược học giá trị như tác dụng tránh thai cho nam, chống virus, chống vi sinh vật và động vật nguyên sinh, chống oxi hóa và chống ung thư. Trong đó, (-)-gossypol đã cho thấy có nhiều hoạt tính sinh học mạnh hơn hẳn (+)-gossypol như hoạt tính tránh thai, chống HIV và chống ung thư. Với tác dụng gây apoptosis trên nhiều dòng tế bào ung thư, đặc biệt là tác dụng trên cả các dòng tế bào đã kháng với các thuốc hóa trị liệu hay xạ trị, (-)-gossypol cũng đã chứng tỏ tác dụng tốt trên lâm sàng nên hứa hẹn sẽ trở thành một thuốc mới góp phần điều trị bệnh ung thư. 1.3. Bệnh ung thư 1.3.1. Ung thư là gì? Ung thư là quá trình sinh trưởng bất bình thường của các tế bào gây ra bởi những biến đổi phức tạp trong biểu hiện gene dẫn đến làm mất cân bằng giữa quá trình tăng sinh và quá trình chết của tế bào và cuối cùng phát triển thành một quần thể tế bào có thể xâm chiếm các mô và di căn đến các vị trí khác, gây bệnh và nếu không điều trị thì sẽ làm chết vật chủ. Trên quan điểm của lâm sàng, ung thư là một nhóm lớn các bệnh, có lẽ khoảng hai trăm bệnh, đa dạng theo độ tuổi mắc bệnh, tốc độ phát triển, trạng thái biệt hoá của tế bào, triệu trứng, khả năng xâm lấn, di căn, phản ứng với cách điều trị và chẩn đoán. Trên quan điểm của sinh học phân tử và tế bào, ung thư có thể là một số lượng nhỏ các căn bệnh gây bởi những khiếm khuyết trong chức năng của tế bào ở mức độ phân tử do những biến đổi thông thường trong các gene của tế bào. Cuối cùng, ung thư là một bệnh với những bất thường trong biểu hiện gene. Có một số cơ chế làm biến đổi biểu hiện gene. Các cơ chế này có thể xảy ra theo con đường tác động trực tiếp đến ADN như đột biến gene, hoán vị gen, khuyếch đại gen, mất gene hay theo cơ chế bất thường trong phiên mã và dịch mã. Toàn bộ kết quả này làm mất cân bằng giữa quá trình tái bản của tế bào và quá trình chết của tế bào trong quần thể tế bào ung thư dẫn đến sự phát triển của mô khối u [46]. 1.3.2. Tình hình phát triển bệnh ung thư trong nước và trên thế giới Ung thư là một trong những nguyên nhân gây chết hàng đầu ở các nước phương Tây. Ở Mỹ và một số nước Châu Âu, ung thư là nguyên nhân gây chết thứ 2 đứng sau bệnh tim mạch. Riêng ở Mỹ, kể từ năm 1999, số người chết ở độ tuổi dưới 85 vì bệnh ung thư đã vượt qua bệnh tim. Ở Mỹ, hàng năm có hơn 1,3 triệu ca ung thư mắc mới, trong đó không kể có trên 1 triệu ca hàng năm. Mức độ nguy hiểm cao nhất trong các bệnh ung thư là ung thư phổi, ung thư ruột kết, ung thư trực tràng, ung thư vú và ung thư tiền liệt tuyến. Hàng năm có hơn 570 nghìn người chết bởi ung thư tại Mỹ [46]. Tại Việt Nam, ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu. Theo thống kê, hàng năm Việt Nam có khoảng 200.000 người mắc bệnh ung thư và 150.000 bênh nhân tử vong vì căn bệnh này. Chỉ tính riêng tại TPHCM, mỗi năm có khoảng 5.500-6.000 ca ung thư mới, trong đó thường gặp nhất là ung thư phổi, gan, dạ dày ở nam giới; ung thư vú, cổ tử cung, phổi ở nữ giới [73].  1.3.3. Sơ lược về các thuốc điều trị ung thư Cùng với phương pháp điều trị tại chỗ như phẫu thuật và xạ trị phương pháp điều trị toàn thân bằng hoá trị liệu đã góp phần quan trọng vào điều trị và chăm sóc bệnh nhân ung thư. Các thuốc chống ung thư đang được sử dụng trong hoá trị liệu hiện nay có thể chia thành các nhóm như sau: - Nhóm chống chuyển hoá: Các thuốc thuộc nhóm này tác động vào quá trình chuyển hoá các chất có nhân pyrimidine và purine. Ví dụ, 5-fluorouracil ức chế sinh tổng hợp vòng purine, ức chế methyl hoá acid deoxyurydylic thành acid thymidylic. Methotrexate ức chế men khử dihydrofolate reductase cần thiết cho việc tạo các folate khử vốn là các gốc methyl trong tổng hợp thymidine… - Nhóm alkyl hoá, mutard nitơ: Các nhóm alkyl hóa có trong cấu trúc phân tử sẽ gắn vào nhóm ái điện tử trong ADN tạo ra các liên kết chéo giữa 2 chuỗi ADN và các liên kết ngang giữa các bazơ nitơ gần nhau làm ức chế hoạt động của ADN. Trong nhóm thuốc này có thể kể đến cisplatine, cyclophosphamide…. - Nhóm các thuốc tác động đến tubulin: Trong nhóm này có thể kể đến như docetaxel, paclitaxel (từ cây thông đỏ Taxus wallichiana Zucc.) và vinblastine, vincristine (từ dừa cạn Catharanthus roseus); - Nhóm các thuốc có tác động ức chế enzyme topoisomerase: Topoisomerase là enzyme cần thiết cho việc tháo xoắn của ADN cần thiêt cho quá trình phân chia của tế bao. Trong nhóm này có thể kể đến etoposide (dẫn xuất của podophyllotoxin từ Podophyllum peltatu) có tác dụng ức chế enzyme topoisomerase II. - Điều trị ung thư theo hướng đích (Targeted cancer therapy): Liệu pháp này sử dụng các loại thuốc ngăn sự phát triển và lan rộng của tế bào ung thư bằng cách cản trở các phân tử đặc hiệu liên quan đến quá trình sinh ung thư và phát triển khối u. Các liệu pháp điều trị ung thư theo hướng đích là phương pháp hiệu quả hơn các thuốc điều trị truyền thống và ít gây độc trên các tế bào thường hơn. Trong liệu pháp này có thể kể đến như sử dụng các kháng thể đơn dòng và các độc tố miễn dịch đặc hiệu, các chất chống tạo mạch máu mới nuôi khối u, các chất chống proteasome như bortezomide, các thuốc ức chế Bcl-2 gây apoptosis như genasene,... Hầu hết các thuốc điều trị ung thư hướng đích hiện nay mới đang được thử nghiệm tiền lâm sàng, một số đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng và một số khác đã được FDA đồng ý đưa vào điều trị. Điều trị ung thư hướng đích có thể sử dụng đơn lẻ, kết hợp với nhau hoặc kết hợp với các thuốc hóa trị liệu khác [2, 46] 1.3.4. Chất ức chế protein anti-apoptosis họ Bcl-2 và tiềm năng trong liệu pháp điều trị ung thư - Họ protein Bcl-2 và con đường apoptosis: Apoptosis là một cơ chế “chết theo chương trình của tế bào” làm cho các sinh vật đa bào có thể điểu khiển được số lượng tế bào trong các mô và loại bỏ các tế bào không cần thiết hay đã bị lão hoá trong quá trình phát triển của cơ quan. Apoptosis được xảy ra bởi quá trình hoạt hoá liên tiếp các cysteine protease trong họ caspase theo cả hai con đường. Con đường bên ngoài là hoạt hoá caspase-8 (caspase 10 trên người) xảy ra khi quá trình trimer hoá thụ thể cái chết (death receptor) trên màng tế bào. Con đường bên trong (còn được gọi là con đường ty thể hay con đướng stress) hoạt hoá caspase-9 bởi protein Apaf-1 khi cytochrome c được giải phóng ra khỏi ty thể phản ứng với các stress khác nhau như mất các cytokine và sai hỏng trong ADN. Các caspase khởi đầu (initiator caspase) này có thể phân cắt và hoạt hóa các caspase thi hành (effector caspase) (caspase-3, caspase-6 và caspase-7), gián tiếp làm phá huỷ tế bào bằng cách phân cắt hàng loạt các protein thiết yếu của tế bào [58]. Hình 1.6 mô tả quá trình apoptosis thông qua con đường ty thể gây ra bởi hóa trị liệu hoặc tia xạ.
Hình 1.6. Apoptosis thông qua con đường ty thể [35] Con đường bên trong được kiểm soát bởi họ protein Bcl-2, thông qua sự điều khiển tính nguyên vẹn của màng ngoài ty thể. Các protein thuộc họ Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) có thể phân làm 3 nhóm: Các protein anti-apoptotic (pro-survival): chúng có trình tự tương đồng tại các domain BH1, BH2, BH3 và BH4 (BH = Bcl-2 homology), ví dụ như các Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1 và ở người là Bcl-B. Các protein pro-apoptotic: chúng có trình tự tương đồng tại các domain BH1, BH2 và BH3. Ví dụ như Bax và Bak và ít được nghiên cứu hơn là Bok. - Các protein BH3-only: là các pro-apoptotic nhưng chỉ có trình tự tương đồng ở domain BH3 bao gồm Bim, Bad, Bid, Bik, Bmf, Puma, Noxa và Hrk. Khi tiếp nhận được tín hiệu cái chết, Bax và Bak có thể tạo thành dạng oligomer trên màng ngoài ty thể, giải phóng cytochrome c và hoạt hoá caspase, trong khi đó các protein anti-apoptosis lại ngăn cản quá trình giải phóng này bằng cách cản trở sự hoạt hóa Bax và Bak. Các protein BH3-only đóng vai trò khởi động cái chết của tế bào, hoạt tính của chúng đựơc kiểm soát chặt chẽ bởi các cơ chế phiên mã và sau phiên mã. Khi được hoạt hoá bởi tín hiệu stress, các protein BH3-only liên kết đặc hiệu vào bên trong rãnh kỵ nước của các protein anti-apoptosis họ Bcl-2. Chính sự kết cặp này dẫn đến làm hoạt hoá Bax/ Bak [58]. - Tiềm năng của một số chất ức chế protein anti-apoptosis họ Bcl-2 làm thuốc điều trị ung thư Những sai sót trong quá trình apoptosis thường xảy ra trong nhiều loại khối u ác tính trong đó thường do có sự biểu biện quá mức của họ protein Bcl-2, chủ yếu là Bcl-2 và Bcl-xL. Sự biểu hiện quá mức của các protein này ngăn cản apoptosis thông qua con đường ty thể, góp phần vào quá trình kháng với liệu pháp hoá học và xạ trị của tế bào ung thư. Do đó, các chất bắt chước domain BH3, có khả năng liên kết với 1 hay nhiều protein anti-apoptosis trong họ Bcl-2, phát động quá trình apoptosis, rất có tiềm năng trở thành thuốc chống ung thư đặc biệt là để chống lại tính kháng với liệu pháp hoá học và xạ trị của các tế bào ung thư. Một nghiên cứu dựa trên cấu trúc của các protein họ Bcl-2 đã thiết kế ra phân tử ABT-737, có khả năng liên kết mạnh với domain liên kết với BH3 (ái lực cỡ nM) của Bcl-2. Bcl-xL và Bcl-w nhưng không liên kết với Mcl-1, A1. ABT-737 đã được chứng minh là có tác dụng trên nhiều loại tế bào ung thư lympho B, ung thư máu lympho bào mãn tính (CLL) cũng như là dòng tế bào ung thư phổi tế bào nhỏ. Đặc biệt, nó có tác dụng ức chế hiệu quả các tế bào ung thư phổi trên chuột (mô hình xenografts) với ít tác dụng phụ. Nó cũng gây chết tế bào ung thư bạch cầu cấp tính (AML) nhưng lại không làm chết tế bào máu bình thường in vitro và ức chế ung thư máu trên mô hình xenografts mà không gây tác dụng phụ. ABT-737 và A-385358-chất ức chế Bcl-xL đặc hiệu đã được chứng minh là làm cho tế bào ung thư trở lên nhạy hơn với các thuốc hoá trị liệu khác như dexamethasone, vincristine, và L-asparagine [5]. Obatoclax (GX15-070), đây là một dẫn xuất indol bipyrrol của prodiginine trong vi khuẩn được phát triển bởi hãng dược phẩm Gemin X Biotechnology (Canada), có đặc tính bắt chước BH3. Khác với ABT-737, obatoclax có khả năng ức chế không những Bcl-2 mà còn có khả năng ức chế cả Mcl-1. Obatoclax gây apoptosis trên các dòng tế bào ung thư máu, ung thứ vú và thậm trí trên cả các dòng tế bào đã kháng với các thuốc khác như melphalan, ABT-737 hoặc bortezomib. Đã có nghiên cứu cho thấy rằng obatoclax liên kết với Bcl-w, Bcl-xL và Mcl-1 tái tổ hợp và làm phá vỡ mối tương tác Mcl-1/Bak trong tế bào [35].
Hinh 1.7. Mô hình liên kết giữa Bcl-2 với (-)-gossypol và Bim Nhờ vào quá trình sàng lọc dựa trên cơ sở dữ liệu cấu trúc phân tử để xác định các phân tử liên kết với rãnh liên kết với BH3 của Bcl-2 và Bcl-xL, Shaomeng Wang đã phát hiện (-)-gossypol có ái lực khá cao với Bcl-2 và Bcl-xL. (-)-Gossypol có giá trị Ki lần lượt là 320 nM và 480 nM với Bcl-2 và Bcl-xL. (-)-Gossypol cũng liên kết với Mcl-1, là một protein anti-apoptosis khác trong họ này với giá trị Ki là 180 nM. Để hiểu rõ về cơ sở cấu trúc của (-)-gossypol liên kết với Bcl-2, dựa vào việc mô hình hoá trên máy tính họ đã tiến hành gắn (-)-gossypol vào rãnh liên kết với BH3 trong Bcl-2. Dựa trên sự mô hình hoá này đã xác định (-)-gossypol tạo nên mạng lưới liên kết hydro với Arg 146 và Asn 143 trong Bcl-2 thông qua nhóm aldehyde và nhóm hydroxyl lân cận trên vòng naphthalene bên phải. Nó bắt chước mạng lưới liên kết hydro tạo bởi Asp 99 và Asn 102 trong Bim và Arg 146 và Asn 143 trong Bcl-2. Nhóm isopropyl trong cùng vòng naphthalene này gắn vào hốc kỵ nước trong Bcl-2, phần nào bắt chước Phe 101 trong Bim. Phần bên phải của (-)-gossypol tương tác chủ yếu với Bcl-2 thông qua tương tác kỵ nước, bắt chước Ile 97 trong Bim (Hình 1.7) [59]. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Nguyên liệu thực vật và các dòng tế bào ung thư Hạt của của các giống khác nhau thuộc hai loài bông G. barbadense và G. hirsutum đã được cán loại xơ do Thạc sĩ Trần Văn Tâm, Phòng di truyền và chọn giống, Viện Nghiên cứu và phát triển cây bông, Nha Hố, Ninh Thuận cung cấp. Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan; LU-1 (Human lung carcinoma) – ung thư phổi và MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú. 2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu - Các hóa chất và dung môi dùng cho tổng hợp, tinh chế, đo các loại phổ và thử độc tính tế bào (MTT assay) được mua của hãng Merck hoặc Sigma. Vincristine được cung cấp bởi Tiến sỹ Trần Bạch Dương-Viện Hóa Công nghiệp. Các dung môi dùng cho chiết xuất là dung môi tinh khiết của Trung Quốc. - Các thiết bị nghiên cứu chính được sử dụng gồm: Xác định độ ẩm trên máy Precisa HA60 - Viện Dược liệu Máy quang phổ tử ngoại Cary 1E (Varian) - Viện Dược liệu. Máy đo điểm nóng chảy: SMP3 (Stuart) - Viện Dược liệu Máy quang phổ hồng ngoại Impact 410 Nicolet - Viện Hoá học. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy) được đo trên máy Shimadzu LC-MS 2010 EV - Khoa Hóa học - Đại học Quốc Gia Hà Nội. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) được đo trên máy Bruker AM500-FT-NMR - Viện Hóa học. Máy phân cực kế Electronic Polarimeter-P3001 - Viện Dược liệu. Máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của hãng Agilent 1200 (Mỹ) - Trường Đại học Dược Hà Nội. Các thiết bị để nuôi cấy và phân tích độc tính tế bào gồm có: Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170), tủ cấy sinh học an toàn cấp II, máy li tâm (Universal 320R), kính hiển vi ngược (Zeizz), tủ lạnh sâu -250C đến -800C. Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ), máy quang phổ (Genios Tecan) - Viện Hóa học. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chiết xuất Quy trình chiết gossypol từ hạt bông được tiến hành dựa theo phương pháp của Carruth được cải tiến [8]. Hạt bông G. barbadense (giống HD139) sau khi đã cán loại xơ bông được phơi khô, nghiền nhỏ và phân tách nhân ra khỏi lớp vỏ bên ngoài. Bột nhân thu được sau đó được xác định độ ẩm trên máy Precisa HA60. Phần nhân hạt thu được dưới dạng bột được bảo quản ở nhiệt độ -180C cho tới khi được sử dụng để nghiên cứu tách gossypol. Bột nhân hạt bông được chiết qua ete dầu (nhiệt độ sôi 30-600C) để loại các tạp chất kém phân cực và sau đó tiếp tục được chiết bằng diethyl ether. Các quá trình này đều được tiến hành trên máy chiết soxhlet. Phần dịch chiết ete dầu và diethyl ether (DEE) được bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết tương ứng. 2.2.2. Phương pháp định tính gossypol Phần chiết ete dầu và cao chiết diethyl ether (cao chiết DEE) được định tính gossypol bằng 2 phương pháp: Phương pháp quang phổ tử ngoại và phương pháp sắc ký lớp mỏng. 2.2.2.1. Phương pháp quang phổ tử ngoại (UV-Vis) Gossypol trong cloroform có phổ tử ngoại với 4 đỉnh hấp thụ là: 243, 278, 289 và 365 nm. Trong đó đỉnh 365 nm là đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm aldehyde tự do. Phần chiết ete dầu và DEE được hoà trong chloroform ở nồng độ thích hợp và đo phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng từ 200-500 nm trên máy UV- Visible Spectrophotometer Cary 1E (Varian). 2.2.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng Dịch chiết được tiến hành sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn GF254 (Merck), khai triển bằng hệ dung môi: n-hexan/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4. Bản mỏng sau khi sấy khô cho bay hết dung môi được nhuộm bằng thuốc thử H2SO4 20% trong EtOH hơ nóng trên bếp điện để hiện mầu. Tiến hành tương tự với thuốc thử FeCl3 5%. Gossypol phản ứng với thuốc thử H2SO4 cho mầu đỏ và phản ứng với thuốc thử FeCl3 cho mầu xanh đậm trên bản mỏng quan sát dưới ánh sáng thường. 2.2.3. Phương pháp tinh chế gossypol 2.2.3.1. Phương pháp tinh chế gossypol bằng sắc ký cột Cao chiết DEE được tiến hành phân lập trên cột sắc ký với chất hấp phụ là silica gel pha thuận cỡ hạt 0,04-0,063 mm (Merck) với khối lượng gấp 30 lần khối lượng mẫu cần phân tách. Hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp n-hexane/EtOAc/acetic acid với độ phân cực tăng dần (100/0/1 – 80/20/1). Tốc độ dòng được điều chỉnh ở 5 ml/phút. Quá trình chạy cột được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn GF254 (Merck) với hệ dung môi khai triển là n-hexane/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4, hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 20% trong EtOH. Các phân đoạn có các chất cùng Rf được gộp lại với nhau rồi bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm trong điều kiện tránh ánh sáng. Sản phẩm thu được sau đó được kết tinh lại dưới dạng G-AA trong dung môi DEE và acetic acid băng. 2.2.3.2. Kết tinh gossypol từ cao chiết diethyl ether của hạt bông Gossypol được kết tinh dưới dạng gossypol acetic acid (G-AA) trong dung môi DEE và acetic acid băng. Quá trình kết tinh được tiến hành trong bình cầu dung tích 100 ml. Phương pháp chung là cao chiết DEE từ 100 g hạt bông (chuẩn bị theo phương pháp đã được mô tả ở mục 2.2.1) được hoà tan trong một thể tích DEE xác định (khoảng 6 ml cho 100 g hạt), dung dịch thu được sau đó được thêm acetic acid băng. Ngay sau đó bình cầu được đậy kín và đặt trong điều kiện tránh ánh sáng để ngăn cản quá trình ôxy hoá. Sau 24 h, lọc dung dịch bằng phễu lọc hút chân không, rửa tinh thể G-AA bằng ete dầu (300C -600C) cho đến khi dịch rửa không còn mầu. Sấy sản phẩm trong 24 h ở nhiệt độ phòng trong tủ sấy chân không rồi cân bằng cân phân tích. Các sản phẩm sau đó được xác định độ tinh sạch bằng phương pháp quang phổ tử ngoại ở bước sóng 365 nm. Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình kết tinh G-AA như: nhiệt độ kết tinh (nhiệt độ phòng và 4ºC), tỷ lệ DEE/acetic acid và nồng độ của cao chiết DEE (thể tích DEE được dùng để kết tinh). Mỗi điều kiện kết tinh đều được lặp lại 3 lần để lấy kết quả là giá trị trung bình và sai số tương ứng. Phân tích số liệu sử dụng tiêu chuẩn t-test của Student. Giá trị P<0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. 2.2.3.3. Xác định độ tinh khiết của gossypol acetic acid Sản phẩm G-AA trong quá trình nghiên cứu tinh chế gossypol bằng phương pháp kết tinh được được xác định độ tinh khiết bằng quang phổ tử ngoại dựa theo phương pháp được xây dựng bởi Guangfeng Jia và cộng sự [21]. - Xây dựng đường chuẩn: 50 mg G-AA đối chiếu được đưa vào bình định mức 100 ml và định mức đến 100 ml bằng chloroform để thu được dung dịch gốc với nồng độ 0,5 mg/ml (m/v). Tiếp theo, lấy 50, 100, 150, 200, 250 µl dung dịch gốc ở trên bằng micropipette đưa vào bình định mức 5 ml và định mức lần lượt thành các dung dịch có nồng độ 5, 10, 15, 20, 25 µg/ml bằng chloroform. Các dung dịch chuẩn thu được sau đó được đo cường độ hấp thụ ở bước sóng 365 nm trên máy quang phổ UV-Visible Spectrophotometer Cary 1E (Varian), đo lặp lại 3 lần. Qua đó, chúng tôi xây dựng được đường chuẩn có phương trình là: y = 0,0403x + 0,0395 (R2=0,0085) với x là nồng độ G-AA (µg/ml), y là cường độ hấp thụ ở bước sóng 365 nm. - Đánh giá độ tinh khiết của mẫu: Độ khiết của sản phẩm G-AA thu được trong quá trình kết tinh từ cao DEE được xác định bằng phương pháp UV dựa theo phương trình đường chuẩn được xây dựng ở trên. Dung dịch mẫu thử được chuẩn bị ở nồng độ vào khoảng 15 µg/ml G-AA trong CHCl3. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 365 nm. Độ tinh sạch của sản phẩm G-AA được tính là tỷ lệ giữa nồng độ của G-AA tinh khiết khi được xác định theo đường chuẩn và nồng độ của mẫu thử.
Hình 2.1. Đường chuẩn G-AA bằng phương pháp UV 2.2.3.4. Tinh sạch sản phẩm G-AA Sản phẩm G-AA thô kết tinh từ cao DEE được tinh chế lại để làm tăng độ tinh khiết. G-AA thô được hoà trong DEE (tỷ lệ 1 : 7, w/v), lọc qua phễu lọc hút chân không và sau đó acetic acid băng (1/3 thể tích DEE) được thêm vào. Dung dịch này sau đó được đậy kín, tránh ánh sáng ở điều kiện nhiệt độ phòng. Sau 6 h, sản phẩm G-AA thu được bằng cách lọc qua phễu lọc hút chân không, rửa bằng ete dầu (30-60ºC) cho đến khi dịch ete dầu không mầu. Sản phẩm được sấy trong máy sấy chân không 24 h ở nhiệt độ phòng. Quá trình kết tinh này được lặp lại 3 lần. Trong các lần kết tinh thứ 2 và thứ 3, công đoạn lọc đầu tiên có thể được bỏ qua. Sản phẩm cuối cùng được xác định điểm chảy, phổ tử ngoại, MS và kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC. 2.2.4. Xác định cấu trúc hóa học Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng hợp chất mà người ta sử dụng những phương pháp cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất người ta còn phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với các phương pháp sắc ký so sánh. Ở đây, gossypol và các đồng phân hoặc dẫn xuất của nó đều đã biết nên có thể dễ dàng so sánh với các dữ liệu đã công bố. Cấu trúc hoá học của gossypol và các đồng phân hoặc dẫn xuất của nó được xác định bằng các phương pháp phân tích hiện đại như: Máy đo điểm chảy, máy đo phổ tử ngoại, máy đo phổ hồng ngoại, máy đo phổ khối lượng, máy đo cộng hưởng từ hạt nhân 1H, và 13C, máy đo độ quay cực, máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và so sánh với dữ liệu đã công bố. 2.2.5. Tách đồng phân quang học từ hỗn hợp racemic Tách hai đồng phân này bằng phương pháp tạo dẫn xuất với amine bất đối L-phenylalaninol dựa theo phương pháp đã được mô tả bởi Sampatk D. S. [53]. 2.2.5.1. Điều chế bazơ Schiff gossypol-L-phenylalaninol dienamine (±)-G-AA (0,406 g; 0,70 mmol) được đưa vào bình cầu dung tích 25 ml. Thêm vào đó lần lượt 6 ml acetonitrile và L-phenylalaninol (0,233 g, 1,54 mmol). Hỗn hợp này được khuấy ở nhiệt độ phòng trong điều kiện tránh ánh sáng và trong môi trường khí nitơ. Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển n-hexane/EtOAc = 7/3. Sau khi phản ứng kết thúc (gossypol phản ứng hết), hỗn hợp này được chuyển vào bình chiết quả lê và thêm vào đó 50 ml nước cất và chiết bằng 50 ml DCM. Quá trình chiết này được lặp lại 3 lần. Gộp các dịch chiết DCM rồi làm khan bằng Na2SO4 khan. Lọc bỏ Na2SO4 qua giấy lọc, phần dịch chiết DCM s